JPH10511554A

JPH10511554A - 所望のペプチド混合物をコードするポリヌクレオチド混合物の制御された合成法

Info

Publication number: JPH10511554A
Application number: JP8521037A
Authority: JP
Inventors: ゲイセン，エイチ．マリオ
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1994-12-30
Filing date: 1995-12-15
Publication date: 1998-11-10
Also published as: CA2208693A1; EP0800526B1; DE69530119T2; US5789577A; ATE235504T1; EP0800526A1; WO1996020947A1; DE69530119D1; AU4522196A

Abstract

(57)【要約】選択された個々のポリヌクレオチド、またはその混合物を得るための方法であって、ここでその各々はペプチドをコードし、そして混合物の少なくとも１つのポリヌクレオチドは標的特性を有するペプチドをコードする。混合物中に、検出可能で、回収可能で、かつクローン化可能な量で存在する本発明のポリヌクレオチドは、標的活性についてのスクリーニングのために、宿主生物中で発現される。本発明は、合成プールが小分けにされる割合を調整することにより、そして各カップリング工程で添加される活性化ヌクレオチドの割合を調整することにより、制御されたランダムポリヌクレオチドを合成し、所定のポリヌクレオチドの混合物を生成し、そして終止コドンの合成を避ける能力を特徴とする。標的特性を有するペプチドをコードするポリヌクレオチドは、選択され、そして配列決定されることができ、ペプチドのアミノ酸配列を推定する。

Description

【発明の詳細な説明】所望のペプチド混合物をコードするポリヌクレオチド混合物の制御された合成法発明の分野本発明は、所望のポリヌクレオチド混合物を得るための合成法に関する。より詳細には、本発明は、所望のペプチド混合物をコードするコドン配列を有するポリヌクレオチドの制御されたランダム混合物の調製法に関する。発明の背景小さなアミノ酸配列の全ての可能なバリエーションを合成するという概念が提唱されている。このようなペプチドは、ヒトの疾患の処置または診断において有用な生物学的に活性なペプチドについてスクリーニングされ得る。特定のペプチドの合成はルーチンであり得るとはいえ、必然的に手間がかかる。このことは、多数のペプチドのうちのどれが実際に所望の調製物であるかを事前に知らない状況において大きな実施上の問題を示す。全ての可能な候補を合成すること、および関係のあるアッセイ（特定の抗体との免疫反応性、特定のレセプターとの相互作用、特定の生物学的活性など）のいずれによってでもそれらを試験することは理論的に可能であるが、上記の方法を用いてそのように行うことは、無数のサルにより無数のタイプライターで有名なシェークスピア劇を作ることに匹敵する。一般に、個々のペプチドの合成によって、特定の目的のために適切なペプチドを探索することは、最も有望な成功しそうな配列について幾分先行知識がある場合にのみ行われている。従って、アッセイシステムにおいて試験するための多数のペプチドの合成を系統化する方法は、能率および経済的に非常に有利であり、そして所望の配列についてなにも知らない場合に外挿し得る。 H.M．Geysenら（J Immunol Meth(1987)102:259）は、アミノ酸の混合物から特定の位置でアミノ酸をカップリングすることにより合成ペプチドを作製するアプローチを考案した。このアプローチは、アミノ酸の全ての組み合わせを提供するが、約15残基より長いペプチドの混合物は、所望でない、より短いペプチドのかなりの量を不純物として有する。さらに、この制限のため、任意の特定の二次構造（例えば、α-ヘリックスとして）で、目的のシステムに試験ペプチドを提示することは不可能である。これは、特定の２次構造が優位になる前に、ポリペプチドの長さが少なくとも20または30残基を必要とするためである。代わりのアプローチはScottおよびSmith（Scott，J.K.およびSmith，G.P.，Sc ience （1990）249:386-390）により提案された。ペプチドが、繊維状のバクテリオファージの先端に存在する表面タンパク質をコードする遺伝子の一部としてコードされ得ることが提案された。内部で融合したランダムペプチドを含有する、この表面タンパク質の発現により、化学的なペプチド合成に関連したペプチド長の限界が克服される。さらに、ScottおよびSmithの方法を用いて、ランダムペプチドにランダムセクションの前後でさらなるアミノ酸配列を会合させて、試験システムへの提示のために特定の２次構造がランダムペプチドにより達成されるように、融合タンパク質全体の中で前後関係（context）を提供することができる。この方法はまた、選択されたペプチドの増幅（例えば、選択の後にバクテリオファージを増殖させることによる）、および配列決定（例えば、増幅されたファージ中の核酸挿入物を配列決定することによる）を促進する。 ScottおよびSmithは、ランダムなアミノ酸が合成されるためのコドンが、A、C 、G、およびTの混合物から各トリプレットの第１および第２の塩基をカップリングすることにより調製されることを提案した。最後の塩基は、GおよびTの混合物から、各塩基が同等の効率でカップリングし得る条件下でカップリングされ得る。しかし、ScottおよびSmithにより提案されたストラテジーは限界を有する。まず、「終止」コドン[TAG]が混合物中に現れることが確実となる。従って、「ランダム」ヘキサペプチドが要求される場合、生成したコドンの17%より多くが少なくとも１つの終止コドンを有する。コドントリプレットの最後の位置が２つのヌクレオチド（GおよびT）の内の１つに限定されるため、32種のコドンを合成することが可能であり、そのうち１つが最後の位置にGを有する終止コドン（TAG）である。従って、各位置について、31種のアミノ酸コドンのうちの１つまたは１つの終止コドンが合成され得、各トリプレットについてアミノ酸コドンを合成する確率は31/32（または96.9%）となる。しかし、ヘキサペプチドについては、例えば、終止コドンを含まない６-コドンポリヌクレオチドを合成する確率は82.7% （(96.7%)⁶）に減少する。従って、この方法により合成された６コドンポリヌクレオチドの約17%は、少なくとも１つの終止コドンを有し、そして完全に発現されない。アミノ酸は異なる数のコドンによりコードされる。遺伝コードの重複は、このストラテジーの使用において、6.4×10⁷の可能なヘキサペプチド（20⁶、ここで2 0は天然に存在するアミノ酸の数である）をコードするために、全部で1.07×10⁹ （32⁶、ここで32は可能なコドンの数である）の異なるコドン配列を作製することが必要であることを意味する。さらに、上記に概略したシステム下で、アミノ酸のメチオニンは、トリプレット[ATG]によってのみコードされ；しかし、セリンは３コドン、[TCT]、[TCG]および[AGT]によってコードされる。従って、所定のトリプレット位置でセリンを得る確率は、メチオニンを得る確率より３倍大きく、従って、ランダムペプチドの合成において、複数のコドンによりコードされるアミノ酸に対しての統計的な偏りを作り出している。発明の要旨本発明は、ペプチドが任意の所望の相対量で混合物中に存在するペプチドの混合物をコードし、そして発現するために作製され得るポリヌクレオチドの混合物の合成方法を包含する。この方法は、1)調製された樹脂の混合物を別々のプール（分割量(subamount)）に分割する工程；2)連続的な反応でヌクレオチドを反応させることにより樹脂上でコドン（すなわち、20種の天然に存在するアミノ酸を表すポリヌクレオチドトリプレット）を合成してコドン配列を得る工程；および 3)20のアミノ酸のそれぞれのためのコドンが所望の相対量（例えば、等量）で存在した時点でコドン配列の分割量を再び組み合わせる工程により実施される。これらの工程を反復して、１回の反復当たり１つのコドンずつコドン配列の長さを増加させ、そしてその結果、制御されたランダムな配列のより長いペプチドをコードするコドン配列が生成される。例えば、終止コドンの合成を避けるため、そして所定の位置で各アミノ酸をコードする確率を等しくするために、固相オリゴヌクレオチド合成樹脂を、20の分割量に分割し、そしてコドンをランダムなアミノ酸の各々について合成する（終止コドンの合成を特に避ける）。次いで、分割量を混合し、そして次回の合成のための調製において新しい分割量に再配分する。そのようにして、各分割量は樹脂に共有結合した個別のアミノ酸に対するコドンを有する。実施において、樹脂を20の分割量に分割することは、所望の長さの全てのポリヌクレオチドのライブラリーを生成するのに必要な、大量の樹脂を必要とするので、ランダムペプチドをコードする短いポリヌクレオチド（または未知の配列がわずかしかない、より長い配列）に対してのみ有用である。ヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチドを例として用いると、６つの位置での20の可能なコドンは、(20)⁶または6.4×10⁷の合成種の理論的な最小数を生じる。従って、１つの樹脂ビーズが各合成種についで平均に配分されると仮定すると、ランダムヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチド混合物をその上で「構築」するためには、6.4×10⁷の樹脂粒子の最小数が必要とされる。各カップリングサイクルの間で、樹脂は完全に混合されるため、個々の樹脂ビーズ上のそれぞれのポリヌクレオチドは、ほぼポアソン分布に従って分割量間でランダムに分布する（このプロセスの優れた近似）。ポリヌクレオチドの分布を計算するためのモデルとしてポアソン分布を用いると、予想される全ての合成されるポリヌクレオチドの約37% は、このライブラリーから失われる（すなわち、これらは０個の樹脂ビーズ上に事実上作られる、または事実上作られない）。従って、予想される6400万のポリヌクレオチドのうち2350万が失われる。一方、いくつかのポリヌクレオチドは、１つより多い樹脂ビーズ上で合成される。統計的には、百万より多くのポリヌクレオチドが４以上の樹脂ビーズ上で作製される。ライブラリーにおいて合成される１ポリヌクレオチド当たり平均100樹脂ビーズまでビーズ数を増加させると、特定のライブラリーに対する実質的に全ての可能なポリヌクレオチド配列が少なくとも50樹脂ビーズ上で作製され、そして160以上のビーズ上で作製されるポリヌクレオチドはないことになる。最終的な結果は、樹脂ビーズ間で、ポリヌクレオチドの濃度の広がりが存在することである。実用上の目的のためには、１ペプチド当たり100樹脂ビーズの選択が、有用なライブラリーを達成するのに十分である。この有用なライブラリーにおいて、意図される全てのポリヌクレオチドが合成され、そして混合物中に、検出可能でかつクローン化可能な量で存在する。本発明の場合のように、１樹脂当たり１より多いポリヌクレオチドが合成される時にもまたあてはまる。従って、実際には、それぞれの種の、検出可能でかつクローン化可能な量の合成のためには少なくとも２桁過剰の樹脂が必要とされ、そのため必要とされる樹脂全量は6.4×10⁹樹脂粒子となる。１ミリリットル当たり5×10⁵ 樹脂粒子の代表的な容量で、1.3×10⁴ml（または13L）の容量の樹脂が必要とされる；明らかに非実用的な状況である。本発明の利点は、支持樹脂を比較的少ない分割量（例えば、４または５の分割量）に分割することにより、樹脂の必要量が減少することである。必要な樹脂の最低量は、コドンを付加するための分割、カップリング、および分割量のプールのサイクルの反復と同じ回数、最小分割量ずつに分割され得る、調製された支持樹脂粒子の数である。好ましくは、樹脂粒子の量は、必要な最低樹脂量より２桁多い量を使用する。本発明の第１の目的は、既知の組成を有し、そして複数の異なるペプチドをコードする（好ましくは、標的特性を有する少なくとも１つの生物学的に活性なペプチドをコードする）ポリヌクレオチドの混合物を作製する方法を提供することであり、ここで、異なるポリヌクレオチドのそれぞれは検出およびクローン化に十分な量で存在する。本発明の特徴は、異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの混合物を調製する方法であり、ここで、混合物は検出可能で、回収可能で、かつクローン化可能な量のそれぞれのポリヌクレオチドを含有する。この方法は、以下の工程を包含する：まず、調製された支持樹脂を複数の既知の割合の分割量に分割する工程；次に、分割量の１つに、少なくとも１つの活性化されたヌクレオチドの混合物から第１の活性化されたヌクレオチドをカップリングする工程（ここで、混合物中のこの活性化されたヌクレオチドは、樹脂上の反応部位に対して既知の割合で存在し、かつカップリング混合物に存在し得る他の活性化ヌクレオチドに対して既知の割合で存在する）。