CN101538606B - 检测一种或多种靶核酸的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在同一体系中检测样品中靶核酸的方法。另外，本发明还涉及在同一体系中检测样品中多种靶核酸的方法、以及分别用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。本发明的方法不但灵敏度高，而且可以在同一体系中实施，还可以进行多重检测，并可以利用现有设备，因此可广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域。

Description

检测一种或多种靶核酸的方法及其试剂盒

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及在同一体系中检测样品中靶核酸的方法。另外，本发明还涉及在同一体系中检测样品中多种靶核酸的方法、以及分别用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。

背景技术

核酸检测技术日益普及，其中方法学更是多种多样，主要有聚合酶链反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、依赖核酸序列的扩增技术(NASBA)、分支探针(b-DNA)、连接酶链反应(LCR)等技术及其衍生技术。这些技术应用领域广泛，可用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多行业。例如，使用这些技术的某些诊断项目已获得美国或中国医药管理部门许可，可用于临床分子检测从而供医师诊断参考，其中PCR还获得授权用于血液筛查。对于DNA的检测，国际普遍采用PCR的方法，快速简便，例如Roche的COBAS Amplicor test system是FDA最早授权检测HBV DNA的试剂；对于RNA的检测，主要采用NASBA、b-DNA等方法，如ChironProcleix HIV-1/HCV试剂。

RT-PCR也可进行RNA分子检测，但是在测定微量RNA分子时，往往由于反转录效率低而限制了它的灵敏度，一般的反转录效率偏低，其原因其一是RNA靶分子太少，其二是RNA分子的高级结构所致。Roche公司COBAS Amplicor test system在检测HCV RNA和HIV RNA使用耐热tTh酶，提高了反转录温度，增加了反转录效率，但仍然是由一个RNA靶分子对应一个cDNA分子，cDNA的产出率较低，反转录效率低下，是核酸PCR检测的瓶颈。中国专利申请CN1331755A通过引入一种复杂的启动子和引物结构来提高反转录的效率，但是其对启动子序列识别特异性的要求严格，而且引物在具体实施时要使用硫代磷酸酯来连接，这些都大大限制了该方法的实施。而中国专利申请CN1820081A则涉及一种分析基因导入位点的方法，其是基于DNA分析的技术，避免了反转录效率的影响。

为了克服现有技术的不足，经过长期艰苦努力，本发明人令人惊讶地通过基于转录的PCR技术发明了在同一体系中对RNA高效转录/反转录并进行PCR扩增检测的方法，其可以在同一体系中完成转录/反转录及PCR扩增检测的步骤，不必更换容器，因而不但操作方便快捷，便于实现自动化操作，而且可以使用目前医院、血站、科研实验室的常用设备，不会造成用户仪器购买负担。另外，该方法的转录/反转录试剂不但高效，短时间内可以产生初始RNA模板分子数量百倍左右cDNA分子和/或RNA分子，大大地提高了扩增检测核酸分子时的灵敏度；而且更令人惊讶的是，该转录/反转录试剂不但能针对RNA高效转录/反转录而产生大量相应的cDNA分子和RNA分子，而且还能够对DNA高效转录/反转录而产生大量相应的RNA分子和DNA分子，也就是说，该方法还可以对DNA高效转录/反转录并PCR扩增检测。更令人惊讶的是，该方法不但可以实现同时对多种RNA混合的样品或多种DNA混合的样品进行多重检测，还可以实现同时对RNA和DNA的混合样品进行多重检测，可实现极低浓度RNA和/或DNA的检测，从而可以取代现有核酸检测方法，广泛用于实验室研究、食品安全、医药卫生等众多领域，尤其是体外检测材料中含有DNA和/或RNA的病原，例如体外检测血液或血液制品中的RNA病毒和DNA病毒。本发明人还发明了用于上述方法中的转录/反转录试剂和扩增试剂配方及相应试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供在同一体系中同时检测样品中一种或多种靶核酸的方法。该方法通过转录/反转录放大并用PCR扩增技术，可以取得灵敏度更高的优势，可实现对极低浓度RNA/DNA的检测，而且该方法可以在同一体系中实施，并可以进行多从检测，尤其是可以同时检测RNA和DNA分子，操作方便快捷，无需更新专门设备，因此不单是DNA高效检测技术或是RNA高效检测技术，更是可以应对实际样品中多种混合核酸的高效、便捷的检测方法。另外，本发明的目的还在于提供上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。

具体而言，在第一方面，本发明提供了在同一体系中检测样品中靶核酸的方法，其包括：

(1)将样品与转录/反转录试剂混合温浴，进行核酸转录和反转录，其中所述转录/反转录试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有所述启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)将步骤(1)得到的温浴产物与PCR扩增试剂混合，进行PCR扩增，并检测PCR扩增的产物。

