KR20010092721A - 발현된 메신저 rna의 상대적인 농도를 산출하고 결정하는방법 - Google Patents

발현된 메신저 rna의 상대적인 농도를 산출하고 결정하는방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 mRNA 군에서 mRNA를 동시 서열 특이적으로 동정하기 위한 향상된 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 조직에 의해 발현된 거의 모든 mRNA를 겔상에 mRNA의 농도에 대략적으로 상응하는 강도를 가진 명백한 밴드로서 가시화시켜준다. 일반적으로, 상기 방법은 앵커 프라이머를 사용하여 cDNA를 형성시켜 3'-말단지점에 고정시키고, 후속하는 RNA 합성을 위한 박테리오파지 특이적인 프로모터를 포함하는 벡터내의 cDNA로부터 클로닝된 삽입물을 생성시키고, 클로닝된 삽입물의 선형화된 단편을 생성시키고, cRNA로부터 cDNA를 전사시키고 cDNA의 두 가지 서열 특이적인 PCR 증폭을 수행하는 것을 포함한다. 바람직한 양태에서, 상기 방법은 PCR 생성물의 누클레오티드 서열의 길이 및 적어도 일부분을 비교하여 누클레오티드 서열의 데이터베이스로부터 결정된 값을 예상하는 것을 포함한다. 상기 방법은 약물의 투여 또는 생리학적 또는 병리학적 상태와 관련된 mRNA의 발현에 있어서의 변화를 동정할 수 있다. 또한 본 발명은 상기 향상된 방법을 실행하기 위해 유용한 벡터 및 프라이머를 제공한다.

Description

발현된 메신저 RNA의 상대적인 농도를 산출하고 결정하는 방법{METHOD FOR INDEXING AND DETERMINING THE RELATIVE CONCENTRATION OF EXPRESSED MESSENGER RNAS}
생물체를 구성하는 단백질 분자의 완전한 특성화는 예를 들어, 개선된 약물 디자인, 개별 환자에 최적화된 치료법의 선택, 및 보다 더 경쟁력 있는 생물소재의 개발에 유용하다. 이러한 발현된 단백질의 특성화는 이들의 동정, 서열 측정, 이들의 발현의 해부학적 부위, 이들의 생화학적 활성의 해명, 및 이들 활성이 생물체의 생리학을 여떻게 결정하는가에 대한 이해를 포함한다. 의학적 적용에서, 또한 각각의 단백질의 농도가 약물학적 제제 또는 독소에 대해 반응하여 어떻게 변화되는가에 대한 정보를 포함한다.
관련 문제의 범주는 다음과 같다. 얼마나 많은 유전자가 존재하는가? 포유동물에서 얼마나 많은 유전자가 발현되는가의 문제는 20여년 이상 연구기간에도 불구하고 여전히 확정되지 않았다. 다른 조직에서 유전자 발현의 패턴을 소개한 수개의 직접적인 연구가 있다. 돌연변이 로딩 연구들은 3×104내지 105개의 필수적인 유전자가 존재한다고 제안했다(J.O. Bishop, "The Gene Numbers Game," Cell 2:81-86(1974); T. Otha & M. Kimura, "Functional Organization of Gentic Materials as a Product of Molecular Evolution." Nature 223:118-119(1971)).
cDNA 클로닝 방법 이전에, 유전자 발현에 대한 정보는 RNA 복합체의 연구: RNA 분자와 풍부한 양의 다른 특이성 물질과의 혼합물의 관찰에 기초한 유사체 측정(벌크내에서의 측정)으로부터 얻었다. 예상하지 못한 정도로, 초기 유사체 복잡성 연구는 대부분의 mRNAs 질량을 구성하는 각 조직의 분자가 전체 복잡성의 단지 작은 부분만을 포함한다는 사실의 감취진 복잡성에 의해 왜곡되었다. 이후, cDNA 클로닝은 디지털 측정(즉, 각각의 종에 대한 서열 특이적 측정)을 허용하였으며; 이에 따라, mRNAs 발현에 대한 보다 더 최근의 구상은 각 RNA 종에 대한 실질적인 관찰에 기초한다.
뇌, 간, 신장은 유사체 RNA 복잡성 연구에서 가장 광범위하게 연구되어온 대상이다. 가장 낮은 복잡성 추정은 해스티(Hastie) 및 비숍(Bishop)에 의한 것들로서(참조문헌: N.D. Hastie & J. B. Bishop "The Expression of Three Abundance Classes of Messenger RNA in Mouse Tissues," Cell 9:761-774(1976)), 뇌에서 3×109염기쌍의 설치류 지놈의 26×106, 간에서 23×106, 및 신장에서 22×106의 누클레오티드를 제안했으며, 이는 RNA 세트가 거의 완전히 중복된다. 이것은 매우 최소화된 숫자의 조직 특이적 mRNAs를 지시한다. 그러나, 실험은 이러한 값이 명백히 낮게 평가되었음을 제시하는데, 이는 뇌에서 발현되는 것으로 보이나 간 또는 신장에서는 측정할 수 없는 많은 mRNAs 분자가 초기 연구의 검출 한계의 아래에 다량 존재하였을 가능성 때문이다. 많은 다른 연구자(J.A.Bantle & W.E. Hahn, "Complexity and Characterizatio of Polyadenylated RNA in the Mouse Brain," Cell 8:139-150(1976); D.M. Chikaraishi, "Complexity of Cytoplasmic Polyadenylated and Non-Adenylated Rat Brain Ribonucleic Acids," Biochemistry 18:3249-3256(1979))는 뇌에서 100-200×106누클레오티드, 간 및 신장에서 2 내지 3배 보다 더 낮은 결과의 유사체 복잡성을 측정했다. 이러한 값은 디지털 클로닝 연구에 의해 지지되었다(R.J.Milner & J.G. Sutcliffe, "Gene Expression in Rat Brain," Nucl. Acids Res. 11:5497-5520(1983)).
벌크 mRNA 상에서의 유사체 측정은 평균 mRNA 길이가 1400-1900 누클레오티드 사이임을 제안했다. 노턴 블롯팅(상기 Milner & Sutcliffe)으로 RNA 크기를 측정하기 위해, 무작위로 선택된 200개의 뇌 cDNAs를 사용한 뇌 mRNA 길이의 체계적 디지털 분석에서, mRNAs 크기 데이터가 RNA에 대해 측정되는 경우, 평균 길이가 1790인 누클레오티드임이 밝혀졌으며, 이는 유사체 측정에 의한 것과 동일했다. 그러나, 뇌의 mRNA 복잡성의 대부분을 구성하는 mRNAs는 5000 누클레오티드의 평균 길이를 갖는다. 보다 더 우세한 뇌 mRNAs가 도처에 존재하고 평균 보다 훨씬 더 짧은 반면에, 보다 더 긴 뇌 mRNAs는 드물고 이들은 뇌 특이성인 경향이 있다.
RNA 길이에 대한 이러한 구상은, 그의 서열이 측정된 뇌 mRNA로부터 보다 더최근에 보강되었다(J.G. Sutcliffe, "mRNA in Mammalian Central Nervous System," Annu. Rev. Neurosci. 11:157-198(1998)). 이와 같이, 평가된 발현된 30,000 mRNA 대해 1-2×108누클레오티드 복잡성 및 5000 누클레오티드 평균 mRNA 길이가 뇌에서 계산되었고, 이들의 약 2/3이 간 및 신장에서 검출되지 않았다. 뇌는 포유동물의 조직 특이적 유전자의 상당 부분에 해당함이 분명하다. 대부분의 뇌 mRNA가 저농도로 발현된다. 총 포유동물 mRNA 복잡성 측정은 없으며, 5000 누클레오티드가 비신경 조직에 대해 바람직한 mRNA 길이인가에 대한 것도 알려지지 않았다. 총 유전자 수에 대한 합리적인 평가는 50,000 내지 100,000일 수 있다.
생리학적 기능의 화학적 이해에 의한 진전에 가장 필요한 것은 지놈에 의해 코딩된 단백질 서열 및 각각이 발현되는 세포 유형의 메뉴이다. 현재, 단백질 서열은 지놈이 아닌, 단지 cDNAs로부터 신뢰할 수 있을 정도로 유도될 수 있으며, 이는 지놈 서열중의 방해 서열(인트론)의 존재 때문이다. 포유동물 지놈의 완전한 누클레오티드 서열 조차도 그의 발현 서열의 특성화를 치환할 수 없다. 따라서, 전사된 서열을 수집하고 이들의 발현 부위를 측정하는 체계적인 기술이 필요하다. 이러한 기술은 뇌에서 다르게 발현된 서열을 측정하는데 있어 특별한 용도가 될 것이다. 완결에 이르는 것 즉, 모든 mRNAs를 동정하는 것이 이러한 연구의 필수적인 궁극적 목표이다. 완결은 다양한 mRNAs의 다른 우세성 및 많은 다른 조직에 의해 발현된 많은 수의 다른 mRNAs 때문에 완성하기 어렵다. 이것을 이루고자 하는 노력은 발명자가 점진적으로 유전자 스페이스의 크기의 보다 더 신뢰할 만한 기술을얻도록 한다.
크레이그 벤터(Craig Venter)9M.D. Adams et al., "Complementary DNA Sequencing: Expressed Sequence Tags and Human Genome Project," Science 252:1651-1656(1991); M.D. Adams et al., " Sequence Identification of 2,375 Human Brain Genes, "Nature 355:632-634(1992))의 실험실에서 수행된 연구는, 사람 뇌 mRNAs의 무작위적으로 선택된 cDNA 클론의 단리, 약 300 염기쌍인 3'말단의 짧은 단일-패스 서열의 측정, 및 "발현 서열 태그"의 데이터베이스로서의 이들의 약 2500의 편집의 결과를 가져왔다. 이들 데이터베이스는 유용한 반면에 다른 발현에 대한 정보를 제공하지 못한다. 따라서, 단일 조직내에서의 단순한 발현 보다, 뇌의 영역내에서 그의 전체적 발현 패턴에 기초하고 다양한 패러다임 예컨대, 다양한 생리학적 또는 독성학적 상태에 대한 반응에 따른 유전자를 인식할 수 있는 것이 매우 중요하다.