このカップリング工程から、複数の異なる樹脂 −ヌクレオチド反応生成物が得られ、そしてこのカップリングは、カップリングが実質的に完了するような条件下で行われる。樹脂−ヌクレオチドの3'反応部位は、カップリング反応の後に脱保護されて、続くカップリング反応を受け得る。次の工程は、この分割量に少なくとも１つの活性化されたヌクレオチドの混合物からの第２の活性化されたヌクレオチドをカップリングする工程であり、ここで、各活性化ヌクレオチドは既知の割合で混合物中に存在し、そして複数の樹脂 -ヌクレオチド反応生成物が得られる。このカップリングは、カップリングを実質的に完了させる条件下で行われる。第２のヌクレオチドのカップリングの後、樹脂-ヌクレオチドの3'反応部位は脱保護されて、続くカップリング反応を受け得る。次の工程は、この分割量に少なくとも１つの活性化されたヌクレオチドの混合物からの第３の活性化されたヌクレオチドをカップリングする工程を包含し、ここで、各活性化ヌクレオチドは既知の割合で混合物中に存在し、そして複数の樹脂-ヌクレオチド反応生成物が得られる。このカップリングは、カップリングを実質的に完了させる条件下で行われる。第３のヌクレオチドのカップリングの後、樹脂−ヌクレオチドの3'反応部位は脱保護されて、続くカップリング反応または固相ポリヌクレオチド合成の当業者に公知の他の樹脂−ヌクレオチド混合物の処理を受け得る。第１、第２、および第３の活性化ヌクレオチドのカップリングに関しての上記の工程におけるように、活性化ヌクレオチドの混合物から残りの分割量のそれぞれに活性化ヌクレオチドをカップリングし、樹脂-ヌクレオチド混合物を得る。分割量のそれぞれへのカップリングの反応生成物を合わせて、樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の制御されたランダムな混合物を生成する。合わせた分割量の制御されたランダムな混合物を用い、そして分割する工程；第１、第２、および第３の活性化ヌクレオチドを各分割量にカップリングする工程；および合わせる工程を、ポリヌクレオチドの制御されたランダムな混合物が得られるまで順序正しく繰り返し、ここで、各ポリヌクレオチドは、所望の数のアミノ酸をコードする。樹脂-ヌクレオチド反応生成物のランダムな混合物の組成物は、その樹脂- ポリヌクレオチド生成物の少なくとも１つのコドン位置で天然に存在する各アミノ酸の実質的に等量を含む。別の目的は、任意の所望の相対量で存在するペプチドを有するペプチドの混合物を得るために、合成されたコドン配列を検出し、クローン化し、そして発現することである。本発明の別の目的は、本発明の方法により合成されたRNAまたはDNAを、RNAまたはDNAをペプチドとして発現することなく使用することである。例えば、RNAは、目的のRNAまたはDNAをハイブリダイズするのに使用され得；本発明の方法により合成されたDNAは、プローブとして、プライマーとして、および遺伝子に作動可能に結合した場合、プロモーターの最適化に有用な配列として使用され得る。本発明の利点は、反応条件を調節し、そして反応速度における差を考慮して調節される相対量で、プールに添加される各活性化ヌクレオチドの過剰量を添加することにより、個々のプールにおいて、カップリング反応を完了させ得ることである。本発明の特徴は、コドンの合成が制御され、そして所望の場合には終止コドンを導入することができるが、所望されない場合は避けられ得るように、合成プロトコルが設計されることである。本発明の別の特徴は、各合成の反復に対して、異なるコドン合成スキームが用いられ得ることである。分割量の数は、反復毎に変化し得、ポリヌクレオチド混合物の設計における最大のフレキシビリティーを可能とする。本発明の別の特徴は、アミノ酸配列におけるヘアピン形成のように、ポリペプチド合成において観測される、配列に依存する困難を回避し得ることである。本発明の別の目的は、ポリヌクレオチドの複雑な混合物（混合物の組成はプロトコルに基づいて既知である）を含有する組成物を生成するための特異的合成プロトコルを考慮した方法を提供することである。そのため、合成の後の混合物の特徴付けの必要性が排除される。本発明の別の特徴は、制御されたランダムポリヌクレオチドのライブラリーを生成するのに必要な支持樹脂量の、以前の方法により同じライブラリーを生成するのに必要な支持樹脂量と比べての低減である。さらに、本発明の別の目的は、ペプチドをコードするポリヌクレオチドの混合物(この混合物は所望の標的特性を有するペプチドをコードする)を生成するための方法を提供することである。本発明の別の特徴は、ポリヌクレオチドの混合物（所定のヌクレオチド配列を有し、ランダムペプチドをコードし、そして開示されたプロセスにより生成される）中で、各ポリヌクレオチドが、検出可能で、かつクローン化が可能な量でそれぞれ存在することである。本発明の特徴は制御されたランダム化されたポリヌクレオチドのコドンのそれぞれで、各アミノ酸が等モル量のような制御可能な量でコードされることである。本発明の別の特徴は、本発明の方法の生成物が、非リボリン酸骨格を有するポリヌクレオチドであり得ることである。代わりの骨格構造は、プリンおよび／またはピリミジン塩基を側鎖として有するペプチド骨格、およびプリンおよび／またはピリミジン塩基を側鎖として有するペプトイド骨格（Hanvey，J.C.ら、(199 2)Science 258:1481-1485; Zuckerman，R.ら、1993年9月24日出願のWO94/06451 、プリンおよびピリミジン側鎖が非リポリン酸骨格に付加され得ることを示す目的に限定して、本明細書中で参考として援用される）を包含するが、これらに限定されない。本発明の利点は、ポリヌクレオチド混合物において、ランダムペプチドをコードする非常に多数の異なるポリヌクレオチドの生産が可能であることである。このポリヌクレオチドは、次いでクローン化され、インビボまたはインビトロで発現され、そして特定の標的特性を有するペプチドの存在についてスクリーニングされ得る。本発明の別の利点は、非常に多数のペプチドが、それらをコードするポリヌクレオチドを生産するための少ない処理工程を利用して生産され得ることである。本発明の別の利点は、従来の化学的なペプチド合成により可能であるよりも、多数の長いペプチドをより迅速かつ効率よく生成する能力である。本発明のこれらおよび他の目的、利点、および特徴は、以下により完全に示す合成および利用の詳細を読むことで当業者に明らかとなる。詳細な説明ペプチドをコードするポリヌクレオチドの混合物を作製する本発明の方法、およびポリヌクレオチドの複雑な混合物の組成を決定するプロセスを説明する前に、本発明は、記載される特定のポリヌクレオチド、アミノ酸、樹脂、ペプチド、またはプロセスに限定されず、反応物およびプロセスは勿論変化し得ることが理解されるべきである。本明細書中で用いた用語は特定の実施態様のみを説明する目的のためであり、そして限定を意図しないこともまた理解されるべきである。本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ制限されるからである。本明細書および添付の請求の範囲において用いられるように、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈上が明らかにそうでないことが示されない限り、複数の指示対象を包含することに留意すべきである。従って、例えば、「ポリヌクレオチド（単数）」または「ペプチド（単数）」への言及は多くの同じ配列のポリヌクレオチド（複数）または同じ配列のペプチド（複数）を包含し、そして「the process」または「the step」への言及は、本明細書中に記載される一般的なタイプの別のプロセス（複数）および工程（複数）を包含する、などである。定義本発明と関連して用いられるように、「調製された樹脂」は、その表面上に活性化ヌクレオチドと反応しそして共有結合を形成するアクセプター基を有する固体支持材料を意味する。このような固体支持材料の限定しない例として、種々の支持樹脂および支持樹脂へのコネクター、例えば、光分解性のDKP-形成リンカー（DKPはジケトピペラジン；例えば、本明細書中に参考として援用されるWO90/09 395を参照のこと）、TFA分解性リンカー、HF分解性リンカー、フッ化物イオン分解性リンカー、還元的分解性リンカー、および塩基に不安定なリンカーが挙げられる。アクセプター基としては、本発明の方法により活性化ヌクレオチドが結合し得る、ヌクレオチド、またはリーダーヌクレオチド配列のような共有結合した化合物が挙げられ得る。さらに、用語「ヌクレオチド誘導体化された樹脂」は、5'ヌクレオチド末端が樹脂に共有結合し、かつ3'ヌクレオチド末端が次のヌクレオチドの5'反応位置へのカップリングのために活性化されているアクセプターポリヌクレオチドの混合物を意味する。従って、このような「ヌクレオチド樹脂」または「調製された樹脂」は一般に、さらなるヌクレオチドがそれらの3'末端に付加され得ることを意味する「アクセプター」であるとして分類される。さらに、「単一」の化合物として記載されない限り、開示された化合物はポリヌクレオチドまたは樹脂の混合物（すなわち、単一の化合物から重合によって生成される不均一な化合物の群）である。不均一な群または混合物は、化合物の統計的混合物（すなわち、比例的な量の範囲にわたる異なる化合物の範囲）を含む。用語「活性化ヌクレオチド」は、樹脂またはヌクレオチド誘導体化された樹脂と、3'ヒドロキシル基でなく5'ヒドロキシル基がアクセプター樹脂と共有結合形成が可能である条件下で反応し、そして共有結合するヌクレオチドを意味する。活性化ヌクレオチドは、保護基（例えば、ジメトキシトリチル、DMT）により3' ヒドロキシルで保護され、所定の単一段階での複数のカップリング反応を避ける。従って、「アクセプター」および「アクセプター樹脂」のような用語は、3'ヒドロキシル基で脱保護されたヌクレオチドの3'ヒドロキシル基と反応しそして結合する活性化化合物を言い、他方、「ヌクレオチド」および「活性化ヌクレオチド」のような用語はヌクレオチドの5'ヒドロキシル基の活性化を言い、このようなヌクレオチドが樹脂の反応基と反応し、そして共有結合を形成することを示す。3'から5'への合成（すなわち、逆合成）もまた、本発明の方法により可能であり、従って「アクセプター」および「活性化ヌクレオチド」の定義を変えることに留意するべきである。固相合成を行う上で有用である活性化基および保護基ならびに保護および脱保護反応は、固相ヌクレオチド合成の当業者に周知である。「保護基」は、結合される元素（通常、酸素または窒素）が所望でない反応および結合に（通常合成反応に）関与するのを妨げ得る任意の基を意味する。このような基ならびにその調製および導入は従来技術であり、そして塩、エステルなどを含む。「プリンおよびピリミジン塩基」としては天然のヌクレオシド塩基（例えば、 A、T、G、CまたはU）が挙げられ、そして１つまたはそれ以上のアルキル、カルボキシアルキル、アミノ、ヒドロキシル、ハロゲン（すなわち、フルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨード）、チオール、またはアルキルチオールにより置換されたプリンおよびピリミジンを含むその誘導体（ここで、アルキル基は１個〜約６個の炭素原子を含む）もまた挙げられる。プリンおよびピリミジンの限定しない例としては、2,6-ジアミノプリン、5-フルオロウラシル、キサンチン、ハイポキサンチン、8-ブロモグアニン、8-クロログアニン、8-アミノグアニン、8-ヒドロキシグアニン、8-メチルグアニン、8-チオグアニン、2-アミノプリン、5-エチルシトシン、5-メチルシトシン、5-ブロモウラシル、5-エチルウラシル、5-ヨードウラシル、5-プロピルウラシル、2-メチルアデニン、メチルチオアデニン、N, N-ジメチルアデニン、8-ブロモアデニン、8-ヒドロキシアデニン、6-ヒドロキシアミノプリン、6-チオプリン、4-（6-アミノヘキシル／シトシン）などが挙げられる。本発明は、ヌクレオチド合成の従来の固相法の使用を包含し得、この方法は延長するヌクレオチドの3'末端にヌクレオチドを付加する化学を用いて、この開示において示される。本発明が容易に他の合成法（液相法を含む）および他の化学に拡張され得ることは当業者に明らかである。例えば、延長するポリヌクレオチドの5'末端に塩基が付加される、より一般的な方法を使用して、塩基は以下の実施例で与えられるものとは逆の順序でカップリングされる。さらにこれらの実施例は「ユニバーサル遺伝コード」を用いる。本開示を読むことにより、本発明は種々の遺伝コードに適用され得ることもまた明らかである。ポリヌクレオチド配列の「検出可能で、回収可能で、かつクローン化可能な量」は、当業者に周知の従来の化学的および分子生物学的方法により、観測され、回収され、そして操作され得る量を意味する。