在本文中，“同一体系”指技术上转录/反转录过程和PCR扩增过程在同一容器中进行，没有必要更换容器。在本发明的检测方法中，在同一体系中就可以完成转录/反转录过程和PCR扩增检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与转录/反转录试剂，温浴一段时间后再加入PCR扩增试剂即可，温浴以及PCR扩增可以通过普通PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装置的PCR仪)，即可完成本发明检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。当然，出于非技术原因，例如仅仅是为规避本发明的专利权而故意在步骤(1)和步骤(2)之间移取液体至更换的容器中，这本身并非出于技术上的必要，也涵盖在本发明的保护范围内。

本发明的检测方法所检测的样品是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。本发明的检测方法所针对的样品形式广，所检测的样品可以不限于是液体形式的，例如在本发明的具体实施方式中，使用的是固体样品。

本发明的检测方法所检测的目标(即，靶核酸)可以是任何适合PCR扩增的核酸，如基因或基因片段，包括DNA和RNA。经过本发明人长期研究发现，采用本发明的检测方法，不但可以检测RNA，也可以检测DNA，甚至可以同时检测DNA和RNA。对于靶核酸是RNA的情况，RNA在反转录酶活性的作用下被反转录成cDNA，然后经过DNA聚合酶活性的作用将cDNA合成双链DNA，双链DNA经RNA聚合酶作用，产生相应RNA，这些RNA可作为模板，可循环进行上述反转录/转录的过程，从而产生大量相应cDNA和RNA产物；对于靶核酸是DNA的情况，如有必要，双链DNA通过热变性或者解链酶的作用变成单链DNA，而单链DNA与具有启动子序列的引物结合，在DNA聚合酶活性的作用下得到双链DNA，双链DNA经RNA聚合酶作用，产生相应RNA，然后进行上述反转录/转录的循环，也可得到大量相应RNA和DNA产物。例如，在本发明的具体实施方式中，可以检测HCV(丙型肝炎病毒，其为RNA病毒)的5’非编码区RNA、HIV(人免疫缺陷病毒，其为RNA病毒)的gag基因RNA和HBV(乙型肝炎病毒，其为DNA病毒)的编码S抗原的基因DNA。因此，本发明的检测方法中靶核酸是RNA或DNA，优选是病原体的RNA或DNA，如相应病原体的特异性RNA或DNA，优选是细菌、病毒或致病微生物的RNA或DNA，更优选是病毒RNA或DNA，最优选是HCV RNA、HIV RNA或HBV DNA。在本发明的具体实施方式中，靶核酸的示例有HCV的5’非编码区(即5’非翻译区，简称5’UTR)RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的编码S抗原的基因DNA(即，s区DNA)。这些核酸能够在一定程度上表征相应病原体的存在性。

需要指出的是，本发明的检测方法用于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。

在本发明的检测方法中，步骤(1)中的温浴温度是可以变化的，例如短时(如，30秒)升温(如，92℃)使双链DNA热变性，然后维持在转录/反转录试剂的酶活性温度。为了操作方便，也为了减少升温对转录/反转录试剂的酶活性的影响，步骤(1)中的温浴温度优选是转录/反转录试剂的酶活性温度，例如在转录/反转录试剂中各种酶的最适酶活性温度±5℃以内，更优选温浴温度是恒定的。例如，步骤(1)中的温浴温度可以为36-45℃，优选为38-43℃，更优选为40-42℃，最优选温浴温度为41℃。当然，在这样的温度下，无法使双链DNA热变性，因此转录/反转录试剂需要包含解链酶。

在本发明的检测方法中，步骤(1)中的温浴时间可以视预估的靶核酸的拷贝数或需要达到的检测阈值来确定。例如对于检测食品，病原体含量较多，检测的低限较高，因此温浴时间较短；而对于检测血液，病原体含量很少，检测的低限很低，希望能检测靶核酸的水平能达到检测出几十个甚至几个这样数量级的水平，因此温浴时间较长。通常，步骤(1)中的温浴时间为15-150分钟，优选为20-100分钟，更优选为30-80分钟，更优选为40-70分钟，最优选为60分钟。

在本发明中，转录/反转录试剂优选包含启动子转录特异性的RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶和RNase H。另外，转录/反转录试剂优选还包含解链酶。这样，无论本发明的检测方法中是否采用使双链DNA热变性的温度，温浴过程中产生的双链DNA都能够在解链酶的作用下解链。本文中提及的各种酶本身都是本领域技术人员所熟知的，而且已经有大量已经商品化的酶，可以通过商业渠道购买。例如，常见的反转录酶有禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶，其除了具有反转录活性外，还具有DNA聚合酶活性。当然，如果转录/反转录试剂包含的反转录酶没有DNA聚合酶活性，则转录/反转录试剂还需要包含DNA聚合酶。

