JP2002528135A - 発現されたメッセンジャーＲＮＡの相対濃度の指数化（ｉｎｄｅｘ）及び決定方法 - Google Patents

発現されたメッセンジャーＲＮＡの相対濃度の指数化（ｉｎｄｅｘ）及び決定方法

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JP2002528135A JP2000579778A JP2000579778A JP2002528135A JP 2002528135 A JP2002528135 A JP 2002528135A JP 2000579778 A JP2000579778 A JP 2000579778A JP 2000579778 A JP2000579778 A JP 2000579778A JP 2002528135 A JP2002528135 A JP 2002528135A
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カール ダブリュー． ヘイゼル、
ブライアン エス． ヒルブッシュ、
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デジタル ジーン テクノロジーズ インコーポレイテッド
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Abstract

(57)【要約】 ｍＲＮＡ個体群中のｍＲＮＡの同時に起こる配列特異の識別の改善された方法は、ｍＲＮＡの濃度に強度がおおよそ相当するゲル上の別個のバンドとして組織によって表現されるほぼすべてのｍＲＮＡの視覚化ができる。一般に、方法は、３′−終点を固定するためにアンカープライマを使用するｃＤＮＡの構成、次のＲＮＡ合成のためのバクテリオファージ特異のプロモーターを含むベクトルのｃＤＮＡから複製した挿入物を生成し、複製した挿入物の線形化された断片を生成し、ｃＲＮＡを準備し、ｃＲＮＡからのｃＤＮＡを転写し、およびｃＤＮＡの２つの配列特異的ＰＣＲの増幅を実行することを含む。好ましい具体化では、この方法は、ＰＣＲ生成物のヌクレオチド配列の長さおよび少なくとも一部と、ヌクレオチド配列のデータベースから決定された期待値との比較を含む。この方法は、薬の管理あるいは生理学または病理学の条件に関連したｍＲＮＡの表現の変化を識別することができる。さらに改善された方法の実施に役立つベクトルおよびプライマが提供された。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） この発明は、特異的に表現されたｍＲＮＡの同時識別方法、及び、相対濃度の
測定に関する。
【０００２】 組織を構成するタンパク質分子の完全な特性は、例えば、医薬のデザイン改良
、個々の患者の最適処置の選択、及び、より適合した生体物質の開発に有用であ
ろう。このような表現されたタンパク質の特性は、それらの識別、配列決定、表
現の組織部位の決定、生化学的活性の解明、及び、これらの活性が組織生理機能
をいかに決定するかの理解を含むであろう。医学的応用について、医薬または毒
性試薬に反応して各タンパク質の濃度がどの様に変化するかについての情報も説
明に含むべきである。
【０００３】 遺伝子は幾つあるのか？という問題の範囲を考えてみよう。ヒトにおいて幾つ
の遺伝子が表現されるかという主題は、少なくとも２０年の研究の後においても
はっきりしない。異なる臓器における遺伝子の表現パターンに向けられた直接的
な研究は殆どない。変異量（Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｌｏａｄ）の研究（Ｊ．Ｏ
．Ｂｉｓｈｏｐ，”Ｔｈｅ Ｇｅｎｅ Ｎｕｍｂｅｒｓ Ｇａｍｅ，”Ｃｅｌｌ
２：８１−８６（１９７４）；Ｔ．Ｏｈｔａ ＆ Ｍ．Ｋｉｍｕｒａ，”Ｆｕ
ｎｃｔｉｏｎａｌ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｔ
ｅｒｉａｌ ａｓ ａ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌ
ｕｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ ２２３：１１８−１１９（１９７１））は、本質
的な遺伝子は３×１０４及び１０５の間であると示唆している。
【０００４】 ｃＤＮＡクローニング技術以前は、遺伝子表現上の情報は、ＲＮＡ複雑性の研
究：多量の異なる特異性を有するＲＮＡ分子の混合固体群の観察に基づいたアナ
ログ測定（バルクでの測定）からきていた。予期せぬ程度に、初期のアナログの
複雑性の研究は、各臓器においてそのｍＲＮＡ全体のほとんどを構成する分子は
その全体の複雑さのほんの小さな部分を構成するに過ぎないという事実の隠れた
複雑な要素によって歪められた。後に、ｃＤＮＡクローニングは、デジタル測定
（つまり、個々の種における配列−特異測定）がなされるのを可能にしたので、
ｍＲＮＡ表現についてのより最近の概念は個々のＲＮＡ種の実際の観察に基づい
ている。
【０００５】 脳、肝臓及び腎臓は、アナログＲＮＡ複雑性測定によって最も広範に研究され
ているヒトの臓器である。複雑性の最も低い評価は、ハスティ及びビショップ（
Ｎ．Ｄ．Ｈａｓｔｉｅ ＆ Ｊ．Ｂ．Ｂｏｓｈｏｐ，”Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ａｂｕｎｄａｎｃｅ Ｃｌａｓｓｅｓ ｏｆ Ｍｅ
ｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｉ Ｍｏｕｓｅ Ｔｉｓｓｕｅｓ，”Ｃｅｌｌ ９：
７６１−７７４（１９７６））のそれであり、彼らは、３×１０９の塩基対のげ
っ歯類ゲノムの２３×１０６のヌクレオチドが脳において、２３×１０６が肝臓
において、２２×１０６が腎臓において表現され、ＲＮＡセットにおいてほぼ完
全に重なっていることを示唆している。これは、非常に少ない数の臓器特異ｍＲ
ＮＡを示している。しかし、実験はこれらの値が明らかに過小評価であることを
示している、というのは、多数のｍＲＮＡ分子、おそらくこの早期の研究の検出
限界以下における多量のｍＲＮＡ分子、が脳において表現されるが肝臓や腎臓で
検出可能であることが示されたからである。多くの他の研究者（Ｊ．Ａ．Ｂａｎ
ｔｌｅ ＆ Ｗ．Ｅ．Ｈａｈｎ，”Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ａｎｄ Ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ ＲＮＡ ｉｎ
ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｂｒａｉｎ，”Ｃｅｌｌ ８：１３９−１５０（１９７
６）；Ｄ．Ｍ．Ｃｈｉｋａｒａｉｓｈｉ，”Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｏｆ Ｃｙ
ｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｐｏｌｙａｄｅｎｙｌａｔｅｄ ａｎｄ Ｎｏｎ−Ａｄｅ
ｎｙｌａｔｅｄ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，
”Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８：３２４９−３２５６（１９７９））は、脳
における１００−２００×１０６の間でアナログ複雑性を測定しており、肝臓及
び腎臓において２から３倍低い評価である。これらの値は、デジタルクローニン
グの研究により指示されている（Ｒ．Ｊ．Ｍｉｌｎｅｒ ＆ Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃ
ｌｉｆｆｅ，”Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｒａｔ Ｂｒａｉｎ，
”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：５４９７−５５２０（１９８３））。
【０００６】 バルクのｍＲＮＡにおけるアナログ測定は、平均ｍＲＮＡ長さが１４００−１
９００ヌクレオチドの間であることを示唆した。２００の無作為選択したｃＤＮ
Ａを用いたノーザンブロッティング（Ｍｉｌｎｅｒ ＆ Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，
ｓｕｐｒａ）によりＲＮＡサイズを測定する脳のｍＲＮＡ長さの体系的デジタル
分析において、ｍＲＮＡサイズデータがＲＮＡプリバレンスについて測定された
とき、平均長さが１７９０ヌクレオチドであり、アナログ測定によって決定され
たものと同じであることが判った。しかし、脳のｍＲＮＡ複雑性のほとんどを構
成するｍＲＮＡの平均長さは５０００ヌクレオチドである。より稀な脳ＲＮＡが
より長いだけでなく、それらは脳特異的である一方、よりプリバレントな脳ｍＲ
ＮＡほど、より遍在的に表現され平均で十分短い。
【０００７】 これらのｍＲＮＡ長さについての概念は、より最近、配列が決定されている脳
ｍＲＮＡ（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，”ｍＲＮＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｍａｍｍ
ａｌｉａｎ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ，”Ａｎｎｕ．Ｒ
ｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１：１５７−１９８（１９８８））の長さから裏付
けられている。故に、１−２×１０８ヌクレオチド複雑性及び５０００−ヌクレ
オチド平均ｍＲＮＡ長さは、脳において表現されるがその約２／３は肝臓又は腎
臓において検出されない見積られた３００００のｍＲＮＡにむけて計算する。脳
は明らかにヒトの臓器特異的遺伝子のかなりの部分を負う。ほとんどの脳ｍＲＮ
Ａは低濃度で表現される。全ヒトｍＲＮＡ複雑性測定はなく、５０００ヌクレオ
チが非神経系臓器についてのｍＲＮＡ長さの良い評価であるかも判らない。全遺
伝子数の正当な評価は５００００と１０００００との間かも知れない。
【０００８】 生理機能の化学的理解による前進に最も必要とされることは、ゲノムプラスセ
ルタイプによってコードされ各々が表現されるタンパク質配列のメニューである
。現在では、ゲノム配列において介在する配列（イントロン）が存在することか
ら、タンパク質配列は、遺伝子からではなく、ｃＤＮＡからのみ高い信頼性で導
かれる。ヒトのゲノムの完全なヌクレオチド配列でさえ、その表現された配列の
特徴付けの代用にはならないであろう。故に、複写された配列を収集し表現の部
位を証明するための体系的戦略が必要である。そのような戦略は、脳内において
異なるように表現される配列の決定における特異的使用によるであろう。それは
必然的に、そのような終結に達する、つまり、全ｍＲＮＡを識別する研究の最終
ゴールである。各種ｍＲＮＡの異なるプリバレンス及び多くの異なる臓器によっ
て表現される多数の異なるｍＲＮＡによって得る終結は困難かもしれない。それ
を得る努力によって、遺伝子スペースの次元の進歩によるより確かな説明を手に
することが可能となる。
【０００９】 クレイグ ベンターの研究所において実施された研究（Ｍ．Ｄ．Ａｄａｍｓ
ｅｔ ａｌ．，”Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
： Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｔａｇｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ
Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：１６５１−１６５
６（１９９１）；Ｍ．Ｄ．Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，”Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｉ
ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ２，３７５ Ｈｕｍａｎ Ｂｒａｉｎ Ｇ
ｅｎｅｓ，”Ｎｏｔｕｒｅ ３５５：６３２−６３４（１９９２））は人間の脳
ｍＲＮＡの無作為に選ばれたｃＤＮＡクローンの遊離、それらの３’末端の短い
単一パス配列、約３００塩基対、の決定、及び、これらのうちのある２５００の
”表現された配列タグ”のデータベースとしての編集に帰結している。このデー
タベースは、有用である一方、特異的表現の知識を提供していない。故に、単に
単一臓器における表現よりも、むしろ、各種の生理的又は病理学的状態あるいは
医薬処置の効果として、脳及び他の臓器の領域内において各種の実例に応じて遺
伝子をその表現の全体的なパターンに基づいて認識可能であることが重要である
。
【００１０】 他の研究は、ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）を用いたデータベ
ースの完成に焦点を当てている。ウィリアムズら（Ｊ．Ｇ．Ｋ．Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ ｅｔ ａｌ．，”ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ａｍｐｌｉｆｉｅ
ｄ ｂｙ Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ａｒｅ Ｕｓｅｆｕｌ ａｓ
Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｒｋｅｒｓ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：
６５３１−６５３５（１９９０））及びウェルシュ＆マクレランド（Ｊ．Ｗｅｌ
ｓｈ ＆ ＭｃＣｌｅｌｌａｎｄ，”Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ
ｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ Ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ ａｎｄ
ａ Ｍａｔｒｉｘ ｏｆ Ｐａｉｒｗｉｓｅ Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏ
ｆ Ｐｒｉｍｅｒｓ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１８：７２１３−７２
１８（１９９０））は、任意に選ばれた配列の単一の１０−ｍｅｒ（量体）プラ
イマ、つまり、入手容易ないかなる１０−ｍｅｒプライマであっても、人間、植
物、イースト又はバクテリアのゲノムＤＮＡのような複雑なＤＮＡテンプレート
でのＰＣＲに用いられるとき、ＰＣＲ生成物の配列を生じることを示した。プラ
イミングの結果は、プライマとテンプレートＤＮＡとの間の不完全な相補性があ
ることを示した。推定上、部分的にミスマッチしたプライマ結合部位がゲノムを
通してランダムに分布する。時折、対向して配向しているこれらの部位の２つは
、ＰＣＲ生成物バンドを生じるのに互いに十分に近くに位置した。平均で８−１
０の生成物があり、そのサイズは約０．４から約４ｋｂで変動があり、各プライ
マについて異なる変動性を有していた。ＰＣＲ生成物の配列は、同じ種の個体間
で差を示した。これらの著者らは、任意のシングルプライマを用いて遺伝子研究
のために制限フラグメント長さポリモルフィスム（ＲＦＬＰ）様の情報を生成す
ることができることを提案した。他の者は、このテクノロジー（Ｓ．Ｒ．Ｗｏｏ
ｄｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，”Ｒａｎｄｏｍ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｏｌｉｇｏｎ
ｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ Ｄｅｔｅｃｔ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ
ＤＮＡ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｗｈｉｃｈ Ｓｅｇｒｅｇａｔｅ ｉｎ Ｉｎｂ
ｒｅｄ Ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｅ，”Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ３：７
３−７８（１９９２）；Ｊ．Ｈ．Ｎａｄｅａｕ ｅｔ ａｌ．，”Ｍｕｌｔｉｌ
ｏｃｕｓ Ｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ Ｍｏｕｓｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓ
ｉｓ：ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｓｉｎｉｇｌ
ｅ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ａｒｂｉｔｒａｒｙ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅ
ｑｕｅｎｃｅ，”Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ３：５５−６４（１９９２））を応
用した。
【００１１】 ２つのグループ（Ｊ．Ｗｅｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，”Ａｒｂｉｔｒａｒｉｌｙ
Ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ Ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ ｏｆ ＲＮＡ，”Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：４９６５−４９７０（１９９２）ｌ Ｐ．
Ｌｉａｎｇ ＆ Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ，”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓ
ｐｌａｙ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｂｙ
Ｍｅａｎｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ
ｏｎ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１（１９９２））は、ｍＲＮＡ
個体郡を比較する方法を採用した。ライアン及びパーディの研究において、この
ｍＲＮＡ特異（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）表示と呼ばれる方法は、２つの関連
するセルタイプ、普通及び腫瘍性マウスＡ３１のセル、によって表現されるｍＲ
ＮＡの個体群を比較するのに用いられた。各実験について、５’プライマとして
任意の１つの１０−ｍｅｒが、３’アンカープライマとしてポリＡテールのサブ
セットと相補的なオリゴヌクレオチドが用いられ、２つのセルタイプと比較され
るｃＤＮＡ上の３５Ｓ−ｄＮＴＰの存在下でＰＣＲ展開（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ
ｉｏｎ）を行う。生成物は、配列決定ゲル上で解析され、１００から５００ヌク
レオチドに及ぶ５０−１００バンドが観察された。ゲノムＤＮＡテンプレートに
おいて観察されているように、バンドは、推定上、部分的にミスマッチした５’
プライマ部位及び３’アンカープライマの相補部を含むｍＲＮＡの３’末端に対
応するｃＤＮＡの展開から生じる。各プライマ対について、２つのｃＤＮＡから
展開されたバンドのパターンは、識別できないバンドの約８０％のインテンシテ
ィと類似であった。あるバンドは、１つの又は他のＰＣＲサンプルにおいてより
強烈であり、いくつかは２つのサンプルのうちの１つのみにおいて検出された。
【００１２】 更なる研究（Ｐ．Ｌｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，”Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ
ａｎｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍ ＲＮＡｓ ｂｙ
Ｍｅａｎｓ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｄｉｓｐｌａｙ： Ｒｅｆｉｎ
ｅｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．２１：３２６９−３２７５（１９９３））は、低濃度の投入ＲＮＡで手
順がうまくいく（より稀な種については定量されないが）ことを示し、特異性は
元来、３’アンカープライマのヌクレオチドにある。少なくとも識別された特異
的に検出されるＰＣＲ生成物の３分の１は、少なくとも２５％のファルスポシテ
ィブレート（ｆａｌｓｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ）で、特異的に表現され
るＲＮＡに対応する。
【００１３】 もし哺乳動物の５０，０００から１００，０００ｍＲＮＡのすべてがこの任意
プライマーＰＣＲアプローチにアクセス可能であったならば、約８０から９５の
５’任意プライマーと１２の３’アンカープライマーは約１０００ＰＣＲパネル
とゲルにおいてポアソン分布により計算され、これらのｍＲＮＡの約２／３が同
定されるという蓋然性を与えることが要求される。
【００１４】 以下の理由によりすべてのｍＲＮＡがこの方法により検出しやすいとは疑わし
い。そのような調査における表面に対するｍＲＮＡとして、オートラジオグラフ
上の信号を生成し、不整合なプライマー結合やプライミングのための部位として
供することが可能なその３’末端５００ヌクレオチドにおける配列を含むに十分
に有力でなければならない。個々のｍＲＮＡスペシーズがより有力であるほど、
製品を産生する可能性が高い。従って、有力なスペシーズが多くの異なる任意プ
ライマーのバンドを与えるであろう。この後者の特性は任意プライマーの選択に
基づき予期できない見込みの要素を含むので、任意プライマー方法により終結を
アプローチすることが困難である。また、一つの研究室から他の研究室に移動可
能でかつ信頼性のある情報にとって、不整合なプライミングは反応条件において
得られるわずかな変動を有する異なるＰＣＲ機を用いる異なる研究室条件で高い
再現可能性を備えなければならない。不整合なプライミングの基礎はほとんど理
解されていないので、Ｌｉａｎｇ＆Ｐａｒｄｅｅ・ディファレンシャル表示方法
により得られたデータからデータベースを構築する欠点となる。
【００１５】 米国特許第５４５９０３７号（’０３７）及び同第５８０７６８０号（’６８
０）は、５’末端ジェネレーションの不確かな面を減少し、異なる設定において
データを無制限に再現可能とすることを許容するｍＲＮＡスペシーズの改良され
た異なる表示方法について言及している。この方法は、潜在的に再現不可能な不
整合なプライミングに依存せず、完全な調査に必要なＰＣＲパネル及びゲルの数
を減少し、二本鎖配列データを迅速に集めることを可能にする。さらに、改良さ
れた方法は、ｍＲＮＡの同じスペシーズから得られた同時信号の数をまた減少さ
せる。’０３７および’６８０特許はここにこの開示の一部として参照により盛
り込む。
【００１６】 ’０３７特許に開示された方法のさらなる改良の必要性が残る。例えば、その
方法の特殊性は、相補的ＤＮＡ分子の合成に際し及びＰＣＲ反応に際してミスプ
ライミングを減少させることにより改良することができる。さらに、その技術は
、より再現可能に、より繊細に、使い方が容易となるようにさらに改良すること
ができる。好ましくは、その技術は、得られた配列を用いてデータベースを形成
し、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸのようなコンピュータプログラムを用いて配列
同定や類似性を認識するためにＧｅｎＢａｎｋのようなヌクレオチドデータベー
スを走査する能力を提供する。
【００１７】 （概要） 我々は、ｍＲＮＡポピュレーションにおけるｍＲＮＡの同時の配列特異性同定
のための改良された方法を開発した。改良された方法は、（１）長さａ＋ｂ（こ
こで、ａは制限エンドヌクレアーゼ認定部位の塩基における長さであり、ｂはパ
ーシング塩基の数（ここで、６≧ｂ≧３である。）である。）の部分ヌクレオチ
ド配列により、及び、（２）ポリ（Ａ）テールからその部分配列の距離により決
定されるアイデンティテイまたはアドレスに基づいてｍＲＮＡをソートする。典
型的には、アイデンティテイまたはアドレスは、制限エンドヌクレアーゼとして
の４つの塩基認定部位及び４つのパーシング塩基を含む部分配列により決定され
る。１つの好ましい実施形態においては、制限エンドヌクレアーゼの認定部位は
ＭｓｐＩであり、部分配列はＣ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４である。
それはｍＲＮＡのヌクレオチド配列に依存し、所定の組織のその有効性ではない
ので、その方法は、その検出閾値を超える濃度で存在するすべてのｍＲＮＡを考
慮することができる。ディファレンシャルディスプレイ及びＲＡＰ−ＰＣＲ法と
対照的に、５’末端のジェネレーションに不確かな面はない。
【００１８】 本発明の方法の１つの好ましい実施形態（図１）によれば、ｍＲＮＡサンプル
のそれぞれから産生されるｃＤＮＡライブラリは、ＭｓｐＩの最遠位部位からポ
リ（Ａ）テールの始めまで、ｍＲＮＡの初期相対濃度にほぼ従う開始ＲＮＡサン
プルにおけるほぼすべてのポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡの最端の３’末端のコピーを含
む。各スペシーズのインサートの両端はｍＲＮＡそれ自体の配列により正確に規
定されるので、断片長は各スペシーズに均一であり、ゲル上の別個のバンドとし
てそれらの後の具象化を可能にする。これらの長さがｍＲＮＡの組織源に関わら
ず一定であり、そのアプローチの重要な基本概念である。ＭｓｐＩ認定配列を欠
くメッセンジャーＲＮＡは示されないが、これらは比較的まれである。これらの
ｍＲＮＡは、異なる４つの塩基認定配列を認識する１つの異なる制限エンドヌク
レアーゼを用いた方法を適用することにより捕獲される。
【００１９】 本発明のかような実施形態の他の面は、３’制限エンドヌクレアーゼに隣接す
る配列の使用であり、一つの好ましい実施形態では、ＭｓｐＩ部位であり、少な
くとも２つの後続のＰＣＲステップにおいてｃＤＮＡをソートする。第１のＰＣ
Ｒステップは、例えばｐＢＣ ＳＫ＋のようなベクターから生じた配列をアニー
ルするプライマーを用いるが、非再発生ＭｓｐＩ部位のＣＧＧを横切って延び、
インサートの第１隣接ヌクレオチド（Ｎ１）を含む。このステップは、ｍＲＮＡ
の開始ポピュレーションを４つのサブプールに分離する。第２のＰＣＲステップ
において、第１のＰＣＲステップにより産生された４つのサブプールのそれぞれ
は、更なるインサート−インバーシブプライマー（Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ４）を
用いることによって６４に分割して総計２５６のサブプールにさらに分離される
。最後のＰＣＲステップにおいて蛍光標識化３’ＰＣＲプライマーを用いること
によりレーザ誘導された蛍光により検出のために蛍光ラベルが製品に組み込まれ
る。
【００２０】 好ましい実施形態では、電気泳動のような分離技術がＰＣＲ製品の標識化され
た分子を測定可能な強度の測定可能な長さに対応する明瞭なバンドに分解するの
に用いられる。適切な分離技術はゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、ＨＰＬ
Ｃ、ＭＡＬＤＩマス分光器、その他本発明により包含される５０〜５００塩基の
範囲を超える単一の塩基解析が可能な当業界で知られた好適な分離技術を含む。
【００２１】 一つの好ましい実施形態において、それぞれの最終ＰＣＲ反応製品は、従って
、４つの塩基制限エンドヌクレアーゼ部位と４つのパーシィブ塩基（例えば、Ｃ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ１−Ｎ２−Ｎ３−Ｎ４）を含む８個のヌクレオチド配列及びメ
ッセージの端部とｍＲＮＡの３’端末でのポリＡテールの第１のＡとの間の結合
部からのその配列の距離に基づいて、アイデンティテイまたはアドレスを割り当
てられる。ＰＣＲ製品断片のヌクレオチド配列（実験的に決定されまたはデータ
ベース配列から決定された両者）が知られたとき、断片はデジタル配列タグ（Ｄ
ＳＴ）、すなわち、本発明の方法により生じた３’末端ＥＳＴ（表示された配列
タグ）として参照される。適切な方法、好ましくはレーザ誘導された蛍光（但し
、放射性または磁気ラベリング及び検出も使用することができる。）を用いて検
出された標識化されたＰＣＲ製品断片の分離化したバンドの強度は、定量化され
、そのＰＣＲ製品断片に割り当てられたアドレスでデータベースにそれぞれのＰ
ＣＲ製品断片として記憶される。標識化されたＰＣＲ製品断片の分離したバンド
の強度は、ＰＣＲ製品断片に応じてｍＲＮＡの開始量に比例する。
【００２２】 一般に、本発明の方法は、以下のようになる。
【００２３】 （ａ）アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡポピュレーションから二
本鎖ｃＤＮＡポピュレーションを作成し、それぞれのアンカープライマーは、５
’末端と３’末端とを有し、（ｉ）７〜４０Ｔ残渣の区域と、（ｉｉ）６以上の
塩基を認識する第１の制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位であって