다른 연구는 데이터베이스의 구축을 위한 중합효소연쇄반응(PCR)의 사용에 집중되었다. 윌리엄스 등(J.G.K.Williams et al., "DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers Are Useful as Genetic Markers, "Nucl. Acids Res. 18:6531-6535(1990)) 및 웰시(Welsh)와 맥클리랜드(McVlelland)(J. Welsh & McClelland. "Genomic Fingerprinting Using Arbitrarily Primed PCR and a Matrix of Pairwise Combinations of Primers, "Nucl. Acids Res. 18:7213-7218(1990)은 다일 )는 복합 DNA 주형 예컨대, 사람, 식물, 효모, 또는 박테리아의 지놈 DNA와 PCR에 사용되는 경우, 무작위로 선택된 서열의 단일의 10-mer 프라이머 즉, 선반구조로부터의 임의의 10-mer 프라이머가 PCR 생성물의 근원이 됨을 제시한다. 프라이밍은 프라이머와 주형 DNA사이의 불완전한 상보성을 포함함이 밝혀졌다. 일부 과오 결합된 프라이머 결합 부위가 지놈상에 무작위적으로 분포되는 것으로 추정된다. 이따금, 반대 방향의 이들 두개의 부위가 PCR 생성물 밴드를 생성시킬 정도로 가깝게 분포되었다. 평균 8-10개의 생성물이 있었으며, 그 크기가 약 0.4 내지 약 4kb로 다양했고, 각각의 프라이머에 대해 다른 유동성을 가졌다. PCR 생성물의 배열은 동일한 종의 개체간에 상이함을 보였다. 이들 저자들은 단일의 무작위적인 프라이머가 유전자 연구에 있어, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 같은 정보를 생성하는데 사용될 수 있음을 제안하였다. 다른 이들이 이러한 기술을 이용하였다(S. R. Woodward et al., "Random Sequence Oligonucleotide Primers Detect Polymorphic DNA Products Which Segregate in Inbred Strains of Mice," Mamm. Genome 3:73-78(1992); J.H. Nadeu et al., "Multilocus Markers for Mouse Genome Analysis: PCR Amplification Based on Single Primers of Arbitrary Nucleotide Sequence, "Mamm. Genome 3:55-64(1992)).
두개의 그룹(J. welsh et al., "Arbitrarily Primed PCR Fingerprinting of RNA," Nucl. Acids Res. 20;4965-4970(1992); P. Liang & A.B. Pardee, "Defferential Display of Eukaryotic Messenger RNA by Means of the Polymerase Chain Reaction," Science 257:967-971(1992))은 mRNA 집단을 비교하기 위한 방법을 채택했다. 리앙(Liang) 및 패르디(Pardee)의 연구에서, mRNA 분별 디스플레이로 불리는 방법이, 두개의 관련된 세포 유형 즉, 정상 및 종양원성 마우스 A31 세포에 의해 발현된 mRNAs의 집단을 비교하기 위해 사용되었다. 각각의 실험에서, 이들은 5'-프라이머로서 하나의 무작위적 10-mer 및 두개의 세포 유형으로부터의 cDNAs상에서,35SdNTPs의 존재하에 PCR 증폭을 수행하는 3'-앵커 프라이머로서 폴리 A 테일의 서브세트와 상보성인 올리고 누클레오티드를 사용하였다. 생성물을 서열 겔상에 전개시키고, 100-500 누클레오티드 범위의 50-100 밴드를 수득했다. 상기 밴드는 지놈 DNA 주형상에서 관찰되었던 것과 같이, 3' 앵커 프라이머 및 일부 과오 결합된 5' 프라이머 부위의 보충물을 포함하는 mRNAs의 3'말단과 대응하는 cDNAs의 증폭의 결과로 추정되었다. 각각의 프라이머 쌍에 대해, 두개의 cDNAs로부터 증폭된 밴드의 패턴은 약 80%의 구별할 수 없는 세기를 지녀 유사했다. 밴드의 일부는 하나의 또는 다른 PCR 샘플과 비교하여 보다 더 세기가 강했다; 수개는 두개의 샘플중 단지 하나에서만 검출되었다.
추가의 연구(P, Liang et al., "Distribution and Cloning of Eukaryotic mRNAs by Means of Differential display: Refinements and Optimization, "Nucl. Acids Res. 21:3269-3275(1993))는 상기 방법이 저농도의 유입 RNA(비록 희귀종에 대해 정량적이지는 않으나)와 함께 수행되고, 특이성 잔기가 주로 3' 앵커 프라이머의 최종 누클레오티드중에 주로 존재함을 입증했다. 동정된 분별 검출 PCR 생성물의 3분의 1 이상이 25% 이상의 양성 착오율을 지닌 분별 발현된 RNAs와 대응했다.
포유동물의 50,000 내지 100,000 mRNAs의 모두가 상기 무작위-프라이머 PCR방법에 이용가능하다면, 약 80-95의 5' 무작위 프라이머 및 12의 3' 앵커 프라이머가, 가능성을 얻기 위해 포이손(Poisson) 분포로 측정하여 약 1000 PCR 패널 및 겔이 필요할 것이며, 이들 mRNAs의 약 3분의 2가 동정될 것이다.
하기에 의거할 때, 모든 RNAs가 상기 방법에 의해 검출되기는 어려울 것이다. mRNA는 방사능사진상의 시그널을 생성할 수 있을 정도로 충분히 우세해야 하며, 그의 3' 말단에 과오 결합된 프라이머 결합 및 프라이밍을 위한 부위로서 작용할 수 있는 500 누클레오티드를 포함해야 한다. 보다 더 우세한 mRNA 개별종이, 보다 더 용이하게 생성물을 생성해야 한다. 이와 같이, 우세한 종은 많은 다른 무작위 프라이머를 지닌 밴드를 제공할 수 있다. 이러한 후술한 특성이 무작위 프라이머의 선택에 기초한 예측하기 어려운 가능성의 성분을 포함하므로, 무작위 프라이머 방법에 의한 완결은 어려울 것이다. 또한, 하나의 실험실로부터 다른 실험실로의 정보의 이전이 용이하게 하기 위해, 과오 결합된 프라이밍은 다른 PCR 장치를 사용하는 다른 실험실 조건하에서, 반응 조건에 따라 다소간의 변화는 있으나, 고도의 재생성이 있어야 한다. 과오 결합된 프라이머의 기초에 대한 이해도가 높지 않기 때문에, 이것은 리앙(Liang) 및 패르디(Pardee) 분별 디스플레이 방법에 의해 수득하는 데이터의 구축의 단점이 된다.
미국특허 제 5,459,037호('037) 및 제 5,807,680('680)호는 mRNA 종의 분별 디스플레이의 개선된 방법을 기술하며, 이는 5' 말단 생성의 불확실한 면을 감소시키고, 데이터가 다른 조건하에서 완전히 재생성이 되도록 하였다. 상기 방법은 잠재적 비재생성 과오 결합 프라이밍에 의존하지 않고, 완전한 조사에 필요한 PCR 패널 및 겔의 수를 감소시키며, 이중가닥 서열 데이터가 신속하게 축적될 수 있도록 하였다. 또한, 상기 개선된 방법은 동일한 mRNA 종으로부터 수득된 수반되는 시그날의 수를 감소시킨다. 상기 '037 및 '680 특허는 본원에 참고로서 통합된다.
상기 '037 특허에 개시된 방법의 추가적인 개선의 필요성이 존재한다. 예를 들어, 상기 방법의 특이성은 상보성 DNA 분자의 합성 및 PCR 반응중에 미스프라이밍을 감소시킴에 의해 개선될 수 있다. 또한, 상기 방법은 보다 더 재생성이고 보다 더 감도가 높으며, 보다 더 사용이 용이하게 추가로 개량될 수 있다. 바람직하게는, 상기 방법은 수득된 서열을 데이터베이스를 형성에 사용할 수 있는 능력을 제공할 수 있으며, 컴퓨터 프로그램 예컨대, BLASTN 및 BLASTX를 사용하여 서열 동일성 및 유사성을 인식할 수 있도록 누클레오티드 서열 데이터베이스 예컨대, 유전자은행(GeneBank)를 스캐닝하도록 할 수 있다.
발명의 개요
본 발명자들은 mRNA 집단에서 mRNAs의 동시적인 서열 특이적 동정을 위한 방법을 개선하였다. 상기 개선된 방법은 mRNAs를 하기에 따라 측정된 동정 및 어드레스에 기초하여 분류한다: 1) a+b 길이의 누클레오티드 부분(여기서, a는 엔도누클레아제 제한효소 인식 부위의 염기들의 길이이고, b는 파어싱(parsing) 염기의 수로서 6≥b≥3이다), 2) 폴리(A) 테일로부터의 부분 서열까지의 거리. 일반적으로 동정 및 어드레스는 엔도누클레아제의 4개의 인식부위 및 4개의 파어싱 염기를 포함하는 부분 서열에 의해 측정된다. 하나의 바람직한 구체예에서, 엔도누클레아제 제한효소의 인식부위는MspI이며, 부분 서열은 C-C-G-G-N1-N2-N3-N4이다. 이것은 주어진 조직의 우세성이 아닌 mRNA의 누클레오티드 서열에 의존하기 때문에, 상기 방법은 이것의 검출한계 초과의 농도로 존재하는 모든 mRNAs에 이용할 수 있다. 분별 디스플레이 및 RAP-PCR 방법론과 대조적으로, 5' 말단 생성에 대한 어떠한 불확실한 면도 없다.
본 발명의 방법의 하나의 바람직한 구체예에 따르면(도 1), 각각의 mRNA 샘플로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 대체로 mRNAs의 초기의 상대 농도에 따르는 개시 RNA 샘플중의 3' 최말단의 복제를 함유한다. 각 종에 대한 삽입체의 양 말단이 mRNAs 서열 자체에 의해 정확히 한정되기 때문에, 단편의 길이가 각각의 종에 대해 균일하며, 이는 이후에 겔상에서의 분리된 밴드로의 가시화를 허용한다. 이들 길이는 mRNA의 조직 공급원에 무관하게 일정하며, 이는 상기 방법의 중요한 기초 개념이다.MspI 인식 서열이 결실된 메신저 RNAs는 나타나지 않으나, 이들은 비교적드물다. 이들 mRNAs는 다른 4개의 염기 인식 서열을 인식하는 다른 엔도누클레아제 제한효소를 사용하는 방법을 적용함에 의해 찾을 수 있다.
본 발명의 이러한 구체예의 다른 면은, 3' 엔도누클레아제 제한효소 부위, 바람직한 구체예에서MspI 부위에 인접한 서열을, 두 단계 이상의 연속적인 PCR에서 cDNAs를 분류하는데 이용하는 것이다. 제 1의 PCR 단계는 벡터 예를 들어, pBC SK+로부터 유도된 서열과 어니일링되나, 삽입체의 제 1의 인접 누클레오티드(N1)를 포함하기 위한 비재생성MspI 부위의 CGG를 가로질러 연장되는 것은 아니다. 상기단계는, mRNAs의 출발 집단을 4개 서브푸울로 구분한다. 제 2의 PCR 단계에서, 상기 제 1의 PCR 단계에 의해 생성된 4개 서브푸울 각각은 삽입체-침투성 프라이머 (N1N2N3N4)를 사용함에 의해 추가로 64개로 분류되어, 총 256개의 서브푸울로 분류된다. 형광 표지가, 최종 PCR 단계에서 형광 표지된 3'PCR 프라이머를 사용하는 레이져 유도 형광에 의한 검출을 위해 생성물과 결합된다.