启动子转录特异性的RNA聚合酶也是本领域技术人员所熟知的，如T7RNA聚合酶、SP6RNA聚合酶、T3RNA聚合酶等，分别针对不同的启动子聚合。因此，启动子转录特异性的RNA聚合酶的启动子转录特异性应该与步骤(1)温浴时的引物所引入的启动子相对应。优选，本发明的检测方法中的启动子优选是T7启动子或T3启动子，更优选是T7启动子。这样，本发明的检测方法中优选使用T7RNA聚合酶或T3RNA聚合酶，更优选使用T7RNA聚合酶。相应地，引物对中的一条引物的5’端连接有的启动子序列优选是T7启动子序列或T3启动子序列，更优选是T7启动子序列。作为示例，T7启动子具有如序列表Seq ID No.1或Seq ID No.2所示的序列。

在本文中，“引物”、“探针”都具有本领域技术人员所理解的含义，都是指单链核酸，该单链核酸有能与靶核酸的有义链或其互补链配对互补的区域。“能扩增靶核酸序列的引物对”是本领域技术人员所通常理解的特异针对靶核酸序列的由正向引物和反向引物所组成的引物对，其能够扩增出靶核酸序列。“探针”通常标记有可检测标记，例如同位素、化学发光剂、酶底物、荧光剂等，如用于实时PCR检测的荧光剂及其淬灭剂。这些标记的方法都是本领域技术人员所熟知的，可以通过行业渠道购买或委托加工。

在本发明中，转录/反转录试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对中的一条引物的5，端连接有启动子序列，优选连接有T7启动子序列或T3启动子序列，更优选连接有T7启动子序列。在本发明具体实施方式中，5’端连接有T7启动子序列的引物分别有如Seq IDNo.3、Seq ID No.7和Seq ID No.11所示的序列，其分别特异针对HCV的5’非编码区RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的编码S抗原的基因DNA；相应地，引物对中另一条引物分别有如Seq ID No.4、Seq ID No.8和Seq ID No.12所示的序列。

在本发明中，转录/反转录试剂还包含用于延伸靶核酸的核酸单体，如dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP。另外，转录/反转录试剂还可以包含pH缓冲剂(如Tris-HCl、PBS等)、离子强度调节剂(如，盐)、抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)等，这些成分及作用都是本领域技术人员所熟知的。

综上所述，在本发明的检测方法中，优选的转录/反转录试剂包含T7 RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶、RNase H和解链酶、以及能扩增靶核酸序列的引物对、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP，所述引物对中的一条引物的5’端连接有T7启动子序列。其中，具有DNA聚合酶活性的反转录酶优选是禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；引物对优选是由Seq ID No.3和Seq ID No.4组成的引物对、由Seq ID No.7和Seq ID No.8组成的引物对、或由Seq ID No.11和Seq ID No.12组成的引物对，分别针对HCV、HIV或HBV的靶核酸。

在本发明中，在步骤(2)中，PCR可以是能够检测步骤(1)得到的RNA或DNA的常规PCR，例如，针对RNA的RT-PCR，或针对DNA的实时PCR。因此，相应的PCR扩增试剂也可以是常规的PCR扩增试剂，其包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对可以与转录/反转录试剂中的引物对相同或不相同。例如，步骤(2)中不相同的引物可以取靶核酸上步骤(1)中相应引物扩增的下游片段来设计。在本发明具体实施方式中，引物对是由Seq ID No.5和Seq ID No.4组成的引物对、由Seq ID No.9和Seq ID No.8组成的引物对、或由Seq ID No.13和Seq ID No.12组成的引物对，分别针对HCV、HIV或HBV的靶核酸。步骤(2)的PCR扩增产物的检测可以选自实时PCR检测、电泳(如，微流芯片电泳或凝胶电泳)和酶联免疫吸附测试(ELISA)。这些检测技术本身对于本领域技术人员来说都是已知的。

在本发明中，步骤(2)中的PCR特别优选是实时PCR。这样可以实时检测PCR扩增DNA的产物，操作便捷，可以在诸如荧光PCR仪上完成整个检测流程，更便于自动化检测，非常适合大规模应用。因此，步骤(2)中的PCR扩增试剂是实时PCR扩增试剂，其不但需要包括常规PCR所用的引物对、核酸单体(如，dATP、dCTP、dGTP、dUTP)、聚合酶(如，Taq酶)以及pH缓冲剂(如Tris-HCl、PBS等)、离子强度调节剂(如，盐)等，还需要包括标记有实时PCR检测信号的能与靶核酸序列杂交的探针。例如，在本发明的具体实施方式中，所述探针优选标记有用于实时PCR检测的荧光剂及其淬灭剂，示例有5’-(FAM)ATTTGGGCGTGCCCCCGC(eclipse)-3’(Seq ID No.6)、5’-(HEX)ATCAATGARGAGGCTGCAGAATGGGA(eclipse)-3’(Seq ID No.10)或5’-(ROX)TGTGT CTGCG GCGTT TTATCA(eclipse)-3’(Seq ID No.14)，分别针对HCV、HIV或HBV的靶核酸。另外，由于步骤(1)的产物中有RNA，为了进一步增加实时PCR扩增的DNA模板，提高检测的灵敏度，优选PCR扩增试剂还包含反转录酶。另外，为了消除实际情况中存在的RNA酶(RNase)的干扰，优选PCR扩增试剂还包含RNase抑制剂。