、切断のための部位はＴ残渣の区域に対して５’末端に向かって位置するものと
、（ｉｉｉ）４〜４０ヌクレオチドの第１のスタッファセグメントであり、その
第１のスタッファセグメントは第１の制限エンドヌクレアーゼによる切断のため
の部位に対して５’末端に向かって位置するものと、（ｉｖ）６以上の塩基を認
識する第１の制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位とＴ残渣の区域と
の間に介在する第２のスタッファセグメントと、（ｖ）−Ｖ，−Ｖ−Ｎ，及び−
Ｖ−Ｎ−Ｎ（ここで、ＶはＡ，Ｃ及びＧからなる群から選択されたデオキシリボ
ヌクレオチドであり、ＮはＡ，Ｃ，Ｇ及びＴからなる群から選択されたデオキシ
リボヌクレオチドであり、Ｖ及びＮのすべての可能性を含むアンカープライマー
を含む混合物である。）からなる群から選択されたアンカープライマーのそれぞ
れの３’末端に位置するフェイジング残渣とからなり、 （ｂ）第１の制限エンドヌクレアーゼと第２の制限エンドヌクレアーゼを有す
る二本鎖ｃＤＮＡを切断し、第２の制限エンドヌクレアーゼは４つのヌクレオチ
ド配列を認識してそれぞれ第１及び第２末端を有する二本鎖ｃＤＮＡ分子のポピ
ュレーションを形成し、 （ｃ）ステップ（ｂ）から各二本鎖ｃＤＮＡ分子をベクター内にバクテリオフ
ァージ特異性プロモータに対してアンチセンスである向きにベクターに挿入し、
挿入されたｃＤＮＡ分子を含む構造物のポピュレーションを形成し、それにより
挿入されたｃＤＮＡのセンス鎖の５’末端及びセンス鎖の３’末端にそれぞれ隣
接した５’及び３’フランキングベクター配列を規定し、上記構造物は前記第１
の制限エンドヌクレアーゼ部位と前記プロモータにおいて転写開始を規定する部
位との間の少なくとも長さで１５ヌクレオチドの３’フランキングベクター配列
を有し、 （ｄ）切断されたｃＤＮＡが挿入されクローン化された挿入体を含むベクター
を生成したベクターを備えたホスト細胞を形質転換し、 （ｅ）挿入されたｃＤＮＡ分子またはバクテリオファージ特異性プロモータの
配列を認識しないが、ベクターの配列を認識する少なくとも１つの制限エンドヌ
クレアーゼを含むステップ（ｃ）で生成された構造物のダイジェスチョンにより
挿入されたｃＤＮＡ分子を含む線形化されたフラグメントを発生し、得られた線
形化したフラグメントは少なくとも１５のヌクレオチドの５’フランキングベク
ター配列を二本鎖ｃＤＮＡ分子の第２の末端にベクター５’に有するようにし、 （ｆ）線形化されたフラグメントをバクテリオファージ特異性プロモータから
転写を開始可能なバクテリオファージ特異性ＲＮＡポリメラーゼでインキュベー
トすることによりアンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ作成を生じ、 （ｇ）反転トランスクリプターゼと１５〜３０の長さのヌクレオチドであって
５’フランキングベクター配列を相補するヌクレオチド配列である５’ＲＴプラ
イマーを用いてｃＲＮＡを転写することにより第１の鎖ｃＤＮＡを生じ、 （ｈ）第一鎖ｃＤＮＡを副プールの第一シリーズへ分割することと、第一鎖ｃＤ
ＮＡを第一ポリメラーゼ連鎖反応での鋳型とし、１５から３０ヌクレオチド長の
、３’隣接ベクター配列に対し相補的な、最初の制限エンドヌクレアーゼ部位と
、バクテリオファージ特異的プロモーターと３’末端構造が−Ｎ１として定義さ
れる、ここで「Ｎ」は４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴのう
ちの一つである、最初の５’ＰＣＲプライマーによる翻訳開始決定部位との間に
ある、最初の３’ＰＣＲ−プライマーと、１５から３０ヌクレオチド長で、最初
の５’ＰＣＲプライマーのうちの異なる一つが４つの異なる副プールの各々に用
いられるｃＲＮＡの挿入特異的ヌクレオチド群の一ヌクレオチドへの、最初の５
’ＰＣＲプライマーの相補性拡張を伴う５’隣接ベクター配列に対し相補的であ
る、最初の５’ＰＣＲプライマーとともに使用することによる、最初のＰＣＲ産
物セットの生成。
【００２４】 （ｉ）それぞれの副プールの第一シリーズでのＰＣＲ産物第一セットを、副プー
ルの第二シリーズにさらに分割することと、ＰＣＲ産物第一セットを第二ポリメ
ラーゼ連鎖反応のに対する鋳型とし、１５から３０ヌクレオチド長の、３’隣接
ベクター配列に対し相補的な、最初の制限エンドヌクレアーゼ部位と、バクテリ
オファージ特異的プロモーターによる翻訳開始決定部位との間にある、第二３’
プライマーと、３’末端構造が−Ｎ１−ＮＸとして定義され、ここでＮ１はその
副プールのための第一ポリメラーゼ連鎖反応に使われたＮ１と同一であり、「Ｎ
」はステップｈのように、そして「ｘ」は１から５の整数値であり、プライマー
は１５〜３０ヌクレオチド長で、全ヌクレオチド数が「ｘ」＋１でありここでは
第二５’ＰＣＲプライマーのうちの異なる一つが副プールの第二シリーズの異な
る副プールにおいて用いられ、ここで第二シリーズにおいて４ｘ副プールがる、
ｃＲＮＡの挿入特異的ヌクレオチド群を越えてのプライマーの相補性拡張を伴う
５’隣接ベクター配列に対し相補的である第二５’プライマーを共に使用するこ
とによる、ＰＣＲ産物の第二セット生成。
【００２５】 （ｊ）ｍＲＮＡの密度を表すｍＲＮＡの３’末端が象徴する配列特異的産物の表
示を生成するＰＣＲ生成物の第二セットの分析。
【００２６】 好適な実施例によれば、ビオチン半族はアンカープライマー、好ましくはアン
カープライマーの５’末端に結合される。この実施例では、ステップ（ｂ）にお
いてストレプタビジンがコートされた基質を有する第一の制限されたｃＤＮＡに
接触することにより第一の制限されたｃＤＮＡが残留ｃＤＮＡから分離される。
適切なストレプタビジンがコートされた基質はマイクロティテュレプレート、Ｐ
ＣＲチューブ、ポリスチレンビーズ、常磁性ポリマービーズおよび常磁性多孔性
ガラス片を含む。好ましいストレプタビジンがコートされた基質は常磁性ポリマ
ービーズの懸濁液（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓ，ＮＹ）で
ある。
【００２７】 好適な実施例によれば、３つのヌクレオチドは第１の５’ＰＣＲプライマーの
３’末端においてフォスフォジエステラーゼ−レジスタント連結、好ましくはフ
ォスフォロチオネート連結により結合される。別の好適な実施例によれば３つの
ヌクレオチドは第２の５’ＰＣＲプライマーの３’末端においてフォスフォジエ
ステラーゼ−レジスタント連結、好ましくはフォスフォロチオネート連結により
結合される。好ましくは３つのヌクレオチドは第１および第２の５’ＰＣＲプラ
イマーの３’末端においてフォスフォジエステラーゼ−レジスタント連結により
結合される。
【００２８】 典型的には、第２のＰＣＲ反応のプライマーの１つは蛍光標識に結合される。
適切な蛍光標識は以下の群から選択される。
【００２９】 スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３
−オン，６−カルボキシル酸，３’，６’−ジヒドロキシ−６−カルボキシフル
オレセイン（６−ＦＡＭ，ＡＢＩ）， スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３
−オン，５−カルボキシル酸，３’，６’−ジヒドロキシ−５−カルボキシフル
オレセイン（５−ＦＡＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３
−オン，３’，６’−ジヒドロキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ，Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）−
キサンチリウム（６−カルボキシルテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）
，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ３，６−ジアミノ−９−（２−カルボキシフェニル）−キサンチリウム（Ｒｈ
ｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
）， スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−キサンテン］−６−カルボキ
シル酸，５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキ−２’，７’−ジメトキシ−
３−オキソ（ＪＯＥ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， １Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ［２，３，４−ｉ，ｊ，５，６，７
−ｉ’，ｊ’］ジキノリジン−８−ｉｕｍ，−（２，４−）ジスルフォフェニル
）−２，３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ，インナーソルト
（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ６−（（４，４−ジフルオロ−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−
ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−プロピオニル）アミノ）ヘキサノ酸（ＢＯＤＩＰＹ Ｆ
Ｌ−Ｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ６−（（４，４−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５−（４−メトキシフェニ
ル）−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−プ
ロピオニル）アミノ）ヘキサノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ， Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ６−（（（４−（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ｂｏｒａ
−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｙｌ）フェノキシ）ア
セチル）アミノ）−ヘキサノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ， Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ４，４−ジフルオロ−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅ
ｎｅ−３−ペンタノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−Ｃ５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ）， ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａ
ｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−プロパノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ， Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ４，４−ジフルオロ−５−フェニル−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ
−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−プロパノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）， ４，４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１，３−ブタジエニル）−４−ｂ
ｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−プロピオン酸（
ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ） ４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ｂｏｒａ−３ａ，４ａ−ｄｉａｚａ
−ｓ−ｉｎｄａｎｃｅｎｅ−３−プロピオン酸， ６−（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ｂｏｒａ−３ａ
，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｙｌ）スチリロキシ）アセチ
ル）アミノヘキサノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ）， ６−（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−４−ｂｏｒａ−３ａ
，４ａ−ｄｉａｚａ−ｓ−ｉｎｄａｃｅｎｅ−３−ｙｌ）スチリロキシ）アセチ
ル）アミノヘキサノ酸（ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ），および ９−（２，４（または２，５）−ジカルボキシフェニル）−３，６−ｂｉｓ（
ジメチルアミノ）−キサンチリウム，ｉｎｎｅｒ ｓａｌｔ （ＴＡＭＲＡ，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ） 他の好適な蛍光標識としては、４，７，２’，４’，５’，７’ヘクサクロロ
６−カルボキシフルオレセイン（”ＨＥＸ”，ＡＢＩ），”ＮＥＤ”（ＡＢＩ）
および４，７，２’，７’テトラクロロ６−カルボキシフロレセイン（”ＴＥＴ
”，ＡＢＩ）が知られている。
【００３０】 典型的には、ステップ（ａ）で生成される残基は−Ｖ−Ｎ−Ｎの第３’末端を
有する。好ましくはステップ（ａ）で生成される残基は−Ｖまたは−Ｖ−Ｎの第
３’末端を有する。
【００３１】 このましい実施例においては、ステップ（ｉ）の”ｘ”は３である。好ましく
はステップ（ａ）で生成される残基は−Ｖ−Ｎ−Ｎであり、ステップ（ｉ）の”
ｘ”は３である。
【００３２】 典型的には、アンカープライマーの各はＴ残基の中の８〜１８Ｔ残基を有する
。好ましい実施例においては、アンカープライマーの各はＴ残基の中の１８Ｔ残
基を有する。他の実施例においてはアンカープライマーの各はＴ残基の中の８〜
１８Ｔ残基を有するが、好ましくは８〜１６Ｔ残基であり、より好ましくは８〜
１４Ｔであり、最も好ましくは８〜１２Ｔである。他の実施例においてはアンカ
ープライマーの各はＴ残基の中の１２Ｔ残基を有する。
【００３３】 典型的にはアンカープライマーの第一の詰まった配列は１４残基長である。好
適な実施例によれば、第一の詰まった配列はヌクレオチドのシーケンスがＡ−Ａ
−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１
）である。好ましい実施例においては第一の詰まった配列はヌクレオチドのシー
ケンスがＧ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ（ＳＥＱＩ
Ｄ ＮＯ：２）である 典型的には、Ｔ３プロモータ、Ｔ７プロモータ、ＳＰ６プロモータの群の中か
らバクテリオファージ特異性プロモータが選択される。好ましくは、バクテリオ
ファージ特異性プロモータはＴ３プロモータである。
【００３４】 好適な実施例では、ｃＲＮＡからｃＤＮＡへの翻訳の開始のためのプライマの
シーケンスは、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４）である。他の実施例においては、ｃＲＮＡか
らｃＤＮＡへの翻訳の開始のためのプライマのシーケンスは、Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−
Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｃ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：２８）である。さらに他の実施例においては、ｃＲＮＡからｃＤＮＡへの翻
訳の開始のためのプライマのシーケンスは、Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３５）である
。
【００３５】 好適な実施例では、ベクターはＣｌａＩおよびＮｏｔＩでクリーブされたプラ
ズミドｐＢＣＳＫ＋であり、ステップ（ｈ）および（ｉ）の３’ＰＣＲプライマ
ーは、Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｔ（ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：４７）である。他の実施例では、ベクターはＣｌａＩおよびＮｏｔＩ
でクリーブされたプラズミドｐＢＣＳＫ＋であり、ステップ（ｈ）および（ｉ）
の３’ＰＣＲプライマーは、Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８）である。
【００３６】 典型的には、６つ以上の基部を識別する第１の制限エンドヌクレアーゼは、Ａ
ｓｃＩ，ＢａｅＩ，ＦｓｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰｍｅＩ，ＰｐｕＭＩ，Ｒ
ｓｒＩＩ，ＳａｐＩ，ＳｅｘＡＩ，ＳｆｉＩ，ＳｇｆＩ，ＳｇｒＡＩ，ＳｒｆＩ
，Ｓｓｅ８３８７ＩおよびＳｗａＩである。好ましい６つ以上の基部を識別する
第１の制限エンドヌクレアーゼはＮｏｔＩである。
【００３７】 典型的には、４ヌクレオチドシーケンスを識別する第２の制限エンドヌクレア
ーゼは、ＭｂｏＩ，ＤｐｎＩＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，Ｔｓｐ５０９Ｉ，ＨｐａＩＩ，
ＢｆａＩ，Ｃｓｐ６Ｉ，ＭｓｅＩ，ＨｈａＩ，ＮｌａＩＩＩ，ＴａｑＩ，Ｍｓｐ
Ｉ，ＭａｅＩＩおよびＨｉｎＰｌＩである。典型的には、４ヌクレオチドシーケ
ンスを識別する第２の制限エンドヌクレアーゼは、ＭｓｐＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，Ｎ
ｌａＩＩＩである。
【００３８】 典型的には、ステップ（ａ）で使用される制限エンドヌクレアーゼは、ステッ
プ（ｂ）で使用される第２の制限エンドヌクレアーゼ４ヌクレオチドシーケンス
を含むことを識別する。好ましい実施例においては、第２の制限エンドヌクレア
ーゼはＭｓｐＩであり、ステップ（ｅ）で使用される制限エンドヌクレアーゼは
ＳｍａＩである。他の実施例では、第２の制限エンドヌクレアーゼはＴａｑＩで
あり、ステップ（ｅ）で使用される制限エンドヌクレアーゼはＸｈｏＩである。
他の選択的実施例では、第２の制限エンドヌクレアーゼはＨｉｎＰｌＩであり、
ステップ（ｅ）で使用される制限エンドヌクレアーゼはＮａｒＩである。他の一
方の選択的実施例では、第２の制限エンドヌクレアーゼはＭａｅＩＩであり、ス
テップ（ｅ）で使用される制限エンドヌクレアーゼはＡａｔＩＩである。
【００３９】 典型的には、ステップ（ｃ）のベクターはベクタースタファーシーケンスに隣
接する第１および第２の制限エンドヌクレアーゼサイトを有するサーキュラーＤ
ＮＡの形態を備え、さらに第１および第２のベクター制限エンドヌクレアーゼサ
イトにおいてベクターをクリーブする制限エンドヌクレアーゼはによってベクタ
ーが消化されるステップを備える。好ましくは、ベクタースタファシーケンスは
第１および第２のベクター制限エンドヌクレアーゼサイト間に内部ベクタースタ
ファ制限エンドヌクレアーゼサイトを含む。
【００４０】 １つの最適な宿主細胞は大腸菌である。
【００４１】 典型的には、ステップ（ｅ）は内部ベクタースタファ制限エンドヌクレアーゼ
サイトにおいてベクターがクリーブされる制限ヌクレアーゼとともにベクターが
消化されるステップを含む。
【００４２】 典型的には、ステップ（ｅ）で用いた制限酵素は、ベクターを内部のベクター
集積点の制限酵素作用サイトでも切断する。
【００４３】 他の制限酵素については、内部の４塩基の認識部位を含む６塩基の認識部位を
有する適合する制限酵素なしに、ｐＳＫを直鎖化する手順は、（ｉ）挿入鎖を含
むプラスミドを２つの断片、すなわち制限酵素ＸｈｏＩにより切断した第１の断
片及び制限酵素ＳａｌＩにより切断した第２の断片、に分けることと、（ｉｉ）
切断後に第１と第２の断片を再結合させることと、（ｉｉｉ）再結合させた断片
を３つの第３の断片に分け、１番目の第３断片を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにより
、２番目の第３断片を制限酵素ＢａｍＨＩにより、３番目の第３断片を制限酵素
ＥｃｏＲＩにより、それぞれ切断することと、（ｉｖ）母集団の約１／６が酵素
の可能な組み合わせのそれぞれによる切断の生成物と対応する直鎖化した断片の
母集団を作ることを目的とした温浸の後、第３の断片を再結合させること、とか
らなる。
【００４４】 典型的には、ｍＲＮＡの母集団は、ポリアデニレーションしたｍＲＮＡの反応
種が濃縮されている。
【００４５】 典型的には、ステップ（ｊ）における増幅した断片は、生成物を表示するため
の電気泳動により分解される。好ましくは、電気泳動により表示された生成物の
強度は、元の混合物における生成物に対応するｍＲＮＡの濃度とほぼ比例する関
係にある。好ましい実施形態としては、この方法はさらに、電気泳動後のそのｍ
ＲＮＡに対応する生成物の強度から元の混合物における各々のｍＲＮＡの相対存
在比を決定するステップからなる。
【００４６】 典型的には、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅した断片を電気泳動により分解
するステップは、複合ゲルにおける断片の電気泳動からなる。
【００４７】 一実施形態においては、この方法はさらに、 （ｋ）サンプル中にｍＲＮＡの３’−末端が存在することを示すバンドが現れ
ているエレクトロフェログラムよりそのｍＲＮＡに対応するｃＤＮＡの少なくと
も１つ以上を溶出することと、 （ｌ）ポリメラーゼ連鎖反応において分離されたＰＣＲ反応生成物を増幅する
ことと、 （ｍ）プラスミドへ増幅した分離されたＰＣＲ反応生成物を転写することと、 （ｎ）プラスミドより転写された分離されたＰＣＲ反応生成物に対応するＤＮ
Ａを合成することと、 （ｏ）転写された分離されたＰＣＲ反応生成物を連結すること、よりなる。
【００４８】 本発明の他の実施形態においては、 （ａ）ｍＲＮＡ母集団を分離するステップ （ｂ）各アンカープライマーが５’終点および３’終点およびｉ）７〜４０Ｔ
の残留物の地域；（ｉｉ）８つの塩基を認識する第１の制限酵素による切断のた
めのサイトで、該サイトはＴ残留物の地域に関する５’−終点に向かって位置し
ている切断のためのサイト；（ｉｉｉ）４〜４０のヌクレオチドの第１のスタッ
ファー断片で、第１の制限酵素によって切断のためのサイトに関する５’−終点
に向かって位置している第１のスタッファー断片；（ｉｖ）６塩基以上かつＴ残
留物の地域を認識する第１の制限酵素による切断のためにサイト間に置かれた第
２のスタッファー断片、および（ｖ）−Ｖ、−Ｖ−Ｎあるいはアンカープライマ
ーの各々３’−終点に位置した−Ｖ−Ｎ−Ｎのうちの１つによって定義される調
整された残留物（式中Ｖは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含むグループから選択される
デオキシリボヌクレオチド；および、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴを含むから選択さ
れるデオキシリボヌクレオチドであって、ＶおよびＮである可能性をすべて含ん
でいるアンカープライマーを含む混合物）；を含み、アンカープライマーの混合
に使用するｍＲＮＡ母集団からの二重らせん構造のｃＤＮＡ母集団を準備するス
テップ （ｃ）第１の制限酵素および第１と第２の終点がある二重らせん構造のｃＤＮ
Ａ分子の母集団を形成するために４つのヌクレオチドシーケンスを認識する第２
の制限酵素を備えた二重らせん構造のｃＤＮＡ母集団を切断するステップ； （ｄ）挿入されたｃＤＮＡ分子を含む母集団を形成するベクター内のＴ３プロ
モーターに関してアンチセンスのオリエンテーションにベクターにステップ（ｂ
）からの個々の二重らせん構造のｃＤＮＡ分子を挿入するステップで、５’およ
び挿入されたｃＤＮＡのセンスの５’終点に隣接しているベクターシーケンスの
側面に位置する３’およびセンスストランドの３’終点をそれぞれ定義して、第
１の制限酵素サイトと前記プロモーターに転写開始を定義するサイトの間の長さ
で少なくとも１５のヌクレオチドのベクターシーケンスの側面に位置する３’を
有する； （ｅ）クローンを含むベクターを生産するために切断されたｃＤＮＡが挿入さ
れたベクターを備えた大腸菌を変形するステップ； （ｆ）挿入された一方のｃＤＮＡ分子中の、あるいはＴ３プロモーター中のシ
ーケンスを認識しない少なくとも１つの制限酵素を備えたステップ（ｃ）の中で
生産された母集団の温浸によって、挿入されたｃＤＮＡ分子を含む直鎖化された
断片を生成するステップ； （ｇ）Ｔ３プロモーターからの転写を始めることができるＴ３ＲＮＡポリメラ
ーゼを備えた直鎖化された破片をインキュベートすることによりアンチセンスｃ
ＲＮＡ転写するｃＲＮＡ調整物を生成するステップ； （ｈ）逆転写酵素および１５から３０の長さのヌクレオチドであり、ベクター
シーケンス側面に位置する３’と相補的であるヌクレオチド・シーケンスからな
る３’ＲＴプライマーを使用して、ｃＲＮＡの転写により第１のストランドｃＤ
ＮＡを生成するステップ； （ｉ）サブプールの第１のシリーズ中への第１のストランドｃＤＮＡの分割を
し、第１の制限酵素サイトと、特定のＴ３プロモーターおよび−Ｎ１（「Ｎ」は
４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧあるいはＴのうちの１つで、第１の
５’ＰＣＲプライマーは１５から３０の長さのヌクレオチドであり、ｃＲＮＡの
挿入した特定ヌクレオチドの１つのヌクレオチドへ伸びる第１の５’ＰＣＲプラ
イマー相補性を備えたベクトルシーケンスの側面に位置する５’と相補的である
。また、第１の５’ＰＣＲプライマーの異なった１つは、４つの異なったサブプ
ールの各々で使用される。）を含む３’終点を有すると定義される第１の５’Ｐ
ＣＲプライマーにより転写開始を定義するサイトとの間のベクトルシーケンス側
面に位置する３’と相補的である１５〜３０の長さのヌクレオチドの第１の３’
ＰＣＲプライマーを備えた第１の合成酵素連鎖反応用テンプレートとして第１の
ストランドｃＤＮＡを使用することによりＰＣＲ生成物の第１のセットを生成す
るステップ； （ｊ）サブプールの第１のシリーズの各々でのサブプールの第２のシリーズ中
へのＰＣＲ生成物の第１のセットの分割をし、第１の制限酵素サイトと、特定の
Ｔ３プロモーターおよび−Ｎ１−Ｎｘ（Ｎ１はサブプール用に第１のポリメラー
ゼ連鎖反応の中で使用されたＮ１と同一であり、Ｎはステップ（ｉ）と同様、お
よびｘは３または４から選択される整数である。プライマーは１５から３０の長
さのヌクレオチドであり、ｘ＋１に等しい数のヌクレオチド中のｃＲＮＡの挿入
した特定のヌクレオチドへ横切って伸びるプライマーの相補性を備えたベクトル
シーケンスの側面に位置する５’と相補的である。また、第２の５’ＰＣＲプラ
イマーの異なった１つは、サブプールの第２のシリーズの異なったサブプールで
使用され、各々のサブプール用にサブプールの第２のシリーズに４Ｘサブプール
がある。）を含む３’終点有すると定義される第２の５’ＰＣＲプライマーによ
り転写開始を定義するサイトとの間のベクトルシーケンス側面に位置する３’と
相補的である１５〜３０の長さのヌクレオチドの第２の３’ＰＣＲプライマーを
備えた第２の合成酵素連鎖反応用テンプレートとしてＰＣＲ生成物の第１のセッ
トを使用することによりＰＣＲ生成物の第２のセットを生成するステップ； （ｋ）ｍＲＮＡ母集団中にあるｍＲＮＡｓの３’末端を表わす、シーケンス特
異的な生成物の表示を生成するためのＰＣＲ生成物の第２のセットを解析するス
テップ； とからなる。
【００４９】 典型的には、４８のアンカープライマの混合物は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）なるシーケンスを有する
。
【００５０】 より好ましくは、４８のアンカープライマの混合物は、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−
Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）なるシーケンス
を有する。
【００５１】 典型的には、１２のアンカープライマの混合物は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）なるシーケンスを有する。
【００５２】 より好ましくは、１２のアンカープライマの混合物は、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−
Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）なるシーケンスを有
する。
【００５３】 典型的には、３のアンカープライマの混合物は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ
−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ
−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）なるシーケンスを有する。
【００５４】 より好ましくは、３のアンカープライマの混合物は、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ
−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ
−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）なるシーケンスを有する。
【００５５】 より好ましくは、一番目の制限酵素はＭｓｐＩであり、二番目の制限酵素はＮ
ｏｔＩである。
【００５６】 典型的には、一番目の５’ＰＣＲプライマは、Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２）である。
【００５７】 より好ましくは、二番目のポリメラーゼ連鎖反応における３’ＰＣＲプライマ
は、蛍光ラベルしたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のヌクレオチドであり、さらに好
ましくは、６−ＦＡＭでラベルしたＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７のヌクレオチドで
ある。
【００５８】 ステップ（ｉ）における”ｘ”の適した値は、１から５の整数である。より好
ましくは、ステップ（ｉ）における”ｘ”は、３である。
【００５９】 典型的には、 （ａ）生理学的ないし病理学的変化に関わらない普通のまたは腫瘍の生体組織
の最初のサンプルを得ることと、 （ｂ）当該最初のサンプルからｍＲＮＡの母集団を分離することと、 （ｃ）ステップ（ａ）から（ｊ）の一般的方法を実施することにより、生体組
織の当該最初のサンプルにおけるｍＲＮＡ表現のパターンを決定して、最初のサ
ンプルに存在するｍＲＮＡの３’−末端を表すシーケンス特異的な反応生成物の
最初の表示させることと、 （ｄ）生理学的ないし病理学的変化に関わる生体組織の２番目のサンプルを得
ることと、 （ｅ）２番目のサンプルよりｍＲＮＡの母集団を分離することと、 （ｆ）ステップ（ａ）から（ｊ）の一般的方法を実施することにより、生体組
織の当該２番目のサンプルにおけるｍＲＮＡ表現のパターンを決定して、２番目
のサンプルに存在するｍＲＮＡの３’−末端を表すシーケンス特異的な反応生成
物の２番目の表示させることと、 （ｇ）２つの表示を比較して、生理学的ないし病理学的変化が生体組織におけ
るｍＲＮＡ表現に及ぼす影響を決定すること とからなるステップからなる生理学的ないし病理学的変化と関連した生体組織に
おけるｍＲＮＡの表現形式のパターンにおける変化を検出する方法である。
【００６０】 典型的には３つ以上のサンプルが比較される。好適な実施例では３つの、より
好適には少なくとも４つの、サンプルが多数回採取され比較される。
【００６１】 通常、前記生理学的な又は病理学的な変化はアルツハイマー病、パーキンソン
症候群、局所貧血、アルコール依存症、薬物依存症、精神分裂症、筋萎縮側部硬
化症、多局硬化症、鬱病、及び双極躁鬱異常から成るグループから選ばれる。
【００６２】 典型的には、前記生理学的な又は病理学的な変化は学習若しくは記憶、感情、
グルタミン酸神経毒性、摂餌行為、嗅覚、視覚、動作異常、ウイルス感染、電気
ショック治療、ある薬の管理又は薬物の毒性面での効果に関係する。
【００６３】 典型的には、前記生理学的な又は病理学的な変化は生物学的サイクルでの変動
、老化、及び長期的強化から成るグループから選ばれる。一般に、前記生理学的
な又は病理学的な変化は転写因子、細胞内第２メッセンジャ、ホルモン、神経伝
達物質、増殖因子及び神経修飾物質が介在する過程から選択される。或いは、前
記生理学的な又は病理学的な変化は細胞／細胞接触、細胞／基層接触、細胞／細
胞外間質接触及び細胞膜細胞骨格間の接触が介在する過程から選ばれる。
【００６４】 好ましくは、前記正常な又は腫瘍的な組織は心臓血管系、リンパ系、呼吸系、
消化系、辺縁神経系、中枢神経系、腸神経系、内分泌系、（皮膚、髪及び爪を含
む）外被、（骨及び筋肉を含む）骨格系、泌尿系及び生殖系から成るグループか
ら選ばれた器官又は器官系から採取若しくは導出された細胞で構成される。
【００６５】 好適な実施例では、前記正常な又は腫瘍的な組織は上皮、内皮、粘膜、腺、血
液、リンパ液、結合組織、軟骨、骨、平滑筋、骨格筋、心筋、神経の元、間質細
胞、脾臓、胸腺、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質、副腎髄質、副腎皮質、松果体、
皮膚、髪、爪、歯、肝臓、膵臓、肺臓、腎臓、膀胱、尿管、乳房、卵巣、子宮、
膣、睾丸、前立腺、陰茎、目及び耳から成るグループから選ばれた器官又は器官
系から採取若しくは導出された細胞で構成される。
【００６６】 通常、前記正常な又は腫瘍的な組織は網膜、大脳皮質、嗅球、視床、視床下部
、下垂体前葉、下垂体後葉、海馬、座核、扁桃、線条、小脳、脳幹、交叉上核、
及び脊髄から成るグループから選ばれた中枢神経系内の構造から導出される。
【００６７】 典型的には、既知組成物とスクリーンされる薬物との作用の相違を検出する方
法は、 （ａ）生理学的機能が既知の組成物で処理した生体からの組織の第１のサンプ
ルを得る段階と、 （ｂ）前記第１のサンプルからｍＲＮＡ母集団を分離する段階と、 （ｃ）前記一般的な方法の段階（ａ）−（ｊ）を行うことにより前記組織の第
１のサンプルにおけるｍＲＮＡ発現のパターンを決定して前記第１のサンプルに
存在するｍＲＮＡの３’末端を表す配列特定生成物の第１の表示を生成する段階
と、 （ｄ）前記既知組成物と薬物との作用の相違を求むべくスクリーンされる前記
薬物で処理した生体からの組織の第２のサンプルを得る段階と、 （ｅ）前記第２のサンプルからｍＲＮＡ母集団を分離する段階と、 （ｆ）前記一般的な方法の段階（ａ）−（ｊ）を行うことにより前記組織の第
２のサンプルにおけるｍＲＮＡ発現のパターンを決定して前記第２のサンプルに
存在するｍＲＮＡの３’末端を表す配列特定生成物の第２の表示を生成する段階
と、 （ｇ）前記第１及び第２の表示を比較して、発現が前記既知の組成物により影
響されないが前記スクリーンされる薬物により影響されるｍＲＮＡ種の存在を検
出し、それにより前記既知の組成物と前記スクリーンされる薬物との作用の相違
を示す段階と から成る。
【００６８】 典型的には、前記スクリーンされる薬物は坑鬱薬、神経遮断薬、精神安定薬、
坑痙攣薬、モノアミン酸化酵素阻害薬、刺激薬、坑パーキンソン症候群剤、骨格
筋弛緩薬、鎮痛薬、局所麻酔薬、コリン抑制薬、坑ウイルス剤、鎮攣薬、ステロ
イド、及び非ステロイド坑炎薬物から成るグループから選ばれる。
【００６９】 より広義には、本明細書で用いられる「スクリーンされる薬物」及び「試験さ
れる薬物」という用語は生理学的に活性なステロイド、坑生物質、坑真菌剤、坑
菌剤、坑腫瘍剤、鎮痛薬及び鎮痛併用薬、食欲抑制薬、駆虫薬、坑関節炎薬、坑
無力症剤、坑痙攣薬、坑鬱薬、坑糖尿病剤、下痢止め剤、坑ヒスタミン薬、坑炎
剤、坑頭痛製剤、アンチモーション病製剤、坑パーキンソン症候群薬物、止痒薬
、坑精神病薬、解熱薬、鎮攣薬、で胃腸及び尿用を含み；コリン抑制薬、交感神
経薬、キサンチン誘導体、心臓血管製剤で含むカルシウムチャンネルブロッカー
、ベータブロッカー、坑不整脈薬、坑高血圧薬利尿薬、血管拡張薬で汎用、冠状
、辺縁及び大脳用を含み；中枢神経系刺激薬、咳及び風邪用製剤、鬱血除去薬、
ホルモン、催眠薬、免疫抑制薬、筋弛緩薬、副交感神経遮断薬、副交感神経作動
薬、精神刺激薬、鎮静薬、精神安定薬、アレルゲン、坑ヒスタミン剤、坑炎剤、
生理学的に活性なペプチド及び蛋白質、紫外スクリーニング剤、香料、昆虫忌避
剤、染髪剤等を含む広範なクラスの有用な化学的及び治療学的薬剤を意味する。
本明細書で考慮された薬剤を説明する前記「生理学的に活性な」という用語は、
宿主に対し直接に薬理学的効果を持つ薬剤のみでなく医学において有用な間接的
或いは観察可能な効果、例えば、診断目的のための組織の色付け又は混濁化、そ
の組織からの紫外輻射のスクリーニング等、をもつものをも含めて広義に使用さ
れる。
【００７０】 例えば、典型的な静真菌及び殺真菌薬剤にはチアベンダゾール、クロロヒン、
アンホテリシン、カジシジン、フンギムシン、ナイスタチン、クロルダントイン
、クロトリマゾール、硝酸エソナム、硝酸ミコナゾール、ピロルニトリン、サリ
チル酸、フェザチオン、チクラトン、トルナフテート、トリアセチン、亜鉛、ピ
リチオン及びピリチオンナトリウムが含まれる。
【００７１】 ステロイドにはコーチゾン、コルトドクソン、フルオラセトナイド、フルドロ
コーチゾン、ジフルオルゾン ジアセテート、フルランドレノロン アセトナイ
ド、メドリゾン、アムシナフェル、アムシナファイド、ベータメタゾンとそのエ
ステル、クロロプレドニゾン、クロコルテロン、ジサイノロン、ジソナイド、ジ
クサメタゾン、ジクロリゾン、ジフルプレドネーテ、フルクロロナイド、フルメ
タゾン、フルナイソナイド、フルオシノナイド、フルコロトロン、フルオルメタ
ロン、フルペロロン、フルプレドニゾン、メプレドナイゾン、メチルメプレドナ
イゾン、パラメタゾン、プレドナイソロン及びプレディゾンが含まれる。
【００７２】 坑菌剤にはスルホンアミド、ペニシリン、セファロスポリン、ペニシリナーゼ
、エリスロミシン、リノミシン、バンコマイシン、テトラサイクリン、クロラム
フェニコール、ストレプトマイシン等が含まれる。抗菌剤の特殊な例にはエリス
ロマイシン、エチル炭酸エリスロマイシン、エリスロマイシンエストレート、エ
リスロマイシングルセプテート、エチル琥珀酸エリスロマイシン、エリスロマイ
シンラクトビオネート、リンコマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン
、クロルテトラサイクリン、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、メタサイ
クリン、オキシテトラサイクリン、ミノサイクリン等が含まれる。
【００７３】 ペプチド及び蛋白質には、特に、小から中サイズのペプチド、例えば、インシ
ュリン、バソプレシン、オキシトシン、増殖因子、シトキンや人の成長ホルモン
等の更に大きな蛋白質が含まれる。
【００７４】 他の薬剤にはキサンチン類、トリアムテレン及びテオフィリン、坑腫瘍剤類、
５−フルオロユリジンデオキシリボシド、６−メルカプトプリンデオキシリボシ
ド、ビダラビン、麻酔鎮痛薬類、ハイドロモルフォン、シクラジン、ペンタゾシ
ン、ブポモルフィン、有機アニオンを含む組成物類、ヘパリン、プロスタグラン
ジン及びプロスタグラジン状組成物類、クロモリンナトリウム、カルベノキソロ
ン、ポリヒドロキシリック組成物類、ドーパミン、ドブタミン、１−ドーパ、ａ
−メチルドーパ、アンギオテンシン拮抗薬類等の様々な治療学的薬剤、ブラヂキ
ニン、インシュリン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＴＣＨ）、エンケファリン、エ
ンドルフィン、ソマトスタチン、セクレチン等のポリペプチド類及びテトラサイ
クリン、ブロモクリプチン、リドケイン、シメチジン等の諸種の組成物類、又は
任意な関連組成物類が包含される。
【００７５】 他の薬剤にはヨードデオキリユリジン、ポドフィリン、テオフィリン、イソプ
ロテレノール、トリアムシノロンアセトナイド、ヒドロコルチゾン、フィンドメ
タシン、パラアミノ安息香酸フェニルブタゾン、アミノプロピオニトリル及びペ
ニシルアミンが含まれる。
【００７６】 以上の列記は必ずしも上げ尽くしたものではなく、生理学的に活性な任意な薬
剤を本発明の方法により試験できる。
【００７７】 典型的には、順序特定ＰＣＲ生成物の表示の定量化により生じたデータから成
るデータベースが構成される。典型的には、このデータベースは更に順序関係、
遺伝子マッピング及び細胞分布に関するデータを有して成る。
【００７８】 １つの実施例では、本発明は、順序のデータベースとサンプルに存在するｍＲ
ＮＡ分子の３’端末の順序との間の順序の同定及び類似を認識する方法であって
： （ａ）ｍＲＮＡ集団から、それぞれのアンカープライマーが５’終端と３’終
端を持ち、そして以下を含んでいるアンカープライマー混合物を用い、二重鎖ｃ
ＤＮＡを調製する。（ｉ）７〜４０のＴ残基の区域；（ｉｉ）最初の６残基以上
を認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位で、切断のためのサ
イトはＴ残基区域と比較して５’方向に位置している；（ｉｉｉ）最初の４〜４
０ヌクレオチドの詰まった断片で、最初の詰まった断片は最初の制限エンドヌク
レアーゼによる切断部位と比較して５’方向に位置している；（ｉｖ）６残基以
上を認識する最初の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位と、Ｔ残基の区域と
の間に挟まれている、２番目の詰まった断片；（ｖ）−Ｖ、−Ｖ−Ｎおよび−Ｖ
−Ｎ−Ｎからなる群から選択されたそれぞれのアンカープライマーの、３’終端
方向に位置する位相調節残基で、ここでＶはＡ、ＣおよびＧからなる群から選択
された一デオキシリボヌクレオチド、そしてＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群
から選択された一デオキシリボヌクレオチドであり、該混合物はＶとＮの全可能
性を包含するアンカープライマーを含んでいる； （ｂ）分割された二重螺旋構造のｃＤＮＡ集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）であっ
て、第一制限酵素と第二制限酵素を有し、第二制限酵素が４つのヌクレオチド配
列を識別し、 それぞれ第一、第二終端（ｔｅｒｍｉｎｉ）を持つ二重鎖のｃＤＮＡ分子を形成
するステップと、 （ｃ）ステップ（ｂ）の二重鎖のｃＤＮＡ分子それぞれを一方向から挿入する（
ｉｎｔｏａ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ａｎ ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）ベクターに
、このベクター内で特定のバクテリオファージ特異的プロモータに関してアンチ
センス（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）に挿入し、ｃＤＮＡ分子を含む集団を形成するス
テップ。
【００７９】 この結果、５’、３’で定義されるフランキング・ベクター配列は挿入された
ｃＤＮＡの５’、３’の末端にそれぞれ隣接し、前記構成ではフランキング・ベ
クター配列３’は少なくとも前記第一制限酵素と前記プロモータによって転写が
開始される部位との間の長さの中に１５のヌクレオチドを有する。
【００８０】 （ｄ）前記方向に対して変形されたホストセル（ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ）は分解し
たｃＤＮＡに挿入され、複製された挿入物を含むベクターを生成するステップと
、 （ｅ）挿入された一方のｃＤＮＡ分子中の、あるいはバクテリオファージ・スペ
シフィックプロモータは認識しないが、 ベクター中の配列、例えば、結果的に直鎖化された断片で前記ｃＤＮＡ分子の第
２末端のベクター５’に挿入された少なくとも１５のヌクレオチドを有する５’
フランキングベクター配列を認識する少なくとも１つの制限酵素を備えたステッ
プ（ｃ）の中で生産された母集団の温浸によって、挿入されたｃＤＮＡ分子を含
む直鎖化された断片を生成するステップと、 （ｆ）バクテリオファージプロモーターからの転写を始めることができるバクテ
リオファージスペシフィックＲＮＡポリメラーゼを備えた直鎖化された破片をイ
ンキュベートすることによりアンチセンスｃＲＮＡ転写するｃＲＮＡ調整物を生
成するステップと （ｇ）第一ｃＤＮＡの生成におけるｃＲＮＡによる転写は反転転写酵素と、１５
から３０のヌクレオチドを有する５’ＲＴプライマーを使用して行われ、ヌクレ
オチドの配列は５’フランクリンベクター配列と相補な構成を有すステップと、
（ｈ）サブプールの第１のシリーズ中への第１のストランドｃＤＮＡの分割をし
、第１の制限酵素サイトと、特定のＴ３プロモーターおよび−Ｎ１（「Ｎ」は４
つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧあるいはＴのうちの１つで、第１の５
’ＰＣＲプライマーは１５から３０の長さのヌクレオチドであり、ｃＲＮＡの挿
入した特定ヌクレオチドの１つのヌクレオチドへ伸びる第１の５’ＰＣＲプライ
マー相補性を備えたベクトルシーケンスの側面に位置する５’と相補的である。
また、第１の５’ＰＣＲプライマーの異なった１つは、４つの異なったサブプー
ルの各々で使用される。）を含む３’終点を有すると定義される第１の５’ＰＣ
Ｒプライマーにより転写開始を定義するサイトとの間のベクトルシーケンス側面
に位置する３’と相補的である１５〜３０の長さのヌクレオチドの第１の３’Ｐ
ＣＲプライマーを備えた第１の合成酵素連鎖反応用テンプレートとして第１のス
トランドｃＤＮＡを使用することによりＰＣＲ生成物の第１のセットを生成する
ステップと、 （ｉ）サブプールの第１のシリーズの各々でのサブプールの第２のシリーズ中へ
のＰＣＲ生成物の第１のセットの分割をし、第１の制限酵素サイトと、特定のＴ
３プロモーターおよび−Ｎ１−Ｎｘ（Ｎ１はサブプール用に第１のポリメラーゼ
連鎖反応の中で使用されたＮ１と同一であり、Ｎはステップ（ｈ）と同様、およ
びｘは１〜５の中から選択される整数である。プライマーは１５から３０の長さ
のヌクレオチドであり、ｘ＋１に等しい数のヌクレオチド中のｃＲＮＡの挿入し
た特定のヌクレオチドへ横切って伸びるプライマーの相補性を備えたベクトルシ
ーケンスの側面に位置する５’と相補的である。また、第２の５’ＰＣＲプライ
マーの異なった１つは、サブプールの第２のシリーズの異なったサブプールで使
用され、各々のサブプール用にサブプールの第２のシリーズに４Ｘサブプールが
ある。）を含む３’終点有すると定義される第２の５’ＰＣＲプライマーにより
転写開始を定義するサイトとの間のベクトルシーケンス側面に位置する３’と相
補的である１５〜３０の長さのヌクレオチドの第２の３’ＰＣＲプライマーを備
えた第２の合成酵素連鎖反応用テンプレートとしてＰＣＲ生成物の第１のセット
を使用することによりＰＣＲ生成物の第２のセットを生成するステップと、 （ｊ）第二のＰＣＲ生成物の組（ｓｅｔ）を解決するために、ｍＲＮＡの集団（
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）中でｍＲＮＡが示す（ｐｒｅｓｅｎｔ）３’末端（３’
−ｅｎｄｓ）を配列特異的産物を表示するステップ、 （ｋ）少なくとも１つのｍＲＮＡの電気泳動図に関するｃＤＮＡを抽出し、試料
（ｓａｍｐｌｅ）中のｍＲＮＡの前記３’末端のバンドが表示されるステップと
、 （ｌ）ポリメラーゼ連鎖反応中の抽出されたｃＤＮＡが増幅（ａｍｐｌｉｆｙｉ
ｎｇ）されるステップと、 （ｍ）プラスミドへ前記増幅されたｃＤＮＡが複製されるステップと、 （ｎ）前記プラスミドより複製されたＤＮＡに合致するようにＤＮＡが製造（ｐ
ｒｏｄｕｃｅ）されるステップと、 （ｏ）前記複製されたｃＤＮＡの配列が決定されるステップと、 （ｐ）ヌクレオチド・データベースのヌクレオチド配列に対応するように、ヌク
レオチドの配列が決定され、 前記一致されたヌクレオチド配列（ｓａｉｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）は最末端（ｍｏｓｔ ｄｉｓｔａｌ
ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）の場所の第二エンドヌクレアーゼと最先端 のポリ
Ａ（ｐｏｌｙ（Ａ）ｔａｉｌ）によって限定されるステップと、 （ｑ）前記複製されたｃＤＮＡの配列と前記ヌクレオチドの配列との比較の結果
から、識別された試料中のｍＲＮＡ分子の３’末端（３’−ｅｎｄｓ）データベ
ースの配列とにおいて一致または相似が示されるステップとから構成される。
【００８１】 典型的に、前記方法は以下の段階からも構成される、 （ｒ）２次元画像ディスプレーにおけるＰＣＲ生成物の、量と長さの比較を行う
ステップ。
【００８２】 また概して、前記方法は以下のステップからも構成される、 （ｓ）前記期待される相当するしたヌクレオチド配列長さ（ｔｈｅ ｅｘｐｅｃ
ｔｅｄ ｌｅｎｇｔｈ）の決定は、相当するデータベースのヌクレオチド配列、
ベクター配列と混合された前記５’ＰＣＲ配列の長さ、残りのアンカープライマ
リー配列（ａｎｃｈｏｒ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）の長さ、ベクター
配列とベクター配列に混合された前記３’ＰＣＲ配列の中間（ｉｎｔｅｒｖｅｎ
ｉｇ）の長さ、の合計に一致する （ｔ）前記ＰＣＲ生成物の長さと期待される符号したヌクレオチド配列との比較
において、前記期待されるヌクレオチド配列の長さは、画像記号や文字を用いた
２次元画像表示ディスプレー（適当な画像記号には垂直および水平方向の線、”
Ｘ”といった短い交差する線部、円や多角形といった幾何図形が含まる。）に表
示されるステップ。
【００８３】 その他の実施例として、本発明は試料中のｍＲＮＡ分子に合致（ｃｏｒｒｅｓ
ｐｏｎｄｉｎｇ）したｃＤＮＡ断片の配列とデータベースの配列の一致または相
似の識別の方法についても提供するものであり、 次の段階から成る、 試料中に示されるｍＲＮＡ分子に合致された抽出したｃＤＮＡ断片と、 ポリメラーゼ連鎖反応中のｃＤＮＡ断片の増殖における前記ｃＤＮＡ断片と、 プラスミドに変化（ｉｎｔｏ）される前記複製増殖されたｃＤＮＡ断片と、 前記ｃＤＮＡ断片と符号、生成されたＤＮＡ分子と、 前記ＤＮＡ分子の連鎖生成（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ）と
、 これら決定され抽出されるｃＤＮＡ断片の配列とからなり、 前記抽出されたｃＤＮＡ断片の配列とデータベースの配列とが比較され、そ
の結果配列の一致または類似が識別されるステップ。
【００８４】 概して、前記抽出されたｃＤＮＡ断片の配列とデータベースの比較を行う手
順はコンピュータを用いて行われる。また概して前記方法では、別途前記比較の
結果を図示する段階からも構成される。
【００８５】 一般に、試料中のｍＲＮＡ分子に符号したｃＤＮＡ断片配列とデータベース
の配列の一致または類似の比較は以下の段階から成る、 試料中に現れる（ｐｒｅｓｅｎｔ）ｍＲＮＡに符号した抽出されたｃＤＮＡ断
片であって、 ｃＤＮＡ断片は認識部位と、前記ｍＲＮＡ分子のポリＡテールの長さと、 制限酵素と符号される５’ＰＣＲプライマーとポリメラーゼ連鎖反応によって
動作する（ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）前記決定されたｃＤＮＡ断片の一部と、 前記決定された抽出ｃＤＮＡ断片とデータベースの中のｃＤＮＡ断片の長さが
比較され、この結果両者の一致と類似が識別されるステップ。
【００８６】 また別の実施例では、本発明はトランスフォムされたポリヌクレオチド断片の
データベースへエントリーの作成の方法を提供し、 下記の段階からなる、 元になる試料断片をデータベースエントリー中のポリヌクレオチド断片から選
び、 前記元試料中の、ｐｏｌｙ（ａ）ｔａｉｌ断片を位置づけし（ｌｏｃａｔｉｎ
ｇ）、 前記支流中の、エンドヌクレアーゼの識別箇所を前記識別位置断片に最も近い
範囲内に位置づけ、 エンドヌクレアーゼの位置に近接するおよそ２〜６のヌクレオチドから成る断
片の印を決定し、 前記元試料の範囲内相関した断片を決定し、前記相関した断片はポリＡテール
によって制限される前記断片とエンドヌクレオチド識別部位と少なくともエンド
ヌクレアーゼの識別部位の一部を含み、 前記相関断片の長さを決定し、 ポリＡテールの位置と断片に関する情報、前記相関断片における元試料との前
記長さの関係に関する情報を保管する。この結果、転写データベースエントリが
作成されるステップ。
【００８７】 概して前記方法には、前記識別断片における前記相関断片の長さを画像表示す
る段階もある。
【００８８】 また可能ならば、制限酵素はＭｓｐＩ、ＴａｑＩ、ＨｉｎＰｌＩの中から選ぶ
のが好ましい。
【００８９】 また別の実施例では、本発明はｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ ｂａｃｋｇｒｏｕｎ
ｄの増加によりＰＣＲ生成物の前記長さおよび量を求める方法における改善策を
提供する、これは非標的対象（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｃＤＮＡ）ｃＤＮＡの増
加に起因するものであり、 下記の段階からなる、 試料中のから、個々のｃＲＮＡ分子が挿入された断片とベクターに由来する断
片からなるｃＲＮＡ集団を選ぶステップ、 前記ベクターに由来する断片を混合し、かつ約５〜６個のヌクレオチドを挿入
引き延ばされたｃＤＮＡ反転写するために生成された逆転写プライマーを使用し
て逆転写を行うステップ、 前記ｃＤＮＡを反転写した生成物を再分割するステップと、 前記再分割したｃＤＮＡ反転写生成物を使用して、少なくとも１つのポリメラ
ーゼ連鎖反応を実行するステップと、 前記ベクター由来の断片と混合され、約７〜９個のヌクレオチドを挿入し引き
延ばされた３’ＰＣＲプライマーと５’ＰＣＲプライマーによってＰＣＲ生成物
を生成するステップとからなり、その結果ｄｉｍｉｎｉｓｈｉｎｇ ｂａｃｋｇ
ｒｏｕｎｄされる、これは非標的対象（ｕｎｔａｒｇｅｔｅｄ ｃＤＮＡ）ｃＤ
ＮＡの増加に依存する また概して、１６の反転写反応のプールと１６の異なる反転写プライマーが存
在する。一般に、４ｘのポリメラーゼ連鎖反応のサブプール（ｓｕｂｐｏｏｌ）
があって、Ｘは前記５’ＰＣＲの延長用に挿入されたヌクレオチドの数と、前記
反転写プライマーによる前記挿入配列のヌクレオチドの数の差（ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｃｅ）である。
【００９０】 本発明のこれらの、そして他の特徴、観点および利点は、以下の説明、付随す
る請求項および付属する図面を参照にすることによりさらに理解されるようにな
るであろう。
【００９１】 （好ましい実施形態の詳細な説明） 本発明者らは、薬物活性の機構の決定、薬物スクリーニング、生理学的および
病理学的状態の研究およびゲノムマッピングでの多くの適用を持つｍＲＮＡ集団
中のｍＲＮＡｓの刺激性配列一特異的同定および表示に関する改善した方法を発
展させた。前記改善した方法およびその適用を以下で論議する。
【００９２】 １．ｍＲＮＡｓの刺激性配列−特異的同定 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいた本発明に従った方法は、その強度
が大まかにｍＲＮＡの濃度と相関するゲル上の異なるバンドとしての正常または
新生物真核生物細胞または組織によって発現したほとんどすべてのｍＲＮＡを視
覚化するための方法を提供する。本方法は、すべてのＲＮＡｓが実質的に３’−
ポリ（Ａ）テールで終結するが、しかし前記テールへ結合しているプライマーの
特異性にはよらない観察に基づく。本改善した方法は、図１、２および８での３
つの実施形態において略図的に図解した。一般的に、本改善した方法には以下の
工程が含まれる。
【００９３】 （ａ）それぞれのアンカープライマーが５’末端および３’末端を持ち、（ｉ
）７〜４０Ｔ残基のトレース、（ｉｉ）６残基以上の、Ｔ残基トレースに関連す
る５’末端に対して局在している開裂部位を認識する第１制限エンドヌクレーゼ
による開裂部位、（ｉｉｉ）第１制限ヌクレアーゼによる開裂部位に関連する５
’−末端に対して局在している、４〜４０ヌクレオチドの第１要素区画、（ｉｖ
）６残基以上、Ｔ残基のトレースを認識する第１制限ヌクレアーゼによる開裂部
位間に挿入された第２要素区画、（ｖ）−Ｖ、−Ｖ−Ｎおよび−Ｖ−Ｎ−Ｎ、好
ましくは−Ｖ−Ｎ−Ｎで、式中ＶはＡ、ＣおよびＧからなる群より選択したデオ
キシリボヌクレオチドであり、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴ、からなる群より選択し
たデオキシリボヌクレオチドであるものからなる群より選択したそれぞれのアン
カープライマーの３’末端に局在した同期残基を含み、ＶまたはＮに対してすべ
ての可能性のあるものを含むアンカープライマーを含んでいる混合物を使用して
、ｍＲＮＡ集団より２本鎖ｃＤＮＡ集団を調製する工程、 （ｂ）第１制限エンドヌクレアーゼおよび第２エンドヌクレアーゼによって２
本鎖ｃＤＮＡを開裂させること、ここで第２制限エンドヌクレアーゼは４残基ヌ
クレオチド配列を認識し、それぞれ第１および第２末端を持つ２本鎖ｃＤＮＡ分
子の集団を形成する工程、 （ｃ）工程（ｂ）からのそれぞれの２本鎖ｃＤＮＡを、ベクター内のバクテリ
オファージ特異的プロモータに関するアンチセンスである方向でベクターに組み
込み、挿入ｃＤＮＡ分子を含む構造物の集団を形成し、これによって、それぞれ
挿入ｃＤＮＡのセンス鎖の５’末端およびセンス鎖の３’末端に接続している５
’および３’隣接ベクター配列、および前記第１制限エンドヌクレアーゼ部と前
記プロモータでの転写開始を定義している部位の間の長さにして少なくとも１５
ヌクレオチドの３’隣接ベクター配列を持つ前記構造物を同定する工程、 （ｄ）宿主細胞に、クローン化した挿入物を含むベクターを産出するために開
裂したｓＤＮＡを挿入したベクターを形質転換する工程、 （ｅ）得られた直線化した断片が２本鎖ｃＤＮＡ分子の第２末端に対してベク
ター５’内への少なくとも１５ヌクレオチドの５’隣接ベクター配列を持つよう
に、挿入ｃＤＮＡ分子内またはバクテリオファージ特異的プロモータ内どちらか
での配列は認識せず、しかしベクター内の配列は認識する少なくとも１つの制限
ヌクレアーゼでの、工程（ｃ）で産出した構造物の消化によって挿入ｃＤＮＡを
含む直線化断片を合成する工程、 （ｆ）前記直線化断片を、バクテリオファージ特異的プロモータからの転写を
開始することができるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと共にイン
キュベーションすることで、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調製品を合
成する工程、 （ｇ）逆転写酵素および長さにして１５〜３０ヌクレオチドで、５’隣接ベク
ター配列に相補的なヌクレオチド配列を含んでいる５’ＲＴプライマーを用いて
ｃＲＮＡを逆転写することによって第１鎖ｃＤＮＡを合成する工程、 （ｈ）第１鎖ｃＤＮＡを第１連続サブプールにわけ、第１制限エンドヌクレア