具体的な方法としては、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅による検出が挙げられる。「標的」性質または特性は、ペプチドまたはペプチドファミリーより示されることが所望される生物学的または物理的特性（例えば、特異的結合特性、収縮活性、基質としての挙動、遺伝子レギュレーターとしての活性など）を言う。本明細書中に記載される固相合成の方法論は液相合成に適用され得、ここでアクセプターヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、活性化ヌクレオチドの適切な混合物との反応のための混合物として供給される。いずれか、または両方の混合物は、速度定数の差を考慮して濃度調整される。「カップリング」は、アクセプター分子とドナー分子との反応を意味し、ここで、以下の実施例におけるアクセプター分子は、成長配列の5'ヌクレオチドであり、そしてドナー分子は、反応の後に成長鎖の3'ヌクレオチドになる活性化ヌクレオチドである。この3'ヌクレオチドは次の鎖伸長反応において5'ヌクレオチドになる。活性化ヌクレオチドまたはヌクレオチド混合物は、各分割量においてヌクレオチド誘導体化またはポリヌクレオチド誘導体化された樹脂の全てとのカップリング反応が実質的に完了するような量および条件下で添加される。その後、分割された分割量のそれぞれのポリヌクレオチドを、最終合成コドンにおける各アミノ酸の実質的に等量をコードするポリヌクレオチドの混合物を提供するために、合わせる。カップリング反応は当業者に公知の技術を用いて、完了についてモニターされ得る。「実質的に完了」は、所定の合成工程における過剰の活性化ヌクレオチドの条件下で反応し得る、利用可能な反応性5'アクセプター分子の98%またはそれ以上の反応、および好ましくは全ての反応を意味する。「実質的に等モル」は、当業者の実施の範囲内で同じモル量（互いにモル量で 50%以内、好ましくは20%以内、より好ましくは10%以内）で存在する、樹脂、ヌクレオチド、または他の薬剤を意味する。「天然に存在するアミノ酸」は、産物ポリヌクレオチドが発現される所定の宿主またはインビボ反応により天然に合成される20のL型アミノ酸のうちの１つを意味する。本明細書中で開示されるスキームおよび実施例は、当業者に指標を与える目的で、天然に存在するアミノ酸を使用する。この20の天然に存在するアミノ酸は、Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr 、Asn，Lys、Val、Ala、Asp，Glu、およびGlyである。変異宿主において、またはインビトロ発現系において与えられるコドンによりコードされる任意のアミノ酸誘導体は、所望なら置換され得る。「インビボにおける発現」または「宿主における発現」は、本発明の方法により合成されるランダムポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を意味する。発現の前に、それぞれのランダムポリヌクレオチドに対する相補鎖が当該分野で周知の分子生物学的技術により合成され、二本鎖DNAを生産する。これに続いて、この二本鎖ランダムポリヌクレオチドは発現ベクター中にクローン化され、次いで、このランダムポリヌクレオチド配列は、これもまたランダムなアミノ酸配列を有するペプチドへと転写および翻訳することが可能な宿主生物に導入される。「インビトロにおける発現」は、本発明の方法によりランダムポリヌクレオチドを提供し、次いで各ポリヌクレオチドの相補鎖を合成して二本鎖DNAを生成することを意味する。これに続いて、当業者に周知の標準的なインビトロ発現系によりランダムポリヌクレオチト配列を発現する。「A、T、C、G、U」は、それぞれアデニン、チミン、シトシン、グアニン、およびウラシル、ならびにその活性化されたヌクレオチド誘導体を意味する。「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」は、第１のヌクレオチドの3'ヒドロキシル位および第２のヌクレオチドの5'ヒドロキシル位で共有結合した、少なくとも２つのヌクレオチドの鎖を意味する。用語、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドはまた、非リボリン酸骨格を有するオリゴマーを包含する。このような非リボリン酸骨格構造は、プリンおよび／またはピリミジン塩基を側鎖として有するペプチド、またはペプトイド骨格（Zuckerman，R．N.ら、J. Med．Chem．37:2678-2685）を含むが、これらに限定されない。「アンバー終止コドン」は、コドンTAG（転写形態においてUGA）を意味し、これは細菌において転写されないが、転写の終結をコードする。特定のアミノ酸またはアミノ酸誘導体を担当するTRNAを産生する細菌変異体は、アンバーコドンでアミノ酸またはアミノ酸誘導体を挿入し得、従って所定の位置で挿入され得るアミノ酸の種類を増加する。「生物学的活性」または「標的活性」は、産物（ポリヌクレオチド、ペプチド、またはペプトイド）が所望のタンパク質（例えば、抗体）、ペプチド、核酸に結合して所望の活性を生じる能力を意味する。発明の実施の形態合成オリゴヌクレオチドは、当該分野に公知の、任意の従来の方法（例えば、 Matteucciら、J ．Am Chem Soc(1981)103:3185のトリエステル法）によるか、または市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機を用いて調製され得る。一般に、適切な樹脂または他の固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドを合成することが、現在好ましい。この支持体は、好ましくは、容易に分割され、そして分別し得る微細分割形態、または微粒子形態（小さな球状のビーズ）で供給される。まず、適切な量の支持材料を、当該分野で公知の方法によってカップリングのために調製する。例えば、後でベクターへの連結を促進するための制限酵素認識部位をコードするリーダーを提供するために、短いリーダーヌクレオチド配列を結合または合成し得る。リーダーはまた、PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）プライマーのための便利なハイブリダイゼーション部位として作用し得、ポリヌクレオチド産物の増幅を促進し得る。所望なら、支持粒子および／またはポリヌクレオチドの異なる部分の間を区別するための手段を提供するために、多くの異なるリーダーが使用され得る。リーダー配列は、その代わり、あるいはそれに加えて、切断部位を提供し得、酵素的または化学的手段による支持粒子からのポリヌクレオチドの切断を促進し得る。本発明によれば、調製された支持体は、選択されるスキームに応じて４つまたは５つの部分のいずれかに分割され得る。各制御されたランダム化された位置でアミノ酸の実質的に等モルの混合物を表すコドンをコードするポリヌクレオチドをそれぞれ産生する５つのスキームを、以下、提供する。１つのスキームは終止コドンを含むが、残りは特に終止コドンの合成を避ける。既知の組成を有し、そして標的特性を有するペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、異なるコドン配列を有するヌクレオチドの混合物を調製する方法が開示される。この方法は以下のような、３つの必須工程を包含する： (1)調製されたヌクレオチド誘導体化またはポリヌクレオチド誘導体化樹脂の混合物の所定量を、多くのプール（または分割量；好ましくは20、より好ましくは４または５の分割量）に分割する。各プール（または分割量）は制御された量（例えば、実質的に等モル量）の各樹脂を含有するか、または異なるモル量の各樹脂を含む（ここで、分割量のモル比は既知であり、そして制御されている）； (2)ヌクレオチドの混合物からの単一の活性化されたヌクレオチドを、工程(1) において作製されたそれぞれのプール（または分割量）における各樹脂にカップリングし、そしてカップリング反応を完了させて樹脂-ヌクレオチド反応生成物を得る； (3)ヌクレオチドの混合物からの第２の単一の活性化されたヌクレオチドを、工程(1)において作製されたそれぞれのプール（または分割量）における各樹脂にカップリングし、そしてカップリング反応を完了させて樹脂-ヌクレオチド反応生成物を得る； (4)ヌクレオチドの混合物からの第３の単一の活性化されたヌクレオチドを、工程(1)において作製されたそれぞれのプール（または分割量）における各樹脂にカップリングし、そしてカップリング反応を完了させて樹脂-ヌクレオチド反応生成物を得る； (5)工程(2)から(4)において得られた、それぞれのプールにおいて得られた樹脂-ヌクレオチド反応生成物を、次いで、共に混合し、既知の組成のポリヌクレオチド混合物を得る（すなわち、各コドン位置で、天然に存在する20アミノ酸をコードするコドンをそれぞれ実質的に等量含む）；および (6)工程(5)で得られた混合物を上記(1)で出発物質として用い、そしてポリヌクレオチドのランダムな混合物（それぞれ所望の数のアミノ酸をコードする）が得られるまで工程(2)から(5)を反復する。２つの重要な点を重要視すべきである：(a)工程(1)から(5)を任意の回数で反復して、ポリヌクレオチド鎖を延長することができる。および(b)延長されたポリヌクレオチドの各コドンは、工程(5)でのコドンの合計が20のアミノ酸のそれぞれを既知の量（例えば、実質的に等量で）コードするように生成されるか；または各部位について所望のように20アミノ酸のサブセットをコードするように生成される。多様なポリペプチドおよび混合物の合計（amounts）は、次の活性化ヌクレオチド添加について独立にアクセプターとして使用され得、延長されたポリヌクレオチドアクセプターを作製し、これは、再混合および分割され得る。この方法は多数のポリヌクレオチド（それぞれ異なる配列を有する）を検出可能でかつクローン化可能な量で生産するため、この方法は、大きな群のポリヌクレオチドを得るための非常に強力な道具である。このポリペプチドを、クローン化し、発現して、ペプチド混合物を得ることができる。このペプチド混合物は、所望の標的生物学的特性を有するペプチドについてスクリーニングされ得る。混合物中で所望のポリヌクレオチドを検出し、そして当業者に公知の方法によりヌクレオチド配列の決定のような分析を行うための方法が用いられ得る。工程 (2)から(4)において、各プール中で十分なポリヌクレオチドを生成するように、十分な量の活性化ヌクレオチドが添加され、その結果プールが工程(5)において合わせられる場合、得られる混合物中の各ポリヌクレオチドはその混合物中に検出可能でかつクローン化可能な量で存在する。本発明は、多数のポリヌクレオチド配列の混合物の実用的な合成を、意図する目的のための予測可能でかつ定義された量で（統計的に受容可能な変動内で）可能にする。さらに、本発明はこの混合物が、個々にまたは群としてクローン化され、発現され、そして所望のペプチドについてスクリーニングされるか、または選択されることを可能にする。本発明はまた、これらの選択されたポリヌクレオチドの配列の決定を可能にする。なぜなら、所望なら、これらは個々に多量に合成され得るからである。多くのポリヌクレオチドの混合物が使用されるため、標的生物学的活性について必要とされる配列の性質に関する偏った仮定が回避される。しかし、ペプチドについての情報（例えば、鎖の所定の位置でのアミノ酸残基）が既知であれば、その情報は、ポリヌクレオチド中の正しい位置で正しいコドンを合成する（これは、その位置にあることが既知のアミノ酸をコードする）ことにより、本発明の方法において容易に使用され得る。従って、１つの局面においては、本発明はランダムペプチドをコードする定義された組成のポリヌクレオチドの混合物を合成する方法に関する。混合物中のポリヌクレオチドの各コドンの相対量は、上記の工程(2)、(3)および(4)における活性化ヌクレオチドの混合物中、各ヌクレオチドのモル比を変化させることにより制御され得る。混合物中のポリヌクレオチドの各コドンの相対量はまた、上記の工程(1)または(6)、または続く工程(11)、(16)、(21)などにおけるそれぞれのプールまたは分割量において、出発樹脂のモル比を変化させることにより制御され得る。本発明の方法は全てのカップリング反応を完了させる条件下で実施されるので、アクセプターが、全ての活性化ヌクレオチドとの反応について同じ相対反応速度を有するか否かには無関係となる。相対速度定数の違いは、得られるポリヌクレオチドの混合物の組成に影響する因子ではない。本発明の合成方法は最も一般的かつ実用的には固体支持ポリヌクレオチドを用いて行われるが、液相合成に対して用いることができない理由はない。