JP2001513981A - アミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体を同定可能にするオリゴヌクレオチド - Google Patents

アミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体を同定可能にするオリゴヌクレオチド

Info

Publication number
JP2001513981A
JP2001513981A JP2000507687A JP2000507687A JP2001513981A JP 2001513981 A JP2001513981 A JP 2001513981A JP 2000507687 A JP2000507687 A JP 2000507687A JP 2000507687 A JP2000507687 A JP 2000507687A JP 2001513981 A JP2001513981 A JP 2001513981A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
oligonucleotide
nucleotides
dna
deleted
oligonucleotides
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2000507687A
Other languages
English (en)
Inventor
マルテイネ，ジヤン
ゴゼ，カトリーヌ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ipsen Pharma SAS
Original Assignee
Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS filed Critical Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Publication of JP2001513981A publication Critical patent/JP2001513981A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6811—Selection methods for production or design of target specific oligonucleotides or binding molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Abstract

(57)【要約】 本発明は、新規なオリゴヌクレオチド及びその使用であってアミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体をコードするmRNAを同定し、それによって新規なアミド化されたポリペプチドホルモンするためのプローブとしてのその使用に関する。本発明はまた、開示したヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド及びアミド化されたホルモンの前駆体の同定方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、新規なオリゴヌクレオチド及びその使用であってアミド化されたポ
リペプチドホルモンの前駆体をコードするmRNAを同定するためのプローブとして
の使用に関し、さらにまた新規なアミド化されたポリペプチドホルモンの同定に
関する。従って、本発明は、以下に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドに関
し且つホルモン前駆体の同定方法に関する。
【０００２】 アミド化されたポリペプチドホルモンは、成熟化を受ける(subit une maturation)前駆体の形で合成される。この成熟化はアミド化反応からなる。
【０００３】 Ｃ-末端のアミド化反応は、アミド化されたポリペプチドホルモンに特徴的な 反応である。１種又はそれ以上のホルモンの前駆体において生じるこの反応は、
ホルモンの成熟化を可能にし且つ生理学的媒体中での生安定性(biostability)を
確実にする：すなわち形成されたアミド基は遊離の酸官能基よりも攻撃されにく
い。従って、前記ホルモンは、よりいっそうカルボキシペプチダーゼに対して耐
性があり、細胞中でより長期間活性であり続け、しかもそのレセプター部位に対
して最適な親和性を保持する。
【０００４】 アミド化は広く報告されており〔Alan F. Bradbury 及び Derek G. Smythの論
文、TIBS 16, 12-115, March 1991,“Peptide Amidation”並びに A.G. Katopodis, D.S. Ping, C.E. Smith 及びS.W. Mayの論文、Biochemistry, 30 (25),6189-6194, June 1991,“Functional and structural characterization
of peptidylamidoglycolate lyase, the enzyme catalyzing the second step
in peptide amidation”〕、そのメカニズムは次の通りである： １ − ホルモンの前駆体ポリペプチド鎖の２種類の塩基性アミノ酸、すなわ ちアルギニン及び/又はリシンでエンドプロテアーゼにより該前駆体ポリペプチ ド鎖が切断され、 ２ − 次いで、カルボキシペプチダーゼによる２つの切断が生じ、これによ り伸長されたグリシン中間体がもたらされ、 ３ − 酵素PAM（ペプチジル-グリシン-α-アミド化モノオキシゲナーゼ）は ２つの異なる酵素活性を有し：該酵素は最初に、前記の伸長されたグリシン中間
体をα-ヒドロキシグリシン誘導体に転化させる。これに関与した酵素PAMのサブ
ユニットはPHM(ペプチジル-グリシン-α-ヒドロキシル化モノオキシゲナーゼ)で
ある。得られたα-ヒドロキシグリシン誘導体は、酵素PAMの第二のサブユニット
(PAL：ペプチジル-α-ヒドロキシグリシン-α-アミド化リアーゼと呼ばれる）の
基質として機能し、N-末端側のすぐ隣りのアミノ酸にグリシンのアミノ基を結合
し且つグリオキシル酸を遊離させる。
【０００５】 この反応は、１個又は複数個のホルモンの前駆体上に認識部位が存在すること
を必要とし、その部位は常に次の配列：すなわち、グリシンと２個の塩基性アミ
ノ酸（アルギニン又はリシン）とを含んでいる〔A.G. Katopodisらの論文、 Biochemistry, 30(25), 6189-6194, June 1991 及びその引用文献参照〕。
【０００６】 小胞体の外に分泌されるべきアミド化されたポリペプチドホルモンは、約15個
〜30個のアミノ酸からなる共通シグナル配列を有していることが知られており、
この配列はポリペプチド鎖のN-末端に存在する。この配列は一度分泌されたタン
パク質中にもはや認められないように、後でシグナルペプチダーゼ酵素によって
切り離される〔F. Cuttitaの論文、The Anatomical Record, 236, 87-93(1993) 及びその引用文献参照〕。 現在では、新規なタンパク質を発見することは容易ではない。タンパク質は種
々の方法：すなわち等電点での沈降法、ある種の溶媒による選択的抽出法、次い
で結晶化による精製法、交流分配、吸着クロマトグラフィー、分配クロマトグラ
フィー、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動法などにより単離し、精製す