바람직한 구체예에서, 분리 기술 예컨대, 전기영동이 PCR 생성물을 뚜렸한 측정가능한 세기 및 측정 가능한 길이의 밴드로 전개시키기 위해 사용된다. 적절한 분리 방법은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, HPLC, MALDI 질량 분광계 및 50-500 염기 범위의 단일 염기에 이용할 수 있는 당업계에 공지된 다른 적절한 분리방법이 본원에 포함된다.
하나의 바람직한 구체예에서, 각각의 최종 PCR 반응 생성물은 4개의 염기 엔도누클레아제 제한효소 부위 및 4개의 파어싱 염기(예를 들어, C-C-G-G-N1-N2-N3-N4)를 포함하는 8-누클레오티드 서열, 및 메시지의 말단과 mRNA의 3' 말단의 폴리A의 제 1의 A사이의 결합으로부터의 서열 거리에 기초한 동정 및 어드레스를 가진다. PCR 생성물 단편의 누클레오티드 서열이 알려진 경우, 상기 단편은 디지털 서열 태그 즉, 본 발명의 방법에 의해 유도된 3' 말단 EST(발현서열 태그)로 언급된다 (DST). 적절한 방법, 바람직하게는 레이져 유도 형광(그러나, 방사활성 또는 자기장 표지 및 검출이 사용될 수 있다)으로 측정한 표지된 PCR 생성물 단편의 분리된 밴드의 세기가 PCR 생성물 단편에 대해 할당된 어드레스를 지닌 데이터베이스중의PCR 생성물 단편 각각에 대해 정량화되고 저장된다. 표지된 PCR 생성물 단편의 분리된 밴드의 세기는 PCR 생성물 단편에 대응하는 mRNA의 출발 양에 비례한다.
일반적으로, 본 발명의 방법은 하기를 포함한다:
(a) 각각 5' 말단 및 3' 말단을 가지며 하기를 포함하는 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 집단으로부터 이중가닥 cDNA 집단을 제조하는 단계: (ⅰ) 7 내지 40 T 잔기의 영역; (ⅱ) 6개 초과의 염기를 인식하는 제 1의 엔도누클레아제 제한효소에 의한 절단 부위(상기 절단 부위는 T 잔기 영역에 대해 5' 말단 을 향해 위치된다); (ⅲ) 4-40 누클레오티드의 제 1 스터퍼 분편(상기 제 1 스터퍼 분편은 상기 제 1 엔도누클레아제 제한효소에 의한 절단 부위에 대해 5'말단쪽으로 위치된다); (ⅳ) 6개 초과의 염기를 인식하는 제 1의 엔도누클레아제 제한효소에 의한 절단 부위 및 T 잔기 영역 사이에 낀 제 2의 스터퍼 분편, 및 (ⅴ) -V, -V-N, 및 -VN-N(여기서, V는 A, C, 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시누클레오티드이고; N은 A, C, G, 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이며, 여기서 T는 V 및 N에 대한 모든 가능성을 포함하는 앵커 프라이머를 포함하는 혼합물이다) 구성된 군으로부터 선택된 앵커 프라이머의 각각의 3' 말단에 위치하는 페이징 잔기;
(b) 이중가닥 DNA 집단을 제 1의 엔도누클레아제 제한효소 및 제 2의 엔도 누클레아제 제한효소로 절단하는 단계(상기 제 2의 제한효소는 4개의 누클레오티드를 인식하여 각각 제 1 및 제 2의 말단을 가지는 이중가닥 cDNA 분자의 집단을 형성한다);
(c) 단계 (b)로부터의 각각의 이중가닥 cDNA 분자를 벡터내의 박테리오파아지 특이성 프로모우터에 대해 안티센스 방향으로 벡터에 삽입하여, 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성체의 집단을 형성함에 의해, 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 각각 인접한 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 한정하는 단계(상기 구성체는 15 누클레오티드 길이 이상의 3' 플랭킹 벡터 서열을 제 1의 엔도누클레아제 제한효소 부위 및 프로모우터의 전사 개시를 한정하는 부위의 사이에 갖는다);
(d) 숙주 세포를 그안에 절단된 cDNA가 클로닝된 삽입체를 함유하는 벡터를 생성하도록 삽입된 벡터로 형질전환시키는 단계;
(e) 단계 (c)에서 생성된 구성체를 삽입된 cDNA 분자 또는 박테리오 파아지 특이성 프로모우터중의 서열은 인식하지 않으나, 벡터중의 서열은 인식하는, 하나 이상의 엔도누클레아제 제한효소를 사용하여 분해시켜, 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 생성시키므로써, 생성된 선형화된 단편이 15 누클레오티드가 이중가닥 cDNA 분자의 제 2 말단의 이중결합으로의 5' 플랭킹 벡터 서열을 가지도록 하는 단계;
(f) 선형화된 단편을 박테리오파이지 특이성 프로모우터로부터 전사를 개시할 수 있는 박테리오파아지 특이성 RNA 중합효소와 함께 인큐베이션시킴에 의해 안티센스 cRNA의 cRNA 제조물을 생성시키는 단계;
(g) 상기 cRNA 전사물을 역전사 효소 및 15-30 누클레오티드 길이로서 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보성인 누클레오티드 서열을 포함하는, 5'RT 프라이머를 사용하여 전사시켜 제 1의 가닥의 cDNA를 생성하는 단계;
(h) 제 1 세트의 PCR 생성물을, 제 1의 가닥의 cDNA를 제 1의 일련의 서브푸울로 구분하고, 상기 제 1의 가닥의 cDNA를 제 1의 중합효소연쇄반응을 위한 주형으로서, 15 내지 30 누클레오티드 길이로서 제 1의 엔도누클레아제 부위와 -N1으로 구성된 3' 말단을 갖는 것으로 정의된 제 1의 5' PCR-프라이머에 의한 전사 개시를 한정하는 부위 사이의 3' 플랭킹 백터 서열에 상보성인 3' PCR 프라이머와 함께 사용함에 의해 생성시키는 단계(여기서, "N"은 4개의 데옥시누클레오티드 A, C, G, 및 T중의 하나이고, 상기 제 1의 5' PCR 프라이머 벡터 서열은 15 내지 30 누클레오티드 길이로서 cRNA의 삽입체 특이성 누클레오티드의 하나의 누클레오티드로 연장된 제 1의 5' PCR 프라이머의 상보성을 지닌 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보성이고, 여기서 제 1의 5' PCR 프라이머의 다른 하나가 각각의 4개의 다른 서브푸울에 사용된다);
(i) 서브푸울의 제 1 시리즈 각각에서 PCT 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 시리즈로 분리하고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 -N1-Nx-(여기에서, N1은 서브푸울에 대한 제 1 폴리머라제 사슬 반응에서 사용되는 N1과 동일하고, "N"은 단계(h)에서와 같으며, "x"는 1 내지 5의 정수이다) 로 이루어진 3' 말단을 갖는 것으로서 정의된 제 2의 5' PCR 프라이머 및 박테리오파지 특이적인 프로모터에 의한 전사 개시를 한정하는 부위 사이의 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드인 제 2의 3' PCR 프라이머와의 제 2 폴리머라제 사슬 반응을 위한 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계로서, 프라이머는 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드이며 "x"+1과 같은 누클레오티드 수로 cRNA의 삽입물 특이적인 누클레오티드로 연장되는 프라이머 상보성을 갖는 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 제 2의 5' PCR 프라이머의 다른 하나는 서브푸울의 제 2 시리즈의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 서브푸울의 제 1 세트중의 각각의 서브푸울에 대한 서브푸울의 제 2 시리즈중에는 4x의 서브푸울이 있는 단계; 및
(j) PCR 생성물의 제 2 세트를 분해하여 mRNA 집단중에 존재하는 mRNA의 3' 말단을 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계.
한 가지 바람직한 구체예에서, 비오틴 부분은 앵커 프라이머, 바람직하게는 앵커 프라이머의 5' 말단에 컨쥬게이트된다. 이 구체예에서, 제한된 제 1 cDNA는 제한된 제 1 cDNA를 스트렙타비딘 코팅된 기질과 접촉시킴으로써 단계(b)에서 cDNA의 잔여부분으로부터 분리된다. 적합한 스트렙타비딘 코팅된 기질은 마이크로적정 플레이트, PCR 튜브, 폴리스티렌 비드, 파라마그네틱 중합체 비드 및 파라마그네틱 다공성 유리 입자를 포함한다. 바람직한 스트렙타비딘 코팅된 기질은 파라마그네틱 중합체 비드(Dynal Inc., Lake Success, NY)의 현탁액이다.
한 가지 구체예에서, 제 1의 5' PCR 프라이머의 3' 말단에서 3개의 누클레오티드는 포스포디에스테라제 저항성 결합, 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합된다. 또 다른 구체예에서, 제 2의 5' PCR 프라이머의 3' 말단에서 3개의 누클레오티드는 포스포디에스테라제 저항성 결합, 바람직하게는 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합된다. 바람직하게는, 제 1 및 제 2의 5' PCR 프라이머 모두의 3' 말단에서 3개의 누클레오티드가 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합된다.