液相合成では、アクセプターヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは5'ヒドロキシル基で単にブロックされる。別の局面においては、本発明は所望の「標的」生物学的活性を有する混合物の成分（個別にまたはファミリーとして）を選択する方法に関する。これらのポリヌクレオチドについての配列情報もまた得られ得る。従って、本発明はまた、元々の組成物から所望のポリヌクレオチドを分離する方法に関する。これは、選択された部分との結合（例えば、合成されたポリヌクレオチド上のリーダー配列と、分離のためのカラム中における相補的な配列との相互作用）のような、成分の物理的な分離を生じる条件下で、識別的挙動をもたらすことを伴う。分離は、合成されたポリヌクレオチドを含むベクターがインビボまたはインビトロでの発現の後に単離されるように、最初の混合物またはクローン化された種について行われ得る。別の局面においては、本発明は、ポリヌクレオチド配列決定のために増幅されるように本発明のポリヌクレオチドをクローン化する方法に関する。本発明の方法により合成されたポリヌクレオチドはまた、ランダムペプチドの所望の混合物が所望の「標的」活性の試験のために生成されるように、宿主（インビボ）またはインビトロにおけるポリヌクレオチドの発現のための適切なクローン化ベクター中にクローン化され得る。上記の局面に加えて、その種々のさらなる組み合わせが有用である。所望のポリヌクレオチドの生成一般的に、本発明の最終目標は、「標的」活性（例えば、特異的なレセプターまたは酵素と結合する能力、特定の抗体との免疫反応性など）を有する、特異的なペプチド配列の１つまたはファミリーを得る方法を提供する。この目的を達成するために、本発明は、その全体が20種類の天然アミノ酸を表すコドン（または、所望のサブセット）を、制御された量、好ましくは、実質的に等モル量で含有するポリヌクレオチドを合成する手段を提供する。本発明は、さらに、ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列がランダムであることを提供する。本発明は最も好ましくは、以下の局面を包含する：（ａ）所望のペプチドのコドン配列を推定上含む、多くのポリヌクレオチドの混合物の調製：（ｂ）コードされるランダムペプチドの発現および所望の特性の選択のための、混合物からのポリヌクレオチドの検出、回収および／またはクローニング；ならびに（ｃ）ヌクレオチド配列を決定し、そして選択されたペプチドのアミノ酸配列をヌクレオチド配列から推定するための、選択されたペプチドをコードするポリヌクレオチドの分析。この情報を用い、所望の特性を有する、ポリヌクレオチドまたはコードされる選択されたペプチドを、当業者に周知の方法により多量に合成し得る。本発明の本質は、上記の工程(１)〜(６)で実行される調製（ａ）にある。混合物が検出可能な量の各々の異なるポリヌクレオチドを含んで生成されなければ、ポリヌクレオチドを検出し得ず、そして(ｂ)において上記したような検出なしには、(ｃ)において上記したような分析を実行し得ない。ポリヌクレオチドの複雑な混合物を選択のための出発物質として合成するので、生物学的に活性な産物の配列を知ることは必要でない。本方法はまた、所望のポリヌクレオチド配列に関する予備的推測が合理的に行われ得る場合にも適用可能である。実際に、所望の配列の性質に関する妥当な推測を行う能力は、本発明の方法の利点である。しかし、所望のポリヌクレオチドに関して、そして最終的に「標的」生物学的活性を有する所望のペプチドに関してあまり知られていない場合に、先行技術に対する本発明の利点はさらに強調される。例示のために20種の天然アミノ酸のみを使用すると、ヘキサペプチド（例えば、その中の各アミノ酸が独立してこれらのアミノ酸の１つである）をコードするポリヌクレオチドの混合物は、(20)⁶または6.4×10⁷の可能なメンバーを含む。従って、ヘキサペプチドを各々コードする6.4×10⁷個の異なるポリヌクレオチド配列の合成が必要であり、これらのヘキサペプチドの１つは生物学的活性（例えば、モノクローナル抗体のエピトープに結合する）を有する。このようなヘキサペプチド混合物の合成手順は、Geysen，H.M.,ら（J Immmunol Meth(1987)102:259）に例示され、この手順は、樹脂混合物をプールし、そして細分化して、各部位に 20種の天然アミノ酸のいずれかを含有するペプチド（例えば、ヘキサペプチド）配列を生成するプロセスを用いる。アミノ酸配列合成のこの方法において、樹脂のプールは、20の部分に分割され、この各部分を異なるアミノ酸と完全に反応させる。このプールを混合し、そして次のアミノ酸とカップリングするために、20 の部分に再分割する。これらの工程を、20⁶種のヘキサペプチドの混合物が生成されるまで繰り返す。樹脂をより少数の部分に細分化し、そしてペプチドではなくポリヌクレオチドを合成することに関する本発明の利点は、本明細書中に記載されている(上記)。所望のメンバーのクローニングおよび分析のための手順に供されるために、本発明のポリヌクレオチド混合物は、選択および分析を可能にするように各メンバーを十分に提供しなければならない。現在の必要条件を用いて（利用可能な選択および分析技術の制限によって課せられる）、ポリヌクレオチドをPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅し、各ポリヌクレオチドから二本鎖種を生成し、そして便利なクローニングのための総量を増加させるためには、約0.01pmolの一本鎖ポリヌクレオチド（この例の場合、18mer）を必要とする。次に、二本鎖ポリヌクレオチドは、コードされるランダムペプチドの発現のために、宿主生物においてクローン化され、そして増幅され得る。インビトロ増幅およびインビトロ発現のための発現系は、当業者に周知のE.coliまたは酵母におけるプラスミドベクター発現を包含するが、それに限定されない。二本鎖ポリヌクレオチド（例えば、RNA ）の発現は、当業者に周知のインビトロ発現系（例えば、ウサギ網状赤血球翻訳系（Promega.，Inc．Madison,WI）））を用いてインビトロで行われ得る。本発明の利点は、ポリリボヌクレオチドを、アンチセンスRNAについてのスクリーンニングにおいて、またはリボザイム活性を有するRNAのスクリーンニングのために使用されるべきRNA配列のランダム混合物の調製のために合成し得ることである。本発明の重要な特徴は、その中でアミノ酸が制御可能な相対量（例えば、実質的に等モル量）で表される20種類の天然アミノ酸の各々を表すコドンを有する、多数の異なるポリヌクレオチドを合成する能力である。樹脂ビーズとヌクレオチド混合物との反応、樹脂の分割、および樹脂をプールするプロセスの結果として、複数のポリヌクレオチド配列が、各樹脂ビーズに付着される。この複数のポリヌクレオチド配列は、樹脂材料上にランダムに分布する。本発明の方法は、本発明の方法によって合成された配列の一端または両端での任意のポリヌクレオチド配列のカップリングを可能にするという利点を有する。例えば、任意の配列は、その配列が二本鎖で作製される場合、制限酵素切断部位を提供し得る。任意の配列はまた、PCR増幅のためのプライマーのハイブリダイゼーションのための部位を提供し得るか、または融合ペプチドとして、ランダムに合成したペプチドと共に発現される、分離したトレース可能な（traceable）ペプチドをコードし得る。本発明の方法によって合成され、そして当業者に周知の方法によって二本鎖にされる配列の混合物を、平滑端連結によって結合し、さらにこの混合物をランダムにし、そしてポリヌクレオチド配列を長くし得る。本発明のポリヌクレオチド混合物はまた、特定のタンパク質ドメインの活性を最適化する目的または分析する目的で、公知の遺伝子中にクローン化され、公知のタンパク質の位置をランダムにし得る（Ladnerら、米国特許第5,223,409号：これは1993年６月29日に発行され、組換えタンパク質の発現および選択された細菌細胞、細菌胞子またはファージの外部表面上でタンパク質の潜在的な結合ドメインの提示を記載するために本明細書中に参考として援用される）。本発明の方法は、合成支持体または樹脂を比較的少量の分割量（subamount）（好ましくは、４分割量または５分割量）に分割することを教示すること、および活性化ヌクレオチドの混合物から活性化ヌクレオチドを制御されたモル比でカップリングすることによって、多数の配列を合成するのに必要な樹脂量を低減する利点を提供する。以下のスキームはこの利点に関する例示を提供するが、いかなる方法においても本発明を制限するとして解釈されない。実施例下記のスキームおよび関連の実施例を当業者への指針として提供するが、これらはいかなる場合においても本発明を制限するものとして解釈されない。各スキームおよび各実施例は、固体支持体樹脂を用いて開始し、これは既知の割合に分割され、３工程で既知の割合で活性化ヌクレオチドとカップリングされ、新たなコドンを形成する。この樹脂部分を再び組み合わせてコドンの混合物を提供し、そしてこの混合物は、新たなコドンの次の付加のために再分配される。分割、カップリング、および再組み合わせを、所望の数のコドンが樹脂に結合されるまで続ける。スキーム１合成支持体樹脂を４つの非等量の分割量（モル比6:3:7:5を有する）に分割する。この比は、コドン合成サイクルの終了時に各分割量で存在するコドンの数に対応する。第１の分割量（モル比６）にヌクレオチドＴをカップリングさせ；次に実質的に等モル量でＡ、ＴおよびＧの混合物をカップリングさせ；次に実質的に等モル量でＧおよびＴの混合物またはＧおよびＣの混合物をカップリングさせる。これは、以下の６つのコドン：TAG、TAT、TTG、TTT、TGGおよびTGT（または TAG、TAC、TTG、TTC、TGGおよびTGC）を、実質的に等しい比で提供する。これらは、それぞれ終止（アンバー）、Tyr、Leu、Phe、TrpおよびCysをコードする。第２の分割量（モル比３）にＣをカップリングさせ；次にＡに対するＣの実際上半分のモル比を有するＣおよびＡの混合物をカップリングさせ；次に実質的に等モル量でＴおよびＧの混合物をカップリングさせる。これは、以下の４つのコドン：CCT、CAT、CAGおよびCCGを提供する。これらは、それぞれPro、His、Gln およびProをコードする。この分割量において２つのコドンがProをコードするが、Proコドンの各々の他の２つのアミノ酸のコドンに対する比は、CATおよびCAG に対するCCTおよびCCGのそれぞれの量を半分にする合成混合物中におけるＣのＡに対する減少した比のため、1:1である。第３の分割量（モル比７）にＡをカップリングさせ；次に、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を、それぞれ2:1:2:2の有効モル比でカップリングさせ；次に実質的に等モル量でＧおよびＴの混合物をカップリングさせる。これは、以下の８つのコドン：AAG、AAT、ACG、ACT、AGG、AGT、ATGおよびATTを提供する。これらは、それぞれLys、Asn、Thr、Thr、Arg、Ser、MetおよびIleをコードする。Thrに対して２つのコドンが存在するが、これらのコドンのモル量の和は、合成混合物におけるＣの減少した濃度のために、いずれの他の単一コドンに対しても実質的に等価である。第４の分割量（モル比５）にＧをカップリングさせ；次にＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物を、それぞれ2:1:1:1の有効モル比でカップリングさせ；次にＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせる。これは、以下の８つのコドン：GAG、GAT、GCG、GCT、GGG、GGT、GTGおよびGTTを提供する。これらは、それぞれGlu、Asp、Ala、Ala、Gly、Gly、ValおよびValをコードする。再び、Ala 、GlyおよびValが２つのコドンによってそれぞれ特定されているが、各アミノ酸のコドンが実質的に等濃度で生じるように相対濃度が調整されている。従って、このスキームは、実質的に等モル比で20種類のアミノ酸の全ておよび終止コドン（アンバー）をコードするコドンを提供する。合成分割量を合わせ、そして混合し、４つまたは５つの新たな分割量にアリコート化する。そして、コドンの別の混合物を、本発明のスキームの１つ（各回同じスキームを用いる必要はない）に従って合成する。このサイクルを、所望のオリゴヌクレオチドにおける各コドンについて繰り返す。終止コドンは、ポリヌクレオチドが細菌（例えば、TAGコドンで転写を終結する非サプレッサー株）内での発現のためのバクテリオファージまたはプラスミドベクターに組み込まれる場合、一般に所望されない。しかし、ポリヌクレオチドライブラリーはまた、所望の改変または非天然アミノ酸を担う対応するアンバーtRNAを有する系で、インビボまたはインビトロで翻訳され得る。