综上所述，在本发明的检测方法中，优选的PCR扩增试剂是实时PCR扩增试剂，其包含能扩增靶核酸序列的引物对、标记有实时PCR检测信号的能与靶核酸序列杂交的探针、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq酶，优选还包含反转录酶和RNase抑制剂。

作为对本发明第一方面的方法的优选方法，在第二方面，本发明提供了在同一体系中检测样品中多种靶核酸的方法，其包括：

(1)将样品与转录/反转录试剂混合温浴，进行核酸转录和反转录，其中所述转录/反转录试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对，每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有所述启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)将步骤(1)得到的温浴产物与PCR扩增试剂混合，进行PCR扩增，并检测PCR扩增的产物，其中所述PCR扩增试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对。

本发明第二方面的检测方法是本发明第一方面的检测方法的优选方法，其中增加了步骤(1)和步骤(2)中试剂所含的引物对的种类(对于实时PCR来说，还增加了探针种类)，分别针对多种靶核酸，因此可以实现检测多种靶核酸。能够在同一体系中进行多种靶核酸的多重检测，可以节约检测时间，减小所需空间，因此更符合实际检测的需求，尤其是对于大规模筛查来说，优势更为明显。

本发明第二方面的检测方法除了增加引物对(和探针)的种类之外，其他试剂成分和步骤都可以遵循本发明第一方面的检测方法的说明，以下不再详细重复说明。例如，其中步骤(1)中的温浴温度可以为36-45℃，优选为38-43℃，更优选为40-42℃，更优选温浴温度是恒定的，最优选温浴温度为41℃；和/或，其中步骤(1)中的温浴时间可以为15-150分钟，优选为20-100分钟，更优选为30-80分钟，更优选为40-70分钟，最优选为60分钟；和/或，其中转录/反转录试剂优选包含启动子转录特异性的RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶(如，禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶)和RNase H，优选还包含解链酶；和/或，启动子可以是T7启动子或T3启动子，优选是T7启动子。又如，步骤(2)中的PCR可以是RT-PCR或实时PCR，优选是实时PCR；和/或，其中步骤(2)中的检测可以选自实时PCR检测、电泳(如，微流芯片电泳或凝胶电泳)和酶联免疫吸附测试(ELISA)，优选是实时PCR的荧光检测。这样的步骤也可以方便地将加入样品和试剂的操作自动化。

在本发明第二方面的检测方法中，“多种靶核酸”指两种或两种以上序列不同的靶核酸。如果尽管客观上有两种靶核酸来自不同的病原体，但是核酸序列是相同的，那么在本文中这客观上的两种靶核酸只能算作“一种靶核酸”，本发明第二方面的检测方法不能加以检测区分这种仅为来源的不同。多种靶核酸可以是RNA和/或DNA，即可以是多种RNA、或可以是多种DNA、或可以是至少一种RNA与至少一种序列不同的DNA的混合，优选多种靶核酸是病原体RNA和/或DNA，如相应病原体的特异性RNA和/或DNA，优选是细菌、病毒或致病微生物的RNA和/或DNA，更优选是病毒RNA和/或DNA，最优选是HCV RNA、HIV RNA和HBV DNA。多种靶核酸可以为两种靶核酸，优选为三种靶核酸，也优选为三种以上靶核酸，例如四种、五种、六种或七种等。在本发明的具体实施方式中，多种靶核酸为三种靶核酸，具体为HCV的5’非编码区RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的编码S抗原的基因DNA，这些靶核酸在同一体系中都能够顺利检测。这些核酸能够在一定程度上表征相应病原体的存在性，但不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况。

在本发明第二方面的检测方法中，转录/反转录试剂所包含的引物对有多种，每一种引物对特异针对一种靶核酸，即每一种引物能特异扩增一种靶核酸序列的，从而多种引物对分别能特异扩增多种靶核酸序列。由于引物对的靶核酸特异性，因此不同种引物对在退火时互相不会二聚化。转录/反转录试剂所包含的每一种引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，在靶序列5’端引入启动子序列，从而能使步骤(1)中相应启动子转录特异性的RNA聚合酶发挥作用。