전형적으로, 제 2 PCR 프라이머에 대한 프라이머중 하나는 형광 라벨에 컨쥬게이트된다. 적합한 형광 라벨은 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산센)-3-온, 6-카르복실산, 3',6'-디히드록시-6-카르복시플루오레세인(6-FAM, ABI);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산센)-3-온, 5-카르복실산, 3',6'-디히드록시-5-카르복시플루오레세인(5-FAM, Molecular Probes);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산센)-3-온, 3',6'-디히드록시-플루오레세인(FAM, Molecular Probes);
9-(2,5-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸리움 (6-카르복시테트라메틸로다민(6-TAMRA), Molecular Probes);
3,6-디아미노-9-(2-카르복시페닐)-크산틸리움(Rhodamine GreenTM, Molecular Probes);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산센)-6-카르복실산, 5'-디클로로-3',6'-디히드록시-2',7'-디메톡시-3-옥소-(JOE, Molecular Probes);
1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-8-이움,-(2,4-디술포페닐)-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 이너(inner) 염 (Texas, Red,Molecular Probes);
6-((4,4-디하이드로푸로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥산 (BODIPY FL-X, Molecular Probes);
6-((4,4-디하이드로푸로-1,3-디메틸-(4-메톡시페닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥산 (BODIPY TMR-X, Molecular Probes); 6-(((4-(4,4-디하이드로푸로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)페녹시)아세틸)아미노)-헥산 (BODIPY TR-X, Molecular Probes);
4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜탄산 (BODIPY FL-C5, Molecular Probes);
4,4-디하이드로푸로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로판산(BODIPY FL, Molecular Probes);
4,4-디하이드로푸로-5-페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산 (BODIPY 581/591, Molecular Probes);
4,4-디하이드로푸로-5-(4-페닐-1,4-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산 (BODIPY 564/570, Molecular Probes);
4,4-디하이드로푸로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산;
6-(((4,4-디하이드로푸로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥산 (BODIPY 630/650, Molecular Probes);
6-(((4,4-디하이드로푸로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥산 (BODIPY 650/665, Molecular Probes); 및
9-(2,4 (또는 2,5)-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸리움, 이너 염(TAMRA, Molecular Probes). 4,7,2',4',5',7' 헥사클로로 6-카르복시플루오레세인("HEX", ABI), "NED"(ABI) 및 4,7,2',7' 테트라클로로 6-카르복시플루오레세인("TET", ABI)를 포함하는 다른 적합한 형광 라벨이 당해 분야에 공지되어 있다.
전형적으로, 단계(a)에서 페이징(phasing) 잔기는 -V-N-N의 3' 말단을 갖는다. 다른 구체예에서, 단계(a)에서 페이징 잔기는 -V 또는 V-N의 3' 말단을 갖는다.
바람직한 구체예에서, 단계(i)에서 "x"는 3이다. 바람직하게, 단계(a)에서 페이징 잔기는 -V-N-N이며, 단계(i)에서 "x"는 3이다.
전형적으로, 앵커 프라이머 각각은 T 잔기의 영역에서 8 내지 18개의 T 잔기를 갖는다. 한 가지 바람직한 구체예에서, 앵커 프라이머 각각은 T 잔기의 영역에서 18개의 T 잔기를 갖는다. 다른 구체예에서, 앵커 프라이머 각각은 T 잔기의 영역에서 8 내지 18개의 T 잔기, 바람직하게는 8 내지 16개의 T 잔기, 더욱 바람직하게는 8 내지 14개의 T 잔기, 가장 바람직하게는 8 내지 12개의 T 잔기를 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 앵커 프라이머 각각은 T 잔기의 영역에서 12개의 T 잔기를 갖는다.
전형적으로, 앵커 프라이머의 제 1 스터퍼 단편은 14 잔기의 길이이다. 한 가지 구체예에서, 제 1 스터퍼 단편은 누클레오티드 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C(서열 번호: 1)을 갖는다. 바람직한 구체예에서, 제 1 스터퍼 단편은 누클레오티드 서열 G-A-AT-TC-A-A-C-T-G-G-A-A (서열 번호: 2)를 갖는다.
전형적으로, 박테리오파지 특이적인 프로모터는 T3 프로모터, T7 프로모터 및 SP6 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직하게, 박테리오파지 특이적인 프로모터는 T3 프로모터이다.
한 가지 구체예에서, cRNA로부터 cDNA의 전사의 프라이밍을 위한 프라이머는 서열 A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G (서열 번호: 14)를 갖는다. 한 가지 구체예에서, cRNA로부터 cDNA의 전사의 프라이밍을 위한 프라이머는 서열 A-G-C-T-C-T-G-T-G-G-T-G-A-G-G-A-T-C (서열 번호: 28)을 갖는다. 또 다른 구체예에서, cRNA로부터 cDNA의 전사의 프라이밍을 위한 프라이머는 서열 T-C-G-A-C-T-G-T-G-G-T-G-A-G-C-A-T-G (서열 번호: 35)를 갖는다.
한 가지 구체예에서, 벡터는ClaI 및NotI로 분할된 플라스미드 pBC SK+ 이며 단계(h) 및 단계(i)에서의 3' PCR은 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-T(서열 번호:47)이다. 또 다른 구체예에서, 벡터는ClaI 및NotI로 분할된 플라스미드 pBC SK+ 이며 단계(h) 및 단계(i)에서의 3' PCR은 G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-C-A-G(서열 번호:48)이다.
전형적으로, 6개 보다 많은 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제는AscI,BaeI,FseI,NotI,PacI,PmeI,PpuMI,RsrII,SapI,SexAI,SfiI,SgfI,SgrAI,SrfI,Sse838I 및SwaI로 이루어진 군으로부터 선택된다. 6개 보다 많은 염기를 인식하는 바람직한 제 1 제한 엔도누클레아제는NotI이다.
전형적으로, 4개의 누클레오티드 서열을 인식하는 제 2 제한 엔도누클레아제는MboI,DpnII,Sau3AI,Tsp509I,HpaII,BfaI,Csp6I,MseI,HhaI,NlaIII,TaqI,MspI,MaeII 및HinPII로 이루어진 군으로부터 선택된다. 4개의 누클레오티드 서열을 인식하는 바람직한 제 2 제한 엔도누클레아제는MspI,Sau3AI 및NlaIII이다.
전형적으로, 단계(e)에서 사용되는 제한 엔도누클레아제는 단계(B)에서 사용되는 제 2 제한 엔도누클레아제의 4개의 누클레오티드 서열을 포함하는 누클레오티드 서열 인식을 갖는다. 한 가지 구체예에서, 제 2 제한 엔도누클레아제는MspI 이고, 단계(e)에서 사용되는 제한 엔도누클레아제는SmaI이다. 또 다른 구체예에서, 제 2 제한 엔도누클레아제는TaqI 이고 단계(e)에서 사용되는 제한 엔도누클레아제는XhoI이다. 대안적인 구체예에서, 제 2 제한 엔도누클레아제는HinPII이고 단계(e)에서 사용되는 제한 엔도누클레아제는AatII 이다.
전형적으로, 단계(c)의 벡터는 벡터 스터퍼 서열을 플랭킹시키는 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위를 갖는 원형 DNA 분자 형태이며, 또한 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 분할하는 제한 엔도누클레아제로 벡터를 분해하는 단계를 포함한다. 바람직하게, 벡터 스터퍼 서열은 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위 사이의 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위를 포함한다.
하나의 적합한 숙주 세포는 대장균이다.
전형적으로, 단계(e)는 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 분할하는 제한 엔도누클레아제로 벡터를 분해하는 것을 포함한다.
전형적으로, 단계(e)에 사용되는 제한 엔도누클레아제는 또한 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 분할한다.
다른 제한 엔도누클레아제에 있어서, 내부 4개의 염기 인식 부위를 함유하는 6개의 염기 인식 부위를 갖는 적합한 제한 엔도누클레아제가 없이 pSK 벡터를 선형화하기 위한 일반적인 방법은 (i) 불활성체를 함유하는 플라스미드를 2개의 분획으로 분리하는 단계로서, 제 1 분획은 제한 엔도누클레아제 XhoI로 분리되고 제 2 분획은 제한 엔도누클레아제 SalI로 분리되는 단계; (ii) 분할 후에 제 1 및 제 2 분획을 조합하는 단계; (iii) 조합된 분획을 3 분획으로 분리하고, 처음 1/3을 제한 엔도누클레아제 HindIII로 분할하고, 두번째 1/3을 제한 엔도누클레아제 BamHI로 분할하고, 마지막 1/3을 제한 엔도누클레아제 EcoRI로 분할하는 단계; 및 (iv) 분해후에 3 분획을 재조합하여 집단의 약 1/6이 효소의 가능한 조합 각각에 의한 분할 생성물에 상응하는 선형화된 분획의 집단을 생성하는 단계를 포함한다.
전형적으로, mRNA 집단은 폴리아데닐화된 mRNA 종에 대해서 풍부해진다.
전형적으로, 단계(j)에서 증폭화된 단편의 분해는 전기영동에 의해 수행되어 생성물을 디스플레이한다. 바람직하게, 전기영동후에 디스플레이된 생성물의 강도는 원 혼합물중의 생성물에 상응하는 mRNA의 양에 거의 비례한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 방법은 전기영동 후의 mRNA에 상응하는 생성물의 강도로부터 원 혼합물중의 각각의 mRNA의 상대적인 양을 결정하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 전기영동에 의해 폴리머라제 사슬 반응으로 증폭된 단편을 분해하는 단계는 다수의 겔상에서의 단편의 전기영동을 포함한다.
본 발명의 한 가지 구체예에서, 본 발명의 방법은 하기 단계(k) 내지 (o)를 포함한다:
(k) 샘플중에 존재하는 mRNA의 3' 말단을 나타내는 밴드가 디스플레이된 일렉트로페로그램으로부터의 mRNA에 상응하는 하나 이상의 cDNA를 용리시키는 단계;
(l) 폴리머라제 사슬 반응에서 단리된 PCR 생성물을 증폭시키는 단계;
(m) 증폭되고 단리된 PCR 생성물을 플라스미드로 클로닝시키는 단계;
(n) 플라스미드로부터 클로닝되고 단리된 PCR 생성물에 상응하는 DNA를 생성시키는 단계; 및
(o) 클로닝되고 단리된 PCR 생성물을 서열화시키는 단계.