各プールについてのサイクルにおける第３の工程が、ＧとＴのバランスをとった混合物をカップリングする工程からなること留意のこと。従って、４つのプールは、このサイクルの第３の工程の前に組み合わされ、そしてＧおよびＴのカップリングは同時に行われ得る。スキーム２支持体を8:6:3:3のモル比で４つの分割量に分割する。第１の分割量（モル比８）にＡおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせる。これは、以下の８つのコドン： AGG、AGT、ATG、ATT、TGG、TGT、TTGおよびTTTを、実質的に等モル量で提供する。これらは、それぞれArg、Ser、Met、Ile、Trp、Cys、LeuおよびPheをコードする。第２の分割量（モル比６）にＡ、ＣおよびＧの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＡおよびＣの実質的等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧのみをカップリングさせる。これは、以下の６つのコドン：AAG、A CG、CAG、CCG、GAGおよびGCGを提供する。これらは、それぞれLys、Thr、Gln、P ro、GluおよびAlaをコードする。第３の分割量（モル比３）にＡ、ＣおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いて、Ａにカップリングさせ；続いて、Ｔにカップリングさせる。これは、以下の３つのコドン：AAT、CATおよびTATを、実質的に等モル量で生じる。これらは、それぞれAsn、HisおよびTyrをコードする。第４の分割量（モル比３）にＧをカップリングさせ；続いてＡ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物にカップリングさせ；続いてＴにカップリングさせる。これは、以下の３つのコドン：GAT、GGTおよびGTTを提供する。これらは、それぞれAsp、GlyおよびValをコードする。第３および第４の分割量は、コドンの最後の位置においてＴをカップリングさせ、そして従って、これらは各コドン生成の最終工程においてＴのカップリングにについて組み合わされ得る。スキーム３支持体を8:4:4:4の有効モル比で４つの分割量に分割する。第１の分割量（モル比８）にＡおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の別の混合物をカップリングさせる。これは、スキーム２における第１の分割量の場合と同様に、以下の８つのコドン：AGG、AGT、ATG、ATT 、TGG、TGT、TTGおよびTTTを、実質的に等モル量で提供する。これらは、それぞれArg、Ser、Met、Ile、Trp、Cys、LeuおよびPheをコードする。第２の分割量（モル比４）にＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＡをカップリングさせ；続いてＴをカップリングさせる。これは、以下の４つのコドン：AAT、CAT、GATおよびTATを、実質的に等モル量で提供する。これらは、それぞれAsn、His、AspおよびTyrをコードする。第３の分割量（モル比４）にＧをカップリングさせ；続いてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下の４つのコドン：GAG、GCG、GGGおよびGTGを、実質的に等モル量で提供する。これらは、それぞれGlu、Ala、GlyおよびValをコードする。第４の分割量（モル比４）にＡおよびＣの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＡおよびＣの実質的に等モル量の第２の混合物をカップリングさせ；続いてＧにカップリングさせる。これは、以下の４つのコドン：AAG、A CG、CAGおよびCCGを、実質的に等モル量で提供する。これらは、それぞれLys、T hr、GlnおよびProをコードする。次いで、この４つのプールを再び組み合わせ、等モル量の20種の天然アミノ酸のそれぞれをコードするオリゴヌクレオチドを提供する。スキーム４支持体を５つの実質的に等モルの分割量に分割する。第１の分割量にＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＡをカップリングさせ；続いてＴをカップリングさせる。これは、以下の４つのコドン：AA T、CAT、GATおよびTATを提供する。これらは、それぞれAsn、His、AspおよびTyr をコードする。第２の分割量にＧおよびＣの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いて、ＣおよびＡの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下のコドン：GCG、GAG、CCGおよびCAGの合成を生じる。これらは、それぞれAla、Glu、ProおよびGlnをコードする。第３の分割量にＡをカップリングさせ；続いてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下のコドン：AAG、ACG、AGGおよびATGの合成を生じる。これらは、それぞれ Lys、Thr、ArgおよびMetをコードする。第２および第３の分割量は、末端のＧの付加のために組み合わされ得ることに留意のこと。第４の分割量にＡおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＴをカップリングさせる。これは、以下のコドン：AGT、ATT、TGTおよびTTTを生じる。これらは、それぞれSer、Ile、CysおよびPheをコードする。第１および第４のプールは、末端のＴの付加のために組み合わされ得ることに留意のこと。第５の分割量にＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の第２の混合物をカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下のコドン：GGG、GTG、TGGおよびTTGを生じる。これらは、それぞれGly、Val、TrpおよびLeuをコードする。スキーム５支持体を５つの等しい分割量に分割する。第１の分割量にＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＡをカップリングさせ；続いてＴをカップリングさせる。これは、以下の４つのコドン：AAT、CAT、GA TおよびTATを提供する。これらは、それぞれAsn、His、AspおよびTyrをコードする。第２の分割量にＧおよびＣの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＣおよびＡの実質的に等モル量の混合物ををカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下のコドン：GCG、GAG、CCGおよびCAGを生じる。これらは、それぞれAla、Glu、ProおよびGlnをコードする。第３の分割量にＡをカップリングさせ；続いてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下のコドン：AAG、ACG、AGGおよびATGを生じる。これらは、それぞれLys、T hr、ArgおよびMetをコードする。第４の分割量にＣおよびＧの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＣおよびＡの実質的に等モル量の第２の混合物をカップリングさせ；続いてＧをカップリングさせる。これは、以下のコドン：CCG、CAG、GCGおよびGAGを提供する。これらは、それぞれPro、Gln、AlaおよびGluをコードする。第２および第４の分割量は、ＣとＡとの実質的に等モル量の混合物の付加のために組み合わされ得、そして第２、第３および第４の分割量は末端のＧの付加のために組み合わされ得ることに留意のこと。第５の分割量にＴをカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の混合物をカップリングさせ；続いてＧおよびＴの実質的に等モル量の第２の混合物をカップリングさせる。これは、以下のコドン：TGG、TGT、TTGおよびTTTを提供する。これらは、それぞれTrp、Cys、LeuおよびPheをコードする。次いで、この５つの分割量を組み合わせ、そして混合し、各アミノ酸のための実質的に等モル量のコドンを有する、組み合わされた量の支持体を提供する。スキーム１の実施例：「ランダム」アミノ酸の合成が必要な場合、ヌクレオチド配列の合成に適切な樹脂を6:3:7:5の比で４つの部分に分割する。樹脂をチミンの活性化溶液と反応させることにより、コドンの第１の塩基として、チミンを樹脂の第１の部分（全樹脂の6/21を含む）に結合させる。カップリング後、この樹脂を、アデニン、グアニンおよびチミンがコドンの第２の位置に等しい効率でカップリングするように（すなわち、実質的に等モル量の、Ａ、ＴおよびＧの混合物から）、活性化ヌクレオチド混合物と反応させる。最後に、この樹脂を、実質的に等量の塩基がコドンの最後の位置でカップリングするように（すなわち、実質的に等モル量の、ＧとＴとの混合物から）、チミンとグアニンとの混合物と反応させる。コドンの第３の塩基の混合物は、等量の塩基がカップリングされるように（すなわち、実質的に等モル量のＴとＧとの混合物ではなく、実質的に等モル量のＣとＧとの混合物から）、シトシンとグアニンとの混合物により置き換えられ得ることに留意のこと。従って、樹脂のこの部分（モル比６を有する分割量）は、以下の合成されるコドンを有する：この表において、各モル比は、全樹脂の1/21のコドンの量をいう。従って、樹脂のこの部分は、５つのアミノ酸と終止コドンとをコードする同数のコドンを有する。樹脂の第２の部分（全樹脂の3/21を含む）を、シトシンをコドンの第１の位置でカップリングさせるように反応させる。処理後、この樹脂をシトシン塩基とアデニン塩基との活性化混合物と反応させる。しかし、ＡおよびＣの相対濃度を調節し、シトシンの各モルに対して２モルのアデニンがカップリングされるようにする。最後に、この樹脂を、実質的に等モル量のチミンとグアニンとの混合物と反応させる。これは、コドンの最後の位置での両塩基の等量のカップリングを与える。従って、樹脂のこの部分上で合成される４つの可能なコドンは、以下の通りである：従って、樹脂のこの部分は４つのコドンを含むが、このコドンは３つのアミノ酸を等量でコードする。この樹脂の第３の部分（全樹脂の7/21を含む）をコドンの最初の位置でアデニンとカップリングさせる。次に、樹脂のこの部分を、アデニン塩基、シトシン塩基、チミン塩基およびグアニン塩基の混合物と反応させる。ここで、これらの塩基の濃度を調整し、アデニン、グアニンおよびチミンのそれぞれ２モルが、シトシンの各モルとカップリングされるようにする。最後に、樹脂のこの部分を、実質的に等モルのグアニンおよびチミンの混合物と反応させる。これは、両塩基の等量のカップリングを提供する。従って、この分割量の樹脂上では、８つの異なるコドンが、既知であるが等しくないモル比で合成される。これらは、以下の通りである：従って、８つのコドンが合成され、これらは、７つのアミノ酸を実質的に等モル比でコードする。樹脂の最後のプール（全樹脂の5/21を含む）は、コドンの最初の位置にカップリングさせたグアニンを有する。このコドンの第２の塩基を、４塩基全ての混合物からカップリングさせ、シトシン、グアニンおよびチミンの各モルに対して２モルのアデニンがカップリングされるようにする（すなわち、2:1:1:1の有効モル比のＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物）。最後に、コドンの第３の塩基を実質的に等モル量のチミンおよびグアニンの混合物からカップリングさせ、両塩基の同数がこの位置でカップリングされるようにする。従って、樹脂粒子のこのプールにおいて、以下の８つの異なるコドンが合成される：従って、樹脂のこの位置上で８つのコドンが合成され、これは実質的に等モル比で５つのアミノ酸をコードする。コドンを合成した後、樹脂プール（分割量）を再び組み合わせる。本実施例において、コドンの第３塩基をカップリングする工程が、各分割量について同じであることに留意すべきである。従って、コドンの第２塩基をカップリングした後に、樹脂をプールして、第３の位置の塩基を単一の工程でカップリングさせることを可能にし得る。このような改変は、本発明の範囲内にあると考えられる。従って、全てのアミノ酸は、それに対して合成される少なくとも１つのコドンを有する。さらに、各アミノ酸に対して合成されるコドンのモル比の和は実質的に等しい。樹脂の分割量の異なる組み合わせ、および反応性塩基の組み合わせが上記の実施例と同じ結果を与えることは、当業者に明白である。