ーゼ部位とバクテリオファージ特異的プロモータによる転写開始を定義している
部位間の３’隣接ベクター配列と相補的な、長さにして１５〜３０ヌクレオチド
の第１の３’ＰＣＲプライマー、および−Ｎ１からなる３’末端を持っていると
定義された第１の５’ＰＣＲ−プライマー（式中「Ｎ」は４つのデオキシリボヌ
クレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの１つである）、ｃＲＮＡの挿入特異的ヌクレオ
チドの１つのヌクレオチド内に伸張している５’ＰＣＲ−プライマーの相補性を
持つ５’隣接ベクター配列に相補的な、長さにして１５〜３０ヌクレオチドであ
る第１の５’ＰＣＲプライマーでの第１ポリメラーゼ連鎖反応に対する鋳型とし
て第１鎖ｃＤＮＡを用い、第１の５’ＰＣＲプライマーの異なる１つをそれぞれ
４つの異なるサブプールで使用することで、ＰＣＲ産物の第１組を合成する工程
、 （ｉ）さらにそれぞれのサブプール第１組のＰＣＲ産物の第１組を、第２組の
サブプールにわけ、第１制限エンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファージ特異
的プロモータによる転写開始を定義している部位の間の３’隣接ベクター配列に
相補的な、長さにして１５〜３０ヌクレオチドの第２の３’ＰＣＲプライマー、
−Ｎ１−Ｎｘからなる３’末端で、式中Ｎ１はそのサブプールに対する第１ポリ
メラーゼ連鎖反応で使用したＮ１と同一であり、「Ｎ」は工程ｈと同一であり、
「ｘ」は１〜５までの整数である３’末端を持っていると定義された第２の５’
ＰＣＲプライマー、ヌクレオチドの数が「ｘ」＋１と等しいｃＲＮＡの挿入特異
的ヌクレオチド内に横切って伸張しているプライマーの相補性を持つ５’隣接ベ
クター配列に相補的な、長さにして１５〜３０ヌクレオチドであるプライマーを
用い、異なる１つの第２の５’ＰＣＲプライマーを第２組のサブプールの異なる
サブプールで使用し、第１組のサブプール中のそれぞれのサブプールに対する第
２のサブプールにおいて４ｘのサブプールがあることになる、第２ポリメラーゼ
連鎖反応に対して、鋳型として第１組のＰＣＲ産物を使用することで、第２のＰ
ＣＲ産物を合成する工程、 （ｊ）第２のＰＣＲ産物の組を分解し、ｍＲＮＡ集団内に存在するｍＲＮＡｓ
の３’末端を表している配列特異的産物の表示を作製する工程。
【００９４】 他の実施形態においては、上記工程（ｃ）は、ベクター内のバクテリオファー
ジ特異的プロモータに関してセンスである方向で、ベクター内に工程（ｂ）から
のそれぞれの２本鎖ｃＤＮＡ分子を挿入し、挿入したｃＤＮＡ分子を含んでいる
構築物の集団を形成することを含む。
【００９５】 Ａ．２本鎖ｃＤＮＡの調製 方法の第１工程には、ｍＲＮＡ集団が必要である。ＲＮＡの抽出法はよく知ら
れており、例えば次に挙げる文献に記載されている：Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ
（分子クローニング：実験室マニュアル）」（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９），第１巻、第７章、「Ｅｘｔｒａｃｔｉ
ｏｎ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｅｓｓ
ｅｎｇｅｒ ＲＮＡ ｆｒｏｍ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ（真核細胞
からのメッセンジャーＲＮＡの抽出、精製および分析）」。参照してここに組み
込まれる。他の単離法および抽出法もよく知られている。典型的な単離は、グア
ニジン塩酸塩またはグアニジンチオシアン酸塩のようなカオトロープ剤の存在下
に行われるが、これに替えて他の界面活性剤および抽出剤を使用することもでき
る。
【００９６】 ｍＲＮＡは、典型的には、ｍＲＮＡ分子のポリアデニル化された３’部位を結
合しうるオリゴ（ｄＴ）セルロースまたは他のクロマトグラフィ担体上で、抽出
した総ＲＮＡをクロマト分離することによって単離される。この方法より劣るが
、総ＲＮＡを使用することもできる。しかし一般的には、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡを
単離することが好ましい。
【００９７】 次に、２本鎖ｃＲＮＡは、アンカープライマー混合物を使用しｍＲＮＡポプレ
ーションから逆転写を開始させて調製される。各アンカープライマーには５’末
端および３’末端があり、次の（ｉ）〜（ｖ）を含んでいる：（ｉ）７〜４０個
のＴ残基の領域；（ｉｉ）７個以上の塩基を認識する第１の制限エンドヌクレア
ーゼによる切断部位であって、Ｔ残基の領域に対して５’末端に向かって存在す
る切断部位；（ｉｉｉ）４〜４０個のヌクレオチドの第１のスタッファーセグメ
ントであって、第１の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位に対して５’末端
に向かって存在するセグメント；（ｉｖ）７個以上の塩基を認識する第１の制限
エンドヌクレアーゼによる切断部位とＴ残基の領域との間に挿入される第２のス
タッファセグメント；および（ｖ）−Ｖ，−Ｖ−Ｎおよび−ＶＮ−Ｎから成る群
から選択される各アンカープライマーの３’末端に存在するフェージング残基（
ここで、ＶはＡ，ＣおよびＧから成る群から選択されるデオキシリボヌクレオチ
ド；そしてＮはＡ，Ｃ，ＧおよびＴから成る群から選択されるデオキシリボヌク
レオチドであり、混合物は、ＹおよびＮに関してあらゆる可能性を含むアンカー
プライマーを含み、混合物中のフェージング残基は、−Ｖ，−Ｖ−Ｎまたは−Ｖ
Ｎ−Ｎの１つによって規定される）。アンカープライマーが−Ｖのフェージング
残基を有する時は、混合物は３個のアンカープライマーの混合物を含む。アンカ
ープライマーが−Ｖ−Ｎのフェージング残基を有する時は、混合物は１２個のア
ンカープライマーの混合物を含む。アンカープライマーが−Ｖ−Ｎ−Ｎのフェー
ジング残基を有する時は、混合物は４８個のアンカープライマーの混合物を含む
。
【００９８】 各アンカープライマーは、典型的にはＴ残基の領域に１８個のＴ残基を有し、
−Ｖ−Ｎ−Ｎで終わり、１４個の残基の第１スタッファセグメントを有する。第
１のスタッファセグメントの好ましい配列は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ
−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ（配列番号：１）およびＧ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ
−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ（配列番号：２）から成る群から選択される。７
個以上の塩基を認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断部位はＮｏｔＩ切断
部位である。
【００９９】 ３個のアンカープライマーの１つの好ましい組は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−
Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−
Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖの配列（配列番号：３）を有する。１２個のアンカープライマー
の別の好ましい組は、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号
：４）を有する。４８個のアンカープライマーのさらに別の好ましい組は、Ａ−
Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５）を有する。
【０１００】 好ましい実施形態によれば、３個のアンカープライマーの組は、Ｇ−Ａ−Ａ−
Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ配列（配列番号：６）を有する。別の好ましい
実施形態によれば、１２個のアンカープライマーの組は、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−
Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ配列（配列番号：７）を有する。特に好ましい実施
形態によれば、４８個のアンカープライマーの組は、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−
Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ配列（配列番号：８）を有する。
【０１０１】 アンカープライマーのこの混合物の１つのメンバーは、試料中の各ｍＲＮＡ種
のすべてのコピーの３’末端の固定された位置で合成を開始し、それによって、
各ｍＲＮＡの３’末端点を規定する。
【０１０２】 この反応は、従来技術として良く知られている、ｍＲＮＡから２本鎖ｃＲＮＡ
の調製のための条件下で行われる。このような技術は、例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」の第２巻に「Ｃｏｎｓｔ
ｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｉ
ｅｓ（ｃＲＮＡライブラリーの構築と分析）」の表題で記載されている。好まし
い逆転写酵素としては、トリ骨髄芽細胞症ウイルス（ＡＭＶ）およびモロニーマ
ウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）からの逆転写酵素を挙げることができる。問題
の逆転写酵素としてはＭＭＬＶ逆転写酵素が好ましい。
【０１０３】 本発明の好ましい実施形態に従えば、ｃＤＮＡ集団を調製する改良法として、
磁性ビーズが使用される（図２および８）。ビオチン構造は、典型的にはアンカ
ープライマーの５’末端に連結している。第１の被制限ｃＤＮＡは、ストレプタ
ビジン被覆基質、例えば磁気ビーズで被覆したストレプタビジンのナンバー、を
接触させることによって残りのｃＤＮＡから分離される。
【０１０４】 Ｂ．制限エンドヌクレアーゼによるｃＤＮＡ試料の切断 ｃＤＮＡは２種類の制限エンドヌクレアーゼによって切断される。第１の制限
エンドヌクレアーゼは、７個以上の塩基を有する部位を認識し、アンカープライ
マー混合物の各マンバー内でただ１つの部位を切断する。第２の制限エンドヌク
レアーゼは、４−ヌクレオチド配列を認識する制限エンドヌクレアーゼである。
このような制限エンドヌクレアーゼは、典型的には、ほとんどのｃＤＮＡに対し
て複数個の部位を切断する。典型的には、第１の制限エンドヌクレアーゼはＮｏ
ｔＩであり、第２の制限エンドヌクレアーゼはＭｓｐＩである。酵素ＮｏｔＩは
ほとんどのｃＤＮＡ内で切断しない。このことは、もう１つの別の部位以外の位
置でｃＤＮＡが切断されると生成する、クローン化されたインサートの損失を最
小限に抑えるために望ましい。
【０１０５】 別法では、第２の制限エンドヌクレアーゼとして、ＴａｑＩ、ＭａｅＩＩまた
はＨｉｎＰＩＩが可能である。前記３種類の制限エンドヌクレアーゼを使用する
と、ＭｓｐＩによって切断されない珍しいｍＲＮＡを検出することができる。第
２の制限エンドヌクレアーゼは、後で論じるように、所望ベクターへのクローニ
ングに適合する５’−オーバーハングを生成する。このクローニングは、ｐＢＣ
ＳＫ＋，ｐＢＳ ＳＫ＋，ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ１，ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧ
Ｔ２およびｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ３から成る群から選択されるベクターに対し
て、後で論じるようにＣｌａＩの部で行われる。
【０１０６】 別法では、第２の制限エンドヌクレアーゼとして、Ｓａｕ３ＡＩが可能である
。この制限エンドヌクレアーゼを使用すると、やはりＭｓｐＩによって切断され
ない珍しいｍＲＮＡを検出することができる。第２の制限エンドヌクレアーゼは
、後で論じるように、所望ベクターへのクローニングに適合する５’−オーバー
ハングを生成する。ベクターｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ４に対するこのクローニン
グは、後で述べるように、ＢａｍＨＩの部位で行われる。
【０１０７】 別法では、第２の制限エンドヌクレアーゼとして、ＮｌａＩＩＩが可能である
。この制限エンドヌクレアーゼを使用すると、やはりＭｓｐＩによって切断され
ない珍しいｍＲＮＡを検出することができる。第２の制限エンドヌクレアーゼは
、後で論じるように、所望ベクターへのクローニングに適合する５’−オーバー
ハングを生成する。ベクターｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ５に対するこのクローニン
グは、後で述べるようにＳｐｈＩの部位で行われる。
【０１０８】 別法では、他の適切な制限エンドヌクレアーゼは、上記の制限エンドヌクレア
ーゼによって裂かれないｃＤＮＡを検出するために使用され得る。４−ヌクレオ
チド配列を認識する適切な第２の制限エンドヌクレアーゼは、ＭｂｏＩ、Ｄｐｎ
ＩＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＨｐａＩＩ、ＢｆａＩ、Ｃｓｐ６Ｉ、Ｍ
ｓｅＩ、ＨｈａＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＭｓｐＩ、ＭａｅＩＩ、およびＨ
ｉｎＰＩＩである。
【０１０９】 ７個以上の塩基を認識する適切な第１の制限エンドヌクレアーゼとして、Ａｓ
ｃＩ，ＢａｅＩ，ＦｓｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰｍｅＩ，ＰｐｕＭＩ，Ｒｓ
ｒＩＩ，ＳａｐＩ，ＳｅｘＡＩ，ＳｆｉＩ，ＳｇｆＩ，ＳｇｒＡＩ，ＳｒｆＩ，
Ｓｓｅ８３８７１およびＳｗａＩを挙げることができる。
【０１１０】 ｃＤＮＡを消化する条件は、従来技術として良く知られており、例えば、Ｊ．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」の第１巻、第
５章に「Ｅｎｚｙｍｅｓ Ｕｓｅｄ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ（分子クローニングに使用される酵素）」に記載されている。
【０１１１】 Ｃ．ベクターへの切断ｃＤＮＡの挿入 その後、第１および第２の制限エンドヌクレアーゼで切断したｃＤＮＡサンプ
ルを、ベクターに挿入する。一般に、適切なベクターとしては、ＮｏｔＩ制限エ
ンドヌクレアーゼ部位を有する多クローニング部位が挙げられる。適切なベクタ
ーは、制限エンドヌクレアーゼＣｌａＩおよびＮｏｔＩで切断されたプラスミド
ｐＢＣ ＳＫ＋である。ベクターは、バクテリオファージ特異的プロモータを含
む。典型的に、プロモータは、Ｔ３プロモータ、ＳＰ６プロモータ、またはＴ７
プロモータである。好ましいプロモータは、バクテリオファージＴ３プロモータ
である。切断ｃＤＮＡは、バクテリオファージ特異的プロモータに関してアンチ
センスである方向でプロモータに挿入される（図１および２）。別の好ましい実
施形態では、切断ｃＤＮＡを、バクテリオファージ特異的プロモータに関してセ
ンスである方向でプロモータに挿入する（図８）。好ましい実施形態では、ベク
ターとしては、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１
２、および配列番号：１３から構成される群から選択されるヌクレオチド配列を
有する多クローニング部分が挙げられる。
【０１１２】 好ましいベクターは、位置６５６から７６４までのヌクレオチド配列の部分を
除去し、そしてＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含む少なくとも１１０ヌ
クレオチドの配列に置換されたプラスミドベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐ
ＢＳまたはｐＢＣ）ＳＫ＋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））に基づ
く。多クローニング部位（ＭＣＳ）と称されるこの領域は、ＳａｃＩ部位からＫ
ｐｎＩ部位までのヌクレオチド配列の一部に及ぶ。
【０１１３】 ｐＢＣ ＳＫ＋またはｐＢＳ ＳＫ＋（ストラタジーン）のような適切なプラ
スミドベクターは、多クローニング部位の少なくとも１００個のヌクレオチドを
除去する適切な制限エンドヌクレアーゼで設計された。ｐＢＳ ＳＫ＋の場合に
は、多クローニング部位を除去するための適切な制限エンドヌクレアーゼは、Ｓ
ａｃＩおよびＫｐｎＩである。第１および第２の制限エンドヌクレアーゼで消化
した後、ＮｏｔＩおよびＣｌａＩに適合している末端を有する新たな多クローニ
ング部位を含むｃＤＮＡ部分を、ベクターにクローニングさせて、適切なプラス
ミドベクターを形成した。新たな多クローニング部位を含む好ましいｃＤＮＡ部
分としては、配列番号：９、配列番号：１０および配列番号：１１に記述される
ヌクレオチド配列を有するものが挙げられる。ｃＤＮＡクローンは、第２の制限
エンドヌクレアーゼ部位の４つのヌクレオチド配列を含む６個以上の塩基を有す
る配列を認識する単一制限エンドヌクレアーゼで消化することによって線状化さ
れる。
【０１１４】 ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ１としてここに称される好ましいプラスミドベクター
は、配列番号：９のＭＣＳを包含する。第２の制限エンドヌクレアーゼおよび線
状制限エンドヌクレアーゼ（下の段階Ｅの）の対は、それぞれ、ＭｓｐＩとＳｍ
ａＩ；ＨｉｎＰ１ＩとＮａｒＩ；ＴａｑＩとＸｈｏＩ；ＭａｅＩＩとＡａｔＩＩ
である。
【０１１５】 ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ２としてここに称される別の好ましいプラスミドベク
ターは、配列番号：１０のＭＣＳを包含し、ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ１について
上に記述されるとおりに製造された。多クローニング部位は、ＭａｅＩＩを用い
て生成されたｃＤＮＡ挿入物を受け入れない。したがって、ｐＢＳ ＳＫ＋／Ｄ
ＧＴ２については、第２の制限エンドヌクレアーゼおよび線状制限エンドヌクレ
アーゼ（下の段階Ｅの）の対は、それぞれ、ＭｓｐＩとＳｍａＩ；ＨｉｎＰ１Ｉ
とＮａｒＩ；およびＴａｑＩとＸｈｏＩである。
【０１１６】 ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ３としてここに称される好ましいプラスミドベクター
は、配列番号：１１のＭＣＳを包含する。第２の制限エンドヌクレアーゼおよび
線状制限エンドヌクレアーゼ（下の段階Ｅの）の対は、それぞれ、ＭｓｐＩとＳ
ｍａＩ；ＨｉｎＰ１ＩとＮａｒＩ；ＴａｑＩとＸｈｏＩ；ＭａｅＩＩとＡａｔＩ
Ｉである。
【０１１７】 ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ４としてここに称される好ましいプラスミドベクター
は、配列番号：１２のＭＣＳを包含する。第２の制限エンドヌクレアーゼおよび
このベクターのために使用するのに適切な線状制限エンドヌクレアーゼ（下の段
階Ｅの）酵素の対は、それぞれ、Ｓａｕ３ＡＩとＢｇｌＩＩである。
【０１１８】 ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ５としてここに称される好ましいプラスミドベクター
は、配列番号：１３のＭＣＳを包含する。第２の制限エンドヌクレアーゼおよび
このベクターのために使用するのに適切な線状制限エンドヌクレアーゼ（下の段
階Ｅの）酵素の対は、それぞれ、ＮｌａＩＩＩとＮｃｏＩである。
【０１１９】 好ましい実施形態では、ベクターとしては、第１および第２のベクター制限エ
ンドヌクレアーゼ部位の間の内部ベクタースタッフ制限エンドヌクレアーゼ部位
を含むベクタースタッフ配列が挙げられる。このような実施形態の１つでは、線
状化段階は、内部ベクタースタッフ制限エンドヌクレアーゼ部位でベクターを切
断する制限エンドヌクレアーゼを用いたベクターの消化が挙げられる。別のこの
ような実施形態では、線状段階に使用された制限エンドヌクレアーゼも、内部ベ
クタースタッフ制限エンドヌクレアーゼ部位でベクターを切断する。
【０１２０】 Ｄ．適切な宿主細胞の形質転換 その後、切断ＤＮＡが挿入されたベクターは、挿入物を含むベクターによって
十分に形質転換または形質移入されうるのに適切な宿主細胞を形質転換するのに
使用される。クローニングのために適切な宿主細胞は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル）」上記で記述される。典型的
には、宿主細胞は、真核生物のものである。特に適切な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ（大腸菌）の株である。適切なＥ．ｃｏｌｉ株は、ＭＣ１０６１である。好ま
しくは、少量アリコート量を、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＸＬ１−Ｂｌｕｅを形質転換する
のにも使用して、その結果、挿入物を有するクローンの含有率を、Ｘ−ｇａｌ平
板上での青色および白色コロニーの相対的含有率から測定する。過剰の５×１０
５組換え体を有するライブラリーのみが、全般的に受け入れられる。
【０１２１】 Ｅ．線状断片の生成 その後、プラスミド製品を、各ｃＤＮＡライブラリーから作製する。その後、
線状断片を、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼを用いた消化によって作
製される。
【０１２２】 １つの実施形態では、ベクターは、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋であり、そして
ＭｓｐＩは、第２の制限エンドヌクレアーゼとして、および線状制限エンドヌク
レアーゼとしての両方で使用される。
【０１２３】 別の実施形態では、ベクターは、プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋であり、第２の制
限エンドヌクレアーゼは、ＭｓｐＩ、ＭａｅＩＩ、ＴａｑＩおよびＨｉｎＰ１Ｉ
から構成される群から選択され、そして線状化は、ＳｍａＩを用いた第１の消化
、続いてＫｐｎＩおよびＡｐａＩの混合物を用いた第２の消化によって達成され
る。
【０１２４】 他の実施形態では、ベクターは、ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ１、ｐＢＳ ＳＫ＋
／ＤＧＴ２、ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ３、ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ４およびｐＢ
Ｓ ＳＫ＋／ＤＧＴ５から構成される群から選択される。このような実施形態で
は、第２の制限エンドヌクレアーゼが、ＭｓｐＩであり、そして線状段階で使用
される制限エンドヌクレアーゼが、ＳｍａＩである１つの適切な酵素の組合せが
提供される。第２の制限エンドヌクレアーゼが、ＴａｑＩであり、そして線状段
階で使用される制限エンドヌクレアーゼが、ＸｈｏＩである別の適切な組合せが
提供される。第２の制限エンドヌクレアーゼが、ＨｉｎＰ１Ｉであり、そして線
状段階で使用される制限エンドヌクレアーゼが、ＮａｒＩである別の適切な組合
せが提供される。第２の制限エンドヌクレアーゼが、ＭａｅＩＩであり、そして
線状段階で使用される制限エンドヌクレアーゼが、ＡａｔＩＩであるさらに別の
適切な組合せが提供される。ベクターが、ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ４である場合
、別の適切な組合せは、第２の制限エンドヌクレアーゼとしてＳａｕ３ＡＩ、お
よび線状段階で使用される制限エンドヌクレアーゼとしてＢｇｌＩＩによって提
供される。ベクターが、ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ５である場合、別の適切な組合
せは、第２の制限エンドヌクレアーゼとしてＮｌａＩＩＩ、および線状段階で使
用される制限エンドヌクレアーゼとしてＮｃｏＩによって提供される。
【０１２５】 一般に、以下に、セクションＦで詳細に記述される線状化段階では、ｃＤＮＡ
挿入物を欠く任意のプラスミドベクターを、ＮｏｔＩ部位とＣｌａＩ部位との間
に見られるＳｍａＩ、ＮａｒＩ、ＸｈｏＩ、またはＡａｔＩＩについての６−ヌ
クレオチド認識部位（図７Ａに下線付けした）、および３’からＣｌａＩ部位ま
でに見られるＳｍａＩ、ＮａｒＩ、ＸｈｏＩ、またはＡａｔＩＩについての６個
以上の塩基を有する認識部位で切断した。対照的に、挿入物を含むプラスミドベ
クターは、３’からＣｌａＩ部位までに見られるＳｍａＩ、ＮａｒＩ、ＸｈｏＩ
、またはＡａｔＩＩについての６−ヌクレオチド認識部位で切断される。
【０１２６】 Ｆ．ｃＲＮＡの生成 次の段階は、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ製品の生成である。これ
は、バクテリオファージ特異的プロモータからの転写を開始する能力のあるＲＮ
Ａポリメラーゼを用いた線状断片のインキュベーションによって行われる。全般
的に、上に検討されるとおり、プロモータは、Ｔ３プロモータであり、したがっ
てポリメラーゼは、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼである。ポリメラーゼを、合成に適
切な条件下で線状断片および４つのリボヌクレオシドトリホスフェート（Ａｍｂ
ｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてインキュベートする。
【０１２７】 Ｇ．第１鎖ｃＤＮＡの転写 モロニーネズミの白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を用いて第１鎖ｃＤＮ
Ａを転写する。この逆転写酵素を用いて、アニーリングを、４２℃で、そして転
写反応を、４２℃で行う。反応は、長さ１５から３０ヌクレオチドであり、そし
て５’フラギングベクター配列に相補性であるプライマーを使用する。
【０１２８】 別の実施形態では、以下に記述されるとおり熱安定性逆転写酵素およびプライ
マーを用いてｃＲＮＡを転写する。好ましい転写酵素は、ＴｅｒｍｏＳｃｒｉｐ
ｔ ＲＴとして知られるトリ組換え逆転写酵素であり、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から入手可能である。
【０１２９】 これは、プライマーとｃＲＮＡの間の高い忠実相補性を促進する。使用される
プライマーは、バクテリオファージ特異的プロモータの３’末端に対する配列に
対応する少なくとも長さ１５個のヌクレオチドである。
【０１３０】 別の適切な転写酵素は、ｒＴｔｈとして知られ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ（
Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）から入手可能なサーマスサーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕ
ｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）から得られる組換え逆転写酵素である。
【０１３１】 バクテリオファージ特異的プロモータが、Ｔ３プロモータである場合、プライ
マーは、典型的に、配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ（配列番号：１４）またはＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：４７）を有する。
【０１３２】 Ｈ．第１ＰＣＲ産物を生成すること 次の段階は、ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして転写の産物を
、下に記述されるとおり第１の組のプライマーと共に使用して、第１の組のポリ
メラーゼ連鎖反応増幅断片を生成することである。
【０１３３】 一般に、第１鎖ｃＤＮＡ転写の産物が、第１の３’ＰＣＲプライマーと第１の
５’ＰＣＲプライマーとのポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして使
用して、ポリメラーゼ連鎖反応増幅断片を生成する。第１の３’ＰＣＲプライマ
ーは、典型的に、長さ１５から３０個のヌクレオチドであり、そして第１の制限
エンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファージ特異的プロモータによる転写開始
を規定する部位との間の３’フラッキングベクター配列に相補的である。第１の
５’ＰＣＲプライマーは、「Ｎ１」が、４個のデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ
、ＧまたはＴの内の１つであり、プライマーは、長さ１５から３０個のヌクレオ
チドであり、そしてｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチドの１つのヌクレオチド
に伸長するプライマーの相補性と５’フラッキングベクター配列に相補的である
−Ｎ１から構成され、第１の５’ＰＣＲプライマーの異なる１つは、４つの異な
るサブプールの各々で使用される、３’末端を有する。
【０１３４】 ベクターが、ＣｌａＩ部位とＮｏｔＩ部位とで切断したプラスミドｐＢＣ Ｓ
Ｋ＋である場合、適切な３’−ＰＣＲプライマーは、Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−
Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：４７）およびＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ（配列番号：４８）から構
成される群から選択される。バクテリオファージ特異的プロモータは、Ｔ３プロ
モータである場合、適切な５’−ＰＣＲプライマーは、付与反応Ｎが、Ａ、Ｇ、
Ｃ、またはＴのいずれかである配列Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−
Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（配列番号：２２）を示しうる。
【０１３５】 典型的には、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはＰｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）の
ような適切な熱サイクルで、変性のために９４℃で１５秒、アニーリングのため
に５０−６５℃で１５秒、そして合成のために７２℃で３０秒のＰＣＲプログラ
ムを用いてＰＣＲを行う。アニーリング温度は、当業界でよく知られる概念を用
いて、プライマーの特異的ヌクレオチド配列について適切化される。高温アニー
リング段階は、その３’末端での第１の５’ＰＣＲプライマーによる人工的ミス
プライミングを最小限にし、そしてプロモータ高忠実性コピーを促進する。
【０１３６】 Ｉ．第２のＰＣＲ産物を生成すること 次の段階は、第２のポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして第１の
ＰＣＲ反応の産物を、下に記述されるとおり第２の組のプライマーと共に使用し
て、第２の組のポリメラーゼ連鎖反応増幅断片を生成することである。
【０１３７】 一般に、第１のＰＣＲの産物を、ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレート
として、第２の３’ＰＣＲプライマーと第２の５’ＰＣＲプライマーと共に使用
して、ポリメラーゼ連鎖反応増幅断片を生成する。第２の３’ＰＣＲプライマー
は、典型的に、長さ１５から３０個のヌクレオチドであり、そして第１の制限エ
ンドヌクレアーゼ部位とバクテリオファージ特異的プロモータによる転写開始を
規定する部位との間の３’フラッキングベクター配列に相補的である。第２の５
’ＰＣＲプライマーは、Ｎ１が、そのサブプールについての第１のポリメラーゼ
連鎖反応に使用されるＮ１と一致する−Ｎ１−Ｎｘ（「Ｎ」は、段階（Ｈ）であ
るとおりであり、そして「ｘ」は、１から５までの整数であり、プライマーは、
長さ１５から３０個のヌクレオチドであり、そして「ｘ」＋１に等しい多くのヌ
クレオチドでｃＲＮＡの挿入物特異的ヌクレオチドまで越えて伸長するプライマ
ーの相補性を示す５’フラッキングベクター配列に相補的であり、第２の５’Ｐ
ＣＲプライマーの異なる１つは、第２のシリーズのサブプールの異なるサブプー
ルで使用され、第１の組のサブプール中の各サブプールについて第２のシリーズ
のサブプール中に４ｘサブプールがある）から構成される３’末端を有すると規
定される。
【０１３８】 別の実施形態では、使用されるプライマーは、（ａ）ベクター中のｃＤＮＡサ
ンプルの挿入の部位に接合するベクター中の配列から配列まで対応する第２の３
’ＰＣＲプライマー；および（ｂ）（ｉ）そのサブプールのために第１のＰＣＲ
反応に使用された第１の５’ＰＣＲプライマー；（ｉｉ）それから、第１鎖ｃＤ
ＮＡが、別の残基−Ｎによってその３’末端に伸長したそのサブプールのために
作製された、第１の５’ＰＣＲプライマー；（ｉｉｉ）２つの別の残基−Ｎ−Ｎ
によってその３’末端に伸長したそのサブプールのために使用された、第１の５
’ＰＣＲプライマー、（ｉｖ）３つの別の残基−Ｎ−Ｎ−Ｎによってその３’末
端に伸長したそのサブプールのために使用された、第１の５’ＰＣＲプライマー
；および（ｖ）４つの別の残基−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（式中、Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、ま
たはＴのいずれかでありうる）によってその３’末端に伸長したそのサブプール
のために使用された、第１の５’ＰＣＲプライマーから構成される群から選択さ
れる５’ＰＣＲプライマーである。
【０１３９】 適切な３’ＰＣＲプライマーは、Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−
Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：４７）およびＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ（配列番号：４８）から構成される群から選
択される。
【０１４０】 バクテリオファージ特異的プロモータがＴ３プロモータである場合、適切な５
’−ＰＣＲプライマーは、配列： Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（
配列番号：１６）； Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ（配列番号：１７）； Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ（配列番号：１８）； Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（配列番号
：２２）； Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：２３）； Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：２４）； Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：２５）； Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：２６）； Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号
：１６）； Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１９）；および Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−
Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２０）から構成される群から選択される。
【０１４１】 典型的には、ＰＴＣ−２００（ＭＪ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）またはＰｅｒｋｉｎ
−Ｅｌｍｅｒ９６００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ）の
ような適切な熱サイクルで、変性のために９４℃で１５秒、アニーリングのため
に５０−６５℃で１５秒、そして合成のために７２℃で３０秒のＰＣＲプログラ
ムを用いてＰＣＲを行う。アニーリング温度は、当業界でよく知られる概念を用
いて、プライマーの特異的ヌクレオチド配列について適切化される。高温アニー
リング段階は、その３’末端での第１の５’ＰＣＲプライマーによる人工的ミス
プライミングを最小限にし、そしてプロモータ高忠実性コピーを促進する。
【０１４２】 好ましい実施形態では、非反応性標識を利用する検出方法も使用できる。非反
応性検出方法について、第２のＰＣＲ反応のためのプライマーの内の１つを、蛍
光標識に接合させることが好ましい。適切な蛍光標識は、 スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３
−オン、６−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−６−カルボキシフルオレ
セン（６−ＦＡＭ、ＡＢＩ）； スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３
−オン、５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−５−カルボキシフルオレ
セン（５−ＦＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３
−オン、３’，６’−ジヒドロキシ−フルオレセン（ＦＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ
Ｐｒｏｂｅｓ）； ９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）−
キサンチリウム（６−カルボキシテトラメチルローダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、
Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ３，６−ジアミノ−９−（２−カルボキシフェニル）−キサンチリウム（商標
ローダミングリーンＴＭ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−キサンテン）−６−カルボン
酸、５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３
−オキソ−（ＪＯＥ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； １Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ−キサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−
ｉ’ｊ’］ジキノリジン−８−イウム、−（２，４−ジスルホフェニル）−２，
３，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−、内部塩（テキサスレッ
ド、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ６（（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジア
ザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹＦ
Ｌ−Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ６（（４，４−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５−（４−メトキシフェニル
）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミ
ノ）ヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ
）；６（（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ
−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）ヘキサ
ン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−
ペンタン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−Ｃ５、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ
−インダセン−３−プロパン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒ
ｏｂｅｓ）； ４，４−ジフルオロ−５−フェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、Ｍｏｌｅｃｕａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ４，４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１，３−ブタジエニル）−４−ボ
ラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ５
６４／５７０、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−プロピオン酸； ６（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ
−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリルオキシ）アセチル）アミノヘキ
サン酸（ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）； ６（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−ピロリル）−４−ボラ−３ａ，４ａ
−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリルオキシ）アセチル）アミノヘキ
サン酸（ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；
および ９−（２，４（または２，５）−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジ
メチルアミノ）−キサンチリウム、内部塩（ＴＡＭＲＡ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐ
ｒｏｂｅｓ） から構成される群から選択される。４，７，２’，４’，５’，７’ヘキサクロ
ロ６−カルボキシフルオレセン（「ＨＥＸ」、ＡＢＩ）、４，７，２’，７’テ
トラクロロ６−カルボキシフルオレセン（「ＴＥＴ」、ＡＢＩ）および「ＮＥＤ
」（ＡＢＩ）を含めた他の適切な蛍光標識が当業界で知られている。
【０１４３】 好ましい蛍光標識は、スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ
）−キサンテン）−３−オン、６−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロキシ−６
−カルボキシフルオレセン（６−ＦＡＭ）である。
【０１４４】 選択的実施形態では、オートラジオグラム検出方法を使用できる。１つの実施
形態では、ＰＣＲは、３５Ｓ−ｄＡＴＰの存在下で行われる。選択的には、ＰＣ
Ｒ増幅は、［３２Ｐ］ｄＣＴＰまたは［３３Ｐ］ｄＣＴＰのような放射性核種で
標識されたデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下で行うことがで
きる。しかし、オートラジオグラム検出については、一般に、最大解像度につい
て３５Ｓ−標識デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを使用するのが好ま
しい。
【０１４５】 選択的実施形態では、検出方法は、その教示が参照して組込まれる米国特許番
号第５，６５６，４２９号に記述されるとおり使用および検出される磁性粒子で
標識されるオリゴヌクレオチドを使用する。
【０１４６】 １つの好ましい実施形態では、第１または第２の５’ＰＣＲプライマーの３’
末端にある３ヌクレオチドを、ホスホロチオエート結合によって連結させる。Ｍ
ｕｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｌ、ｄｅ Ｎｏｒｏｎｈａ，Ｃ．Ｍ．、３’末端のホスホロ
チオエート結合を有するアンプリマーが、ポリメラーゼを発し、そしてＴａｑポ
リメラーゼミスプライミングによる分解を阻止する、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａｐｐｌ １９９２年 ２（２）：１３１−１３６；Ｏｔｔ，Ｊ．およびＥｃｋ
ｓｔｅｉｎ，Ｆ．、ＤＮＡポリメラーゼＩによる分解に対するオリゴヌクレオチ
ドプライマーの保護、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８７ ２６（２５）：８
２３７−８２４１；Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．、Ｒｙｔｅ，Ａ．およびＰｅｙｍａｎ
，Ａ．、核酸分解性分解に対する部分的にホスホロチオエート化したオリゴヌク
レオチドの安定化の機構についての研究、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．１９９７ ７（４）：３４５−３５０；Ｓｃｈ
ｒｅｉｂｅｒ，Ｇ．、Ｋｏｃｈ，Ｅ．Ｍ．、およびＮｅｕｂｅｒｔ，Ｗ．Ｊ．、
ホスホロチオエート類似体の組込みによるヌクレアーゼに対してインビトロで合
成されたｃＤＮＡの選択的保護、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９８
５ １３（２１）：７６６３−７６７２参照。
【０１４７】 Ｊ．電気泳動 続いてポリメラーゼ鎖反応で増幅された断片は、サンプル中に存在するｍＲＮ
Ａの３’末端を表すバンドを示す電気泳動のような分離法によって分離される。
【０１４８】 ＰＣＲ増幅断片を解像するための電気泳動法は当分野において公知であり、詳
細をここで引用する必要は無い。該当するＰＣＲ産物は変性ＤＮＡ配列決定用ゲ
ルの中で分離され、レーザー誘導蛍光により視覚化された。あるいは、該当ＰＣ
Ｒ産物はキャピラリー電気泳動法により分離されてからレーザー誘導蛍光により
視覚化された。
【０１４９】 好ましい実施形態の１つでは、第２ＰＣＲ反応用プライマーの１つには蛍光標
識体が結合される。好ましい蛍光標識体は以下より成るグループから選択される
、 スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３−
体、６−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロオキシ−６−カルボキシフルオロセ
イン（６−ＦＡＭ、ＡＢＩ）；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−
（９Ｈ）−キサンテン）−３−体、５−カルボン酸、３’，６’−ジヒドロオキ
シ−５−カルボキシフルオロセイン（５−ＦＡＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏ
ｂｅ））；スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ）、９’−（９Ｈ）−キサンテ
ン）−３−体、３’，６’−ジヒドロオキシ−フルオロセイン（ＦＡＭ、Ｍｏｌ
ｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６
−ビス（ジメチルアミン）−キサンチリウム（６−カルボキシテトラメチルロー
ダミン（６−ＴＡＭＲＡ）、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；３，６−ジア
ミノ−９−（２−カルボキシフェニル）−キサンチリウム（ローダミングリーン
ＴＭ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；スピロ［イソベンゾフラン−１（３
Ｈ）、９’−キサンテン］−−６−カルボン酸、５’−ジクロロ−３’，６’−
ジヒドロキシ−２’、７’−ジメトキシ−３−オキソー（ＪＯＥ、Ｍｏｌｅｃｕ
ａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；１Ｈ、５Ｈ、１１Ｈ、１５Ｈ−キンテノ［２、３、４−
ｉｊ：５，６，７−ｉ’ｊ’］ジキノリジン−８−イウム−（２，４−ジスルフ
ォフェニル）−２，３，４，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−
、不活性塩（テキサスレッド、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；６−（（４
，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−プロピノイル）アミノ）ヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−Ｘ、
Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；６−（（４，４−ジフルオロ−１，３−ジ
メチル−５−（４−メトキシフェニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−
インダセン−３−プロピノイル）アミノ）ヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−
Ｘ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；６−（（（４，４−ジフルオロ−５−
（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル
）フェノキシ）アセチル）アミノ）−ヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、Ｍ
ｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；４，４
−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタン
酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ−Ｃ５、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；４，４−
ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセ
ン−３−プロパン酸（ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）
；４，４−ジフルオロ−５−フェニル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−イ
ンダセン−３−プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、Ｍｏｌｅｃｕａ
ｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；４，４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１，３−ブタ
ジエニル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン
酸（ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；４，
４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセ
ン−３−プロピオン酸）；６−（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル
）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリルオキ
シ）アセチル）アミノヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６６５、Ｍｏｌｅｃ
ｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；６−（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−ピロール
イル）−４−ボラ−３ａ、４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリル
オキシ）アセチル）アミノヘキサン酸（ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５、Ｍｏｌ
ｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）；および９−（２、４（または２，５）−ジカルボ
キシフェニル）３，６−ビス（ジメチルアミノ）−キサンチリウム、不活性塩（
ＴＡＭＲＡ、Ｍｏｌｅｃｕａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）の３’末端を表すバンドを示す
ために電気泳動のような分離法により分離された。４，７，２’，２’，４’，
５’，７’ヘキサクロロ ６−カルボキシフルオレセイン（「ＨＥＸ」、ＡＢＩ
）、ＮＥＤ（ＡＢＩ）および４，７，２’，７’テトラクロロ ６−カルボキシ
フルオレセイン（「ＴＥＴ」、ＡＢＩ）を含む他の適切な蛍光標識は、当分野に
おいて公知である。
【０１５０】 典型的には、蛍光を利用して分解されたｃＤＮＡ種を検出した。しかし、燐光
イメージングまたはオートラジオグラフィのような他の検出法、あるいは磁気検
出法も利用できる。
【０１５１】 概略図によれば、各ｍＲＮＡサンプルより作られたｃＤＮＡライブラリーは、
ｍＲＮＡｓの初期相対濃度におおよそ比例し、開始ＲＮＡサンプル中の全ポリ（
Ａ）＋ｍＲＮＡのＭｓｐＩに関する最遠位端からポリ（Ａ）テールの開始部位ま
での３’一端のコピーを含んでいる。各ｃＮＤＡ種の挿入体の端部は配列により
正確に規定されているため、それらの長さは種毎に均一であり、従って以後ｍＲ
ＮＡの組織源に関係なくゲル上では別個のバンドとして視認することができる。
【０１５２】 典型的には、電気泳動後に示される産物の強度は元の混合体中にある産物に対
応するｍＲＮＡの量に比例する。
【０１５３】 典型的には、方法は更に電気泳動ごにｍＲＮＡに対応する産物の強度から元の
混合物中にある各ｍＲＮＡの相対量を決定する段階を含む。
【０１５４】 ＩＩ．ｍＲＮＡパートナーの提示に適した増幅方法 組織中のｍＲＮＡ発現のパターン検出および電気泳動によるこれらパターンの
分離に適した上記方法は多くの応用が可能である。応用の１つは生理学的および
病理学的変化に伴う組織中ｍＲＮＡ発現パターンの変化検出への利用である。一
般に、この方法は以下を含む： （１）生理学的または病理学的変化に曝されていない組織である第１サンプル
を得ること； （２）上記のようなｍＲＮＡ集団の３’末端を表しているアンチセンスｃＲＮ
Ａプールの構成要素に対応し、ｍＲＮＡについて配列特異的同時同定を実施する
ことにより第１サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表すバンドの第１表
示を作成することで、組織の第１サンプル中のｍＲＮＡ発現パターンを決定する
こと； （３）生理学的または病理学的変化に曝された組織である第２サンプルを得る
こと； （４）上記のｍＲＮＡの集団の３’−末端を表すアンチセンスｃＲＮＡプール
の構成要素に対応して、ｍＲＮＡの配列特異的同時同定を実施し、第２サンプル
中に存在するｍＲＮＡの３’−末端を表すバンドの第２表示を作成することで、
組織の第２サンプル中のｍＲＮＡ発現パターンを決定すること；そして、 （５）第１表示と第２表示を比較し、組織中のｍＲＮＡのパターンに対する生
理学的または病理学的変化の影響を決定する。
【０１５５】 典型的には、比較は単一ゲル上の隣り合うライン間で行われる。
【０１５６】 典型的には、配列特異的産物の提示を定量化することで作成されたデータを含
むデータベースを好ましいコンピュータハードウエアおよびコンピュータソフト
ウエアを利用して構築し、維持された。好ましくはこれらデータベースは更に配
列間の相関性、遺伝子マッピングおよび細胞内分布に関するデータを含む。好ま
しい実施形態では、ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列の長さおよび少なくとも一部
は、ヌクレオチド配列のデータベースから決定される期待値と比較される。
【０１５７】 組織は中枢神経系から得ることができる。特に網膜、脳皮質、嗅球、視床、脳
下垂体、脳下垂体前葉、脳下垂体後葉、海馬、後室周囲核、小脳、線条体、脳幹
、視交叉上核、または脊椎である中枢神経系内の構造から得ることができる。組
織を中枢神経系より得る場合、生理学的または病理学的変化はアルツハイマー病
、パーキンソン病、虚血、アルコール中毒、薬物中毒、分裂病、筋萎縮性側索硬
化症、多発性硬化症、鬱病、および２極性躁鬱病のいずれでもよい。あるいは、
本発明の方法は海馬に影響する概日リズム、老化、または長期間の増強について
の研究に利用することができる。あるいは、中枢神経系内の特定構造体内に生じ
るｍＲＮＡ種を参照すれば、本法を利用して学習や記憶といった複雑な行動や情
緒、薬物常習、グルタミン酸の神経毒、摂食行動、嗅覚、ウイルス感染や運動障
害を研究することができる。
【０１５８】 本法を利用して、薬物や毒物投与前後でのｍＲＮＡのパターンを比較すること
で、個人における薬物および／または毒物投与の結果について研究することもで
きる。電気ショック治療の結果も研究できる。
【０１５９】 あるいは組織は、心臓血管系、肺システム、消化管系、末梢神経系、肝臓、腎
臓、骨格筋、および生殖器官を含む臓器および臓器系から、または退部のその他
臓器あるいは臓器系から得ることができる。例えばｍＲＮＡパターンは肝臓、心
臓、腎臓または骨格筋より研究することができる。あるいはｍＲＮＡの概日リズ
ム効果を研究するために、各種臓器から様々な時間にサンプルを得ることもでき
る。即ち本法は、特定のｍＲＮＡ種をある機能または機能不全に関連つけること
ができる。
【０１６０】 好ましくは正常組織、又は新生物組織は、心臓血管系、リンパ系、呼吸系、消
化系、末梢神経系、中枢神経系、腸神経系、内分泌系、外皮（皮膚、毛髪および
爪を含む）、骨格系（骨および筋肉を含む）、泌尿器系、および生殖系より成る
グループから選択された臓器、又は臓器系より得るか、あるいは由来する。
【０１６１】 好ましい実施形態では、正常又は新生物組織は上皮、内皮、粘膜、腺組織、血