ることができる。しかしながら、これらの方法は、単離すべきタンパク質の性質
を熟知することを伴う。さらにまた、治療の面で関心事の新規なタンパク質の純
粋な試料を調製する場合には、それを合成できる遺伝的に変性された微生物を入
手する前にまだ幾つかの段階が存在している。
【０００７】 本発明によって提案される方法は、これまでに知られているアミド化されたホ
ルモン全ての前駆体のペプチド配列の特徴を使用することによって、この範疇の
幾つかの新規なホルモンを同時に検出することを可能にするという利点を提供す
る。この検出調査(recherche)は、これらのホルモンの前駆体を合成することが できる組織から調製されるcDNAバンク中で前記前駆体をコードするヌクレオチド
配列を直接に同定することによって行われる。
【０００８】 この方法による検出調査は、前述の慣用の生化学的方法よりも制限が少ない。 その理由は、 − この方法は、同じ原理に従って、同じ組織に存在する幾つかの異なる前駆
体を単離することができ； − この方法は、同じ技術条件下で、種々様々な生化学的性質及び生物学的性
質をもつ種々のホルモンに対応する前駆体の検出を可能にし； − この方法は、同じ前駆体に含有され得るペプチドホルモン全てを同時に検
定することを可能にする； からである。
【０００９】 その結果、本発明は、研究開発費用が事業総額の極めて高い割合を占める部門
において、無視し得ない時間と金額の節約を可能にする。
【００１０】 また、本発明は、哺乳類生物において非常に重要な生理学的役割をもつ活性物
質：すなわちホルモン類、特にアミド化されたポリペプチド神経分泌ホルモンの
薬理学的研究を可能にする。活性物質に対応するcDNAを最初に入手できると、そ
の場合には遺伝子工学によりクローン化されたベクターを誘導して微生物を用い
て治療用途をもつホルモンの合成を行うことができるであろう。
【００１１】 本発明は第一に、次の配列： Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5 （式中、Ｙ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｙ1は削除されており、Ｙ2はGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3及び
Ｙ4はそれぞれ独立してArg又はLysをコードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5
は１〜21個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又はＹ5は削除さ れている）を有するオリゴヌクレオチドＯＹと温和な条件下でハイブリダイズで
きる一本鎖オリゴヌクレオチドＯＸに関する。
【００１２】 ヌクレオチドとは、ヌクレオシドリン酸エステルの化学構造をもつRNA又はDNA
の単量体単位を意味すると解釈される。ヌクレオシドは、プリン塩基（プリン、
アデニン、グアニン又は類縁体）又はピリミジン塩基（ピリミジン、シトシン、
ウラシル又は類縁体）と、リボース又はデオキシリボースとを結合させることに
よって得られる。オリゴヌクレオチドはプライマー配列、プローブあるいはRNA 又はDNA断片を意味するヌクレオチド重合体である。
【００１３】 上記のオリゴヌクレオチドは合成によって得ることができ、次の刊行物： S.A. Narangの論文、Tetrahedron, 39, 3 (1983)の“DNA synthesis”並びに K. Itakura, J.J. Rossi及びR.B. Wallanceの論文、Annu. Rev. Biochem., 53,
323(1984)の“Synthesis and use of synthetic oligonucleotides”に記載され
ている参考文献の自動化法がある。
【００１４】 オリゴヌクレオチドＯＸは、オリゴヌクレオチドＯＹとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズできるものであることが好ましい。 オリゴヌクレオチドＯＸは、次の配列：Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5 を有するオリゴヌク
レオチドＯＹとハイブリダイズできるものであることがさらに好ましい。 オリゴヌクレオチドＯＸは、次の配列：Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4 又は Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4 を有するオリゴヌクレオチドＯＹとハイブリダイズできるものであることがさら
に一層好ましい。
【００１５】 特に、オリゴヌクレオチドＯＸは、オリゴヌクレオチドＯＹであってＹ5が次 のヌクレオチド配列： Ｙ6-Ｙ7-Ｙ8-Ｙ9 （式中、Ｙ6はSer、Thr又はTyrをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ7はア ミノ酸をコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ8は Glu 又は Asp をコードす るトリヌクレオチドを表し且つＹ9は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオ チド配列を表す）を表すものであるようなオリゴヌクレオチドＯＹとハイブリダ
イズできる。特に、オリゴヌクレオチドＯＸは、Ｙ1及びＹ9が削除されているよ
うなオリゴヌクレオチドＯＹとハイブリダイズできる。
【００１６】 特に、オリゴヌクレオチドＯＸは、オリゴヌクレオチドＯＹであってＹ2がGly
をコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3がLysをコードするトリヌクレオチド
を表し、Ｙ4がArgをコードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5がSer-Ala-Gluを
コードする３個のトリヌクレオチドからなる配列を表すものであるオリゴヌクレ
オチドＯＹとハイブリダイズできる。
【００１７】 この配列は公知の27個のアミド化部位の統計学的研究によって決定され、しか
もアミノ酸の所定のパターンを６つの位置に関して：Gly-Lys-Arg-Ser-Ala-Glu と定義することをもたらした。
【００１８】 遺伝暗号の縮重(degeneration)並びに Gly（４組のコドン）、Arg（６組のコ ドン）及びSer（６組のコドン）に対応する多数のコドンにより、前記のオリゴ ヌクレオチド配列は、この縮重を考慮にいれることを可能にする２つの方法： − イノシン、すなわち窒素塩基ヒポキサンチンがDNAを構成する前記の４種 類の窒素塩基と無差別に対合しているヌクレオチドのある一定の位置を使用する
方法、 − 組み込まれた窒素塩基の性質をある一定の位置で変化させ、このようにし
て導入された種々の塩基の数に比例するオリゴヌクレオチドの多数の組み合わせ
を作り出す方法、 を用いて構築された。
【００１９】 本発明はまた、次の配列： Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5 （式中、Ｙ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｙ1は削除されており、Ｙ2はGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3及び