このような改変は、本発明の範囲内にあるとみなされる。本発明のこの実施態様における実用上の利点は、より長い「ランダム」ペプチドのコドンの合成が可能になることである。ヘキサペプチドをコードする、全ての可能なポリヌクレオチドを合成する場合を考えてみよう。20個の別々の分割量に樹脂を分割すること、および各アミノ酸に対するコドンを別々に生成することは、ヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチドに対して6.4×10⁷（＝20⁶）個の異なるコドンの組み合わせが存在することを意味する。従って、ヘキサペプチドを合成するために必要な樹脂粒子の理論的最小数は、20個の分割量に６回分割され得る樹脂粒子数、すなわち6.4×10⁷である。上記の本発明の第１の実施例において、樹脂粒子の最小の分割は、樹脂が全樹脂の3/21（＝1/7）に分割される場合に起こる。従って、全てのヘキサペプチドに対するポリヌクレオチドを合成するために必要な樹脂粒子の理論的最小数は、７の６乗に配分され得る樹脂粒子数、すなわち117,649（＝7⁶）である。各樹脂粒子がそれに500以上のポリヌクレオチドをカップリングし得たので、減少した樹脂粒子数は、合成し得る可能な異なるポリヌクレオチド配列の数を制限しない。所望のポリヌクレオチド長が増加するに従って、十分量の各々の種を有するために樹脂量の推定され得る増加が必要であることは、当業者によって理解される。樹脂粒子の最小数の低減は、重要な実用上の結果を有する。樹脂粒子の最小数が6.4×10⁷個である場合を考えてみよう。さらに、ヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチド１つ当たり、平均10粒子が存在すると仮定してみよう。これは、6.4×10⁸個の樹脂粒子が存在することを意味する。ポリヌクレオチド合成に適切な樹脂は、代表的には、約0.5×10⁶粒子/mLを有する。従って、1.28リットルの樹脂が必要とされる。これは、膨大な量の樹脂であり、そして非常に高価である。市販のヌクレオチド合成機は、代表的には、１mL〜10mLの樹脂を操作する。しかし、ヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチド当たり、10個の樹脂粒子を有するのみという根本的な弱点が存在する。ヘキサペプチドをコードする特定のポリヌクレオチドに対して樹脂粒子が存在しない確率は、小さいが、存在する。樹脂粒子の分布が、予想されるポアソン分布に従い、そしてコードされるポリヌクレオチド当たり10個の粒子が存在すると仮定すると、ヘキサペプチドをコードする特定のポリヌクレオチドに対して樹脂粒子が存在しない確率は、4.54×10^-5 （＝ e^-10）、すなわち、22,026分の１である。当業者は、合成から失われるヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチドが、約3000（＝6.4×10⁷/22,026 ）個であると予想し得る。ポリヌクレオチド当たり20個の樹脂粒子を用いた場合、その確率は2.06×10^-9、すなわち4.9×10⁸分の１に減少する。ヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチド当たり20個の粒子を提供することは、ヘキサペプチドをコードするポリヌクレオチドの全てを作製するより高い確率を提供する。しかし、ペプチドをコードするポリヌクレオチド当たりの粒子数のポアソン分布は一様でない。ペプチドをコードするポリヌクレオチド当たり約100粒子へ平均樹脂粒子数を増加させることで、所定ののポリヌクレオチド当たりの樹脂粒子数の受容可能な分布が提供される。本実施例において実証されるように、本発明の方法によって樹脂粒子の最小数を117,649まで減少させることは、この数の100倍が23.5mLの体積に適合することを意味する。これは、合成で用いられる実用的な体積である。スキーム２の実施例：実施例１は、アミノ酸が等しく表現され、そしてTAG終止コドンを含むように、各アミノ酸のための全てのコドンを生産する。本発明のこの実施例は、ランダムコドンを生成する方法を提供し、ここで終止コドンは合成されない。この実施例において、樹脂は8:6:3:3の比で４つのプールに分割される。この実施例および以下の実施例において、カップリング工程において塩基の混合物が使用される場合、各塩基のモル比は、実質的に等しい数の各塩基が延長されるヌクレオチドにカップリングするように、調節される。樹脂の最も多い部分は、全樹脂の8/20を含み、コドンの第１位においてＡおよびＴと反応する。コドンの第２位において、樹脂はＧおよびＴと反応する。コドンの最後の塩基をカップリングするために、樹脂は再びＧおよびＴと反応する。このようにして、この分割量の樹脂上で、８つのコドンが実質的に等しい量で合成され、そして８つのアミノ酸をコードする：本明細書において提供されるこのリストおよび以下のリストにおいて、列の項目「モル比」は、全樹脂の1/20での各コドンの量を示す。樹脂の第２の分割量は、全樹脂の6/20を含み、Ａ、Ｃ、およびＧの実質的に等モルの混合物と反応して、コドンの第１位における塩基をカップリングする。ＡおよびＣの実質的に等モルの混合物を用いて、コドンの第２位の塩基をカップリングする。この分割量の樹脂にカップリングする最後の塩基はグアニンである。このようにして６つの異なるコドンがこの分割量の樹脂上で合成され、各々が異なるアミノ酸をコードする。樹脂の第３の分割量は、全樹脂の3/20を含み、その第１位の塩基は、Ａ、Ｃ、およびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされる。アデニンが第２位にカップリングされ、そしてチミンがコドンの第３位にカップリングされる。このようにして３つのコドンが合成され、各々が異なるアミノ酸をコードする：樹脂の最後の第４の分割量は、全樹脂の3/20を含み、コドンの第１位における塩基としてグアニンをカップリングする。コドンの第２の塩基は、Ａ、Ｇ、およびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされ、そしてコドンの最後の塩基はチミンである。これにより、この樹脂の分割量上で合成された３つのコドンが得られる：コドンが各樹脂の分割量上で合成された時点で、分割量を再び合わせる。この方法において、各アミノ酸が実質的に等しいモル比でコードされる。スキーム２および実施例２はまた、終止コドンが生成されない本発明の方法を提供する。この手順を、所望の長さの全ての可能なペプチドのためのコドンを生成するに十分な回数、繰り返す。樹脂の最も少ないプールは全体の3/20であるので、すべてのヘキサペプチドのためのコドンを合成するために必要とされる樹脂粒子の理論的最少数は、87,791 (＝(20/3)⁶)である。本発明の実施において、この量の100倍が好ましく使用される。この手順の変法が可能であることが理解される。例えば、全樹脂の8/20で表される最も多い分割量は、実質的に等しい２つの部分に分割され得る。これらのうち１つは、チミンをコドンの第１の塩基位置においてカップリングし得、そして他方は、グアニンを第１の塩基位置においてカップリングし得る。次いでコドンの第２および第３の塩基が上記のように生成され得る。このような変法は本発明の範囲内と見なされる。各コドンの第３塩基位置のチミンがシトシンで置換され得ることもまた当業者には自明である。このことにより、翻訳されるアミノ酸を変更することなく、樹脂上に存在するコドンが変更される。例えば、上記実施例２において、最後の分割量において最後にカップリングされる塩基はシトシンであり得る。この場合、以下のコドンが合成される：このようにして、コドンが変更されるが、コードされるアミノ酸は、遺伝コードの縮重のため、変わらない。この方法のこのような変法は、本発明の範囲内と見なされる。スキーム３の実施例：本発明の好適な実施態様は、樹脂粒子の理論的最少数を15,625に低減する。これは、樹脂を8:4:4:4の比で４つのプールに分割することによって達成される。この場合、樹脂粒子の理論的最少数は、ヘキサペプチドを例にとると、4/20部分 (最も少ない部分)に６回分割することができる粒子の数であり、すなわ5⁶(＝15, 625)である。最も多いプールは、全樹脂の8/20を含み、ＡおよびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされる塩基をコドンの第１位に有し；第２塩基はＧおよびＴの実質的に等モルの混合物由来であり；そして最後の塩基はＧおよびＴの実質的に等モルの混合物由来である。このようにして、８つの異なるアミノ酸のための８つのコドンが生成される。それらは：である。次の分割量は、全樹脂の4/20を含み、第１塩基がＡ、Ｃ、ＧおよびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされ；コドンの第２および第３の塩基は、各々アデニンおよびチミンである。これは４つのコドンを生成する：樹脂の次の分割量は、全樹脂の4/20を含み、第１塩基としてグアニンを有し；第２塩基は、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされ；そして第３塩基はグアニンである。これは４つのコドンを生成する：樹脂の最後の分割量はまた、全樹脂の4/20を含み、はじめの２つの塩基はＡおよびＣの実質的に等モルの混合物から、別々の反応でカップリングされ；そして第３塩基はグアニンである。これは４つのコドンを生成する：コドンが合成された後、分割量を再び合わせる。この手順をさらに５回繰り返し、全ての可能なヘキサペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列を実質的に等しいモル比で生成する。樹脂の最少分割量は、この場合、全体の4/20であるので、必要とされる樹脂粒子の理論的最少数は15,625(＝5⁶)である。従って、100倍過剰の樹脂が約3.1mL中に含まれる。実施例２に記載のように、この実施例の変法が存在することは明らかである。このような変法もまた本発明の範囲内に包含される。樹脂を分割量に分割し、そして塩基混合物と反応させる他の２つのスキームが、実質的に等しいモル比で全てのアミノ酸のためのコドンを生じ、かつ終止コドンを生じない。両方とも、樹脂プールを５つの実質的に等しい部分に分割する。両方ともその樹脂分割量のうちの３つが同様の方法で処理される：第１の分割量は、その第１塩基がＡ、Ｃ、Ｃ、およびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされ；そして第２および第３の塩基は、各々、アデニンおよびチミンである。第２の分割量は、ＣおよびＧの実質的に等モルの混合物からカップリングされる第１塩基を有する；第２塩基はＣおよびＡの実質的に等モルの混合物からカップリングされる；そして最後の塩基はグアニンである。第３の分割量は第１塩基としてアデニンを有する；第２塩基はＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔの実質的に等モルの混合物からカップリングされる；そして最後の塩基はグアニンである。１つの方法において、第４の分割量は、その第１塩基がＡおよびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされ；第２塩基はＧおよびＴの実質的に等モルの混合物由来である；そして第３塩基はチミンである。樹脂の第５プールは、第１塩基および第２塩基がＧおよびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされ；そして最後の塩基はグアニンである。もう１つの方法において、第４の樹脂分割量は、その第１塩基がＣおよびＧの実質的に等モルの混合物からカップリングされ；その第２塩基はＣおよびＡの実質的に等モルの混合物からカップリングされる；そして最後の塩基はグアニンである。第５プールは第１塩基としてチミンを有する；そして第２塩基および第３塩基はＧおよびＴの実質的に等モルの混合物からカップリングされる。これらの各別法は、同一の樹脂粒子理論最少数(ヘキサペプチドの合成を例にとると15,625)を必要とする。この実施例中の３つの別法のうちいずれのものも、「ランダム」ポリペプチドのための配列の生成において個々のアミノ酸コドンを提供するために使用され得ることに留意のこと。遺伝子操作において有用であるために、クローニングのための調製においてペプチドをコードするポリヌクレオチドを切断するために選択される制限エンドヌクレアーゼは、この合成DNAを切断すべきではない。これは容易にチェックできる。なぜなら、全ての可能な合成されたポリヌクレオチドについて、その配列が既知であるからである。例えば、Acetobacter aceti由来の制限エンドヌクレアーゼAatIIについて考える。