液、リンパ、結合組織、軟骨、骨、平滑筋、骨格筋、心筋、神経細胞、グリア細
胞、脾臓、胸腺、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎皮質、副腎髄質、副腎皮質、
松果体、皮膚、毛髪、爪、歯、肝臓、膵臓、肺、腎臓、膀胱、尿管、乳房、卵巣
、子宮、膣、精巣、前立腺、陰茎、目および耳より成るグループより得られるか
、あるいは由来する。
【０１６２】 同様に、本発明のｍＲＮＡ分析法は、薬物の副作用に関するスクリーニング法
の一部としても利用することができる。一般に、そのような方法は以下を含む： （１）生理学的機能が既知である化合物で処理された生物体より組織の第１サ
ンプルを得ること； （２）上記の如くｍＲＮＡの集団の３’末端を提示しているアンチセンスｃＲ
ＮＡプールの構成要素に対応するｍＲＮＡの配列特異的同時同定法を実施して第
１サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表すバンドの第１表示を作成し、
組織の第１サンプル中のｍＲＮＡ発現のパターンを決定すること； （３）副作用についてスクリーニングを受ける薬物で処理された生物体より組
織の第２サンプルを得ること； （４）上記のｍＲＮＡの集団の３’−末端を表すアンチセンスｃＲＮＡプール
の構成要素に対応して、ｍＲＮＡの配列特異的同時同定を実施し、第２サンプル
中に存在するｍＲＮＡの３’−末端を表すバンドの第２表示を作成することで、
組織の第２サンプル中のｍＲＮＡ発現パターンを決定すること；そして、 （５）第１表示と第２表示を比較し、その発現が既知化合物には影響を受けな
いがスクリーニング対象の薬物からは影響を受けるｍＲＮＡの存在を検出し、そ
れによってスクリーニング対象薬物と既知化合物の作用の違い、即ち副作用の違
いを提示すること。
【０１６３】 具体的には、本法は抑鬱剤、神経弛緩剤、トランキライザ、抗痙攣剤、ものア
ミン酸化酵素阻害剤、および刺激剤に影響する薬物に利用することができる。し
かし、本法は実際には特定組織中のｍＲＮＡ発現に影響するであろう薬物に利用
することができる。例えば、パーキンソン病治療薬、平滑筋弛緩剤、鎮痛剤、局
所麻酔薬、コリン作動薬、抗痙撃剤、ステロイド系、非ステロイド系抗炎症剤、
抗ウイルス剤、又はその他ｍＲＮＡ発現に影響することができる薬剤のｍＲＮＡ
発現に及ぼす影響を研究することができ、そして具体的な組織又は構造内での影
響を決定することができる。
【０１６４】 更に本発明の方法は、表示されたｍＲＮＡ種の３’末端の配列を得ることに応
用できる。一般に、配列を得る方法は以下を含む： （１）サンプル中に存在するｍＲＮＡの３’末端を示すバンドが提示される電
気泳動像より、ｍＲＮＡに対応する少なくとも１種類のｃＤＮＡを溶出すること
； （２）ポリメラーゼ鎖反応により溶出されたｃＤＮＡを増幅すること： （３）増幅したｃＤＮＡをプラスミド内にクローニングすること； （４）プラスミドよりクローン化されたＤＮＡに対応するＤＮＡを産生するこ
と；および （５）クローン化したｃＤＮＡを配列決定すること。
【０１６５】 切り出されたｃＤＮＡは前記第２ＰＣＲ段階にて利用されたプライマーを利用
することで増幅することができる。続いてｃＤＮＡはＴＡクローニングによりｐ
ＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化さ
れ、ベクター内に連結された。次にＤＮＡミニプレップを標準的な技術を利用し
作成し、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシ鎖終止法による自動配列決定に
かけるためにその一部を変性して二分割した。自動配列決定には、例えばＡＢＩ
社製配列決定装置のような市販の配列決定装置が利用できる。これを利用するこ
とで、断片の全長をカバーしている、長さ５０−５００ｂｐの試験した殆どのｃ
ＤＮＡの相補配列を決定することができた。
【０１６６】 次にこれら部分配列を利用して、適当なコンピュータ装置を用いＧｅｎｅＢａ
ｎｋのようなヌクレオチドデータベースをスキャンし、ＢＬＡＳＴＮおよびＢＬ
ＡＳＴＸのような比較分析プログラムを利用して同一および類似配列を見つけだ
した。この方法ではｍＲＮＡの３’末端に由来する配列のみが作成されるため、
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の発見は偶然によると考えられた。例
えば、脳ｍＲＮＡの３’非翻訳域は平均して１３００ヌクレオチド以上の長さを
持っている（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ、１９８８、上記）。ＯＲＦ候補配列
については、固有の蛋白質モチーフの有無を調べた。
【０１６７】 次に得られたｃＤＮＡを利用して組織での発現パターンを確認するための半定
量的ＰＣＲに適したプライマーを設計した。選択された産物は、更に解析を行う
ための完全長ｃＤＮＡクローンの分離にも利用できる。プライマーペアーはＳＳ
ＣＰ−ＰＣＲ（単鎖立体構造多形−ＰＣＲ）によるゲノムＤＮＡ増幅に利用でき
る。例えば種間戻し交配したマウスのパネルについてこのような増幅を行うこと
で各ＰＣＲ産物を既存の連鎖マーカとの連鎖について決定することができる。そ
の結果、新しい遺伝子地図を作成することができ、そしてマウスの突然変異座お
よび相同的ヒトの疾患遺伝子をマッピングするための候補同定のための材料とし
て利用することができる。ＳＳＣＰ−ＰＣＲは、ＰＣＲによって小断片（１００
−２００ｂｐ）を増幅する合成ヌクレオチドプライマーを利用する。（Ｍ．Ｏｒ
ｉｔａら、「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｏｆＨ
ｕｍａｎ ＤＮＡ ｂｙ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｓ Ｓ
ｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉ
ｓｍｓ，」Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：２７６６−
２７７０（１９８９）；Ｍ．Ｏｒｉｔａら、「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｅｎｓｉ
ｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｏｉｎｔ Ｍｕｔａｔｉｏｎ ｉｎ
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｒｅａ
ｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ」Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５：８７４−８７９
（１９８９）） ｃＤＮＡの切り出し断片は、ｍＲＮＡの分布を検証し、対応する完全長ｍＲＮ
Ａの長さおよび存在率を知るために、ノーザンブロットのプロービングでの利用
に関し、あるは原位置ハイブリダイゼーションに関し当分野公知である技術によ
り放射線標識することができる。プローブは、より有効かつ完全な配列決定に適
したクローンの分離を目的としたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングにも利
用できる。標識されたプローブは更にインビトロ発現研究のようなその他目的に
も利用できる。
【０１６８】 ＩＩＩ．プライマーのパネルと変性混合体 本発明の別の観点は、本発明の実施に好ましいプライマーのパネルおよびプラ
イマーの変性混合体である。これらには以下が含まれる （１）配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１６）であり、式中ＮはデオキシヌクレオチドＡ、Ｃ、
Ｇ又はＴのいずれか１つである１６種類のプライマーを含むプライマーのパネル
； （２）配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１７）である６４種類のプライマーを含むプライマ
ーのパネル； （３）配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１８）である２５６種類のプライマーを含むプ
ライマーのパネル； （４）配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：１９）である１０２４種類のプライマーを
含むプライマーのパネル； （５）配列Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２０）である４０９６種類のプライマ
ーを含むプライマーのパネル； （６）配列Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（配列番号：３）である
３プライマーを含むプライマーのパネル； （７）配列Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：４）で
あり、式中のＶはＡ、ＣおよびＧを含むグループから選択される１種類のデオキ
シヌクレオチドである１２種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （８）配列Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５
）である４８種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （９）配列Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−
Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（配列番号：６）の
３種類プライマーを含むプライマーのパネル； （１０）配列Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：
７）の１２種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （１１）配列Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番
号：８）の４８種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （１２）配列Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
−Ｎ（配列番号：２２）の４種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （１３）配列Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ
−Ｎ（配列番号：２３）の１６種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （１４）配列Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ（配列番号：２４）の６４種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （１５）配列Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ（配列番号：２５）の２５６種類のプライマーを含むプライマーのパネル； （１６）配列Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ（配列番号：２６）の１０２４種類のプライマーを含むプライマーのパネル
； （１７）配列Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ
−Ｎ（配列番号：２７）の４０９６種類のプライマーを含むプライマーのパネル
； （１８）配列Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（配列番号：２）であ
る３ （１９）配列Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：４）
である１２種類のプライマーの混合体を含み、１２種類のプライマーそれぞれが
ほぼ等モル量存在しているプライマーの変性混合体； （２０）配列Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番号：
５）である４８種類のプライマーの混合体を含み、４８種類のプライマーがそれ
ぞれほぼ等モル存在している含んでいるプライマーの変性混合体； （２１）配列Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（配列番号：６）
の３種類プライマーの混合体を含み、１２種類のプライマーがほぼ等モル量存在
しているプライマーの変性混合体； （２２）配列Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（配列番号：
７）の１２種類のプライマーの混合体を含み、１２種類のプライマーがそれぞれ
等モル存在しているプライマーの混合体；および （２３）配列Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番
号：８）の４８種類のプライマーの混合体を含み、４８種類のプライマーがほぼ
等モル存在しているプライマーの変性混合体。
【０１６９】 種類のプライマーの混合体であり、各プライマーをほぼ等モル含む変性混合体。
【０１７０】 ＩＶ．好ましい実施形態の実施形態 実施例１： 改良方法の適用 本発明の改良方法は、実質的にすべての真核ｍＲＮＡがポリ（Ａ）末端で終結
しているが、差次的表示（Ｌｉａｎｇ，Ｐ．ａｎｄ Ａ．Ｂ．Ｐａｒｄｅｅ（１
９９２）ポリメラーゼ連鎖反応による真核メッセンジャーＲＮＡの差次的表示、
Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５７：９６７−９７１）とは異なっているという観察に基づ
いており、本発明の方法は、ｍＲＮＡをプールに細区画するためでなく、各ｍＲ
ＮＡの部位を固定するためだけに末端に結合するプライマーの特異性を使用する
。改良された方法は、図１、２および８の３実施形態において示されている。
【０１７１】 一般に２本鎖ｃＤＮＡは、逆転写を開始するために１セット全部で４８個の５
’−ビオチン化アンカープライマーの等モル混合物を用いて、興味のある組織サ
ンプルから抽出したポリ（Ａ）−濃縮細胞質ＲＮＡより生成する（図２および８
）（Ｇｕｂｌｅｒ，Ｕ．ａｎｄ Ｂ．Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８３）ｃＤＮＡライ
ブラリを生成するための簡単で非常に効果的な方法。Ｇｅｎｅ ２５：２６３−
２６９）（Ｓｃｈｉｂｌｅｒ，Ｋ．，Ｍ．Ｔｏｓｉ，Ａ．Ｃ．Ｐｉｔｔｅｔ，Ｌ
．Ｆａｂｉａｎｉ ａｎｄ Ｐ．Ｋ．Ｗｅｌｌａｕｅｒ（１９８０）マウスアミ
ラーゼ遺伝子の組織特異性発現。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４２：９３−１１６
）。このような適切なセットの１つは、Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−
Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−
Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
Ｖ−Ｎ−Ｎ（配列番号：５）であり、ここでＶはＡ、ＣまたはＧであり、ＮはＡ
、Ｃ、ＧまたはＴである。４８個のアンカープライマーのこのような混合物の１
つの構成要素が、３’末端の固定位置でサンプル中の各ｍＲＮＡ種のコピーすべ
ての合成を開始し、その結果、種それぞれの３’末端が定義され、ビオチン化２
本鎖ｃＤＮＡが生成する。
【０１７２】 ビオチン化２本鎖ｃＤＮＡはそれぞれ、配列ＣＣＧＧを認識する制限エンドヌ
クレアーゼＭｓｐＩによって開裂する。その後、ｃＤＮＡの３’断片は、ストレ
プトアビジン被覆基質上にビオチン化ｃＤＮＡ断片が捕捉されることにより、単
離される。適切なストレプトアビジン被覆基質としては、マイクロタイタープレ
ート、ＰＣＲチューブ、ポリスチレンビーズ、常磁性ポリマービーズ、常磁性多
孔性ガラス粒子が挙げられる。好ましいストレプトアビジン被覆基質は、常磁性
ポリマービーズ（Ｄｙｎａｌ，Ｉｎｋ．，Ｌａｋｅ Ｓｕｃｃｅｓｓ，ＮＹ）の
懸濁液である。
【０１７３】 ストレプトアビジン被覆基質および捕捉ビオチン化ｃＤＮＡ断片の洗浄後、ｃ
ＤＮＡ断片生成物を、ＮｏｔＩを用いた消化によって解放する。ＮｏｔＩはアン
カープライマー内部の８−ヌクレオチド配列で開裂するが、ｃＤＮＡのｍＲＮＡ
由来部分内ではまれにしか開裂しない。ｍＲＮＡ種それぞれについて同一の長さ
である３’ＭｓｐＩ−ＮｏｔＩ断片は一方向に結紮され、ベクターのＴ３プロモ
ータについてアンチセンス方向にて、ＣｌａＩ−、ＮｏｔＩ−開裂プラスミドｐ
ＢＣ ＳＫ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）と、大腸菌Ｓ
ＵＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）の形質転換に使用される生成物となる。結
紮により、ＭｓｐＩ部位ではなく、ＮｏｔＩ部位が再生される。各ライブラリは
、ｍＲＮＡすべての３’末端が０．００１％以上の濃度にて高い可能性で多重表
現されるように、５ｘ１０５個を超える組換体を含んでいた。プラスミド調製物
（Ｑｉａｇｅｎ）は、研究中の各サンプルのｃＤＮＡライブラリから作成した。
【０１７４】 各ライブラリの一定量をＭｓｐＩで消化すると、親ベクター内の複数の部位で
開裂による直線化に影響が及んだが、Ｔ３プロモータを含め、３’ｃＤＮＡイン
サートおよびそのフランキング配列は無傷のままである。生成物をＴ３ ＲＮＡ
ポリメラーゼ（ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔキット、Ａｍｂｉｏｎ）を用いてインキュ
ベートし、元のｃＤＮＡによるＭｓｐＩおよびＮｏｔＩ部位に接する既知のベク
ター配列を含むクローン化インサートの、アンチセンスｃＲＮＡ転写を引き起こ
した。
【０１７５】 このステップは、各ｃＲＮＡサンプルがインサートなしプラスミドからの転写
により、異なる程度まで汚染されるのを防止する。汚染の程度が異なると、プラ
イマーの差分的競合のために、異なるサンプルでは、後のＰＣＲ効率が変化する
ことがある。しかし、親ベクトルのポリリンカー領域はＣｌａＩおよびＮｏｔＩ
部位間にＭｓｐＩのための部位を含むため、ＭｓｐＩの消化ステップは、インサ
ートなしプラスミドから転写されたｃＲＮＡから５’タグを削除し、以下で説明
する生成物増幅ステップにそれらを挿入した。プラスミドＤＮＡは、ＲＮａｓｅ
を含まないＤＮａｓｅを用いてインキュベーションすることによって、アンチセ
ンスｃＲＮＡ転写混合物から除去した。
【０１７６】 この段階で、ｃＲＮＡ調製物はそれぞれ３ステップの方法で処理を行った。ス
テップ１では、５’ＲＴプライマー（図１、２および８の５プライマー）Ａ−Ｇ
−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ（配列番号：１４
）を使用して、ｃＲＮＡ２５０ｎｇを一本鎖ｃＤＮＡに変換した。ステップ２で
は、４つの独立した反応において、ｃＤＮＡ生成物４００ｐｇをＰＣＲテンプレ
ートとして使用した。この４つの反応では、「万能」３’ＰＣＲプライマーＧ−
Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：４７）
とそれぞれ対になるＧ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ
−Ｇ−Ｎ（配列番号：２２）という形式の５’ＰＣＲプライマー４個と、以下の
プログラムを使用した： ９４℃、１５秒； ６５℃、１５秒； ７２℃、６０秒； ２０サイクル。
【０１７７】 ステップ３で、各サブプールの生成物は、次のプログラム ９４℃、１５秒 Ｘ℃、１５秒 ７２℃、３０秒 ３０サイクル を用いて、各々１００ｎｇの蛍光着色した「ユニバーサル」３’ＰＣＲプライマ
ー、６−ＦＡＭに共役結合されたオリゴヌクレオチドＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−
Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：４７）、および形Ｃ−Ｇ−Ａ
−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ−Ｎ−Ｎ−Ｎ（配列番号：２５）の
適切な５’ＰＣＲプライマーにより、第２ＰＣＲ反応のために、さらに６４個の
サブサブプール（２０μｌ中２ｎｇ）に分割された。これは、人為的なミスプラ
イミングを最小にし、かつ忠実度の高い複製を促進するために、各５’ＰＣＲプ
ライマーのＴｍよりわずかに高い温度「Ｘ」でのアニーリングステップを含んだ
。各複製連鎖は、ＴａｑＳｔａｒｔ抗体（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）の存在下で実行
された。
【０１７８】 組織サンプルの各々についての最終複製連鎖反応ステップからの生成物は、自
動化ＡＢＩ Ｐｒｉｚｍ３７７シーケンサを用いて、一連の変性ＤＮＡ配列ゲル
上で分解した。データは、ＧｅｎｅＳｃａｎソフトウェアパッケージ（ＡＢＩ）
を用いて収集し、振幅およびマイグレーションについて正規化した。この一連の
反応の完全な実行により、Ｎ１５’ＰＣＲプライマーによって確立された４つの
プールの各々に対して６４の生成物サブプールが生成され、Ｎ４５’ＰＣＲプラ
イマーセット全体では合計で２５６の生成物サブプールになった。
【０１７９】 要約すると、改善された方法（図２）のこの実施形態では、逆転写酵素を用い
て、形５プライマー（配列番号：１４）のノンパーシング５’ＲＴプライマーに
よりｃＲＮＡからｃＤＮＡプールを生成し、ＰＣＲ（２０サイクル）でＴａｑＤ
ＮＡポリメラーゼを使用して、５’ＰＣＲプライマーとして５’ＰＣＲプライマ
ー５プライマーＮ１（配列番号：１１）および３’ＰＣＲプライマー（配列番号
：４７）により二重鎖ｃＤＮＡサブプールを生成した。最終ＰＣＲは、２ｎｇの
ＤＮＡテンプレートならびに１００ｎｇの各５プライマー３Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４プ
ライマー（配列番号：２５）および６−ＦＡＭに共役結合された３’ＰＣＲプラ
イマー（配列番号：４７）を用いて、３０サイクル実行された。
【０１８０】 血清飢餓状態（図３、パネルＡ）および血清付加状態（図３、パネルＢ）のヒ
トＭＧ６３骨肉種細胞からの２つのｍＲＮＡサンプルを分析した。示したデータ
は、５’末端を６カルボキシフルオレセイン（６ＦＡＭ、ＡＢＩ）によりラベル
付けした「ユニバーサル」３’プライマー（配列番号：４７）と対合する５’−
ＰＣＲプライマー（Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ
−Ｔ−Ｇ、配列番号：４２）により生成された。ＰＣＲ反応生成物は、４．５％
アクリルアミドゲルでゲル電気泳動により分解し、ＡＢＩ３７７自動シーケンサ
で蛍光データを収集した。データは、Ｇｅｎｏｓｃａｎソフトウェア（Ｐｅｒｋ
ｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析した。上で示した３つのパネルには、ラベル付
けされたＰＣＲ生成物の相対アバンダンス対塩基対の生成物の長さがプロットさ
れている（Ｙ軸＝相対蛍光ユニット）。底部のパネルでこの方法の高い再現性が
示されており、これは、サンプル間の相対表現レベルの比較のためにＧｅｎｅｓ
ｃａｎソフトウェアを用いて重ね合わたパネル（Ａ）および（Ｂ）からのデータ
を示す。
【０１８１】 本発明の主要な適用例は、２つまたはそれ以上の組織サンプルのｍＲＮＡ表現
プロフィールを比較する場合である。我々は、生成された生成物のパネルで血清
飢餓／補給実験の効果を比較した。サンプル対からの生成物の大部分はコマイグ
レーションを示し、匹敵する振幅であった。振幅が２倍以上異なる生成物は１０
％未満であり、これらは、血清の補給によって誘発される種間でほぼ均等に分散
され、これらは補給によって抑制された。
【０１８２】 多くの生成物は、その一部を２つのパネルで異なる仕方で表現したが、Ｇｅｎ
Ｂａｎｋから抽出されたデータに基づいて予測されたＤＳＴと一致する位置で移
動するようであり、したがって候補ＩＤを持った。これらの候補ＩＤを試験する
ために、ＧｅｎＢａｎｋ配列の末端ＭｓｐＩ部位に隣接する配列から追加的１４
ヌクレオチドにより３’末端を延長した各候補について、５プライマー３Ｎ１Ｎ
２Ｎ３Ｎ４（配列番号：２５）に対応するオリゴヌクレオチドを合成した。これ
らは、Ｎ１ｃＤＮＡをサブストレートとして使用してＰＣＲで蛍光３プライマー
（配列番号：４７）と対合させた。
【０１８３】 実施例２： ＰＣＲ１工程およびＰＣＲ２工程を用いる方法の態様における構文解析特異性
：ＰＣＲ生成物の分析 ＰＣＲ２工程を含む基本的な方法の態様の利点を血清枯渇、および血清添加Ｍ
Ｇ６３細胞を用いて表した。基本的な方法のＰＣＲ２工程変法（図１および図２
）では、逆転写酵素を用いて、５プライマー（配列番号：１４）からの非構文解
析プライマー（Ｎ０）でｃＲＮＡからｃＤＮＡプールを作った；次いでＰＣＲ（
２０サイクル）においてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い、５‘−ＰＣＲプラ
イマーとして５プライマーＮ１（配列番号：２２）および３’ＰＣＲプライマー
（配列番号：４７）で２本鎖ｃＤＮＡサブプールを作った。ＰＣＲ１工程修飾法
では逆転写酵素を用いて５プライマーＮ１（配列番号：２２）形態の４個のＮ１
プライマーの１個で転写を開始することによりｃＲＮＡから４ｃＤＮＡサブプー
ルを作った。両方の方法でＤＮＡ鋳型２ｎｇおよび５‘ＰＣＲプライマー（配列
番号：２５）および６−ＦＡＭ標識３’ＰＣＲプライマー（配列番号：４７）各
々１００ｎｇを用いて３０サイクルで最終ＰＣＲを実施した。
【０１８４】 標識ＰＣＲフラグメントを自動ＤＮＡシークエンサー（ＡＢＩ３７７）で電気
泳動することにより解析し、ジーンスキャンソフトウェアにより分析した。結果
を図４に示す。プライマー１０９Ｔ（Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ
−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ、配列番号：４３）および４５Ａ（Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ａ、配列番号：４４）によるデ
ータはＮ１位置（太字）でのみ異なり、血清枯渇（図４Ａ、４Ｃ、４Ｅおよび４
Ｇ）および血清添加（図４Ｂ、４Ｄ、４Ｆおよび４Ｈ）サンプルの両方に関して
示す。
【０１８５】 １０９Ｔおよび４５Ａで生じたＰＣＲ生成物はＰＣＲ１工程変法により生成し
た鋳型とほぼ同等であるようだ（図４Ａを図４Ｃと、図４Ｂを図４Ｄと比較）。
対照的に、ＰＣＲ２工程法を用いて生成した鋳型のＰＣＲにより検出された生成
物は全く異なる（図４Ｅを図４Ｇと、図４Ｆを図４Ｈと比較）。従ってこの方法
のＰＣＲ２工程の態様は最近の可能な方法よりも実質的に改善されている。
【０１８６】 実施例３： ＰＣＲ１工程およびＰＣＲ２工程を用いる方法の態様における構文解析特異性
：クローニングおよび配列データー ＰＣＲ１工程（表１）またはＰＣＲ２工程（表１１）態様のいずれかを用いて
、血清枯渇、および血清処理ＭＧ６３細胞で本発明の方法を実施した。表Ｉで示
す実験では、逆転写酵素を用いて、４個のＮ１ ５’ＰＣＲプライマー（配列番
号：２２）のセットの１つで転写を開始してｃＲＮＡから４個のｃＤＮＡサブプ
ールを作った。表１１では逆転写酵素を用いて非構文解析５’ＲＴプライマー（
配列番号：１４）でｃＲＮＡからｃＤＮＡサブプールを作った。ＰＣＲ（２０サ
イクル）においてＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを用い、５’ＰＣＲプライマー（
配列番号：２２）および３’ＰＣＲプライマー（配列番号：４７）として２本鎖
ｃＤＮＡサブプールを作った。表Ｉおよび表ＩＩの両方でインプットｃＤＮＡ鋳
型２ｎｇを用いて、６ＦＡＭ標識３’ＰＣＲプライマー（配列番号：４７）と対
になる２５６ ５’−ＰＣＲプライマー（配列番号：２５）の完全なシリーズと
同等に最終ＰＣＲを実施した。ＰＣＲ反応の表示より、クローニングおよびシー
クエンシング目的で区別して整えられた分子が同定および単離された。
【０１８７】 各クローンに関してＤＮＡ配列データを得、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いる
データベース検索により遺伝子同定を行った。表では既知のヒト遺伝子に性格に
適合することが解ったクローンを遺伝子名およびジーンバンク遺伝子座ＩＤによ
り列挙する。逆転写（表Ｉ）またはＰＣＲ反応（表ＩＩ）のいずれかで５プライ
マーＮ１（配列番号：２２）を用いる構文解析工程の適合度をＮ１位置でジーン
バンク配列に対するクローンの配列適合性を作表することにより評価した。２工
程法では５／２２クローンがＮ１位置で正確に適合し（本質的には無作為で）、
一方３工程法では全クローンが対応するジーンバンク配列データと正確に適合す
ることが見出された。
【０１８８】
【表１】
【表２】 太字で強調した５個の遺伝性生成物、ＭＡＤ−３、Ｉｄ１、Ｎａ／Ｋ ＡＴＰ
アーゼＢ３、ｐｉｍ−１オンコジーンおよびエンドセリン−１を両方の実験にお
いて単離し、各々の場合にＰＣＲ２工程法ではＮ１位置で適合し、一方ＰＣＲ１
工程法では適合しなかったことに注目されたい。このようにＰＣＲ２工程法では
最近の可能な方法よりも実質的に改善されている。
【０１８９】 実施例４： ビオチン化アンカープライマーを用いて得られる解析の改善 前記したように、１つの好ましい態様ではアンカープライマーは５‘末端でビ