综上所述，在本发明第二方面的检测方法中，优选的转录/反转录试剂包含T7RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶、RNase H和解链酶、以及多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP，其中每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有T7启动子序列。其中，具有DNA聚合酶活性的反转录酶优选是禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶；多种引物对特别优选是由Seq ID No.3和Seq ID No.4组成的引物对、由Seq ID No.7和Seq ID No.8组成的引物对、和由Seq ID No.11和Seq ID No.12组成的引物对，分别针对HCV、HIV和HBV的靶核酸，在实际检测中没有相互干扰的情况发生。

在本发明第二方面的检测方法中，PCR扩增试剂所包含的引物对有多种，每一种引物对特异针对一种靶核酸，即每一种引物能特异扩增一种靶核酸序列的，从而多种引物对分别能特异扩增多种靶核酸序列。PCR扩增试剂所包含的一种引物对可以与转录/反转录试剂所包含的特异针对同一种靶核酸的引物对相同或不相同。例如，在本发明具体实施方式中，特别优选了PCR扩增试剂所包含的多种引物对是由Seq ID No.5和Seq ID No.4组成的引物对、由SeqID No.9和Seq ID No.8组成的引物对、和由Seq ID No.13和Seq ID No.12组成的引物对，分别针对HCV、HIV和HBV的靶核酸。这些特别优选的引物对的靶核酸特异性使不同种引物对在退火时互相不会二聚化，使得PCR扩增得以顺利进行。

在本发明第二方面的检测方法中，步骤(2)中的PCR扩增试剂优选是实时PCR扩增试剂。因此，PCR扩增试剂还包含多种标记有互不相同的实时PCR检测信号的分别能与各靶核酸序列杂交的探针，每一种探针特异针对一种靶核酸，不同种探针之间的实时PCR检测信号互不相同，由此可以实时检测相应的靶核酸。在本发明的具体实施方式中，特别优选的三种探针分别标记有不同的用于实时PCR检测的荧光剂，分别为5’-(FAM)ATTTGGGCGTGCCCCCGC(eclipse)-3’(Seq  ID  No.6)、5’-(HEX)ATCAATGARGAGGCTGCAGAATGGGA(eclipse)-3’(Seq ID No.10)和5’-(ROX)TGTGT CTGCG GCGTT TTATCA(eclipse)-3’(Seq ID No.14)，分别针对HCV、HIV和HBV的靶核酸，这三种信号能够顺利区分出相应的靶核酸。

综上所述，在本发明第二方面的检测方法中，优选的PCR扩增试剂优选是实时PCR扩增试剂，其包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对、多种标记有互不相同的实时PCR检测信号的分别能与各靶核酸序列杂交的探针、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq酶，优选还包含反转录酶和RNase抑制剂。

在第三方面，本发明提供了用于本发明第一方面所述方法的检测试剂盒，其包括，(1)转录/反转录试剂，所述转录/反转录试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和(2)PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对可以与转录/反转录试剂中的引物对相同或不相同。

其中，转录/反转录试剂和PCR扩增试剂分装在不同容器中。在本文中，试剂盒具有本领域技术人员所理解的常规含义，如存在不同试剂，则不同试剂分装于不同容器，优选其中还带有标签或说明书，用于指示不同试剂的使用方法。由于本发明实施时要依次序加入转录/反转录试剂和PCR扩增试剂，分装在不同容器中便于添加。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。转录/反转录试剂或PCR扩增试剂中的不同成分可以装在同一个容器中，也可以分多个容器装，优选分多个容器装不同成分。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。

对于本发明第三方面的的检测试剂盒，其中各成分如本发明第一方面所述的那样。例如，转录/反转录试剂包含启动子转录特异性的RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶(如，禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶)和RNase H，优选还包含解链酶；和/或，启动子是T7启动子或T3启动子，优选是T7启动子。优选，转录/反转录试剂包含T7RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶、RNase H和解链酶、以及能扩增靶核酸序列的引物对、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP，所述引物对中的一条引物的5’端连接有T7启动子序列。又如，其中PCR扩增试剂优选是实时PCR扩增试剂，其包含能扩增靶核酸序列的引物对、标记有实时PCR检测信号的能与靶核酸序列杂交的探针、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq酶，优选还包含反转录酶和RNase抑制剂。

在第四方面，本发明提供了用于本发明第二方面所述方法的检测试剂盒，其包括，(1)转录/反转录试剂，所述转录/反转录试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对，每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)PCR扩增试剂，所述所述PCR扩增试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对。

其中，转录/反转录试剂和PCR扩增试剂分装在不同容器中。由于使用时要依次序加入转录/反转录试剂和PCR扩增试剂，分装在不同容器中便于添加。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。转录/反转录试剂或PCR扩增试剂中的不同成分可以装在同一个容器中，也可以分多个容器装，优选分多个容器装不同成分。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第二方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。