Ｙ4はそれぞれ独立してArg又はLysをコードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5
は１〜21個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又はＹ5は削除さ れている）を有する９〜42個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドＯＹに
関する。
【００２０】 本発明は、Ｙ1が削除されているか又はＹ5が削除されているようなオリゴヌク
レオチドＯＹに関する。
【００２１】 本発明は、特に、オリゴヌクレオチドＯＹであってＹ5が次のヌクレオチド配 列： Ｙ6-Ｙ7-Ｙ8-Ｙ9 （式中、Ｙ6はSer、Thr又はTyrをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ7はア ミノ酸をコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ8はGlu又はAspをコードするト リヌクレオチドを表し且つＹ9は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド 配列を表す）を表すものであるようなオリゴヌクレオチドＯＹに関する。
【００２２】 また、本発明は特に、Ｙ1及びＹ9が削除されているようなオリゴヌクレオチド
ＯＹに関する。
【００２３】 さらにまた、本発明は特に、オリゴヌクレオチドＯＹであってＹ1が削除され ているものであり、Ｙ2がGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3がLysを
コードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ4がArgをコードするトリヌクレオチドを
表し且つＹ5がSer-Ala-Gluをコードする３個のトリヌクレオチドを表すものであ
ることを特徴とするオリゴヌクレオチドＯＹに関する。
【００２４】 さらにまた、本発明は、15〜39個のヌクレオチドからなること及びアミド化さ
れたポリペプチドホルモンに特有の共通シグナル配列とハイブリダイズでるもの
であり、前記の配列が次の式： Ｚ1-Ｚ2-Ｚ3-Ｚ4-Ｚ5-Ｚ6-Ｚ7 （式中、Ｚ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｚ1は削除されており、Ｚ2及びＺ3はLeuをコードする２個のトリヌクレオチドを
表し、Ｚ4 及びＺ5は２個のアミノ酸をコードする２個のトリヌクレオチドを表 し、Ｚ6はLeuをコードするトリヌクレオチドを表し且つＺ7は１〜12個のヌクレ オチドからなるヌクレオチド配列を表すか又はＺ7は削除されている）を有する ものであることを特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチドＯＺに関する。
【００２５】 本発明において、ホルモンとは、内分泌系のアミド化されたポリペプチドホル
モン、特に神経分泌ホルモンを意味すると解釈される。
【００２６】 共通シグナル配列は、成熟した後の細胞によって分泌されるタンパク質の前駆
体によって担持される配列である。
【００２７】 最後に、本発明は、組合わせライブラリーを構成するような一群のオリゴヌク
レオチドＯＸ又はＯＺに関する。
【００２８】 本発明において、組合わせライブラリーとは、アミノ酸の幾つかを変化させ得
るアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を鋳型として採用することによっ
て合成される一群のオリゴヌクレオチドを意味すると解釈される。遺伝暗号の縮
重により、種々のオリゴヌクレオチドの一群が得られる。
【００２９】 本発明はまた、次の連続する工程：すなわち、 １ - DNAバンクを得； ２ - １個又はそれ以上のオリゴヌクレオチドＯＸを前記のDNAバンクとハイ ブリダイゼションさせ； ３ - オリゴヌクレオチドＯＸとハイブリダイズする前記バンクの１個又は複
数個のDNA配列を同定し； ４ - この１個又は複数個の配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を 有する１個又はそれ以上のペプチドを同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法に関する。
【００３０】 前記のDNAバンクがcDNAバンクであるような方法が好ましい。
【００３１】 相補的DNA（cDNA）は、mRNAの配列に対して相補的な配列をもつヌクレオチド 鎖であり、一本鎖cDNAをもたらす反応は逆転写酵素によって触媒される。二本鎖
cDNAはDNAポリメラーゼを作用させることによって得ることができ、次いでλバ クテリオファージから誘導されるプラスミド又はベクターにリガーゼを用いて挿
入される。
【００３２】 cDNAバンクは、所定の細胞から抽出した細胞質mRNAに対応するcDNAを含有して
いる。該バンクは各出発mRNAの細菌クローンの少なくとも一つを含有する場合に
は完全である(complete)と言われる。
【００３３】 ハイブリダイゼーションは、２つのオリゴヌクレオチドが実質的に相補的なヌ
クレオチド配列を有している場合に行なわれ、２つのオリゴヌクレオチドは相補
的塩基同士の間で水素結合を形成することによってオリゴヌクレオチド全体の長
さにわたって結合することができる。
【００３４】 オリゴヌクレオチドＯＸが標識剤、例えば32Ｐ又はジゴキシゲニンを用いて検
出できるような方法が特に好ましい。
【００３５】 最も通常的に使用されているヌクレオチドの放射性標識剤は、β-線を発する 元素、例えば3Ｈ、12Ｃ、32Ｐ、33Ｐ及び35Ｓである。
【００３６】 オリゴヌクレオチドの標識化は、オリゴヌクレオチドの５´末端に対して、 (γ-32Ｐ)-ATPによって担持されるリン酸基を付加することによって行なわれ、 この反応は酵素Ｔ4-ポリヌクレオチドキナーゼによって触媒される。ジゴキシゲ
ニンによる標識化は免疫酵素的であり、ジゴキシゲニンは窒素塩基と結合し、オ
リゴヌクレオチドに組み込まれる。その存在は、ジゴキシゲニンを指向し且つア
ルカリ性ホスファターゼに連結される抗体を使用することによって示される。そ
の存在は、アルカリ性ホスファターゼによって加水分解された基質によって発現
される色を利用することによって示される。
【００３７】 別の標識法も使用することができる：すなわち、金属錯化剤(ランタニドの錯 体が使用される場合が多い）、ビオチン又はアクリジンエステルを含有する基、
蛍光化合物〔フルオレセイン、ローダミン、テキサス レッド(Texas red）〕、 その他を含有するように化学修飾されたオリゴヌクレオチドを使用することがで
きる。
【００３８】 前記のハイブリダイゼーション工程が複数個のオリゴヌクレオチドＯＸの組合
わせライブラリーを使用するようなアミド化されたポリペプチドホルモンの前駆
体の同定方法が特に好ましい。
【００３９】 本発明はまた、アミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の同定方法 であって、次の連続する工程：すなわち、 １ - DNAバンクを得； ２ - PCR法を使用して、一群のオリゴヌクレオチドＯＸと別の群のオリゴヌ クレオチドＯＺとを用いて関心事の断片を増幅させ； ３ - 前記のオリゴヌクレオチドＯＸとハイブリダイズし且つPCR反応によっ て増幅されている前記DNAバンクのDNA配列を同定し； ４ - この配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの １個又はそれ以上を同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法に関する。