この酵素は、5'-GACGTC-3'の配列を認識する。上記実施例３で記載したようなアミノ酸のコドンを考える。これは：である。認識配列を、各フレームシフト位置におけるコドンについてチェックしなければならない。従って、シフトなしの位置(すなわち、GAC-GTC)において、この酵素はどのコドンも攻撃しない。これらはこのセット中に存在しないからである。第１のフレームシフト位置（すなわち、G-ACG-TCのような認識配列を考える）において、第３位にＧを有するコドンは10個あり、そしてトレオニンがACG によってコードされる。しかしTCで始まるコドンはなく、従って、１塩基のフレームシフトで、このヘキサペプチドコドンはこの酵素によって切断されない。最後に、２塩基のフレームシフト（すなわち、配列GA-CGT-Cを考える）で、トリプレットCGTはこのセットには存在しない。従って、酵素AatIIはこのコドンのセットと共に使用するに適している。どの組み合わせも認識配列とならないからである。他の場合において、Acinetobacter calcoaceticus由来の酵素AccI（これは認識配列5'-GT(A,C)(G,T)AC-3'を有する）は、これらのコドンから作製されるペプチドをコードするポリヌクレオチドと共に使用するに不適である。これらのコドンの複数の組み合わせが、AccI認識配列を生じる。１つの例はAla-Tyr-Thrであり、これはコードGCGTATACGを有する。（異なる認識配列を有する）市販の制限エンドヌクレアーゼ50種のうち28種が、この実施例で使用されるコドンのセットと適合することが見出された。すなわち、これらのコドンのどのような組み合わせも、これら28種の酵素の認識配列を生じさせない。上記スキームおよび実施例の各々が、多数の異なるポリヌクレオチド配列を有する支持体混合物を与える。組み合わされた支持体混合物の各々が複数の配列を有し、各コドン位置が実質的に等モル比の各アミノ酸で表される。本発明の方法は、実質的な多様性を有する（すなわち非常に多数の多様な配列を有する）ポリヌクレオチドライブラリーを生成するために必要とされる支持体粒子の数を低減させる。分割されたプールの再組み合わせの後、さらなる配列をコドンに加え得る。この混合物を、スキームのうちの１つに従って再び分割することができ、そしてコドンの第２の混合物が合成され得る。あるいは混合物全体またはその組み合わせに、共通の配列を加えることができる。完全なポリヌクレオチドライブラリーが合成され時点で、支持体に結合した切断可能な結合を用いて、これを支持体から切断し得る。次に、遊離のオリゴヌクレオチドを２本鎖DNAに変換し得、そしてJ .Devlinら(Science(1990)249:404-406)によって記載されたようなバイオパンニング（biopanning）アッセイで使用するために、ベクターまたはファージ中にクローン化し得る。あるいは、このポリヌクレオチドを、例えば、Kawasaki(WO91/ 05058)またはGoldら(WO92/02536)に記載のように、無細胞系において増幅し得、そしてこれを翻訳し得る。全長ポリヌクレオチドの単離は、選択可能なヌクレオチド配列をこのポリヌクレオチドにカップリングすることによって補助され得る。ランダムコドンの合成の前に、活性化された樹脂に選択可能なヌクレオチド配列をカップリングし得る；あるいは目的のランダムコドン含有ポリヌクレオチドの完成の後に、選択可能なヌクレオチド配列をポリヌクレオチドにカップリングし得る。本発明の方法は、樹脂の分割量のモル比、ならびに個別の混合物の活性化ヌクレオチド残基のモル比および／または濃度を変更して、行われ得る。これは、ランダムポリヌクレオチドの合成された混合物の所与のコドンにおいて、実質的に等しい各アミノ酸の表現を提供する。選択上記のように、本発明の方法はポリヌクレオチドの複雑な混合物を与える。この混合物は複雑で、そして非常に多数の異なるポリヌクレオチドを含むようであるが、これは、(i)各カップリング反応が完了させられる；(ii)反応物、すなわち、各分割量において各カップリング工程で反応する樹脂および１つの活性化ヌクレオチドまたは複数の活性化ヌクレオチドが既知である；(iii)各カップリングの反復において生成される各コドンの量が既知である；および(iv)再組み合わせ工程で加えられる各ポリヌクレオチドの量が既知であるという点で、既知の組成を有する。組成は既知であるが、この混合物中の１個または数個のポリヌクレオチドのみが、目標の生物学的特性を有する所望のペプチドをコードするポリヌクレオチドである。従って、所望の特性を有するペプチドをコードする産物をこの混合物から選択することが必要である。選択プロセスは、クローニングのための調製において、１本鎖ポリヌクレオチドを２本鎖ポリヌクレオチドに変換することで始まり得る。ポリデオキシヌクレオチド合成の場合、相補性鎖はDNAポリメラーゼプライミング合成によって、このランダムポリヌクレオチドにカップリングする既知のオリゴヌクレオチドに相補性のプライマーから、合成され得る。第２鎖の合成の後、ランダムペプチドをコードする２本鎖DNAを所定の制限部位（これは合成の間にポリヌクレオチド中に取り込まれている）で切断し得る。上記のように、制限酵素の選択は合成されたポリヌクレオチドの配列に依存する。配列が既知なので、当業者は、ランダムペプチドのためのコーディング領域の外側の制限部位のみで切断する酵素を選択し得る。切断されたフラグメントは次に発現ベクター中にクローン化され、そしてDNAの増幅およびランダムペプチドの発現のために、宿主生物（たとえば細菌）中に導入される。発現されたペプチドは、試験のためのランダムペプチドをコードするポリヌクレオチドヌクレオチド配列の外側の特定のコドンに、標識されたアミノ酸（例えば、放射性標識アミノ酸、例えば³⁵S-Met）を取り込むことによって、検出され得る。この目的のために選択される発現ベクターは、クローン化された挿入物を優先的に発現するものである（例えば、バクテリオファージT7のRNAポリメラーゼは、T7 DNAに関連しないDNAにおいてはまれにしか遭遇しないプロモーターから発現する）。初期スクリーニングは、ランダムポリヌクレオチド含有ベクターが導入された各細胞のクローン集団上で行われ得る。非常に多数のクローン集団が、スクリーニングの前に、集団をプールすることによって、同時にスクリーニングされ得る。個別のスクリーニング中の陽性の結果を与える既知の数のプールを、より少ないグループに再プールし、そして標的の特性を有するペプチドを産生するクローン集団が同定されるまで、スクリーニングを繰り返す。所望の標的特性を有するペプチドを選択するためのプロセスの性質は、もちろん、選択が行われるべき産物の性質に依存する。所望の特性が、免疫グロブリン、レセプター、レセプター結合リガンド、抗原または酵素のようなタンパク質への結合能である一般的な例では、選択は、単に、各々がランダムペプチドを含む細胞溶解物または細胞溶解物のプールを、結合が所望される物質に曝露することによって行われ得る。所望のペプチドは優先的に結合する。（炭水化物または核酸のような他の非タンパク質物貿もまた使用され得る）。次いで、結合した物質を混合物の残りから分離する（例えば、固体支持体に結合させた結合性物質の使用、およびクロマトグラフィー技法を用いての分離、あるいは濾過または遠心分離による分離、またはゲル濾過を用いる、サイズに基づいた結合ペプチドと非結合ペプチドとの分離による）。次いで、結合したペプチドは、複合体の変性によって、あるいはこのレセプターまたは抗体に通常結合する天然由来の基質との競合によって、取り外され得る。この一般的方法はまた、遺伝子調節に関与するタンパク質にも適用可能である。これらのペプチドは特定のDNA配列に特異的に結合するからである。分離が基づき得るその他の特性としては、選択的膜輸送、３次元コンホメーション（折り畳み）に起因する識別的な挙動に基づくサイズ分離、および溶解度または凍結点のような他の物理的特性における差異が挙げられる。発現ベクター中にクローン化されたポリヌクレオチドの非常に大きいサブ集団が得られた場合、より高いストリンジェンシーでこの選択技法を再適用することが必要とされ得る。選択は個々の成分に対して行われ得、あるいは限られた数の成分を有する混合物に対して行われ得る。従って、例えば、ある抗体またはレセプターに結合するペプチドの混合物が50ぐらいのメンバーを含む場合、Phの塩濃度を調節して、最も緊密に結合しているメンバー以外を全て解離させ得、あるいは競合を提供するために天然基質を使用し得る。この精製によって、より扱いやすい数の成分を含む混合物が回収され得る。標的とする性質のレベルが種々であるペプチドを区分するための種々のプロトコルが明白である。分析個々のペプチドが得られると、各ペプチドを発現するクローン集団が追跡され、ベクターDNAが単離され、そしてそのペプチドをコードする挿入物のDNA配列が、当業者に周知の方法によって配列決定される。本発明の方法を用いるランダムペプチドの生産は、生物学的に活性なペプチドの推定アミノ酸配列を決定するために、より困難なアミノ酸配列決定よりもむしろDNA配列決定方法を利用するという利点を提供する。活性ペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現宿主中で自然に増幅されるので、利用可能なDNAの量は、標準的技法によって挿入D NAの精密な配列決定を行うに十分である。標準的な分析方法を用いて必要なアミノ酸配列の情報を得て、所望であれば、回収された個々のペプチドを特定することができる。これらの方法にはアミノ酸組成の決定が包含され、高速原子衝撃質量分析法(FABMS)のような高感度の方法の使用が包含され、これは混合物（例えば、ペプチドが、インビトロで、本発明の方法によって合成されたポリリボヌクレオチドの混合物から発現された場合のような混合物）のペプチド成分の非常に正確な分子量を提供する。インビボで発現されたペプチドの配列情報は、当業者に周知の種々の方法によって得られ得る。本発明の方法によって合成されるポリヌクレオチドの混合物は、２本鎖を形成し得、そして発現ベクター中にクローン化され得、その結果、この混合物のポリヌクレオチドの発現によって融合タンパク質が生産される。このようなクローニングは、当業者に周知であり、そして例えば、混合物中の発現されたペプチドのマーキングにこの融合タンパク質の特性を利用することによって、有用である。本発明の方法により、さらなる配列分析のため、あるいはさらなる生物学的試験のために、活性ペプチドの同定後にタンパク質発現系を設計してクローン化することなく、活性ペプチドをより大量に生産させることが可能となる。本発明の方法を使用して、活性ペプチドが迅速に大量発現され得、そしてその活性を確認するため、あるいはその他の特性を特徴付けするためにさらに分析され得る。概要既知の組成を有し、そして所望の標的特性を有する１またはそれ以上のペプチドをコードするポリヌクレオチドの混合物の制御された合成が開示される。この方法は、各アミノ酸が、各合成サイクルで合成されたコドンにより実質的に等量でコードされることを提供する。この方法は５つの不可欠な工程を包含する。第１に、調製された樹脂（または樹脂の混合物）の所定の量を、ある数の分割量に分割する。各分割量は好ましくは既知のモル比の樹脂を含有する。次に、第１の単一の活性化ヌクレオチドまたは活性化ヌクレオチドの混合物を、それぞれの分割量において樹脂にカップリングし、そしてカップリング反応を完了させる。次の工程において、第２の活性化ヌクレオチド（または混合物）を第１のヌクレオチドにカップリングし、そしてカップリング反応を完了させる。次の工程において、第３の活性化ヌクレオチド（または混合物）を第２のヌクレオチドにカップリングし、そしてカップリング反応を再び完了させる。次に、樹脂の分割量を合わせる。この後、既知のモル比で新しく作製されたコドンが実質的に等量で全てのアミノ酸をコードする。この工程を反復して、ポリヌクレオチド鎖を延長し得、そして鎖は連結され得る。その後、混合物中の所望のポリヌクレオチドを検出し、それをクローン化および発現し、そして分析（例えば、核酸配列、推定アミノ酸配列、または所望のペプチドの過剰生産後のアミノ酸自身の配列の決定）を行うための方法が用いられ得る。本発明は、ポリヌクレオチドの複雑な混合物の調製の簡便な方法を提供し、ここで、コドン合成は、縮重した遺伝コードの偏りを克服し、そして各アミノ酸が所定のコドン位置で実質的に等量でコードされるようにするために行われる。混合物が検出可能な量のポリヌクレオチドを含むため、所望の標的特性を有するペプチドをコードするそれらのメンバーのクローン化、発現、および選択が可能である。標的特性の例としては、タンパク質（例えば、酵素、レセプター、レセプター結合リガンドまたは抗体）、核酸、および炭水化物を含む種々の部分への結合、別の生成物を形成する酵素との反応、または膜を介する輸送、抗凍結特性、およびワクチンとしての特性などの他の特性が挙げられる。