본 발명의 또 다른 구체예는 하기 단계들을 포함한다:
(a) mRNA 집단을 단리시키는 단계;
(b) 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 개체로부터 이중 가닥화된 cDNA 집단을 제조하여, 각각의 앵커 프라이머가 5' 말단 및 3' 말단을 가지며, (i) 7 내지 40개의 T 잔기의 영역; (ii) 6개보다 많은 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 분할을 위한 부위로서, T 잔기의 영역에 상대적인 5' 말단을 향해서 위치하는 분할 부위; (iii) 4 내지 40개의 누클레오티드의 제 1 스터퍼 단편(제 1 스터퍼 단편은 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 분할 부위에 상대적인 5' 말단을 향해서 위치한다); (iv) 6개보다 많은 염기 및 T 잔기의 영역을 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 분할을 위한 부위 사이에 삽입된 제 2 스터퍼 단편;및 (v) 앵커 프라이머 각각의 3' 말단에 위치한 페이징 잔기 -V-N-N(여기에서, V는 A, C 및 G로 이루어진 군으로부터 선택되는 데옥시리보누클레오티드이고, N은 A, C, G 및 T로 이루어진 군으로부터 선택되는 데옥시리보누클레오티드이며, 혼합물은 V 및 N에 대한 모든 가능성을 함유하는 앵커 프라이머를 포함한다)를 포함하는 단계;
(c) 이중 가닥화된 cDNA 집단을 제 1 제한 엔도누클레아제 및 제 2 제한 엔도누클레아제로 분할하고, 제 2 제한 엔도누클레아제가 4개의 누클레오티드 서열을 인식하여 제 1 및 제 2 말단을 갖는 이중 가닥화된 cDNA 분자의 집단을 형성하는 단계;
(d) 단계(b)로부터 각각의 이중 가닥화된 cDNA 분자를 벡터 내부에서 T3 프로모터에 대해 민감한 배향으로 벡터내로 삽입시켜 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물 집단을 형성함으로써, 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' ㅁ라단에 각각 인접한 5' 및 3' 플랭킹 벡터를 한정하며, 상기 구성물은 제 2 제한 엔도누클레아제 부위 및 상기 프로모터중에서 전사 개시를 한정하는 부위 사이의 길이가 15개 이상의 누클레오티드인 5' 플랭킹 벡터 서열을 갖는 단계;
(e) 분할된 cDNA가 삽입된 벡터로 대장균을 형질전환시켜 클로닝된 삽입물을 함유하는 벡터를 생성시키는 단계;
(f) 삽입된 cDNA 분자 또는 T3 프로모터에서 서열을 인식하지 않는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 단계(c)에서 생성된 구성물을 분해시킴으로써 삽입된 cdNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 생성시키는 단계;
(g) T3 프로모터로부터 전사를 개시할 수 있는 T3 RNA 폴리머라아제로 선형화된 분획을 인큐베이팅시킴으로써 센스 cRNA 전사체의 cRNA 제조물을 생성시키는 단계;
(h) 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하고 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드인 3' RT 프라이머 및 가역 전사체를 사용하여 cRNA를 복사함으로써 제 1 가닥 cDNA를 생성시키는 단계;
(i) 제 1 가닥 cDNA를 서브푸울의 제 1 시리즈로 분리하고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위에 대한 3' 플랭킹 벡터 서열 및 -N1(여기에서, "N"은 4개의 데옥시리보누클레오티드 A, C, G 또는 T 중 하나이다)로 이루어진 3' 말단을 가지는 것으로 정의된 제 1의 5' PCR-프라이머에 상보적이며 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드인 제 1의 3' PCR 프라이머와 함께 제 1 폴리머라제 사슬 반응을 위한 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 1 세트를 생성시키는 단계로서, 제 1의 5' PCR 프라이머는 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드이며 cRNA의 삽입물 특이적인 누클레오티드로 연장되는 5' PCR 프라이머 상보성을 갖는 제 1의 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 제 1의 5' PCR 프라이머의 다른 하나는 각각의 상이한 서브푸울에서 사용되는 단계;
(j) 서브푸울의 제 1 시리즈 각각에서 PCT 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 시리즈로 분리하고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 -N1-Nx-(여기에서, N1은 서브푸울에 대한 제 1 폴리머라제 사슬 반응에서 사용되는 N1과 동일하고, "N"은 단계(i)에서와 같으며, "x"는 1 내지 5의 정수이다) 로 이루어진 3' 말단을 갖는 것으로서 정의된 제 2의 5' PCR 프라이머 및 박테리오파지 특이적인 프로모터에 의한 전사 개시를 한정하는 부위 사이의 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드인 제 2의 3' PCR 프라이머와의 제 2 폴리머라제 사슬 반응을 위한 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계로서, 프라이머는 길이가 15 내지 30개의 누클레오티드이며 "x"+1과 같은 누클레오티드 수로 cRNA의 삽입물 특이적인 누클레오티드로 연장되는 프라이머 상보성을 갖는 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 제 2의 5' PCR 프라이머의 다른 하나는 서브푸울의 제 2 시리즈의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 서브푸울의 제 1 세트중의 각각의 서브푸울에 대한 서브푸울의 제 2 시리즈중에는 4x의 서브푸울이 있는 단계; 및
(k) PCR 생성물의 제 2 세트를 분해하여 mRNA 집단중에 존재하는 mRNA의 3' 말단을 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계.
전형적으로, 48개의 앵커 프라이머의 혼합물은 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO:5)를 가진다. 바람직한 양태에서, 48 앵커 프라이머의 혼합물은 서열 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N(SEQ ID NO:8)을 가진다.
전형적으로, 12 앵커 프라이머의 혼합물은 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO:4)을 가진다. 바람직한 양태에서, 12 앵커 프라이머의 혼합물은 서열 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N(SEQ ID NO:7)을 가진다.
전형적으로, 3 앵커 프라이머의 혼합물은 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO:3)를 가진다. 바람직한 양태에서, 3 앵커 프라이머는 서열 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V(SEQ ID NO:6)를 가진다.
바람직한 양태에서, 제 1 제한 엔도누클레아제는MspI이고 제 2 제한 엔도누클레아제는NotI이다.
전형적으로, 제 1 5' PCR-프라이머는 G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(SEQ ID NO:22)이다.
바람직한 양태에서, 제 2 중합효소 연쇄 반응에서의 3' PCR 프라이머는 형광성 라벨에 컨쥬게이션된 SEQ ID NO:47의 누클레오티드, 더욱 바람직하게는, 6-FAM에 컨쥬게이션된 SEQ ID NO:47의 누클레오티드이다.
단계 (i)에서 "x"의 적절한 값은 1 내지 5의 정수이다. 바람직하게는, 단계 (i)에서 "x"는 3이다.
전형적으로, 생리학적 또는 병리학적 변화와 관련된 조직에서의 mRNA 발현의 패턴의 변화를 탐지하기 위한 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 생리학적 또는 병리학적 변화를 겪지 않은 정상 조직 또는 종양 조직의 제 1 샘플을 수득하는 단계;
(b) 제 1 샘플로부터 mRNA 군을 단리하는 단계;
(c) 일반 방법의 단계 (a)-(j)를 수행함으로써 조직의 제 1 샘플의 mRNA 발현의 패턴을 결정하여 제 1 샘플에 존재하는 mRNA의 3'-말단을 나타내는 서열-특이적인 생성물의 제 1 디스플레이를 생성시키는 단계;
(d) 생리학적 또는 병리학적 변화를 겪은 조직의 제 2 샘플을 수득하는 단계;
(e) 제 2 샘플로부터 mRNA 군을 단리하는 단계;
(f) 일반 방법의 단계 (a)-(j)를 수행함으로써 조직의 제 2 샘플의 mRNA 발현의 패턴을 결정하여 제 2 샘플에 존재하는 mRNA의 3'-말단을 나타내는 서열-특이적인 생성물의 제 2 디스플레이를 생성시키는 단계; 및
(g) 여러 디스플레이를 비교하여 상기 조직에서 mRNA 발현의 패턴상에 생리학적 또는 병리학적 영향을 결정하는 단계.
전형적으로 두 개 이상의 샘플이 비교된다. 바람직한 양태에서, 3개, 더욱 바람직하게는 4개 이상의 샘플들이 여러 시간대에 취해져서 비교된다.
전형적으로, 생리학적 또는 병리학적 변화는 알츠하이머병, 파킨슨병, 허혈, 알콜 중독, 약물 중독, 정신분열증, 근위축성 측삭경화증, 다발성 경화증, 우울증 및 양극성 조울증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
전형적으로, 생리학적 또는 병리학적 변화는 학습이나 기억, 감정, 글루타메이트 신경독성, 급양 양식, 후각, 시각, 운동 장애, 바이러스 감염, 전기충격 치료, 약물의 투여 또는 약물의 독성 부작용과 관련되어 있다.
전형적으로, 생리학적 또는 병리학적 변화는 일주기성 변화, 노화 및 자기 상승작용으로 구성된 군으로부터 선택된다. 일반적으로, 생리학적 또는 병리학적 변화는 전사 인자, 세포내 제 2 메신저, 호르몬, 신경전달물질, 성장 인자 및 신경조절물질에 의해 중재되는 과정으로부터 선택된다. 또한, 생리학적 또는 병리학적 변화는 세포-세포 접촉, 세포-기질 접촉, 세포-세포외 매트릭스 접촉 및 세포막과 세포골격간의 접촉으로부터 선택된다.
바람직하게는, 정상 조직 또는 종양 조직은 심혈관계, 림프계, 호흡계, 소화계, 말초신경계, 중추신경계, 장관신경계, 내분비계, 외피(피부, 머리카락 및 손톱 포함), 골격계(뼈 및 근육 포함), 비뇨기계 및 생식계로부터 취해지거나 유래된 세포를 포함한다.
바람직한 양태에서, 정상 조직 또는 종양 조직은 상피, 내피, 점막, 선(腺), 혈액, 림프, 연결 조직, 연골, 뼈, 평활근, 골격근, 심근, 뉴런, 아세포, 비장, 흉선, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 부신피질, 부신수질, 부신피질, 송과, 피부, 머리카락, 손톱, 치아, 간, 췌장, 폐, 신장, 방광, 요관, 유방, 난소, 자궁, 질, 고환, 전립선, 음경, 눈 및 귀로부터 취해지거나 유래된 세포를 포함한다.
전형적으로, 정상 조직 또는 종양 조직은 망막, 대뇌피질, 후구, 시상, 시상하부, 뇌하수체 전엽, 뇌하수체 전엽, 해마, 핵 아쿰벤스(accumbens), 편도, 선조체, 소뇌, 뇌간, 상시각교차 핵 및 척수로 구성된 군으로부터 선택된 중주 신경계내의 구조로부터 유래된다.
전형적으로, 스크리닝될 약물 및 공지된 화합물의 작용의 차이를 탐지하는 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 공지된 생리학적 기능의 화합물로 처리된 생물체로부터 조직의 제 1 샘플을 수득하는 단계;
(b) 제 1 샘플로부터 mRNA 군을 단리하는 단계;
(c) 일반 방법의 단계 (a)-(j)를 수행함으로써 조직의 제 1 샘플의 mRNA 발현의 패턴을 결정하여 제 1 샘플에 존재하는 mRNA의 3'-말단을 나타내는 서열-특이적인 생성물의 제 1 디스플레이를 생성시키는 단계;
(d) 약물 및 공지된 화합물의 작용에 있어서의 차이에 대해 스크리닝될 약물로 처리된 생물체로부터 조직의 제 2 샘플을 수득하는 단계;
(e) 제 1 샘플로부터 mRNA 군을 단리하는 단계;
(f) 일반 방법의 단계 (a)-(j)를 수행함으로써 조직의 제 2 샘플의 mRNA 발현의 패턴을 결정하여 제 2 샘플에 존재하는 mRNA의 3'-말단을 나타내는 서열-특이적인 생성물의 제 2 디스플레이를 생성시키는 단계; 및
(g) 제 1 및 제 2 디스플레이를 비교하여 발현이 공지된 화합물에 의해 영향받지 않지만 스크리닝될 약물에 의해 영향을 받아서, 이로써 스크리닝될 약물과 공지된 화합물의 작용에 있어서의 차이를 나타내는 mRNA 종의 존재를 탐지하는 단계.