【００４０】 関心事の断片(le fragment d'interet)とは、１個又はそれ以上のアミド化さ れたペプチドホルモンの前駆体をコードするcDNA配列を意味すると解釈される。
【００４１】 PCR（すなわち、ポリメラーゼ連鎖反応）によるDNAの増幅反応は95℃で加熱す
ることによって変性されたDNA調製物を必要とする。次いで、このDNA調製物は、
その増幅すべき配列の両方で、DNAの相対する２つの鎖に相補的な過剰量の２つ のオリゴヌクレオチドと対合される。この場合に、それぞれのオリゴヌクレオチ
ドは、DNAの２本の鎖のそれぞれをコピーするためのDNAポリメラーゼ〔サーマス
アクアチカス(Thermus aquaticus)種の好熱菌から抽出される：Taqポリメラー ゼ〕のプライマーとして機能する。このサイクルは自動化された方法で連続した
変性−再生によって反復し得る。
【００４２】 PCRプロトコールについては、詳しく述べた文献が多数存在する：すなわち、 米国特許第4,683,192号、同第4,683,202号、同第4,800,159号及び同第4,965,188
号各明細書、“PCR technology：principles and applications for DNA amplification”, H. Erlich編, Stockton Press, New York(1989) 並びに “PCR protocols：a guide to methods and applications”, Innisらの編集, Academic Press, San Diego, California (1990) がある。 前記のDNAバンクはcDNAバンクであることが好ましい。
【００４３】 前記のオリゴヌクレオチドＯＸは、標識剤、例えば32Ｐ又はジゴキシゲニンを
用いて検出できるものであることが特に好ましい。
【００４４】 前記の増幅工程が複数のオリゴヌクレオチドＯＸの組合わせライブラリーと、
複数のオリゴヌクレオチドＯＺの別の組合わせライブラリーとを使用するもので
あるようなアミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体の同定方法が、特に好
ましい。
【００４５】 本発明はまた、アミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の同定方法 であって、次の連続する工程：すなわち、 １ - DNAバンクを得； ２ - PCR法を使用して、一群のオリゴヌクレオチドＯＸを用いて関心事の断 片を増幅させ； ３ - 前記のオリゴヌクレオチドＯＸとハイブリダイズし且つPCR反応によっ て増幅されている前記DNAバンクのDNA配列を同定し； ４ - この配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの １個又はそれ以上を同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法に関する。
【００４６】 この方法の目的は、２つ以上のアミド化部位を有する前駆体をコードするヌク
レオチド配列を特定することにある。
【００４７】 前記のDNAバンクはcDNAバンクであることが好ましい。
【００４８】 前記のオリゴヌクレオチドＯＸは、標識剤、例えば32Ｐ又はジゴキシゲニンを
用いて検出できるものであることが特に好ましい。
【００４９】 前記の増幅工程が複数のオリゴヌクレオチドＯＸの組合わせライブラリーを使
用するものであるような、アミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体の同定
方法が特に好ましい。
【００５０】 本発明によって提案される別の、アミド化されたＣ-末端を有するペプチドの 前駆体の同定方法は、次の連続する工程：すなわち、 １ - DNAバンクを得； ２ - PCR法を使用して、オリゴヌクレオチドＯＸと、別の一本鎖オリゴヌク レオチドであって前記DNAバンクのDNAをクローン化させるプラスミドベクターの
配列に含まれる普遍的共通配列と温和な条件下又はストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズし得る別の一本鎖オリゴヌクレオチド、例えばプライマー Ｔ3、
Ｔ7、KS、SK、Ｍ13、Reverseとを用いて関心事の断片を増幅させ； ３ - オリゴヌクレオチドＯＸとハイブリダイズする前記DNAバンクのDNA配列
を同定し； ４ - この配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの １個又はそれ以上を同定する工程、 を特徴とする。
【００５１】 前記の普遍的共通配列は、前記バンクのDNAがクローン化されるベクターによ り担持される配列である。この配列は配列決定用のプライマーとして機能する。
これらのプライマーのヌクレオチド配列は、Sambrook, J., Fritsch E.F., Maniatis T.の著作、“Molecular cloning, a laboratory manual”, 2nd edition, 1989, Colel Spring Harbor Laboratory Pressに記載のものが利用で きる。
【００５２】 PCR反応は、２種類のオリゴヌクレオチドを、増幅を行うためのベクター中に クローン化されたcDNAに結合させることを必要とする。増幅すべきDNA断片自体 の単一の配列のみが知られている場合には、この問題を克服する解決策は、cDNA
がクローン化されているベクター自体のヌクレオチド配列、例えば普遍的共通配
列とハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドを使用することである。
【００５３】 前記のDNAバンクはcDNAバンクであることが好ましい。 標識剤、例えば32Ｐ又はジゴキシゲニンを用いて検出できるオリゴヌクレオチ
ドＯＹが特に好ましい。 複数個のオリゴヌクレオチドＯＸの組合わせライブラリーを使用する増幅工程
がさらに特に好ましい。
【００５４】実施例 ： 本発明によって説明される方法は、既に単離されているホルモンに適用するこ
とによって有効性が実証されている。選択した神経分泌ホルモンはコレシストキ
ニン(CCKと略記する)であり、これは脳内で最も定量的に表現される神経伝達物 質である。
【００５５】1.1 STRATAGENE社(米国、Lafolla所在)の市販のバンクλZappII（ラットの脳の cDNAライブラリーベクター、ref. 936,501）からPCR反応用に使用する鋳型DNAの 調製 このStratagene社製のcDNAバンクはラットの脳細胞のcDNAのクローンを含有す
る。
【００５６】 1.1.1 Bluescript phagemids〔Stratagene社(米国 Lafolla所在)製〕の形でク ローン化されたcDNAの放出 これは下記の方法に従って行なった：すなわち、２×108PFU/mlの前記cDNAバ ンク250μl、XL1 blue細菌〔遺伝子型：recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac[F’proAB lacIqZΔM15 Tn10(Tetr)]ｃ -Bullock, Fernandez,