オチン化されている（図１および２を比較のこと）。ストレプトアビジンコーテ
ィング基質、好ましくはストレプトアビジンコーティング常磁性ビーズ（ディナ
ル）を用いてビオチン化ｃＤＮＡフラグメントを捕捉できる。図５では標準的な
基本的方法により得られた結果を磁性ビーズで標識したアンカープライマーを用
いて得られた結果と比較している。
【０１９０】 標準的な技術（図１に概要を示す）および一連の時間（０、０．７５、７時間
、１０および１４日）にハロペリドール処置したマウスから取った線条の５個の
別個のサンプルからのｍＲＮＡアリコート２μｇを用いる、磁性ビーズの別の態
様（図２を参照のこと）を用いてｃＤＮＡライブラリーを構築した。結果を図５
Ａ−Ｅ（標準）および５Ｆ−Ｊ（磁性ビーズ）で示す。５‘ＰＣＲプライマー１
７０Ｇ（Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ、配列
番号：４５）および６−ＦＡＭ標識３’ＰＣＲプライマー（配列番号：４７）で
得られた結果を両方の場合の比較として示した。標識ＰＣＲの相対的存在度（任
意の蛍光単位Ｙ軸）をＰＣＲ生成物長（塩基対）に対してプロットする。磁性ビ
ーズライブラリーより得られたデータ（図５Ｆ−Ｊ）は、標準的なライブラリー
技術から得られたデータ（図５Ａ−Ｅ）に比較して、一連の時間におけるサンプ
ルにわたって再現性（フラグメントの類似性および強度の値の一貫性の両方にお
いて）がより大きく、見かけの擬似的な短い（１００ないし１２５塩基対）フラ
グメントがより少ないことを示している。
【０１９１】 実施例５： ３工程法における直線性の証明：ＰＣＲ生成物のピーク高のインプットｃＲＮ
Ａ濃度に対する関係 直線増幅範囲を決定するために単一のｃＲＮＡ種を４個の別個のｃＲＮＡプー
ルにスパイクし、図２に示す本発明の方法により処理した。結果を図６に示す。
合成ＲＮＡに対応するピーク高（相対的蛍光単位にて）を測定し、４個のサンプ
ルに関するインプット濃度に対してプロットした。データは３検体測定の平均で
あり；エラー棒線は平均の標準誤差±１の範囲を示している。
【０１９２】 ＳａｌＩ−ＮｏｔＩ ｃＤＮＡフラグメント（配列番号：５１）をライブラリ
ーベクターｐＢＣＳＫ＋にクローン化し、直線化し、Ｔ３プロモータ合成ｃＲＮ
Ａからの転写により生成したｃＲＮＡを構築し、ＰＣＲにおいて既知の大きさ（
４９２塩基対）のピークまで上昇させた。種々の量のｃＲＮＡ（０、２５、１０
０または２５０ｐｇ）をｃＲＮＡ２５０ｎｇのプールに導入した後、Ｎｏプライ
マー（配列番号：１４）で逆転写した。各々５’ＰＣＲプライマー（配列番号：
２２）および３’ＰＣＲプライマー（配列番号：４７）でのＰＣＲ反応において
鋳型としてｃＤＮＡ４００ｐｇを用いた。５’ＰＣＲプライマー２２１Ｃ（Ｃ−
Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ、配列番号：４
６）および３’ＰＣＲプライマー（配列番号：４７）での最終ＰＣＲにおいてｃ
ＤＮＡ２ｎｇのアリコートを用いた。図６に示す結果は規定の組織型に関してＰ
ＣＲ生成物のピーク高がインプットＲＮＡ濃度に比例することを表している。
【０１９３】 前記は本発明を説明することを意図しており、限定を意図するものではない。
本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の多くの改変および
修飾を行うことができる。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、アンカーおよび他のプライマーの配列を概略的に示したアンチセンス
ＲＮＡ転写および増幅のプライミング、開裂、クローニングのさまざまな段階を
示している本発明の改善された方法の概略描写である。完全な配列はテキストを
参照のこと。
【図２】 図２は、ストレプトアビジンコート基質と共にビオチン化アンカープライマー
を使用し、アンカーおよび他のプライマーの配列を概略的に示したアンチセンス
ＲＮＡ転写および増幅のプライミング、開裂、クローニングのさまざまな段階を
示している本発明の改善された方法の実施形態の概略描写である。完全な配列は
テキストを参照のこと。
【図３】 図３は、標識化ＰＣＲ産物量対蛍光検出系を用いた塩基対の産物長の関係のプ
ロットであり、血清枯渇（Ａ）および血清添加（Ｂ）ヒトＭＧ６３細胞からのｍ
ＲＮＡ試料から開始し、５’ＰＣＲプライマーＣ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ
−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ（配列番号：４２）を用いて得たＰＣＲ産物
の解析を示し、（Ａ）および（Ｂ）からのデータは試料間の相対的な発現レベル
の比較をソフトウェアを用いて下のパネル（Ｃ）で重ね合わせた。
【図４】 図４は、２回のＰＣＲ段階を使用する方法対１回のＰＣＲ段階のみを使用する
方法に関する標識化ＰＣＲ産物量対蛍光検出系を用いた塩基対の産物長の関係の
プロットであり、血清枯渇（ｏｓ−）および血清添加（ｏｓ＋）試料に関して、
Ｎ１部分（太字）のみが異なっている５’ＰＣＲプライマー１０９Ｔ（Ｃ−Ｇ−
Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ａ、配列番号：４３）
および４５Ａ（Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ
−Ａ、配列番号：４４）からのデータを示しており、１ＰＣＲ段階（Ａ−Ｄ）ま
たは２ＰＣＲ段階（Ｅ−Ｈ）のいずれかを用いた血清枯渇（ＡおよびＣ）および
血清添加（ＢおよびＤ）ＭＧ６３骨肉腫細胞から抽出したｍＲＮＡの解析から得
られた結果を示し、１０９Ｔおよび４５Ａで作製されたＰＣＲ産物は、１ＰＣＲ
段階方法（Ａ−Ｄ）によって産出された鋳型に非常に同一であり、一方、２ＰＣ
Ｒ段階方法を用いて産出した鋳型からの以下のＰＣＲで検出された産物はすべて
全く異なっていた（Ｅ−Ｈ）ことを示している。
【図５】 図５は図１で記述した標準方法を用いて得た結果と、図２で記述した方法の磁
石ビーズ実施例とを比較するための標識化ＰＣＲ産物量対蛍光検出系を用いた塩
基対の産物長の関係のプロットであり、磁気ビーズ実施例は、前記方法の標準実
施例から由来したデータと比較して、試料間で再現性をもった明らかな増加（合
成された断片の類似性および強度値の一貫性）を表したことを示している。
【図６】 図６は、いくつかの異なる組織に関するｃＲＮＡ濃度と得られたＰＣＲ産物の
ピーク強度間の直線関係を示すグラフである。
【図７】 図７はプラスミドｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ１、ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＴＧ２、ｐ
ＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ３、ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ４およびｐＢＳ ＳＫ＋／Ｄ
ＧＴ５のマルチクローニングサイトのヌクレオチド配列および制限マップを示す
。
【図８】 図８は、ストレプトアビジンコート基質と共にビオチン化アンカープライマー
を使用し、そしてアンカーおよび他のプライマーの配列を概略的に示したアンチ
センスＲＮＡ転写および増幅のプライミング、開裂、クローニングのさまざまな
段階を示している本発明の改善された方法の実施形態の概略描写である。完全な
配列はテキストを参照のこと。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヒルブッシュ、 ブライアン エス． アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サン ディエゴ カミニート アンジ ェリコ 13058 Ｆターム(参考） 2G045 AA28 AA40 CB01 CB21 DA14 DA77 FB01 FB04 FB05 FB07 FB12 GC30 4B024 AA01 AA11 CA01 CA04 CA11 CA12 DA06 HA12 4B063 QA01 QA11 QA12 QA18 QQ53 QR08 QR14 QR32 QR33 QR75 QS25 QS34 QS38

Claims (87)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ｍＲＮＡ集団中での、ｍＲＮＡの同時で配列特異的な同定の
    ための、以下のステップからなる改良方法。 （ａ）ｍＲＮＡ集団から、それぞれのアンカープライマーが５’終端と３’終
    端を持ち、そして以下を含んでいるアンカープライマー混合物を用い、二重鎖ｃ
    ＤＮＡを調製する。（ｉ）７〜４０のＴ残基の区域；（ｉｉ）最初の６残基以上
    を認識する制限エンドヌクレアーゼによる切断のための部位で、切断のためのサ
    イトはＴ残基区域と比較して５’方向に位置している；（ｉｉｉ）最初の４〜４
    ０ヌクレオチドの詰まった断片で、最初の詰まった断片は最初の制限エンドヌク
    レアーゼによる切断部位と比較して５’方向に位置している；（ｉｖ）６残基以
    上を認識する最初の制限エンドヌクレアーゼによる切断部位と、Ｔ残基の区域と
    の間に挟まれている、２番目の詰まった断片；（ｖ）−Ｖ、−Ｖ−Ｎおよび−Ｖ
    −Ｎ−Ｎからなる群から選択されたそれぞれのアンカープライマーの、３’終端
    方向に位置する位相調節残基で、ここでＶはＡ、ＣおよびＧからなる群から選択
    された一デオキシリボヌクレオチド、そしてＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴからなる群
    から選択された一デオキシリボヌクレオチドであり、該混合物はＶとＮの全可能
    性を包含するアンカープライマーを含んでいる； （ｂ）最初の制限エンドヌクレアーゼと２番目の制限エンドヌクレアーゼでの
    、２番目の制限エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチド配列を認識する、それぞれ
    １番目と２番目の終端を有する二重鎖ＤＮＡ分子集団を形成するための、二重鎖
    ｃＤＮＡ集団の切断； （ｃ）ステップ（ｂ）から、バクテリオファージ特異的なプロモーターに対す
    るアンチセンスである一配向においての、挿入されたｃＤＮＡ分子を含む構造物
    の集団形成するベクターの内部で、ベクターへの各二重鎖ＤＮＡ分子の挿入；そ
    れによって、挿入されたｃＤＮＡの有意鎖の５’終端と有意鎖の３’終端のそれ
    ぞれに隣接した５’および３’隣接ベクター配列と、前記最初の制限エンドヌク
    レアーゼ部位と前記プロモーター内の翻訳開始決定部位の間の、少なくとも１５
    ヌクレオチド長の３’隣接ベクター配列をもつ前記構造物を決定する； （ｄ）クローニングされた挿入を含むベクター製作のため、切断ｃＤＮＡが挿
    入されたベクターによる、宿主細胞の形質転換； （ｅ）ステップ（ｃ）で製造された、挿入ｃＤＮＡ分子中かまたはバクテリオ
    ファージ特異的なプロモーター中のどちらかの配列を認識しない、しかし、二重
    鎖ｃＤＮＡ分子の２番目の終端へベクター５’中への少なくとも１５ヌクレオチ
    ドの５’隣接ベクター配列を持つ直線化断片のようなベクター内の配列は認識す
    る、少なくとも一つの制限エンドヌクレアーゼをもつ構造物の消化による、挿入
    ｃＤＮＡ分子を含む直線化断片の生成； （ｆ）直線化断片をバクテリオファージ特異的プロモーターからの翻訳を開始
    できるバクテリオファージ特異的ＲＮＡポリメラーゼと一緒にインキュベートす
    ることによる、アンチセンスｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ調整品生成； （ｇ）逆転写酵素と、１５から３０ヌクレオチド長で５’隣接ベクター配列に
    対して相補的なヌクレオチド配列を包含する５’ＲＴプライマーを用いた、ｃＲ
    ＮＡの転写による第一鎖ｃＤＮＡの生成； （ｈ）第一鎖ｃＤＮＡを副プールの第一シリーズへ分割することと、第一鎖ｃ
    ＤＮＡを第一ポリメラーゼ連鎖反応での鋳型とし、１５から３０ヌクレオチド長
    の、３’隣接ベクター配列に対し相補的な、最初の制限エンドヌクレアーゼ部位
    と、バクテリオファージ特異的プロモーターと３’終端構造が−Ｎ１として定義
    される、ここで「Ｎ」は４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧまたはＴの
    うちの一つである、最初の５’ＰＣＲプライマーによる翻訳開始決定部位との間
    にある、最初の３’ＰＣＲ−プライマーと、１５から３０ヌクレオチド長で、最
    初の５’ＰＣＲプライマーのうちの異なる一つが４つの異なる副プールの各々に
    用いられるｃＲＮＡの挿入特異的ヌクレオチド群の一ヌクレオチドへの、最初の
    ５’ＰＣＲプライマーの相補性拡張を伴う５’隣接ベクター配列に対し相補的で
    ある、最初の５’ＰＣＲプライマーとともに使用することによる、最初のＰＣＲ
    産物セットの生成。； （ｉ）それぞれの副プールの第一シリーズでのＰＣＲ産物第一セットを、副プ
    ールの第二シリーズにさらに分割することと、ＰＣＲ産物第一セットを第二ポリ
    メラーゼ連鎖反応に対する鋳型とし、１５から３０ヌクレオチド長の、３’隣接
    ベクター配列に対し相補的な、最初の制限エンドヌクレアーゼ部位と、バクテリ
    オファージ特異的プロモーターによる翻訳開始決定部位との間にある、第二３’
    プライマーと、３’終端構造が−Ｎ１−Ｎｘとして定義され、ここでＮ１はその
    副プールのための第一ポリメラーゼ連鎖反応に使われたＮ１と同一であり、「Ｎ
    」はステップｈのように、そして「ｘ」は１から５の整数値であり、プライマー
    は１５〜３０ヌクレオチド長で、全ヌクレオチド数が「ｘ」＋１でありここでは
    第二５’ＰＣＲプライマーのうちの異なる一つが副プールの第二シリーズの異な
    る副プールにおいて用いられ、ここで副プールの第一セットにおける各々の副プ
    ールのための副プールの第二シリーズにおいて４ｘ副プールがある、ｃＲＮＡの
    挿入特異的ヌクレオチド群を越えてのプライマーの相補性拡張を伴う５’隣接ベ
    クター配列に対し相補的である第二５’プライマーを共に使用することによる、
    ＰＣＲ産物の第二セット生成；および （ｊ）ｍＲＮＡ集団中に存在するｍＲＮＡの３’末端を表す配列特異的生産物
    の表示を生成のためのＰＣＲ産物の第二セットの分解
  2. 【請求項２】 ビオチン部分がアンカープライマーと結合する、請求項１の
    方法
  3. 【請求項３】 ビオチン部分がアンカープライマーの５’末端と結合する、
    請求項２の方法
  4. 【請求項４】 第一制限ｃＤＮＡが、第一制限ｃＤＮＡとストレプトアビジ
    ン被覆基質との接触により、請求項１のステップｂにおけるｃＤＮＡの残渣から
    分離される、請求項２の方法
  5. 【請求項５】 第一５’ＰＣＲプライマーの３’末端で３ヌクレオチドがホ
    スホロチオエート連鎖により結合する、請求項１の方法
  6. 【請求項６】 第二５’ＰＣＲプライマーの３’末端で３ヌクレオチドがホ
    スホロチオエート連鎖により結合する、請求項１の方法
  7. 【請求項７】 第一・第二５’ＰＣＲプライマーの３’末端で３ヌクレオチ
    ドがホスホロチオエート連鎖により結合する、請求項１の方法
  8. 【請求項８】 第二ＰＣＲ反応のためのプライマーの一つが蛍光ラベルに結
    合する、請求項１の方法
  9. 【請求項９】 蛍光ラベルが、スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９
    ’−（９Ｈ）−キサンテン）−３−オン，６−カルボン酸，３’，６’−ジヒド
    ロキシ−６−カルボキシフルオレセイン； スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３−
    オン，５−カルボン酸，３’，６’−ジヒドロキシ−５−カルボキシフルオレセ
    イン； スピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）−キサンテン）−３−
    オン，３’，６’−ジヒドロキシ−フルオレセイン； ９−（２，５−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメチルアミノ）−キ
    サンチリウム６−カルボキシテトラメチルローダミン； ３，６−ジアミノ−９−（２−ジカルボキシフェニル）−キサンチリウム； スピロ［イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−キサンテン］−６−カルボン酸
    、５’−ジクロロ−３’，６’−ジヒドロキシ−２’，７’−ジメトキシ−３−
    オキソ； １Ｈ，５Ｈ，１１Ｈ，１５Ｈ，キサンテノ［２，３，４−ｉｊ：５，６，７−ｉ
    ’ｊ’］ジキノリジン−８−イウム，−（２，４−ジスルホフェニル）−２，３
    ，６，７，１２，１３，１６，１７−オクタヒドロ−，内部塩； ６−（（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジア
    ザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミノ）ヘキサン酸； ６−（（４，４−ジフルオロ−１，３−ジメチル−５−（４−メトキシフェニル
    ）−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオニル）アミ
    ノ）ヘキサン酸； ６−（（（４−（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ
    ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）フェノキシ）アセチル）アミノ）
    ヘキサン酸； ４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペ
    ンタン酸； ４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−
    インダセン−３−プロパン酸； ４，４−ジフルオロ−５−フェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イン
    ダセン−３−プロピオン酸； ４，４−ジフルオロ−５−（４−フェニル−１，３−ブタジエニル）−４−ボラ
    −３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸； ４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−イン
    ダセン−３−プロピオン酸； ６−（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−チエニル）−４−ボラ−３ａ，４ａ
    −ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキサ
    ン酸； ６−（（（４，４−ジフルオロ−５−（２−ピローリル）−４−ボラ−３ａ，４
    ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−イル）スチリロキシ）アセチル）アミノヘキ
    サン酸； ９−（２，４（または２，５）−ジカルボキシフェニル）−３，６−ビス（ジメ
    チルアミノ）−キサンチリウム，内部塩；および ４，７，２’，４’，５’，７’ヘキサクロロ６−カルボキシフルオレセインお
    よび４，７，２’，７’テトラクロロ６−カルボキシフルオレセイン、からなる
    群から選択される、請求項８の方法
  10. 【請求項１０】 宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である
    、請求項１の方法
  11. 【請求項１１】 ステップ（ａ）の位相調節残基が−Ｖ−Ｎ−Ｎである、請
    求項１の方法
  12. 【請求項１２】 ステップ（ａ）の位相調節残基が−Ｖ−Ｎである、請求項
    １の方法
  13. 【請求項１３】 ステップ（ａ）の位相調節残基が−Ｖである、請求項１の
    方法
  14. 【請求項１４】 ステップ（ｉ）の「ｘ」が３である、請求項１の方法
  15. 【請求項１５】 ステップ（ｉ）の「ｘ」が１である、請求項１の方法
  16. 【請求項１６】 ステップ（ａ）の位相調節残基が−Ｖ−Ｎ−Ｎで、ステッ
    プ（ｉ）の「ｘ」が３である、請求項１の方法
  17. 【請求項１７】 ステップ（ａ）の位相調節残基が−Ｖで、ステップ（ｉ）
    の「ｘ」が２である、請求項１の方法
  18. 【請求項１８】 アンカープライマーがそれぞれ、Ｔ残基の区画内に１８Ｔ
    残基を持つ、請求項１の方法
  19. 【請求項１９】 アンカープライマーの最初の詰まった断片が１４残基の長
    さである、請求項１の方法
  20. 【請求項２０】 最初の詰まった断片の配列が、Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−
    Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ（配列番号：２）である、請求項１の方法
  21. 【請求項２１】 バクテリオファージ特異的プロモーターが、Ｔ３プロモー
    ター、Ｔ７プロモーター、およびＳＰ６プロモーターからなる群から選択される
    、請求項１の方法
  22. 【請求項２２】 バクテリオファージ特異的プロモーターがＴ３プロモータ
    ーである、請求項１の方法
  23. 【請求項２３】 ｃＲＮＡからｃＤＮＡへの転写の初回刺激をおこすプライ
    マーが、Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ（
    配列番号：１４）の配列を持つ、請求項１の方法
  24. 【請求項２４】 ベクターが、ＣｌａＩとＮｏｔＩにより切断されるプラス
    ミドｐＢＣ ＳＫ＋で、ステップ（ｈ）と（ｉ）の３’ＰＣＲプライマーがＧ−
    Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（配列番号：４７）
    である、請求項１の方法
  25. 【請求項２５】 ベクターが、ＣｌａＩとＮｏｔＩにより切断されるプラス
    ミドｐＢＣ ＳＫ＋で、ステップ（ｈ）と（ｉ）の３’ＰＣＲプライマーがＧ−
    Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ（配列番号：４
    ８）である、請求項１の方法
  26. 【請求項２６】 第二の制限エンドヌクレアーゼが認識する４ヌクレオチド
    配列がＭｓｐＩである、請求項１の方法
  27. 【請求項２７】 ４つのヌクレオチドシーケンスを認識する第２の制限酵素
    が、ＭｂｏＩ，ＤｐｎＩＩ，Ｓａｕ３ＡＩ，Ｔｓｐ５０９Ｉ，ＨｐａＩＩ，Ｂｆ
    ａＩ，Ｃｓｐ６Ｉ，ＭｓｅＩ，ＨｈａＩ，ＮｌａＩＩＩ，ＴａｑＩ，ＭａｐＩ，
    ＭａｅＩＩ Ｓａｕ３ＡＩ，ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎＰｌＩからなる群から選択
    される請求項１の方法。
  28. 【請求項２８】 ６塩基以上を認識する第１の制限酵素が、ＡｓｃＩ，Ｂａ
    ｅＩ，ＦｓｅＩ，ＮｏｔＩ，ＰａｃＩ，ＰｍｅＩ ＰｐｕＭＩ，ＲｓｒＩＩ，Ｓ
    ａｐＩ，ＳｅｘＡＩ，ＳｆｉＩ，ＳｇｆＩ，ＳｇｒＡＩ，ＳｒｆＩ，Ｓｓｅ８３
    ８７ＩおよびＳｗａＩからなる群から選択される請求項１の方法。
  29. 【請求項２９】 ６塩基以上を認識する第１の制限酵素がＮｏｔＩである請
    求項１の方法。
  30. 【請求項３０】 ステップ（ｅ）で使用される制限酵素が、ステップ（ｂ）
    で使用される第２の制限酵素の４つのヌクレオチドシーケンスを含む、ヌクレオ
    チドシーケンス認識を有する請求項１の方法。
  31. 【請求項３１】 第２の制限酵素がＭｓｐＩで、ステップ（ｅ）で使用され
    る制限酵素がＳｍａＩである請求項３０の方法。
  32. 【請求項３２】 第２の制限酵素がＴａｑＩで、ステップ（ｅ）で使用され
    る制限酵素がＸｈｏＩである請求項３０の方法。
  33. 【請求項３３】 第２の制限酵素がＨｉｎＰｌＩで、ステップ（ｅ）で使用
    される制限酵素がＮａｒＩである請求項３０の方法。
  34. 【請求項３４】 第２の制限酵素がＭａｅＩＩで、ステップ（ｅ）で使用さ
    れる制限酵素がＡａｔＩＩである請求項３０の方法。
  35. 【請求項３５】 第２の制限酵素がＳａｕ３ＡＩで、ステップ（ｅ）で使用
    される制限酵素がＢｇｌＩＩである請求項３０の方法。
  36. 【請求項３６】 第２の制限酵素がＮｌａＩＩＩで、ステップ（ｅ）で使用
    される制限酵素がＮｃｏＩである請求項３０の方法。
  37. 【請求項３７】 ステップ（ｃ）のベクターが、ベクタースタッファーシー
    クエンスを側面に配している第１と第２のベクター制限酵素サイトを有し、第１
    と第２のベクター制限酵素サイトでベクターを裂く制限酵素を備えたベクターを
    温浸するステップをさらに含む、環状ＤＮＡ分子の形をしている請求項１の方法
    の実施に適したベクター。
  38. 【請求項３８】 ベクタースタッファーシークエンスが、第１と第２のベク
    ター制限酵素サイトの間に内部ベクタースタッファー制限酵素を含んでいる請求
    項３７のベクター。
  39. 【請求項３９】 ステップ（ｅ）が、内部ベクタースタッファー制限酵素サ
    イトでベクターを裂く制限酵素を備えたベクターの温浸を含む、請求項３８のベ
    クター。
  40. 【請求項４０】 プラスミドｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ１，ｐＢＳ ＳＫ＋／
    ＤＧＴ２，ｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ３，ｐＢＣ ＳＫ＋／ＤＧＴ４およびｐＢＳ ＳＫ＋／ＤＧＴ５からなる群から選択されるベクター。
  41. 【請求項４１】 ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０
    ，ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １１， ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １２ ａｎｄ ＳＥ
    Ｑ ＩＤ ＮＯ： １３からなる群から選択されるマルティプルクローニングサ
    イトを含むベクター。
  42. 【請求項４２】 ｍＲＮＡ母集団がポリアデニレートされたｍＲＮＡ種に対
    し豊富になっている請求項１の方法。
  43. 【請求項４３】 ステップ（ｊ）で増幅された断片の解像度が、生成物を表
    示するために電気泳動によって導かれる請求項１の方法。
  44. 【請求項４４】 電気泳動後に表示された生成物の強度が、オリジナルの混
    合中の生成物に対応する豊富なｍＲＮＡに比例する請求項４３の方法。
  45. 【請求項４５】 電気泳動後のｍＲＮＡに対応する生成物の強度からのオリ
    ジナルの混合中の豊富な各ｍＲＮＡの相対的な量を決定するステップをさらに含
    む請求項４３の方法。
  46. 【請求項４６】 電気泳動によって断片を増幅する合成酵素連鎖反応を解析
    するステップが、少なくとも２つのゲル上の断片の電気泳動を包む請求項４３の
    方法。
  47. 【請求項４７】 ｋ）サンプルの中にあるｍＲＮＡの３’−エンドを表わす
    バンドが、表示されるエレクトロフォレトグラムからのｍＲＮＡに対応する少な
    くとも１つのｃＤＮＡを溶出するステップ； （ｌ）合成酵素連鎖反応中の溶出されたｃＤＮＡを増幅するステップ； （ｍ）プラスミドへ増幅されたｃＤＮＡのクローンを作るステップ； （ｎ）プラスミドからクローンＤＮＡに対応するＤＮＡを生産するステップ；
    および （ｏ）クローンｃＤＮＡを順番に並べるステップ をさらに含む請求項４０の方法。
  48. 【請求項４８】 （ａ）ｍＲＮＡ母集団を分離するステップ； （ｂ）各アンカープライマーが５’終点および３’終点およびｉ）７から４０
    Ｔの残留物の地域；（ｉｉ）８つの塩基を認識する第１の制限酵素による分裂の
    ためのサイトで、該サイトはＴ残留物の地域に関する５’−終点に向かって位置
    している分裂のためのサイト；（ｉｉｉ）４から４０のヌクレオチドの第１のス
    タッファー断片で、第１の制限酵素によって分裂のためのサイトに関する５’−
    終点に向かって位置している第１のスタッファー断片；（ｉｖ）６塩基以上かつ
    Ｔ残留物の地域を認識する第１の制限酵素による分裂のためにサイト間に置かれ
    た第２のスタッファー断片、および（ｖ）−Ｖ、−Ｖ−Ｎあるいはアンカープラ
    イマーの各々３’−終点に位置した−Ｖ−Ｎ−Ｎのうちの１つによって定義され
    る調整された残留物（式中Ｖは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴを含むグループから選択さ
    れるデオキシリボヌクレオチド；および、ＮはＡ、Ｃ、ＧおよびＴを含むから選
    択されるデオキシリボヌクレオチドであって、ＶおよびＮである可能性をすべて
    含んでいるアンカープライマーを含む混合物）；を含み、アンカープライマーの
    混合に使用するｍＲＮＡ母集団からの二重らせん構造のｃＤＮＡ母集団を準備す
    るステップ； （ｃ）第１の制限酵素および第１と第２の終点がある二重らせん構造のｃＤＮ
    Ａ分子の母集団を形成するために４つのヌクレオチドシーケンスを認識する第２