전형적으로, 스크리닝될 약물은 항우울제, 신경이완제, 신경안정제, 항경련제, 모노아민 옥시다제 억제제, 자극제, 항파킨슨병 제(agent), 골격근 이완제, 진통제, 국소 마취제, 콜린제, 항바이러스 제(agent), 진경약, 스테로이드, 및 비스테로이드계 항염증 약물로 구성된 군으로부터 선택된다.
더욱 일반적으로, 용어 "스크리닝될 약물" 및 "시험될 약물"이 본 명세서에 사용되며 생리학적으로 활성인 스테로이드, 항생제, 항진균제, 항균제, 항종양제, 진통제와 진통제 조합물, 식욕억제제, 구충제, 항관절염약, 안티아스티아(antiasthia) 제(agent), 항경련제, 항우울제, 항당뇨병 제(agent), 지사제, 항히스타민제, 항염증 제(agent), 항편두통 제제, 항운동병 제제, 항구토유발제, 항파킨슨병 약물, 항가려움제, 항정신병약, 해열제, 진경약(위장 및 비뇨 포함); 항콜린제, 교감신경성약, 잰틴 유도체, 심혈관 제제(칼슘 채널 봉쇄제, 베타봉쇄제, 항부정맥제, 항고혈압제, 이뇨제, 혈관확장제(일반적, 관상, 말초성 및 대뇌 포함)포함); 중추 신경계 자극제, 기침 및 감기 제제, 충혈제거제, 호르몬, 수면제, 면역억제제, 근육 이완제, 부교감신경억제제, 부교감신경모사체, 정신자극제, 진정제, 신경안정제, 알레르겐, 항히스타민제, 항염증제, 생리학적으로 활성인 펩티드 및 단백질, 자외선 스크리닝 제(agent), 향수, 방충도제, 머리카락 염색약 등을 포함하는 유용한 화학제 및 치료제의 폭넓은 클래스를 말한다. 본 명세서에서 고찰된 제(agent)를 기술하는 데에 있어서, 용어 "생리학적으로 활성인"은 숙주상에 직접적인 약리학적 효과를 가지는 제(agent) 뿐만 아니라 의료 기술, 예컨대, 진단 목적을 위한 조직의 착색 또는 불투명화, 조직으로부터의 자외선 조사의 스크리닝 등에 유용한 간접적이거나 관찰할 수 있는 효과를 가지는 제(agent)를 포함하는 폭넓은 개념으로 사용되었다.
예를 들어, 전형적인 fungistatic and fungicidal agent에는 티아벤다졸, 클로록사인, 암포테리신, 칸디시딘, 펀자이마이신, 니스타틴, 크로르단토인, 클로트리마졸, 에토남 니트레이트, 미코나졸 니트레이트, 피롤니트린, 살리실산, 페자티온, 티클라톤, 톨나프테이트, 트리아세틴, 아연, 피리티온 및 나트륨 피리티온이 포함된다.
스테로이드에는 코르티손, 코르토독손, 플루오르아세토니드, 플루드로코르티손, 디플루오르손 디아세테이트, 플루란드레놀온 아세토니드, 메드리손, 암시나펠, 암시나피드, 베타메타손 및 이의 에스테르, 클로로프레드니손, 클로르코르텔온, 데시놀온, 데소니드, 덱사메타손, 디클로리손, 디플루프레드네이트, 플루클로로니드, 플루메타손, 플루니솔리드, 플루오시노니드, 플루코르톨온, 플루오로메탈온, 플루페롤온, 플루프레드니솔온, 메프레드니손, 메틸메프레드니손, 파라메타손, 프레드니솔온 및 프레디손이 포함된다.
항균제에는 설포나미드, 페니실린, 세팔로스포린, 페니실린아제, 에리쓰로마이신, 리노마이신, 반코마이신, 테트라사이클린, 크로람페니콜, 스트렙토마이신 등이 포함된다. 항균제의 특정 예에는 에리쓰로마이신, 에리쓰로마이신 에틸 카보네이트, 에리쓰로마이신 락토비오네이트, 린코마이신, 클린다마이신, 테트라사이클린, 클로르테트라사이클린, 데메클로사이클린, 독시사이클린, 메타사이클린, 옥시테트라사이클린, 미노사이클린 등이 포함된다.
펩티드 및 단백질에는 특히, 작은 크기부터 중간 크기의 펩티드, 예컨대, 인슐린, 바소프레신, 옥시토신, 성장 인자, 사이토카인 뿐만 아니라 인간 성장 호르몬과 같은 큰 단백질이 포함된다.
다른 제(agent)에는 잰틴, 트리암테렌 및 트레오필린, 항종양제, 5-플루오로우리딘데옥시리보시드, 6-머캅토푸린데옥시리보시드, 비다라빈, 마취성 진통제, 하이드로모폰, 사이클라진, 펜타조신, 부포모핀, (유기 음이온, 헤파린, 프로스타글란딘 및 프로스타글란딘-유사 화합물을 포함하는)화합물, 크로몰린 나트륨, 카벤옥솔온, 폴리하이드록실 화합물, 도파민, 도부트아민, 1-도파, a-메틸도파, 앤지오텐신 길항제, (브라디키닌, 인슐린, 아드레노코르티코트로픽 호르몬(ACTH), 엔케팔린, 엔돌핀, 소마토스타틴, 세크레틴과 같은)폴리펩티드 및 (테트라사이클린, 브로모크립틴, 리도카인, 시메티딘과 같은)갖가지 화합물 또는 임의의 관련된 화합물이 포함된다.
다른 제(agent)에는 요오도데옥시우리딘, 포도필린, 트레오필린, 이소프로테레놀, 트리암시놀온 아세토니드, 하이드로코르티손, 인도메타신, 페닐부타존, 파라아미노벤조산, 아미노프로피오니트릴 및 페니실아민이 포함된다.
앞서 언급한 목록은 결코 전부를 나타내고자 하는 것이 아미며, 임의의 생리학적으로 활성인 제(agent)가 본 발명의 방법에 의해 시험될 수 있다.
전형적으로, 데이터베이스는 서열-특이적인 PCR 생성물의 디스플레이의 정량에 의해 생성된 데이터를 포함하여 구성된다. 전형적으로, 데이터베이스는 서열 관련성, 유전자 맵핑 및 세포 분포에 관한 데이터를 추가로 포함한다.
하나의 양태에서, 본 발명은 하기 단계들을 포함하여, 샘플에 존재하는 mRNA 분자의 3'-말단의 서열과 서열 데이터베이스와의 서열 동일성 및 유사성을 알아내기 위한 방법을 제공한다:
(a) 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 군으로부터 이중 가닥 cDNA를 제조하는 단계로, 각 앵커 프라이머는 5' 말단과 3' 말단을 가지고 있고 다음을 포함하고 있다: (i) 7개 내지 40개 T 잔기의 트랙; (ii) 6개 이상의 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단을 위한 부위, T 잔기의 트랙에 대해 5'-말단을 향해 위치되어 있는 절단을 위한 부위; (iii) 4개 내지 40개 누클레오티드의 제 1 스투퍼(stuffer) 절편, 제 1 스투퍼 절편은 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단을 위한 부위에 대해 5'-말단을 향해 위치되어 있다; (iv) 6개 이상의 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단을 위한 부위와 T 잔기의 트랙사이에 삽입되어 있는 제 2 스투퍼 절편, 및 (v) -V, -V-N 및 -V-N-N으로 구성된 군으로부터 선택된 각 앵커 프라이머의 3'-말단에 위치되어 있는 파싱 잔기, 여기서 V는 A, C 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이고; N은 A, C, G 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이고, 앵커 프라이머를 함유하는 혼합물은 V 및 N에 대해 모든 가능성을 포함하고 있다;
(b) 제 1 제한 엔도누클레아제 및 제 2 제한 엔도누클레아제(제 2 제한 엔도누클레아제는 4-누클레오티드 서열을 인식한다)를 사용하여 이중 가닥 cDNA를 절단하여 각각 제 1 및 제 2 말단을 가진 이중 가닥 cDNA 분자의 군을 형성시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 각 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내에 박테리오파지-특이적인 프로모터에 대해 안티센스인 방향으로 벡터내로 삽입시켜 삽입된 cDNA 분자를 포함하는 구성물의 군을 형성시킴으로써 삽입된 cDNA 의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단 각각에 인접한 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 정의하고, 상기 구성물은 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 상기 프로모터내에서 전사 개시를 정의하는 부위사이에 15개 길이 이상의 누클레오티드의 3' 플랭킹 벡터 서열을 가진다;
(d) 절단된 cDNA가 삽입된 벡터를 사용하여 숙주 세포를 형질전환시켜 클로닝된 삽입물을 포함하는 벡터를 생성시키는 단계;
(e) 삽입된 cDNA 분자 또는 박테리오파지-특이적인 프로모터내의 서열을 인식하지 못하지만, 벡터내의 서열을 인식하는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제를 사용하여 단계 (c)에서 생성된 구성물의 분해에 의한 삽입된 cDNA 분자를 포함하는 선형화된 단편을 생성시키는 단계로, 이렇게 생성된 선형화돈 단편은 이중 가닥 cDNA 분자의 제 2 말단에 대한 벡터 5'내에 15개 이상의 누클레오티드의 5' 플랭킹 벡터 서열을 가지고 있다;
(f) 상기 선형화된 단편을 박테리오파지-특이적인 프로모터로부터 전사를 개시시킬 수 있는 박테리오파지-특이적인 RNA 중합효소와 인큐베이션시킴으로써 안티센스 cRNA 전사체의 cRNA 제조물을 생성시키는 단계;
(g) 역전사효소 및 15개 내지 30개 길이의 누클레오티드이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 5' RT 프라이머를 사용하여 cRNA를 전사시킴으로써 제 1 가닥 cDNA를 생성시키는 단계;
(h) 제 1 3' PCR-프라이머(여기서, 제 1 가닥 cDNA를 서브푸울의 제 1 시리즈로 나누고 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지-특이적인 프로모터에 의해 전사 개시를 정의하는 부위사이의 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 15개 내지 30개 누클레오티드 길이이다) 및 -N1(여기서, "N"은 4가지 데옥시리보누클레오티드 A, C, G 또는 T중 하나이다)으로 구성된 3'-말단을 가지는 것으로서 정의되는 제 1 5' PCR-프라이머(여기서, 제 1 5' PCR-프라이머는 15개 내지 30개 누클레오티드 길이이고 상기 cRNA의 삽입-특이적인 누클레오티드중 하나의 누클레오티드내로 5' PCR-프라이머의 상보성 확장과 함께 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 여기서 제 1 5' PCR 프라이머중 상이한 하나는 4개의 상이한 서브푸울 각각에 사용된다)를 사용하는 제 1 중합효소 연쇄 반응을 위한 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 1 세트를 생성시키는 단계;
(i) 서브푸울의 제 1 시리즈 각각의 PCR 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 시리즈로 추가로 나누고 제 2 3' PCR 프라이머(여기서, 제 2 3' PCR 프라이머는 15개 내지 30개 누클레오티드 길이이고 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적인 프로모터에 의한 전사 개시를 정의하는 부위사이의 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이다) 및 제 2 5' PCR 프라이머(여기서, 제 2 5' PCR 프라이머는 -N1-Nx(여기서, N1은 서브푸울을 위해 제 1 중합효소 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하고, "N"은 단계 h에서와 같고, "x"는 1 내지 5의 정수이다)로 구성된 3'-말단을 가지는 것으로서 정의되며, 상기 프라이머는 15개 내지 30개 누클레오티드 길이이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 여기서 상기 서열은 "x" + 1과 동일한수많은 누클레오티드에서 cRNA의 삽입-특이적인 누클레오티드내로 연장된 상보성을 가진다(여기서, 제 2 5' PCR 프라이머중 상이한 하나는 서브푸울의 제 2 시리즈의 상이한 서브푸울에 사용되며 서브푸울의 제 1 세트에서 각 서브푸울에 대한 서브푸울의 제 2 시리즈에 4x서브푸울이 존재한다)를 사용하는 제 2 중합효소 연쇄 반응을 위한 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용하여 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계;
(j) PCR 생성물의 제 2 세트를 해상시켜 mRNA 군에 존재하는 mRNA의 3'-말단을 나타내는 서열-특이적인 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계;
(k) 밴드가 샘플에 존재하는 mRNA의 3'-말단을 나타내는 일렉트로페로그람으로부터 mRNA에 상응하는 하나 이상의 cDNA를 용리시키는 단계;
(l) 용리된 cDNA를 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시키는 단계;
(m) 증폭된 cDNA를 플라스미드내로 클로닝시키는 단계;
(n) 플라스미드로부터 클로닝된 DNA에 상응하는 DNA를 생성시키는 단계;
(o) 클로닝된 cDNA의 서열을 결정하는 단계;
(p) 누클레오티드 서열의 데이터베이스로부터 상응하는 누클레오티드 서열(이 서열은 제 2 엔도누클레아제에 대한 가장 먼 인자 부위와 폴리(A) 테일의 시작점에 의해 범위가 정해진다)을 결정하는 단계; 및
(q) 클로닝된 cDNA의 서열을 상응하는 누클레오티드 서열과 비교하여, 샘플 및 서열의 데이터베이스에 존재하는 mRNA 분자의 3'-단부의 서열 사이의 서열 동일성 및 유사성을 인지하는 단계.