Shortの論文、Biotechniques, 5, 376-379 (1987)参照 - 600nmにおける光学 密度：OD＝2.5〕200μl 及び1010 PFU/mlのファージExAssist(登録商標)〔Hay B., Short J.の論文、Strategies, 5, 16-18(1992)参照〕１μlを37℃で15分間 接触させた。次いで、この系全体をLB培地（組成：生理学的滅菌水１リットル当
たりにつきNaCl 10g、酵母抽出液５g及びバクトトリプトン10gを混合したもの）
50ml上で37℃で攪拌しながら３時間インキュベートした。培養液を遠心分離し、
次いで上清を70℃で20分間加熱することによって不活性化させた。
【００５７】 1.1.2 二本鎖プラスミドバンクの形のcDNAの取得 この工程は、前記の不活性化させた上清100μlと、SOLR(登録商標)細菌〔遺伝
子型：el4-(McrＡ-)Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 sbcC recB recJ uvrC umuC::Tn5 (Kanr) lac gyrA96 relA1 thi-1 endA1λR[F’proAB lacIqZΔM15]ｃSu-(nonsup
pressing) - Hay B., Short J.M.の論文、Strategies, 5(1), 16-18 (1992)参 照 - OD＝１(600nmにおいて)〕200μlとを、37℃で15分間インキュベートする ことを必要とする。アンピシリン(100mg/ml) 50μlとLB培地50mlとを加えた後で
、系全体を攪拌しながら37℃で一夜インキュベートした。培養液50mlからQIAGEN
社のQIAGEN Plasmid Midi Kitのプロトコールとカラム（該QIAGENカラムは樹脂 表面にDNA骨格のリン酸と反応しない正に荷電したエチルアミノエタノール基を 有するイオン交換樹脂を入れてある）を用いてプラスミドを調製した。このよう
にして1.37μg/μlのDNA溶液が得られた。
【００５８】1.2 前記のようにして調製したプラスミドバンクからCCKの前駆体の一部分の増 幅 1.2.1 PCR反応に必要な２種類のオリゴヌクレオチドの配列の作成 これらの２種類のオリゴヌクレオチドのうちの一つは、CCKのアミド化部位を コードする配列と相補的な配列を含有する。このCCKアミド化部位は知られてお り、配列としてGly-Arg-Arg-Ser-Ala-Gluを有している。このオリゴヌクレオチ ドは、オリゴCCKアミドと呼び、そのヌクレオチド配列として、下記の配列： を有する。 第二のオリゴヌクレオチドは、オリゴCCK 5´と呼び、下記の共通シグナル配 列： に対応する。 予測した増幅生成物の大きさは315塩基対であり、これはCCKの前駆体の配列上
のこれらの２つのオリゴヌクレオチドに対応する配列同士の間の距離である。
【００５９】 1.2.2 PCR反応 ５U/μlの酵素Taqポリメラーゼ Goldstar〔Reynier P., Pellissier J.F., Harle J.R., Malthiery Y.の論文、Biochemical and Biophysical Research Communication, 205(1), 375-380(1994)参照〕１μl、標準Taqポリメラーゼを10
倍に濃縮した緩衝液１μl及び水８μlを含有する希釈液Ｄ1を調製した。 次いで250ng/μlのオリゴCCK 5´１μl、250ng/μlのオリゴCCKアミド１μl、
それぞれ10mMのdNTP １μl、250ng/μlのcDNAバンク１μl、酵素Taqポリメラー ゼを10倍濃縮した緩衝液５μl、25mMのMgCl2 ２μl、希釈液Ｄ1 １μl及び水37 μlを混合した。 増幅条件は次の通りである：加熱処理を先ず95℃で５分間行い、次いで30サイ
クル反復する。変性は95℃で45秒間行い、ハイブリダイゼーションは60℃で30秒
間行い、鎖伸長は72℃で１分間行う。最後に、追加のサイクルを72℃で10分間鎖
伸長させることにより行なう。
【００６０】 1.2.3 結果 PCR反応の生成物の1/10を0.8％のアガロースゲル上を泳動させることによって
結果を読み取った。3,8-ジアミノ-5-エチル-6-フェニルフェナントリジニウムブ
ロミド（臭化エチジウム）の存在下で、分子量300の標識よりも若干大きい一つ の強いバンドが視覚化された。
【００６１】1.3 配列決定を可能にするベクター中へのPCR生成物のサブクローニング 用いたベクターはpGEM T-easy Vector〔PROGEMA Corporation(米国、Madison 所在）から販売されている、ref. A 1380 − その配列は付属書類Ｉに示した〕 であった。この工程は次の通りであった： − 電気溶出によるPCR生成物に対応するバンド(la bande)を精製し、 − 50ng/μlのベクター pGEM T-easy１μlと、10倍濃縮したリガーゼ緩衝液 １μlとを用いて16℃で一夜連結反応させ、 − 20ng/μlと推測される精製バンドの抽出生成物３μlミクロンを得、 − 水10μlで仕上げる。 JM 109細菌〔遺伝子型：el4-(McrA-) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rk -
mk+)supE44 relA1Δ(lac-proAB)[F´traD36 proAB lacIqZΔM15] - Yanish- Perron C., Viera J., Messing J.の論文、J. Gene, 33, 103-109 (1985)参照〕
をCaCl2で前処理することにより受容能をもたせ(rendues competentes)、次いで
連結反応物の1/5を用いて42℃で45秒間熱衝撃を加えることにより形質転換させ た。次いで、細胞をペトリ皿のLB-アンピシリン培地上で37℃で一夜培養した。 数個の組換えクローンのプラスミドDNAを調製した。次いで、得られたサブク ローンをEcoRIを用いて酵素消化することにより精査した。
【００６２】1.4 配列決定 配列決定は315塩基対のPCR生成物を組み込んだ(QIAGEN tip 100 kitを使用し て大規模に調製した)ベクター pGEM T-easy Vectorについてサンガー(Sanger)の
ジデオキシヌクレオチドを用いる慣用の方法で行った。配列決定に使用したプラ
イマーは前記pGEM T-easy Vectorプラスミド上に存在する普遍的オリゴヌクレオ
チドＴ7である。
【００６３】1.5 結果 下記の配列が得られた。
【００６４】 得られた配列をアミノ酸に翻訳した結果は、下記の通りであり、 これはCCKの前駆体のヌクレオチド配列(その配列はタンパク質データバンク Swiss prot no. p01355により提供されている)を認め得る。
【００６５】 アミノ酸の略語は次の通りである： アラニン Ａ ロイシン Ｌ アルギン Ｒ リシン Ｋ アスパラギン酸 Ｄ メチオニン Ｍ アスパラギン Ｎ フェニルアラニン Ｆ システイン Ｃ プロリン Ｐ グルタミン酸 Ｅ セリン Ｓ グルタミン Ｑ スレオニン Ｔ グリシン Ｇ トリプトファン Ｗ ヒスチジン Ｈ チロシン Ｙ イソロイシン Ｉ バリン Ｖ
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 マルテイネ，ジヤン フランス国 エフ−34570 ソーザン，シ ユマン デ ロマン（番地なし) (72)発明者 ゴゼ，カトリーヌ フランス国 エフ−34080 モンペリエ, リユ デ アヴアン−モン，33，バデイマ ン ８，レシダンス シヤトー ダルコ Ｆターム(参考） 4B063 QA13 QA18 QQ42 QQ53 QQ79 QQ94 QR08 QR31 QR55 QR62 QS25 QS34 QX07