    の制限酵素を備えた二重らせん構造のｃＤＮＡ母集団を裂くステップ； （ｄ）５’および挿入されたｃＤＮＡのセンスの５’終点に隣接しているベク
    ターシーケンスの側面に位置する３’およびセンスストランドの３’終点をそれ
    ぞれ定義して挿入されたｃＤＮＡ分子を含む構造の母集団を形成するベクター内
    のＴ３プロモーターに関してアンチセンスのオリエンテーションにベクターにス
    テップ（ｂ）からの個々の二重らせん構造のｃＤＮＡ分子を挿入するステップで
    、前記構造は第１の制限酵素サイトと前記プロモーターに転写開始を定義するサ
    イトの間の長さで少なくとも１５のヌクレオチドのベクターシーケンスの側面に
    位置する３’を有する； （ｅ）クローンを含むベクターを生産するために裂かれたｃＤＮＡが挿入され
    たベクターを備えた大腸菌を変形するステップ； （ｆ）挿入された一方のｃＤＮＡ分子中の、あるいはＴ３プロモーター中のシ
    ーケンスを認識しない少なくとも１つの制限酵素を備えたステップ（ｃ）の中で
    生産された母集団の温浸によって、挿入されたｃＤＮＡ分子を含む線形化された
    断片を生成するステップ； （ｇ）Ｔ３プロモーターからの転写を始めることができるＴ３ＲＮＡポリメラ
    ーゼを備えた線形化された破片をインキュベートすることによりアンチセンスｃ
    ＲＮＡ転写するｃＲＮＡ調整物を生成するステップ； （ｈ）逆転写酵素および１５から３０の長さのヌクレオチドで、ベクターシー
    ケンス側面に位置する５’と相補的であるヌクレオチド・シーケンスである５’
    ＲＴプライマーの使用して、ｃＲＮＡの転写により第１のストランドｃＤＮＡを
    生成するステップ； （ｉ）サブプールの第１のシリーズ中への第１のストランドｃＤＮＡの分割を
    し、第１の制限酵素サイトと、特定のＴ３プロモーターおよび−Ｎ１（「Ｎ」は
    ４つのデオキシリボヌクレオチドＡ、Ｃ、ＧあるいはＴのうちの１つで、第１の
    ５’ＰＣＲプライマーは１５から３０の長さのヌクレオチドであり、ｃＲＮＡの
    挿入した特定ヌクレオチドの１つのヌクレオチドへ伸びる第１の５’ＰＣＲプラ
    イマー相補性を備えたベクトルシーケンスの側面に位置する５’と相補的である
    。また、第１の５’ＰＣＲプライマーの異なった１つは、４つの異なったサブプ
    ールの各々で使用される。）を含む３’終点有すると定義される第１の５’ＰＣ
    Ｒプライマーにより転写開始を定義するサイトとの間のベクトルシーケンス側面
    に位置する３’と相補的である１５〜３０の長さのヌクレオチドの第１の３’Ｐ
    ＣＲプライマーを備えた第１の合成酵素連鎖反応用テンプレートとして第１のス
    トランドｃＤＮＡを使用することによりＰＣＲ生成物の第１のセットを生成する
    ステップ； （ｊ）サブプールの第１のシリーズの各々でのサブプールの第２のシリーズ中
    へのＰＣＲ生成物の第１のセットの分割をし、第１の制限酵素サイトと、特定の
    Ｔ３プロモーターおよび−Ｎ１−Ｎｘ（Ｎ１はサブプール用に第１のポリメラー
    ゼ連鎖反応の中で使用されたＮ１と同一であり、Ｎはステップ（ｉ）と同様、お
    よびＸは３または４から選択される整数である。プライマーは１５から３０の長
    さのヌクレオチドであり、ｘ＋１に等しい数のヌクレオチド中のｃＲＮＡの挿入
    した特定のヌクレオチドへ横切って伸びるプライマーの相補性を備えたベクトル
    シーケンスの側面に位置する５’と相補的である。また、第２の５’ＰＣＲプラ
    イマーの異なった１つは、サブプールの第２のシリーズの異なったサブプールで
    使用され、各々のサブプール用にサブプールの第２のシリーズに４ｘサブプール
    がある。）を含む３’終点有すると定義される第２の５’ＰＣＲプライマーによ
    り転写開始を定義するサイトとの間のベクトルシーケンス側面に位置する３’と
    相補的である１５〜３０の長さのヌクレオチドの第２の３’ＰＣＲプライマーを
    備えた第２の合成酵素連鎖反応用テンプレートとしてＰＣＲ生成物の第１のセッ
    トを使用することによりＰＣＲ生成物の第２のセットを生成するステップ； （ｋ）ｍＲＮＡ母集団中にあるｍＲＮＡｓの３’終点を表わす、シーケンス特
    定生成物の表示を生成するためのＰＣＲ生成物の第２のセットを解析するステッ
    プ； を含むｍＲＮＡ母集団中のｍＲＮＡｓの同時シーケンス特定の識別用に改善され
    た方法。
  49. 【請求項４９】 ４８アンカープライマーの混合物がシーケンスＡ−Ａ−Ｃ
    −Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ
    −Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
    −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ５）を有する
    請求項４８の方法。
  50. 【請求項５０】 ４８アンカープライマーの混合物がシーケンスＧ−Ａ−Ａ
    −Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ
    −Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ
    −Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ８）を有
    する請求項４８の方法。
  51. 【請求項５１】 １２アンカープライマーの混合物がシーケンスＡ−Ａ−
    Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−
    Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
    Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４）を有する請
    求項４８の方法。
  52. 【請求項５２】 １２アンカープライマーの混合物がシーケンスＧ−Ａ−
    Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−
    Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
    Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ７）を有す
    る請求項４８の方法。
  53. 【請求項５３】 ３アンカープライマーの混合物がシーケンスＡ−Ａ−Ｃ−
    Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−
    Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
    Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ３）を有する請求項４８
    の方法。
  54. 【請求項５４】 ３アンカープライマーの混合物がシーケンスＧ−Ａ−Ａ−
    Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−
    Ｇ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−
    Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｖ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ６）を有する請求項
    ４８の方法。
  55. 【請求項５５】 第１の制限酵素がＭｓｐＩで、第２の制限ヌクレアーゼが
    ＮｏｔＩである請求項４８の方法。
  56. 【請求項５６】 第１の５’ＰＣＲプライマーがＧ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ａ−
    Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｎ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ２２）であ
    る請求項４８の方法。
  57. 【請求項５７】 第１の３’ＰＣＲプライマーと第２の３’ＰＣＲプライマ
    ーがＧ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｇ−Ｇ−Ｔ（ＳＥＱ
    ＩＤ ＮＯ： ４７）である請求項４８の方法。
  58. 【請求項５８】 ステップ（ｊ）のｘが３である請求項４８の方法。
  59. 【請求項５９】 ステップ（ｊ）のｘが４である請求項４８の方法。
  60. 【請求項６０】 以下の段階を含む生理学的あるいは病理学的変化に関連
    する組織の中のｍＲＮＡ表現のパターンの変化の検出方法。 （ａ）生理学的あるいは病理学的変化を被っていない組織の最初のサンプルを得
    る；。 （ｂ）ｍＲＮＡ個体群を最初のサンプルから分離する； （ｃ）最初のサンプルに存在するｍＲＮＡの３′−終点を表す配列特異的の生成
    物の最初の表示を発生させるために請求項１の（ａ）から（ｊ）の段階を行って
    組織の最初のサンプル中のｍＲＮＡの表現のパターンを決定する； （ｄ）生理学的あるいは病理学的変化を既に被っている組織の第二のサンプルを
    得る； （ｅ）ｍＲＮＡ個体群を第二のサンプルから分離する； （ｆ）第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３′−終点を表す配列特異的の生成
    物の第二の表示を発生させるために請求項１の（ａ）から（ｊ）の段階を行って
    組織の第二のサンプル中のｍＲＮＡの表現のパターンを決定する；および （ｇ）組織のｍＲＮＡの表現のパターンの生理学的あるいは病理学的変化の影響
    を決定するために最初のおよび第二の表示を比較する。
  61. 【請求項６１】 生理学的あるいは病理学的変化が、転写要因、細胞内の
    第２のメッセンジャー、ホルモン、神経伝達物質、成長要因、神経変調物質、セ
    ル−セルの接触、セル−基質の接触、セル−細胞外マトリックスの接触および細
    胞膜と細胞骨格との間の接触により仲介されたプロセスから選択される請求項６
    ０記載の方法。
  62. 【請求項６２】 組織が中枢神経系から得られる請求項６０記載の方法。
  63. 【請求項６３】 生理学的あるいは病理学的変化が、アルツハイマー病、
    パーキンソン症、乏血、アルコール中毒、薬物依存、精神分裂病、筋萎縮性側索
    硬化症、多発性硬化症、鬱および二極性躁鬱の疾病からなる群から選択される請
    求項６２記載の方法。
  64. 【請求項６４】 生理学的あるいは病理学的変化が、学習または記憶、感
    情、グルタミン酸塩神経毒性、摂食行動、嗅覚作用、視覚、動作疾病、ウィルス
    感染、電気ショック療法あるいは薬か毒素の管理に関連する請求項６２記載の方
    法。
  65. 【請求項６５】 生理学的あるいは病理学的変化が、概日変化、老化、お
    よび長期相乗作用からなる群から選択される請求項６０記載の方法。
  66. 【請求項６６】 網膜、大脳皮質、嗅球、視床、視床下部、前部の脳下垂
    体、後部の脳下垂体、海馬、側坐核、扁桃体、線条体、小脳、脳幹、キアズマ上
    核および脊髄からなる群から選択される中枢神経系内の構造から組織が得られる
    請求項６０記載の方法。
  67. 【請求項６７】 組織が、心臓血管系、肺のシステム、消化器系、末梢神
    経系、肝臓、腎臓、骨格筋および生殖システムからなる群から選択される器官ま
    たは器官系からの常態かまたは新しく生成した組織である請求項６０記載の方法
    。
  68. 【請求項６８】 組織が、心臓血管系、リンパ系、呼吸器系、消化器系、
    末梢神経系、中枢神経系、腸の神経系、内分泌腺のシステム、珠皮（皮膚，毛髪
    および爪を含む）、骨格系（骨と筋肉を含む）、尿のシステムおよび生殖システ
    ムからなる群から選択される器官または器官系から取り出されるかまたは分離さ
    れる細胞を含む常態かまたは新しく生成した組織である請求項６０記載の方法。
  69. 【請求項６９】 組織が、皮膜組織、内皮、粘膜、腺、リンパ液、結合組
    織、軟骨、骨、平滑筋、骨格筋、心筋、ニューロン、膠細胞、脾臓、胸腺、脳下
    垂体、甲状腺、上皮小体、副腎の皮質、副腎の毛髄、副腎の皮質、松果体、皮膚
    、毛髪、爪、歯、肝臓、膵臓、肺、腎臓、膀胱、尿管、胸、卵巣、子宮、膣、精
    巣、前立腺、陰茎、眼および耳からなる群から取り出されるかまたは分離される
    細胞を含む常態かまたは新しく生成した組織である請求項６０記載の方法。
  70. 【請求項７０】 以下の段階を含む、ふるい分けられる薬品と既知の化合
    物との作用の相違の検出方法。 （ａ）既知の生理的機能の化合物で処理した有機体から組織の最初のサンプルを
    得る； （ｂ）ｍＲＮＡ個体群を最初のサンプルから分離する； （ｃ）最初のサンプルに存在するｍＲＮＡの３′−終点を表す配列特異的の生成
    物の最初の表示を発生させるために請求項１の（ａ）から（ｊ）の段階を行って
    組織の最初のサンプル中のｍＲＮＡの表現のパターンを決定する； （ｄ）薬品と既知の化合物との作用の相違のためにふるい分けられる薬品で処理
    した有機体から組織の第二のサンプルを得る； （ｅ）ｍＲＮＡ個体群を最初のサンプルから分離する； （ｆ）第二のサンプルに存在するｍＲＮＡの３′−終点を表す配列特異的の生成
    物の第二の表示を発生させるために請求項１の（ａ）から（ｊ）の段階を行って
    組織の第二のサンプル中のｍＲＮＡの表現のパターンを決定する；および （ｇ）表現が既知の化合物によって影響されないがふるい分けられる薬品によっ
    て影響されるｍＲＮＡ種の存在を検出するために最初のおよび第二の表示を比較
    し、それによって、ふるい分けされる薬品と既知の化合物との作用の相違を表示
    する。
  71. 【請求項７１】 ふるい分けられる薬品が、抗うつ薬、神経弛緩薬、精神
    安定剤、抗痙攣薬、モノアミンオキシダーゼ阻害薬および刺激剤からなる群から
    選択される請求項７０記載の方法。
  72. 【請求項７２】 ふるい分けられる薬品が、抗パーキンソン症薬剤、骨格
    筋弛緩剤、鎮痛剤、局所麻酔薬、コリン作動剤、抗ウイルス性薬剤、鎮痙剤、ス
    テロイドおよび非ステロイド抗炎症剤からなる群から選択される請求項７０記載
    の方法。
  73. 【請求項７３】 請求項１記載の配列特異的の生成物の表示の量によって
    生じるデータを含むデータベース。
  74. 【請求項７４】 さらに配列関係、遺伝子地図および細胞の分配に関係の
    あるデータを含む請求項１のデータベース。
  75. 【請求項７５】 サンプルに存在するｍＲＮＡ分子の３‘末端のシーケンス
    とシーケンスデータベースとの間のシーケンス同一性並びに近似性を認識する、
    以下の段階からなる方法。 （ａ）アンカープライマーの混合物を用いてｍＲＮＡポピュレーションからダ
    ブルストランドのｃＤＮＡポピュレーションを準備する段階、 各々のアンカープライマーは、５‘端と３’端とを有し、かつ、（ｉ）７〜４
    ０のＴ残基のトラクト、（ｉｉ）６以上の塩基を認識する第１限定エンドヌクレ
    アーゼによるクリービッジサイト、該クリービッジサイトはＴ残基のトラクトに
    対して５‘端方向に位置している、（ｉｉｉ）４〜４０ヌクレオチドの第１スタ
    ッファーセグメント、前記第１スタッファーセグメントは前記第１限定エンドヌ
    クレアーゼによる前記クリービッジサイトに対して５’端方向に位置している、
    （ｉｖ）６以上の塩基を認識する第１限定エンドヌクレアーゼによるクリービッ
    ジサイトとＴ残基トラクトとの間に位置する第２スタッファーセグメント、及び
    、（ｖ）−Ｖ、−Ｖ−Ｎ、及び−Ｖ−Ｎ−Ｎから成る群より選択されるアンカー
    プライマーの各々の３‘端に位置するフェージング残基、ここでＶはＡ，Ｃ及び
    Ｇからなる群より選択されるデオキシリボ核酸、ＮはＡ，Ｃ、Ｇ及びＴよりなる
    群より選択されるデオキシリボ核酸、その混合物はＶとＮのすべての可能性を包
    含するアンカーパライマーを含む； （ｂ）第１限定エンドヌクレアーゼと第２限定エンドヌクレアーゼを用いてダ
    ブルストランドｃＤＮＡポピュレーションをクリービングする段階、前記第２限
    定エンドヌクレアーゼは４ヌクレオチドシーケンスを認識するものであって、各
    々第１及び第２末端を有するダブルストランドｃＤＮＡ分子のポピュレーション
    を形成する； （ｃ）段階（ｂ）からの各々のダブルストランドｃＤＮＡ分子を、バクテリオ
    ファージ特定のプロモータに対してアンチセンスとなる方向に、ベクターに挿入
    する段階、前記ベクター内において挿入されたｃＤＮＡ分子を含む構造のポピュ
    レーションを形成し、それによって、挿入されたｃＤＮＡセンスストランドの５
    ‘端並びにセンスストランドの３’端に近接して、各々５‘並びに３’フランキ
    ングベクターシーケンスを規定する、前記構造は前記第１限定エンドヌクレアー
    ゼサイトと前記プロモータにおいて転写開始を規定するサイトとの間の長さが少
    なくとも１５ヌクレオチドである３‘フランキングベクターシーケンスを有する
    ； （ｄ）前記クリービングされたｃＤＮＡが挿入されてクローン挿入物を含むベ
    クターを産する前記ベクターでホストセルをトランスフォームする段階； （ｅ）前記挿入されたｃＤＮＡ分子内でも前記バクテリオファージ特定のプロ
    モータにおいてもシーケンスを認識しないが、前記ベクターにおいてシーケンス
    を認識する少なくとも一つの限定エンドヌクレアーゼで、段階（ｃ）で生成され
    た前記構造をダイジェスティングすることによって、前記挿入されたｃＤＮＡ分
    子を含む線形断片を生成する段階、そうすることによって結果する線形断片は、
    前記ダブルストランドｃＤＮＡ分子の第２端に対するベクター５‘内へ少なくと
    も１５ヌクレオチドの５‘フランキングベクターシーケンスを有する； （ｆ）前記バクテリオファージ特定のプロモータから転写を開始することので
    きるバクテリオファージ特定のＲＮＡポリメラーゼを用いて前記線形断片をイン
    キュベーティングすることによって、アンチセンスのｃＲＮＡ転写物のｃＲＮＡ
    プリパレーションを生成する段階； （ｇ）リバーストランスクリプターゼと、長さが１５〜３０ヌクレオチドであ
    って前記５‘フランキングベクターシーケンスに対して相補的であるヌクレオチ
    ドシーケンスからなる５’ＲＴプライマーとを用いて、前記ｃＲＮＡを転写する
    ことによって、第１ストランドｃＤＮＡを生成する段階； （ｈ）前記第１ストランドｃＤＮＡをサブプールの第１シリーズへ分割し、１
    ５〜３０ヌクレオチドの長さであって前記第一限定エンドヌクレアーゼサイトと
    前記バクテリオファージ特定プロモータによる転写開始を規定するサイトとの間
    で３‘フランキングベクターシーケンスに対して相補的である第１の３‘ＰＣＲ
    −プライマー、及び−Ｎ１から成る３’端を有するものとして規定される第１の
    ５’ＰＣＲ−プライマーとの第１ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートと
    して、前記第１ストランドｃＤＮＡを用いることによって、ＰＣＲ生成物の第１
    セットを生成する段階、 ここで“Ｎ”は４つのデオキシリボヌクレオチドＡ，Ｃ、Ｇ、Ｔのうちの一つ
    であって、かつ、記第一の５‘ＰＣＲ−プライマーは長さが１５〜３０ヌクレオ
    チドであって前記第一５’ＰＣＲ−プライマーの相補性でもって前記５’フラン
    キングベクターシーケンスに対して相補的であり前記ｃＲＮＡの前記挿入特定ヌ
    クレオチドの内の一つのヌクレオチドへ延びる、さらにここで前記第一５‘ＰＣ
    Ｒプライマーのうちの異なった一つは４つの異なったサブプールの各々において
    用いられる； （ｉ）さらに、サブプールの第一シリーズの各々においてＰＣＲ生成物の第一
    セットをサブプールの第２シリーズに分割し、１５〜３０ヌクレオチドの長さで
    あって前記第一限定エンドヌクレアーゼサイトと前記バクテリオファージ特定プ
    ロモータによる転写開始を規定するサイトとの間で３‘フランキングベクターシ
    ーケンスに対して相補的である第２の３‘ＰＣＲ−プライマー、及び−Ｎ１−Ｎ
    ｘから成る３’端を有するものとして規定される第２の５’ＰＣＲ−プライマー
    との第２ポリメラーゼ連鎖反応のためのテンプレートとして、ＰＣＲ生成物の前
    記第一セットを用いることによって、ＰＣＲ生成物の第２セットを生成する段階
    、 ここでＮ１は前記第一ポリメラーゼ連鎖反応においてそのサブプールのために
    用いられる前記のＮ１と同一であって、“Ｎ”は段階（ｈ）におけると同様であ
    り、“Ｘ”は１〜５の整数であって、前記プライマーは長さが１５〜３０ヌクレ
    オチドであって前記プライマーの相補性でもって前記５’フランキングベクター
    シーケンスに対して相補的であり前記ｃＲＮＡの前記挿入特定ヌクレオチド内へ
    “Ｘ”＋１に等しいヌクレオチドの数で横切って延びる、さらにここで前記第二
    ５‘ＰＣＲプライマーのうちの異なった一つはサブプールの第二のシリーズの異
    なったサブプールにおいて用いられ、なおかつここにおいて、サブプールの前記
    第一セット内の前記サブプールの各々に対してサブプールの前記第二のシリーズ
    内には４ｘ個のサブプールが存在する； （ｊ）ＲＣＲ生成物の前記第２セットを解析して、前記ｍＲＮＡポピュレーシ
    ョンに存在するｍＲＮＡの３‘端を表すシーケンス特定生成物のディスプレイを
    生ぜしめる段階； （ｋ）前記サンプルに存在するｍＲＮＡの３‘端を表すバンドがディスプレイ
    されるエレクトロフェログラムからｍＲＮＡに対応する少なくとも一つのｃＤＮ
    Ａを抽出する段階； （ｌ）前記抽出されたｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応において増幅せしめる
    段階； （ｍ）前記増幅せしめられたｃＤＮＡをプラズミドにクローニングする段階； （ｎ）前記プラズミドからの前記クローニングされたＤＮＡに対応するＤＮＡ
    を生成する段階； （ｏ）前記クローニングされたｃＤＮＡのシーケンスを決定する段階； （ｐ）ヌクレオチドシーケンスのデータベースから対応するヌクレオチドシー
    ケンスを決定する段階、前記対応するヌクレオチドシーケンスは前記第２エンド
    ヌクレアーゼの最遠位認識サイト並びに前記ポリ（Ａ）テールの開始部によって
    は限定されない； （ｑ）前記クローニングされたｃＤＮＡのシーケンスを前記対応するヌクレオ
    チドシーケンスと比較することによって、サンプルに存在するｍＲＮＡ分子の３
    ‘端のシーケンスとシーケンスデータベースとの間のシーケンス同一性並びに近
    似性を認識する段階。
  76. 【請求項７６】 さらに、（ｒ）二次元グラフィックディスプレイにおいて
    前記ＰＣＲ生成物の長さ及び量を比較する段階、からなる、請求項７６の方法。
  77. 【請求項７７】 さらに以下の段階から成る請求項７６の方法。 （ｓ）データベースから決定される前記対応するヌクレオチドシーケンスの
    長さの合計値に等しい、前記対応するヌクレオチドシーケンスの期待される長さ
    、ベクターシーケンスにハイブリダイゼーション可能な前記５‘ＰＣＲシーケン
    ス長、残りのアンカープライマーシーケンスの長さ、ベクターシーケンスのイン
    タービーンセグメント、及びベクターシーケンスにハイブリダイゼーション可能
    な３’ＰＣＲシーケンスの長さを決定する段階；及び、 （ｔ）前記ＰＣＲ生成物の長さを前記決定された期待された対応するヌクレ
    オチドシーケンス長と比較する段階、ここで対応するヌクレオチドシーケンスの
    期待された長さはグラフィックシンボル乃至テキストキャラクタを用いて二次元
    グラフィックディスプレイに示される。
  78. 【請求項７８】 サンプルに存在するｍＲＮＡ分子に対応するｃＤＮＡ断片
    シーケンスとシーケンスデータベースとの間のシーケンス同一性並びに近似性を
    認識する、以下の段階からなる方法。 サンプルに存在するｍＲＮＡ分子に対応するｃＤＮＡ断片を抽出すること； ポリメラーゼ連鎖反応において前記抽出されたｃＤＮＡ断片を増幅せしめて
    、増幅されたｃＤＮＡ断片を生成せしめること； 前記増幅せしめられたｃＤＮＡ断片をプラズミドにクローニングすること； 前記クローニングされたｃＤＮＡ断片に対応するＤＮＡ分子を生成せしめる
    こと； 前記生成せしめられたＤＮＡ分子をシーケンシングして、前記抽出されたｃ
    ＤＮＡ断片のシーケンスを決定すること；及び、 前記抽出されたｃＤＮＡ断片のシーケンスをデータベースシーケンスと比較
    して、シーケンス同一性並びに近似性を認識すること。
  79. 【請求項７９】 前記抽出されたｃＤＮＡ断片のシーケンスをデータベース
    シーケンスと比較する段階はコンピュータを用いて実行される、請求項７８の方
    法。
  80. 【請求項８０】 前記比較の結果をグラフィック表示する更なる段階からな
    る、請求項７８の方法。
  81. 【請求項８１】 サンプルに存在するｍＲＮＡ分子に対応するｃＤＮＡ断片
    シーケンスとシーケンスデータベースとの間のシーケンス同一性並びに近似性を
    認識する、以下の段階からなる方法。 サンプルに存在するｍＲＮＡ分子に対応するｃＤＮＡ断片を抽出すること、
    ここにおいて前記ｃＤＮＡ断片は限定エンドヌクレアーゼ認識サイトの位置及び
    前記ｍＲＮＡ分子のポリ（Ａ）テール部とによって決定される長さを有する； 前記限定エンドヌクレアーゼ認識サイトのシーケンスに対応する５‘ＰＣＲ
    プライマーとのポリメラーゼ連鎖反応を実行することによって、前記ｃＤＮＡ断
    片の部分シーケンスを決定すること； 前記抽出されたｃＤＮＡ断片の決定された部分シーケンス及び前記ｃＤＮＡ
    断片長をデータベースシーケンスと比較して、シーケンス同一性並びに近似性を
    認識すること。
  82. 【請求項８２】 トランスフォームされたポリヌクレオチドシーケンスデ
    ータベースエントリを生成する、以下の段階からなる方法。 ポリヌクレオチドシーケンスデータベースエントリからソースシーケンスを
    選択すること； 前記ソースシーケンス内においてポリ（Ａ）テールシーケンス位置を見出す
    こと； 前記第一認識サイトに最近接する前記ソースシーケンス内においてエンドヌ
    クレアーゼ認識サイトシーケンスの位置を見出すこと； 前記エンドヌクレアーゼ認識サイトに近接する約２から約６までのヌクレオ
    チドから成るインデックスシーケンスを決定すること； 前記ソースシーケンス内において相関シーケンスを決定すること；前記相関
    シーケンスは前記ポリ（Ａ）テール部と前記エンドヌクレアーゼ認識サイトとに
    よって境界付けられるシーケンスを含み、かつ前記エンドヌクレアーゼ認識サイ
    トの少なくとも一部を含む； 前記相関シーケンスの長さを決定すること；及び、 前記ポリ（Ａ）テール部の位置とシーケンス、前記エンドヌクレアーゼ認識
    サイトの位置とシーケンス、及び前記ソースシーケンスと関連する前記相関シー
    ケンスの長さに関する情報を蓄積して、トランスフォームされたデータベースエ
    ントリを生成すること。
  83. 【請求項８３】 さらに、前記インデックスシーケンスとの関係において前
    記相関シーケンスの長さをグラフィック表示する段階を含む、請求項８２の方法
    。
  84. 【請求項８４】 前記限定エンドヌクレアーゼがＭｓｐＩ，ＴａｑＩ及びＨ
    ｉｎＰ１Ｉからなる群から選択される、請求項８３の方法。
  85. 【請求項８５】 次の段階を包含する、目標とされていないｃＤＮＡの増
    幅によるバックグラウンドの縮小によりＰＤＲ生成物の長さおよび量の解決を改
    善する方法： ｃＲＮＡ個体群のサンプルを選択し、ここで各ｃＲＮＡ分子は挿入配列および
    ベクトル派生した配列を含む； ベクトル派生した配列に交雑し、ｃＤＮＡの逆の転写生成物を生成するために
    挿入配列へ約５つのヌクレオチドから約６つのヌクレオチドを拡張する逆の転写
    プライマを使用して、逆の転写を実行する； ｃＤＮＡの逆の転写生成物を細分する； ベクトル派生した配列に交雑し、ＰＣＲ生成物を生成するために挿入配列へ約
    ７つのヌクレオチドから約９つのヌクレオチドを拡張する５′ＰＣＲプライマ、
    ３′ＰＣＲプライマおよび細分されたｃＤＮＡの逆の転写生成物を使用して、少
    なくとも一つのポリメラーゼ鎖の反応を実行し、それによって、目標とされてい
    ないｃＤＮＡの増幅によるバックグラウンドを縮小する。
  86. 【請求項８６】 逆の転写反応のプールを１６有し、相違する逆の転写プ
    ライマを１６有する請求項８５記載の方法。
  87. 【請求項８７】 ポリメラーゼ鎖の反応のサブプールを４ｘ有し、ここで
    Ｘは５′ＰＣＲプライマが挿入配列へ拡張するヌクレオチドの数と、逆の転写プ
    ライマが挿入配列へ拡張するヌクレオチドの数との間の差である請求項８６記載
    の方法。
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AU4721800A (en) Method for simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and measurement of relative concentrations

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