本発明の方法は、ポリヌクレオチドの混合物（ここで各コドン位置はコードするアミノ酸に関してランダム化されている）により発現される最も活性なペプチドの選択により所望の特性を最大にする機会を提供する。各コドン位置での、遺伝コードの縮重のための、複数のコドンによりコードされるアミノ酸に対する固有の統計的な偏りは、ランダムなコドン配列中の終止コドンをコードするのを避ける能力はそのままで、本発明の方法により克服される。本発明が、その特定の実施態様を参照して記載されているが、これは種々の変更がなされ得、そして、ポリヌクレオチド混合物を作製するため、および発現されたポリヌクレオチドから所望のペプチドを単離するために、本発明の方法の真の精神および範囲から離れることなしに等価物で置換され得ることが、ポリヌクレオチド合成の当業者により理解されるべきである。さらに、個別の状況、物質、物の組成、プロセス、プロセスの工程（単数または複数）を本発明の目的、精神、および範囲に適合するために多くの改変が成され得る。このような改変全ては添付の請求の範囲内であることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．異なるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドの混合物を調製する方法であって、ここで、混合物は、各ポリヌクレオチドの検出可能で、かつクローン化可能な量を包含し、該方法は： a)調製された支持体樹脂の量を複数の既知の割合の分割量に分割する工程； b)該分割量の１つに、少なくとも１つの活性化ヌクレオチドの混合物からの第１の活性化ヌクレオチドをカップリングさせる工程であって、該混合物中の該ヌクレオチドが既知の割合で存在し、複数の異なる樹脂-ヌクレオチド反応生成物が得られ、該カップリングは該カップリングを実質的に完了させる条件下で行われ、そして該樹脂-ヌクレオチドの3'反応部位が該カップリングの後に脱保護される、工程； c)該分割量に、少なくとも１つの活性化ヌクレオチドの混合物からの第２の活性化ヌクレオチドをカップリングさせる工程であって、該混合物中で該活性化ヌクレオチドの各々が既知の割合で存在し、複数の樹脂-ヌクレオチド反応生成物が得られ、該カップリングは該カップリングを実質的に完了させる条件下で行われ、そして該樹脂-ヌクレオチドの3'反応部位が該カップリングの後に脱保護される、工程； d)該分割量に、少なくとも１つの活性化ヌクレオチドの混合物からの第３の活性化ヌクレオチドをカップリングさせる工程であって、該混合物中で該活性化ヌクレオチドの各々が既知の割合で存在し、複数の樹脂-ヌクレオチド反応生成物が得られ、該カップリングは該カップリングを実質的に完了させる条件下で行われ、そして該樹脂-ヌクレオチドの3'反応部位が該カップリングの後に脱保護される、工程； e)工程(b)、(c)、および(d)と同様に、残りの各分割量に、活性化ヌクレオチドの混合物からの活性化ヌクレオチドをカップリングさせる工程； f)工程(d)および(e)の反応生成物を共に組み合わせて、樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物のランダム混合物を生成する工程；および g)(f)のランダム混合物を用いて、そして該分割工程；該第１、第２、および第３の活性化ヌクレオチドを該分割量の各々にカップリングさせる工程；および組み合わせる工程を、ポリヌクレオチドの制御されたランダム混合物が得られるまで順に繰り返す工程であって、ここで該ポリヌクレオチドの各々が所望の数のアミノ酸をコードする工程、を包含する、方法。２．前記調製された支持体が、それに共有結合した少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の方法。３．前記調製された支持体が５つの実質的に等モルの分割量に分割される、請求項１に記載の方法。４．前記分割工程が8:6:3:3の有効モル比を有する分割量を生じる、請求項１に記載の方法。５．前記分割工程が6:3:7:5の有効モル比を有する分割量を生じる、請求項１に記載の方法。６．請求項１に記載の方法であって、ここで： a)前記分割工程が6:3:7:5の有効モル比を有する分割量を生じ；そして b)前記第３の活性化ヌクレオチドのカップリング工程の前に前記組み合わせ工程を行い、該第３の活性化ヌクレオチドが各分割量について同じである、方法。７．前記分割工程が8:4:4:4の有効モル比を有する分割量を生じる、請求項１に記載の方法。８．請求項１に記載の、ポリヌクレオチドの混合物を調製する方法であって、混合物中の少なくとも１つのポリヌクレオチドを検出する工程をさらに包含し、該ポリヌクレオチドが標的特性を有する方法。９．前記ポリヌクレオチドが１本鎖RNAである、請求項８に記載の方法。１０．前記ポリヌクレオチドが１本鎖DNAである、請求項８に記載の方法。１１．請求項１に記載の、ポリヌクレオチドの混合物を調製するための方法であって： a)混合物中の少なくとも１つのポリヌクレオチドを検出する工程； b)該ポリヌクレオチドに対して相補的な鎖を合成する工程； c)該ポリヌクレオチドを発現ベクター中にクローン化する工程； d)該クローン化されたポリヌクレオチドを宿主生物において発現させる工程；および e)選択された標的特性を有する発現産物を生産する工程をさらに包含する、方法。１２．前記発現産物がRNAである、請求項１１に記載の方法。１３．前記発現産物が二本鎖DNAである、請求項１１に記載の方法。１４．前記発現産物がペプチドである、請求項１１に記載の方法。１５．前記ポリヌクレオチドを配列決定する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。１６．前記クローン化されたポリヌクレオチドを配列決定する工程をさらに包含する、請求項１１に記載の方法。１７．前記活性化ヌクレオチドが活性化デオキシリボヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。１８．前記活性化ヌクレオチドが活性化リボヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。１９．前記活性化ヌクレオチドの各々が活性化デオキシリボヌクレオチドおよび活性化リボヌクレオチドを包含する群より選択される、請求項１に記載の方法。２０．請求項１に記載の方法であって：分析的方法によりカップリング反応をモニターし、該カップリングの完了の度合いを決定する工程をさらに包含する、方法。２１．前記DNAが標的特性を有する、請求項１３に記載の方法。２２．前記RNAが標的特性を有する、請求項１２に記載の方法。２３．前記ペプチドが標的特性を有する、請求項１４に記載のペプチド。２４．樹脂-ヌクレオチド反応生成物の前記ランダム混合物の組成物が、該樹脂- ポリヌクレオチド生成物のコドン位置の少なくとも１つで、実質的に等モル量の天然に存在する各アミノ酸を含有する、請求項１に記載の方法。２５．樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の前記ランダム混合物の組成が予め決定される、請求項１に記載の方法。２６．前記樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列の400またはそれ以上の異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、ここで該混合物中の各ポリヌクレオチドの存在が、予め決定され、各ポリヌクレオチドが該混合物中で、検出可能で、かつクローン化可能な量で存在し、そして該混合物が生物学的に活性なペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。２７．前記樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列の8,000またはそれ以上の異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、ここで該混合物中の各ポリヌクレオチドの存在が、予め決定され、各ポリヌクレオチドが該混合物中で、検出可能で、かつクローン化可能な量で存在し、そして該混合物が生物学的に活性なペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。２８．前記樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列の160,000またはそれ以上の異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、ここで該混合物中の各ポリヌクレオチドの存在が、予め決定され、各ポリヌクレオチドが該混合物中で、検出可能で、かつクローン化可能な量で存在し、そして該混合物が生物学的に活性なペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。２９．前記樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列の3,200,000またはそれ以上の異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、ここで該混合物中の各ポリヌクレオチドの存在が、予め決定され、各ポリヌクレオチドが該混合物中で、検出可能で、かつクローン化可能な量で存在し、そして該混合物が生物学的に活性なペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。３０．前記樹脂-ポリヌクレオチド反応生成物の混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列の64,000,000またはそれ以上の異なるペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有し、ここで該混合物中の各ポリヌクレオチドの存在が、予め決定され、各ポリヌクレオチドが該混合物中で、検出可能で、かつクローン化可能な量で存在し、そして該混合物が生物学的に活性なペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含有する、請求項１に記載の方法。３１．請求項１４に記載の方法であって： a)繊維状のバクテリオファージの表面上に存在する表面タンパク質の一部として前記ペプチドを発現する工程；および b)標的特性について該ペプチドをスクリーニングする工程をさらに包含する、方法。３２．別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列をそれぞれコードする400またはそれ以上の異なるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドの所定の混合物であって、ここで該混合物中の各ポリヌクレオチドの存在は予め決定され、各ポリヌクレオチドは、検出可能で、かつクローン化可能な量で該混合物中に存在し、そして該混合物は、生物学的に活性なペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを検出可能で、かつクローン化可能な量で含有する、混合物。３３．前記混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列のペプチドをそれぞれコードする、8,000またはそれ以上の異なるポリヌクレオチドを含有する、請求項３２に記載の混合物。３４．前記混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列のペプチドをそれぞれコードする、160,000またはそれ以上の異なるポリヌクレオチドを含有する、請求項３２に記載の混合物。３５．前記混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列のペプチドをそれぞれコードする、3,200,000またはそれ以上の異なるポリヌクレオチドを含有する、請求項３２に記載の混合物。３６．前記混合物が、別個の、唯一の、および異なるアミノ酸配列のペプチドをそれぞれコードする、64,000,000またはそれ以上の異なるポリヌクレオチドを含有する、請求項３２に記載の混合物。３７．請求項１に記載の方法であって、ここで： a)前記調製された支持体樹脂の各粒子が、それに共有結合した少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を有し； b)該調製された支持体樹脂がある数の分割量に分割され； c)該調製された支持体樹脂粒子の数が、少なくとも、工程a)からf)の反復と同じ回数、最小の分割量に分割され得る最小粒子数である、方法。３８．前記調製された支持体樹脂粒子の数が、工程a)からf)の反復と同じ回数、最小の分割量に分割され得る粒子の最小数の少なくとも100倍である、請求項３７に記載の方法。