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ９〜42個のヌクレオチドからなること及び次の配列： Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5 （式中、Ｙ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｙ1は削除されており、Ｙ2はGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3及び
    Ｙ4はそれぞれ独立してArg又はLysをコードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5
    は１〜21個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又はＹ5は削除さ れている）からなるオリゴヌクレオチドＯＹと温和な条件下でハイブリダイズで
    きることを特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチドＯＸ。
  2. 【請求項２】 ９〜42個のヌクレオチドからなること及び次の配列： Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5 （式中、Ｙ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｙ1は削除されており、Ｙ2はGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3及び
    Ｙ4はそれぞれ独立してArg又はLysをコードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5
    は１〜21個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又はＹ5は削除さ れている）を有するオリゴヌクレオチドＯＹとストリンジェントな条件下でハイ
    ブリダイズできることを特徴とする請求項１記載のオリゴヌクレオチドＯＸ。
  3. 【請求項３】 Ｙ1がオリゴヌクレオチドＯＹにおいて削除されているもので あることを特徴とする請求項１又は２に記載のオリゴヌクレオチドＯＸ。
  4. 【請求項４】 Ｙ5がオリゴヌクレオチドＯＹにおいて削除されているもので あることを特徴とする請求項１、２又は３に記載のオリゴヌクレオチドＯＸ。
  5. 【請求項５】 オリゴヌクレオチドＯＹにおいてＹ5が次のヌクレオチド配列： Ｙ6-Ｙ7-Ｙ8-Ｙ9 （式中、Ｙ6はSer、Thr又はTyrをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ7はア ミノ酸をコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ8はGlu又はAspをコードするト リヌクレオチドを表し且つＹ9は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド 配列を表す）を表すものであることを特徴とする請求項１、２又は３に記載のオ
    リゴヌクレオチドＯＸ。
  6. 【請求項６】 Ｙ1及びＹ9がオリゴヌクレオチドＯＹにおいて削除されている
    ものであることを特徴とする請求項５記載のオリゴヌクレオチドＯＸ。
  7. 【請求項７】 オリゴヌクレオチドＯＹであってＹ2がGlyをコードするトリヌ
    クレオチドを表し、Ｙ3がLysをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ4がArgを
    コードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5がSer-Ala-Gluをコードする３個のト
    リヌクレオチドからなる配列を表すものであるオリゴヌクレオチドＯＹとハイブ
    リダイズできることを特徴とする請求項６記載のオリゴヌクレオチドＯＸ。
  8. 【請求項８】 次の配列： Ｙ1-Ｙ2-Ｙ3-Ｙ4-Ｙ5 （式中、Ｙ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｙ1は削除されており、Ｙ2はGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3及び
    Ｙ4はそれぞれ独立してArg又はLysをコードするトリヌクレオチドを表し且つＹ5
    は１〜21個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又はＹ5は削除さ れている）を有する９〜42個のヌクレオチドからなることを特徴とする一本鎖オ
    リゴヌクレオチドＯＹ。
  9. 【請求項９】 Ｙ1が削除されているものであることを特徴とする請求項８記 載のオリゴヌクレオチドＯＹ。
  10. 【請求項１０】 Ｙ5が削除されているものであることを特徴とする請求項８ 又は９に記載のオリゴヌクレオチドＯＹ。
  11. 【請求項１１】 Ｙ5が次のヌクレオチド配列： Ｙ6-Ｙ7-Ｙ8-Ｙ9 （式中、Ｙ6はSer、Thr又はTyrをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ7はア ミノ酸をコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ8はGlu又はAspをコードするト リヌクレオチドを表し且つＹ9は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド 配列を表す）を表すものであることを特徴とする請求項８又は９に記載のオリゴ
    ヌクレオチドＯＹ。
  12. 【請求項１２】 Ｙ1及びＹ9が削除されているものであることを特徴とする請
    求項11記載のオリゴヌクレオチドＯＹ。
  13. 【請求項１３】 Ｙ2がGlyをコードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ3がLysを
    コードするトリヌクレオチドを表し、Ｙ4がArgをコードするトリヌクレオチドを
    表し且つＹ5がSer-Ala-Gluをコードする３個のトリヌクレオチドからなる配列を
    表すものであることを特徴とする請求項12記載のオリゴヌクレオチドＯＹ。
  14. 【請求項１４】 15〜39個のヌクレオチドからなること及びアミド化されたポ
    リペプチドホルモンに特有の共通シグナル配列と温和な条件下又はストリンジェ