전형적으로, 본 발명의 방법은 하기 단계를 추가로 포함한다:
(r) PCR 생성물의 길이 및 양을 2차원 그래프 디스플레이로 비교하는 단계.
일반적으로, 본 발명의 방법은 또한
(s) 데이터베이스로부터 결정된 상응하는 누클레오티드 서열의 길이의 합에 상응하는, 상응하는 누클레오티드 서열의 예기된 길이, 벡터 서열에 하이브리다이징될 수 있는 5'PCR 서열의 길이, 앵커 프라이머 서열의 길이, 벡터 서열의 개입 부분 및 벡터 서열에 하이브리다이징될 수 있는 3'PCR 서열의 길이를 결정하는 단계;
(t) PCR 생성물의 길이를 상응하는 누클레오티드 서열의 결정된 예기 길이와 비교하는 단계로서, 상응하는 누클레오티드 서열의 예기된 길이가 그래프 심벌 또는 텍스트 문자의 사용에 의해 2차원 그래프 디스플레이로 나타내어지는 단계를 포함한다. 적합한 그래프 심벌은 수직선 및 수평선, 교차선 및 "x"와 같은 교차되는 단선 부분, 및 원 및 다각형을 포함하는 기하학적 형태를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 본 발명은 샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편의 서열과 서열의 데이터 베이스 사이의 서열 동일성 및 유사성을 인자하기 위한 방법으로서,
샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편을 용리시키는 단계;
용리된 cDNA 단편을 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시켜 증폭된 cDNA 단편을 생성시키는 단계.
증폭된 cDNA 단편을 플라스미드내로 클로닝시키는 단계;
클로닝된 cDNA 단편에 상응하는 DNA 분자를 생성시키는 단계;
생성된 DNA 분자를 시퀀싱하여 용리된 cDNA 단편의 서열을 결정하는 단계; 및
용리된 cDNA 단편의 서열을 데이터베이스의 서열과 비교하여 서열 동일성 및 유사성을 인지하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 용리된 cDNA 단편을 데이터베이스의 서열과 비교하는 단계는 컴퓨터를 사용하여 수행된다. 전형적으로, 본 발명의 방법은 또한 비교의 결과를 그래프로 디스플레이하는 추가의 단계를 포함한다.
일반적으로, 샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편의 서열과 데이터베이스의 서열 사이의 서열 동일성 및 유사성은,
샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편(cDNA 단편은 제한 엔도누클레아제 인자 부위의 위치와 mRNA 분자의 폴리(A) 테일의 위치에 의해 결정되는 길이를 갖는다)을 용리시키는 단계;
제한 엔도누클레아제 인지 부위의 서열에 상응하는 5'PCR 프라이머로 폴리머라이제 연쇄 반응을 수행시킴으로써 cDNA 단편의 부분 서열을 결정하는 단계;
용리된 cDNA 단편의 결정된 부분 서열 및 cDNA의 길이를 데이터베이스의 서열과 비교하여 서열 동일성 및 유사성을 인지하는 단계를 포함하는 방법에 의해 인지된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 방법은
폴리누클레오티드 서열 데이터베이스 엔트리로부터 원천 서열을 선택하는 단계;
폴리(A) 테일 서열을 원천 서열내에 위치시키는 단계;
엔도누클레아제 인지 부위 서열을 제 1 인지 부위에 가장 근접한 원천 서열내에 위치시키는 단계;
엔도누클레아제 인지 부위에 인접한 약 2 내지 약 6개의 누클레오티드로 구성된 인덱스 서열을 결정하는 단계;
원천 서열내에서 상관 서열(상기 상관 서열은 폴리(A) 테일과 엔도누클레아제 인지 부위에 의해 경계가 지어지는 서열 및 엔도누클레아제 인지 부위의 적어도 일부를 포함한다)을 결정하는 단계;
상관 서열의 길이를 결정하는 단계; 및
폴리(A) 테일의 위치 및 서열, 엔도누클레아제 인지 부위의 위치 및 서열, 및 원천 서열과 관련이 있는 상관 서열의 길이에 관한 정보를 저장하여 형질된 변환된 데이터베이스 엔트리를 생성시키는 단계를 포함하여, 전환된 폴리누클레오티드 서열 데이터베이스 엔트리를 생성시키는 방법을 제공한다. 전형적으로, 이러한 방법은 인덱스 서열과 관련이 있는 상관 서열의 길이를 그래프로 디스플레이하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 제한 엔도누클레아제는MspI,TaqI 및HinP1I로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한
cRNA 집단(각각의 cRNA 분자는 삽입 서열 및 벡터 유도된 서열을 포함한다)의 샘플을 선택하는 단계;
벡터 유도된 서열에 하이브리다이징되고 삽입 서열내로 약 5개의 누클레오티드 내지 약 6개의 누클레오티드를 연장시키는 역전사 프라이머를 사용하여 역전사를 수행시켜 cDNA 역전사 생성물을 생성시키는 단계;
cDNA 역전사 생성물을 세분화시키는 단계;
벡터 유도된 서열에 하이브리다이징되고 삽입 서열내로 약 7개의 누클레오티드 내지 약 9개의 누클레오티드를 연장시키는 세분화된 cDNA 역전사 생성물, 3'PCR 프라이머 및 5'PCR 프라이머를 사용하여 1회 이상의 중합효소 연쇄 반응을 수행시켜 PCR 생성물을 생성시킴으로써, 비표적화된 cDNA의 증폭으로 인해 기인되는 바탕을 감소시키는 단계를 포함하여, 비표적화된 cDNA의 증폭으로 기인되는 바탕을 감소시킴으로써 PCR 생성물의 길이 및 양의 해상도를 개선시키는 방법을 제공한다.
전형적으로, 16푸울의 역전사 반응이 제공되며, 16개의 상이한 역잔사 프라이머가 제공된다. 일반적으로, 4X서브푸울의 폴리머라이제 연쇄 반응이 제공되며, 여기에서 X는 5'PCR 프라이머가 삽입 서열내로 연장되는 누클레오티드의 수와 역전사 프라이머가 삽입 서열내로 연장되는 누클레오티드의 수의 차이다.
도면의 간단한 설명
본 발명의 이들 및 그 밖의 특징, 양태 및 장점은 하기의 설명, 청구의 범위 및 첨부 도면을 참조하게 되면 보다 잘 이해되어질 것이다.
도 1은 앵커 및 그 밖의 프라이머의 서열을 개략적으로 보여주고 있는(완전한 서열은 본문 참조) 프라이밍, 절단, 클로닝, 안티센스 RNA 전사 및 증폭의 다양한 단계를 보여주는 개선된 본 발명의 방법을 도시하는 다이아그램이다.
도 2는 스트렙타비딘 코팅된 기질과 비오틴화된 앵커 프라이머를 사용하며, 앵커 및 그 밖의 프라이머의 서열을 개략적으로 보여주고 있는 프라이밍, 절단, 클로닝, 안티센스 RNA 전사 및 증폭의 다양한 단계를 보여주는 개선된 방법의 구체예를 도시하는 다이아그램이다.
도 3은 형광 검출 시스템을 사용하여 염기쌍의 생성물 길이에 대한 라벨링된 PCR 생성물의 상대적인 풍부성을 보여주는 그래프로서, 혈청 고갈된(A) 및 혈청 부가된(B) 사람의 MG63 세포로부터의 mRNA 샘플로부터 출발하여, 5'PCR 프라이머 C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T-G(SEQ ID NO: 42)를 사용하여 수득된 PCR 생성물의 분석 결과를 보여주고 있으며, (A) 및 (B)로부터의 데이터는 샘플간의 상대적인 발현 수준을 비교하기 위한 소프트웨어를 사용하여 바닥 패널(C)에 겹쳐져 있다.