对于本发明第四方面的的检测试剂盒，其中各成分如本发明第一方面所述的那样。例如，其中转录/反转录试剂包含启动子转录特异性的RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶(如，禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶或Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶)和RNase H，优选还包含解链酶；和/或，启动子是T7启动子或T3启动子，优选是T7启动子。优选，其中转录/反转录试剂包含T7RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶、RNase H和解链酶、以及多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP，其中每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列。又如，其中PCR扩增试剂优选是实时PCR扩增试剂，其包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对、多种标记有互不相同的实时PCR检测信号的分别能与各靶核酸序列杂交的探针、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq酶，优选还包含反转录酶和RNase抑制剂。

在第五方面，本发明提供了本发明第三方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用；而且，在第六方面，本发明提供了本发明第四方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第二方面所述方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。

为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。

附图说明

图1：本发明的核酸检测方法对HCV核酸的检测结果。

图2：常规定量检测试剂方法对HCV核酸的检测结果。

图3：本发明的核酸检测方法同时对HBV、HCV、HIV核酸的多重检测结果。

具体实施方式

以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。

实施例1本发明的方法与常规定量检测方法对HCV核酸检测的比较

1.1对照及样品

(1)阴性对照：水(样品4)；

(2)测试样品：编号R-1，其为购自国家卫生部临检中心标准样品，浓度1×10⁶IU/ml，用双蒸水以十倍梯度稀释，得到1×10⁵IU/ml(记为样品1)，1×10⁴IU/ml(记为样品2)，1×10³IU/ml，1×10²IU/ml(记为样品3)作为测试样品。

(3)对比试剂：利用RT-PCR试剂的实时荧光法，其中RT-PCR试剂购自美国EPI。

(4)荧光PCR仪：MX3000p。

1.2检测步骤

对上述各样品分别使用本发明的方法和对比试剂进行测试。本发明的测试方法步骤如下：

在PCR试管中，分别加有各种样品或对照5ul，并加有以下转录/反转录试剂成分并达到以下终浓度：40mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，12mM MgCl₂，10mM DTT(二硫苏糖醇)，15％DMSO(二甲亚砜)，100ug/mL BSA(牛血清白蛋白)，2U/ul T7RNA polymerase(聚合酶)(可购自EPI)，1U/ul M-MLV RT(反转录酶)(可购自EPI)，0.05U/ul RNaseH(可购自MBI公司)、引物(HCV1(SEQ ID NO.3)、HCV-R(SEQ ID NO.4)各0.2uM，其针对HCV RNA 5’UTR区设计)，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1mM，ATP、CTP、GTP和UTP各2mM，使最终体积达到25ul(余量用水补足)。将装有上述不同样品或对照的混合溶液的PCR试管置于PCR仪上，于40℃温浴60分钟。

然后，相PCR试管中加入或补加以下实时PCR扩增试剂成分并达到以下终浓度：15mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，4mM MgCl₂，引物(HCV-F(SEQ ID NO.5)、HCV-R(SEQ IDNO.4)各0.2uM)，探针(HCV-probe(SEQ ID NO.6，带有FAM信号)0.1uM，委托Takara公司合成引物和探针)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.02U/ul Taq酶(可购自MBI公司)，0.5U/ul M-MLV RT(反转录酶)(可购自EPI)，0.5U/ul  RNase抑制剂(可购自MBI公司，重组纯化产品，RNase Inhibitor)，使最终体积达到100ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR：42℃×35min；94℃×3min；(94℃×10s；60℃×30s)×40循环。在进行到60℃×30s这一步骤时检测FAM信号，确定HCV RNA是否存在。

1.3检测结果

检测结果如图1(本发明各样品的检测结果)、图2(对比试剂的检测结果)所示。本发明的方法和比较方法均没有检测到阴性对照的实时PCR检测信号(样品4)；本发明的方法和比较方法均检测到样品1、样品2的实时PCR检测信号。但是，本发明的方法检测到样品3的实时PCR检测信号，而比较方法没有检测到样品3的实时PCR检测信号，这说明在HCV RNA浓度低的时候，本发明的方法仍旧能够检测到低拷贝数的HCV，其具有更高的检测灵敏度，能够检测出样品中几十个这样的数量级的HCV。