    ントな条件下でハイブリダイズできるものであり、前記の配列が下記の式： Ｚ1-Ｚ2-Ｚ3-Ｚ4-Ｚ5-Ｚ6-Ｚ7 （式中、Ｚ1は１〜12個のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を表すか又は Ｚ1は削除されており、Ｚ2及びＺ3はLeuをコードする２個のトリヌクレオチドを
    表し、Ｚ4及びＺ5はアミノ酸をコードする２個のトリヌクレオチドを表し、Ｚ6 はLeuをコードするトリヌクレオチドを表し且つＺ7は１〜12個のヌクレオチドか
    らなるヌクレオチド配列を表すか又はＺ7は削除されている）を有するものであ ることを特徴とする一本鎖オリゴヌクレオチドＯＺ。
  15. 【請求項１５】 組み合わせライブラリーを構成するものであることを特徴と
    する請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドＯＸ又は請求項14
    記載のオリゴヌクレオチドＯＺ。
  16. 【請求項１６】 次の連続する工程：すなわち、 − DNAバンクを得； − 請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの１つ又はそれ以
    上を前記DNAバンクとハイブリダイゼションさせ； − 請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
    する前記バンクの１個又は複数個のDNA配列を同定し； − この１個又は複数個の配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有す るペプチドの１個又はそれ以上の前駆体を同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法。
  17. 【請求項１７】 ハイブリダイゼーション工程が請求項15記載の組み合わせラ
    イブラリーを使用するものであることを特徴とする請求項16記載の方法。
  18. 【請求項１８】 次の連続する工程：すなわち、 − DNAバンクを得； − PCR法を使用して、請求項１〜７のいずれか１項に記載の一群のオリゴヌク レオチドと請求項14記載の別の群のオリゴヌクレオチドとを用いて関心事の断片
    を増幅させ； − 請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
    する前記バンクの１個又は複数個のDNA配列を同定し； − この１個又は複数個の配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有す るペプチドの１個又はそれ以上の前駆体を同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法。
  19. 【請求項１９】 増幅工程が請求項15記載の組み合わせライブラリーを使用す
    るものであることを特徴とする請求項18記載の方法。
  20. 【請求項２０】 次の連続する工程：すなわち、 − DNAバンクを得； − PCR法を使用して、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチ ドの一群を用いて関心事の断片を増幅させ； − 請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
    する前記DNAバンクの１個又は複数個のDNA配列を同定し； − この１個又は複数個の配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有す るペプチドの１個又はそれ以上の前駆体を同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法。
  21. 【請求項２１】 増幅工程が請求項15記載の組み合わせライブラリーを使用す
    るものであることを特徴とする請求項20記載の方法。
  22. 【請求項２２】 次の工程：すなわち、 − DNAバンクを得； − PCR法を使用して、請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチ ドと、前記DNAバンクのDNAがクローン化されるプラスミドベクターの配列に含ま
    れる普遍的共通配列と温和な条件下又はストリンジェントな条件下でハイブリダ
    イズし得る別の一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば プライマー Ｔ3、Ｔ7、KS、
    SK、Ｍ13、Reverseとを用いて関心事の断片を増幅させ； − 請求項１〜７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズ
    する前記DNAバンクのDNA配列を同定し； − この配列において、可能なアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの１個 又はそれ以上の前駆体を同定する工程、 からなることを特徴とするアミド化されたＣ-末端を有するペプチドの前駆体の 同定方法。
  23. 【請求項２３】 増幅工程が請求項15記載の組み合わせライブラリーを使用す
    るものであることを特徴とする請求項22記載の方法。
  24. 【請求項２４】 DNAバンクが cDNAバンクであることを特徴とする請求項16〜
    23のいずれか１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】一本鎖オリゴヌクレオチドが標識剤、例えば32Ｐ又はジゴキシ
    ゲニンを用いて検出できるものであることを特徴とする請求項16〜24のいずれか
    １項に記載の方法。
JP2000507687A 1997-08-26 1998-08-07 アミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体を同定可能にするオリゴヌクレオチド Pending JP2001513981A (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR97/10643 1997-08-26
FR9710643A FR2767830B1 (fr) 1997-08-26 1997-08-26 Oligonucleotides permettant l'identification de precurseurs d'hormones polypeptidiques amidees
PCT/FR1998/001767 WO1999010361A1 (fr) 1997-08-26 1998-08-07 Oligonucleotides permettant l'identification de precurseurs d'hormones polypeptidiques amidees

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2001513981A true JP2001513981A (ja) 2001-09-11

Family

ID=9510493

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000507687A Pending JP2001513981A (ja) 1997-08-26 1998-08-07 アミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体を同定可能にするオリゴヌクレオチド

Country Status (22)

Country Link
US (1) US20020031765A1 (ja)
EP (1) EP1007532B1 (ja)
JP (1) JP2001513981A (ja)
KR (1) KR20010023284A (ja)
CN (1) CN1275988A (ja)
AR (1) AR016638A1 (ja)
AT (1) ATE238338T1 (ja)
AU (1) AU8989598A (ja)
BR (1) BR9811374A (ja)
CA (1) CA2301737A1 (ja)
DE (1) DE69813836T2 (ja)
DK (1) DK1007532T3 (ja)
ES (1) ES2198066T3 (ja)
FR (1) FR2767830B1 (ja)
HU (1) HUP0003567A2 (ja)
IL (1) IL134672A0 (ja)
IS (1) IS5383A (ja)
NO (1) NO20000889L (ja)
PL (1) PL339084A1 (ja)
PT (1) PT1007532E (ja)
WO (1) WO1999010361A1 (ja)
ZA (1) ZA987444B (ja)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002501616A (ja) 1997-05-19 2002-01-15 リプリゲン コーポレーション 自閉的症候群を鑑別診断および治療する際の助けとするための方法
US6507788B1 (en) * 1999-02-25 2003-01-14 Société de Conseils de Recherches et D'Applications Scientifiques (S.C.R.A.S.) Rational selection of putative peptides from identified nucleotide, or peptide sequences, of unknown function
DE10027025A1 (de) * 2000-05-31 2001-12-06 Merck Patent Gmbh Clycinamide

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6040140A (en) * 1991-12-11 2000-03-21 Thomas Jefferson University Methods for screening and treating leukemias resulting from all-1 region chromosome abnormalities
US5610054A (en) * 1992-05-14 1997-03-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecule targeted against Hepatitis C virus
US5756295A (en) * 1994-12-05 1998-05-26 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA primer and a method for screening DNAS

Also Published As

Publication number Publication date
US20020031765A1 (en) 2002-03-14
DE69813836D1 (de) 2003-05-28
ZA987444B (en) 1999-02-17
PT1007532E (pt) 2003-09-30
CN1275988A (zh) 2000-12-06
CA2301737A1 (fr) 1999-03-04
BR9811374A (pt) 2000-08-29
IS5383A (is) 2000-02-25
ES2198066T3 (es) 2004-01-16
AR016638A1 (es) 2001-07-25
EP1007532A1 (fr) 2000-06-14
FR2767830A1 (fr) 1999-03-05
DE69813836T2 (de) 2004-02-05
PL339084A1 (en) 2000-12-04
WO1999010361A1 (fr) 1999-03-04
EP1007532B1 (fr) 2003-04-23
FR2767830B1 (fr) 2000-02-04
DK1007532T3 (da) 2003-08-18
KR20010023284A (ko) 2001-03-26
AU8989598A (en) 1999-03-16
NO20000889D0 (no) 2000-02-23
IL134672A0 (en) 2001-04-30
ATE238338T1 (de) 2003-05-15
NO20000889L (no) 2000-04-14
HUP0003567A2 (hu) 2001-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105705656B (zh) 方法
JP4163001B2 (ja) Ｒｎａポリメラーゼから誘導されたポリペプチド及びそれらの使用
US6060596A (en) Encoded combinatorial chemical libraries
Smith et al. Sequence of the gene for iso-l-cytochrome c in Saccharomyces cerevisiae
US5789206A (en) Method for ligating adaptors to nucleic acids which methods are useful for obtaining the ends of genes
AU698174B2 (en) A gene expression system utilizing an RNA polymerase prebound to DNA
Yamamoto et al. cDNA‐derived amino acid sequence of L‐histidine decarboxylase from mouse mastocytoma P‐815 cells
Machlin et al. Nucleotide sequence and transcriptional start site of the Methylobacterium organophilum XX methanol dehydrogenase structural gene
ES2887078T3 (es) Variantes de ligasa diseñadas
JPH0670772A (ja) Ｔ７ｄｎａポリメラーゼ
US10883091B2 (en) DNA polymerase variant and application thereof
JPH10511554A (ja) 所望のペプチド混合物をコードするポリヌクレオチド混合物の制御された合成法
CN111454926A (zh) 一种优化的扩增目标核酸的聚合酶、复合体系及应用
US4842996A (en) Probes comprising modified adenine groups, their preparation and their uses
Lepage et al. Molecular cloning and localization of the human GAX gene to 7p21
JP2001513981A (ja) アミド化されたポリペプチドホルモンの前駆体を同定可能にするオリゴヌクレオチド
WO1989005857A1 (en) A METHOD OF SIMULTANEOUSLY PRODUCING A LARGE NUMBER OF Leu17-VIP-ANALOGS AND NEW Leu17-VIP-ANALOGS
CZ2000681A3 (cs) Oligonukleotidy dovolující identifikaci prekursorů amidovaných polypeptidových hormonů
JP2005512566A (ja) ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ変異体による核酸標識
JP2005512566A6 (ja) ＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｔｈｅｒｍｏｈｙｄｒｏｓｕｌｆｕｒｉｃｕｓＤＮＡポリメラーゼＩ変異体による核酸標識
MXPA00001978A (en) Oligonucleotides for identifying precursors of amidated polypeptide hormones
JPH0576399A (ja) イン ビトロで複製可能な核酸の製造方法
TWI337869B (en) Pharmaceutical composition and cleansing reagent comprising dendritic cell-specific icam-3 grabbing nonintegrin (dc-sign) and use thereof
CN117165551A (zh) 一种甲硫氨酸腺苷转移酶突变体及其应用
JPH057995B2 (ja)

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20050803

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080528

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080828

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080904

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080929

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081006

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20081028

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20081105

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090225