实施例2本发明的方法同时对HBV、HCV、HIV核酸的多重检测

1.1对照及样品

(1)阴性对照：水；

(2)测试样品：均为国家卫生部临检中心标准样品：HBV干粉；HCV样品，编号R-1；HIV VLP样品。将上述样品混合稀释后得到实验测试用样品。

(3)荧光PCR仪：MX3000p。

2.2检测步骤

对上述各样品使用本发明的方法进行测试，本发明的测试方法步骤如下：

在PCR试管中，分别加有各种样品或对照5ul，并加有以下转录/反转录试剂成分并达到以下终浓度：40mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，12mM MgCl₂，10mM DTT(二硫苏糖醇)，15％DMSO(二甲亚砜)，100ug/mL BSA(牛血清白蛋白)，2U/ul T7RNA polymerase(聚合酶)(可购自EPI)，1U/ul M-MLV RT(反转录酶)(可购自EPI)，0.05U/ul RNaseH(可购自MBI公司)、1U解链酶(可购自MBI公司)、引物(HCV1(SEQ ID NO.3)、HCV-R(SEQ ID NO.4)各0.2uM，其针对HCV 5‘UTR区核酸；HIV1(SEQ ID NO.7)、HIV-R(SEQ IDNO.8)各0.2uM，其针对HIV gag基因核酸；HBV1(SEQ ID NO.11)、HBV-R(SEQ ID NO.12)各0.2uM，其针对HBV s区核酸)，dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1mM，ATP、CTP、GTP和UTP各2mM，使最终体积达到25ul(余量用水补足)。将装有上述不同样品或对照的混合溶液的PCR试管置于PCR仪上，于41℃温浴60分钟。

然后，相PCR试管中加入或补加以下实时PCR扩增试剂成分并达到以下终浓度：10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，4mM MgCl₂，引物(HCV-F(SEQ ID NO.5)、HCV-R(SEQ IDNO.4)、HIV-F(SEQ ID NO.9)、HIV-R(SEQ ID NO.8)、HBV-F(SEQ ID NO.13)、HBV-R(SEQID NO.12)各0.2uM)，探针(HCV-probe(SEQ ID NO.6)、HIV-probe(SEQ ID NO.10)、HBV-probe(SEQ ID NO.14)各0.1uM，委托大连宝生物公司合成各自带有实时PCR检测信号的探针)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.02U/ul Taq酶(可购自MBI公司)，0.5U/ul M-MLV RT(反转录酶)(可购自EPI)，0.5U/ul  RNase抑制剂(可购自MBI公司，重组纯化产品，RNase Inhibitor)，使最终体积达到100ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR：42℃×35min；94℃×3min；(94℃×10s；60℃×30s)×40循环。在进行到60℃×30s这一步骤时检测实时PCR检测信号，确定HCV、HIV和HBV的RNA或DNA是否存在。

2.3检测结果

检测结果如图3所示，其为三个信号在同一混合样品中检测显示结果。本发明的方法没有检测到阴性对照的实时PCR检测信号；本发明的方法均检测到阳性对照的各病毒的实时PCR检测信号，检测没有受到不同核酸的干扰；本发明的方法也检测到低病毒核酸浓度的液体测试样品的各病毒实时PCR检测信号。这说明本发明的方法仍旧能够检测到低拷贝数的病毒核酸，其具有高的检测灵敏度，能够检测出样品中几个、几十个这样的数量级的各种病毒。另外，本发明的方法能够同时检测多种靶核酸，而且可以同时检测RNA和DNA(如，RNA病毒和DNA病毒)，不需要分开检测的步骤，大大方便了检测的实施。另外，本发明的方法还能检测到固体测试样品的实时PCR检测信号，这说明本发明的方法对样品处理没有过多要求，即使对于较不理想的固体样品也能够有效检测。

序列表

<110>上海浩源生物科技有限公司

<120>检测一种或多种靶核酸的方法及其试剂盒

<160>14

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

aattctaata cgactcacta tagggaga                        28

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

aatttaatac gactcactat agggaga                         27

<210>3

<211>49

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

aattctaata cgactcacta tagggagact ttcgcgaccc aacactact 49

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tctgcggaac cggtgagt                                   18

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ctttcgcgac ccaacactac t                               21

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

atttgggcgt gcccccgc                                         18

<210>7

<211>51

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

aattctaata cgactcacta tagggagaag cccagaagta atacccatgt t    51

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

tccatcctat ttgttcctga a                                     21

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

agcccagaag taatacccat gtt                                   23

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

atcaatgarg aggctgcaga atggga                                26

<210>11

<211>47

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

aattctaata cgactcacta tagggagaga tgatgggatg ggaatac         47

<210>12

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

tgtcctggct atcgt tg          17

<210>13

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

gatgatggga tgggaatac         19

<210>14

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

tgtgtctgcg gcgttttatc a      21

Claims (38)

1.如下所述的检测试剂盒在制备用于在同一体系中检测样品中靶核酸的方法的检测试剂产品中的应用，所述的检测试剂盒包括，

(1)转录/反转录试剂，所述转录/反转录试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有所述启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)PCR扩增试剂，所述PCR扩增试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对可以与转录/反转录试剂中的引物对相同或不相同，

其中，所述的在同一体系中检测样品中靶核酸的方法，其包括，

(1)将样品与转录/反转录试剂混合温浴，进行核酸转录和反转录，其中所述转录/反转录试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有所述启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)将步骤(1)得到的温浴产物与实时PCR扩增试剂混合，进行PCR扩增并实时检测。

2.权利要求1所述的应用，其中靶核酸是RNA或DNA。

3.权利要求1所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为36-45℃；和/或，其中步骤(1)中的温浴时间为15-150分钟。

4.权利要求3所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为38-43℃。

5.权利要求4所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为40-42℃。

6.权利要求5所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度是恒定的。

7.权利要求6所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为41℃。

8.权利要求3所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为20-100分钟。

9.权利要求8所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为30-80分钟。

10.权利要求9所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为40-70分钟。

11.权利要求10所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为60分钟。

12.权利要求1所述的应用，其中转录/反转录试剂包含启动子转录特异性的RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶和RNase H。

13.权利要求12所述的应用，其中转录/反转录试剂包含解链酶。

14.权利要求1所述的应用，其中启动子是T7启动子或T3启动子。

15.权利要求1所述的应用，其中转录/反转录试剂包含T7RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶、RNase H和解链酶、以及能扩增靶核酸序列的引物对、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP，所述引物对中的一条引物的5’端连接有T7启动子序列。

16.权利要求1所述的应用，其中实时PCR扩增试剂包含能扩增靶核酸序列的引物对，所述引物对可以与转录/反转录试剂中的引物对相同或不相同。

17.权利要求16所述的应用，其中实时PCR扩增试剂包含标记有实时PCR检测信号的能与靶核酸序列杂交的探针。

18.权利要求16所述的应用，其中实时PCR扩增试剂是实时PCR扩增试剂，其包含能扩增靶核酸序列的引物对、标记有实时PCR检测信号的能与靶核酸序列杂交的探针、dATP、dCTP、dGTP、dUTP和Taq酶。

19.权利要求18所述的应用，其中实时PCR扩增试剂还包含反转录酶和RNase抑制剂。

20.如下所述的检测试剂盒在制备用于在同一体系中检测样品中多种靶核酸的方法的检测试剂产品中的应用，所述的检测试剂盒包括，

(1)转录/反转录试剂，所述转录/反转录试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对，每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有所述启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)PCR扩增试剂，所述所述PCR扩增试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对，

其中，所述的在同一体系中检测样品中多种靶核酸的方法，其包括，

(1)将样品与转录/反转录试剂混合温浴，进行核酸转录和反转录，其中所述转录/反转录试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对，每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列，而且所述转录/反转录试剂具有所述启动子转录特异性的RNA聚合酶活性、反转录酶活性、DNA聚合酶活性和RNase H活性；和

(2)将步骤(1)得到的温浴产物与PCR扩增试剂混合，进行PCR扩增，并检测PCR扩增的产物，其中所述PCR扩增试剂包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对。

21.权利要求20所述的应用，其中多种靶核酸是RNA和/或DNA。

22.权利要求20所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为36-45℃；和/或，其中步骤(1)中的温浴时间为15-150分钟。

23.权利要求22所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为38-43℃。

24.权利要求23所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为40-42℃。

25.权利要求24所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度是恒定的。

26.权利要求25所述的应用，其中步骤(1)中的温浴温度为41℃。

27.权利要求22所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为20-100分钟。

28.权利要求27所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为30-80分钟。

29.权利要求28所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为40-70分钟。

30.权利要求29所述的应用，其中步骤(1)中的温浴时间为60分钟。

31.权利要求20所述的应用，其中转录/反转录试剂包含启动子转录特异性的RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶和RNase H。

32.权利要求31所述的应用，其中转录/反转录试剂包含解链酶。

33.权利要求20所述的应用，其中启动子是T7启动子或T3启动子。

34.权利要求20所述的应用，其中转录/反转录试剂包含T7RNA聚合酶、具有DNA聚合酶活性的反转录酶、RNase H和解链酶、以及多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP，其中每一种所述引物对中的一条引物的5’端连接有启动子序列。

35.权利要求34所述的应用，其中实时PCR扩增试剂还包含反转录酶和RNase抑制剂。

36.权利要求34所述的应用，其中步骤(2)中的PCR是RT-PCR或实时PCR；和/或，其中步骤(2)中的检测选自实时PCR检测、电泳和酶联免疫吸附测试。

37.权利要求36所述的应用，其中步骤(2)中的PCR是实时PCR。

38.权利要求20所述的应用，其中步骤(2)中的PCR扩增试剂是实时PCR扩增试剂，其包含多种分别能特异扩增各靶核酸序列的引物对、多种标记有互不相同的实时PCR检测信号的分别能与各靶核酸序列杂交的探针、dATP、dCTP、dGTP、dUTP、Taq酶，优选还包含反转录酶和RNase抑制剂。

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