도 4는 단지 1단계의 PCR 단계만을 사용하는 방법에 대하여 2단계의 PCR 단계를 사용하는 방법에 대한 형광 검출 시스템을 사용하여 염기쌍에서의 생성물 길이에 대한 라벨링된 PCR 생성물의 상대적인 풍부성을 비교하여 도시한 그래프로서, 혈청 고갈된(os-) 및 혈청 부가된(os+) 샘플에 대하여 N1 위치(굵은 글씨)에서만 다른 5'PCR 프라이머 109T(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G- T -G-C-A, SEQ ID NO: 43) 및 45A(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G- A -G-C-A, SEQ ID NO: 44)로부터의 데이터를 나타내는, 1단계의 PCR 단계(A-D) 또는 2단계의 PCR 단계(E-H) 중의 어느 하나를 사용하여 혈청 고갈된(A 및 C) 및 혈청 부가된(B 및 D) MG63 골육종 세포로부터 추출된mRNA의 분석으로부터 수득한 결과를 보여주고 있으며, 109T 및 45A에 의해 발생된 PCR 생성물이 1단계 PCR 단계 방법에 의해 생성되는 주형과 거의 동일한 것으로 여겨지는 반면(A-D), 2단계 PCR 단계 방법을 사용하여 생성된 주형으로부터 PCR 후에 검출된 생성물이 전체적으로 완전히 구별됨(E-H)을 보여주고 있다.
도 5는 도 1에 도시된 표준 방법을 사용하여 수득된 결과와 도 2에 도시된 방법의 자기 비드(bead) 구체예를 비교하기 위해 형광 검출 시스템을 사용하여 염기쌍에 있어서의 생성물 길이에 대한 라벨링된 PCR 생성물의 상대적인 풍부성을 비교하는 그래프로서, 자기 비드 구체예로부터의 데이터가 방법의 표준 구체예로부터 유도된 데이터와 비교하여 샘플간의 재현성에 있어서 현저한 증가(발생된 단편의 유사성 및 강도 값의 일관성)를 나타냄을 보여주고 있다.
도 6은 수가지의 상이한 조직에 대한 cRNA 농도와 생성된 PCR 생성물의 피크 크기 사이의 선형 관계를 보여주는 그래프이다.
도 7은 플라스미드 pBC SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2, pBS SK+/DGT3, pBC SK+/DGT4 및 pBS SK+/DGT5의 다중 클로닝 부위의 제한 맵 및 누클레오티드 서열을 도시하는 도면이다.
도 8은 스트렙타비딘 코팅된 기질로 비오틴화된 앵커 프라이머를 사용하는 개선된 방법의 구체예를 도시하는 다이아그램으로서, 앵커 및 그 밖의 프라이머의 서열을 개략적으로 보여주는(완전한 서열은 본문 참조) 프라이밍, 절단, 클로닝, 센스 RNA 전사 및 증폭의 다양한 단계를 보여주고 있다.
본 발명은 특이적으로 발현된 mRNAs를 동시에 동정하는 방법 및 이들의 상대 농도를 측정하는 방법에 관한 것이다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명자들은 약물 작용, 약물 스크리닝의 메카니즘의 측정, 생리학적 및 병리학적 상태의 연구 및 게놈 맵핑에 있어 다수의 적용분야를 갖는 하나의 mRNA 집단내에서의 mRNA의 동시적인 서열 특이적 동정 및 디스플레이를 위한 개선된 방법을 개발하였다. 개선된 방법 및 이의 적용은 하기에서 논의된다.
I.mRNA의 동시적인 서열 특이적 동정
중합효소 연쇄 반응(PCR) 기술을 기초로 한 본 발명에 따른 방법은 이의 강도가 mRNA의 농도에 대체로 상응하는 겔상에서 뚜렷한 밴드로서 정상적인 또는 신생의 진핵 세포 또는 조직에 의해 발현된 거의 모든 mRNA의 가시화를 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법은 사실상 모든 mRNA가 3'-폴리(A) 테일에 의해 마무리되지만 테일에 결합되어 있는 프라이머의 특이성에는 의존하지 않는다는 관찰에 토대를 두고 있다.
개선된 방법은 도 1, 2 및 8에서 3개의 구체예로 개략적으로 설명된다. 일반적으로, 개선된 방법은,
(a) 앵커 프라이머의 혼합물(각각의 앵커 프라이머는 5' 말단 및 3' 말단을 가지며 (i) 7 내지 40 T 잔기의 트랙(tract); (ii) 6개 이상의 염기를 인지하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단용 부위(절단용 부위는 T 잔기의 트랙에 대하여 5'-말단을 향하여 위치함); (iii) 4 내지 40 누클레오티드의 제 1 스터퍼(stuffer) 세그먼트(제 1 스터퍼 세그먼트는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단용 부위에대하여 5'-말단을 향하여 위치함); (iv) 6개 이상의 염기를 인지하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단용 부위와 T 잔기의 트랙 사이에 삽입된 제 2 스터퍼 세그먼트 및 (v) -V, V-N, 및 -V-N-N로 구성된 군으로부터 선택된, 바람직하게는 -V-N-N의 앵커 프라이머 각각의 3' 말단에 위치한 페이징(phasing) 잔기(여기에서, V는 A, C 및 G로 구성된 군으로부터 선택되는 데옥시리보누클레오티드이고; N은 A, C, G 및 T로 구성된 군으로부터 선택되는 데옥시리보누클레오티드이다)를 포함하며, 앵커 프라이머를 포함하는 혼합물은 V 및 N에 대한 모든 가능성을 가지고 있다)을 사용하여 mRNA 집단으로부터 이중 가닥 cDNA 집단을 제조하는 단계;
(b) 이중 가닥 cDNA 집단을 제 1 제한 엔도누클레아제 및 4개의 누클레오티드 서열을 인지하는 제 2 제한 엔도누클레아제로 절단시켜 각각 제 1 및 제 2 말단을 갖는 이중 가닥 cDNA 분자의 집단을 형성시키는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 각각의 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내 박테리오파아지 특이적 프로모터에 대하여 안티센스인 배향으로 벡터내로 삽입시켜 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물(상기 구성물은 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 프로모터에서 전사 개시를 규정하는 부위 사이의 길이에 있어 15개 이상의 누클레오티드를 지닌 3' 플랭킹 벡터 서열을 갖는다)의 집단을 형성시킴으로써, 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 각각 인접한 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 규정하는 단계;
(d) 숙주 세포를 절단된 cDNA가 삽입된 벡터로 형질전환시켜 클로닝된 삽입물을 함유하는 벡터를 생성시키는 단계;
(e) 삽입된 cDNA 분자 또는 박테리오파아지 특이적 프로모터의 서열을 인지하지 못하지만 벡터의 서열을 인지하는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제에 의한 단계 (c)에서 생성된 구성물의 분해에 의해 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 발생시켜 생성된 선형화된 단편이 이중 가닥 cDNA 분자의 제 2 말단에 대하여 벡터 5'내로 15개 이상의 누클레오티드의 5' 플랭킹 벡터 서열을 갖게 되는 단계;
(f) 선형화된 단편을 박테리오파아지 특이적 프로모터로부터 전사를 개시시킬 수 있는 박테리오파아지 특이적 RNA 중합효소와 함께 인큐베이션시킴으로써 안티센스 cRNA 전사의 cRNA 제조물을 발생시키는 단계;
(g) 15 내지 30 누클레오티드 길이이며 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 5' RT 프라이머 및 역전사 효소를 사용하여 cRNA를 전사시킴으로써 제 1 가닥 cDNA를 발생시키는 단계;
(h) 제 1 가닥 cDNA를 제 1 열의 서브푸울로 분할시키고 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 -N1(여기에서, "N"은 4개의 데옥시리보누클레오티드, A, C, G 또는 T 중의 하나이다)으로 구성된 3'-말단을 갖는 것으로 규정된 제 1의 5' PCR 프라이머 (여기에서, 제 1의 5' PCR 프라이머는 15 내지 30개의 누클레오티드 길이이며 cRNA의 삽입물 특이적 누클레오티드 중의 하나의 누클레오티드내로 연장되는 제 1의 5' PCR 프라이머 상보성을 갖는 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 여기에서 제 1의 5' PCR 프라이머 중이 하나가 4개의 상이한 서브푸울의 각각에서 사용된다)및 박테리오파아지 특이적 프로모터에 의해 전사 개시를 규정하는 부위 사이에서 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 15 내지 30개의 누클레오티드 길이의 3' PCR 프라이머에 의한 제 1 중합효소 연쇄 반응용 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 제 1 세트의 PCR 생성물을 발생시키는 단계;
(i) 제 1 열의 서브푸울의 각각에 존재하는 제 1 세트의 PCR 생성물을 제 2 열의 서브푸울로 추가로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 -N1-Nx(여기에서, N1은 서브푸울에 대한 제 1 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하며, "N"은 단계 (h)와 같으며, "x"는 1 내지 5의 정수이다)으로 구성된 3' 말단을 갖는 것으로 규정되는 제 2의 5' PCR 프라이머 및 박테리오파아지 특이적 프로모터에 의해 전사 개시를 규정하는 부위 사이에서 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 15 내지 30개의 누클레오티드 길이의 제 의 3' PCR 프라이머에 의한 제 2 중합효소 연쇄 반응용 주형으로서 제 1 세트의 PCR 생성물을 사용함으로써 제 2 세트의 PCR 생성물을 발생시키는 단계로서, 상기 프라이머는 15 내지 30개의 누클레오티드 길이이며 "x"+1과 동일한 다수의 누클레오티드에서 cRNA의 삽입물 특이적 누클레오티드내로 가로질러 연장되는 프라이머 상보성을 갖는 5 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 여기에서, 제 2의 5' PCR 프라이머 중의 다른 하나는 제 2 열의 서브푸울의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 제 1 세트의 서브푸울의 서브푸울의 각각에 대해 제 2 열의 서브푸울에 4X서브푸울이 존재하는 단계;
(j) 제 2 세트의 PCR 생성물을 분해시켜 mRNA 집단에 존재하는 mRNA의 3' 말단을 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 발생시키는 단계를 포함한다.
대안적인 구체예에서, 상기 단계 (c)는 단계 (b)로부터의 각각의 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내 박테리오파아지 특이적 프로모터에 대하여 센스인 배향으로 벡터내로 삽입시켜 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물의 집단을 형성시키는 것을 포함한다(도 8 참조).
A.이중 가닥 cDNA의 제조
방법에서 제 1 단계는 mRNA 집단을 필요로 한다. RNA의 추출 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 본원에서 참고문헌으로 인용되는 문헌[참조: J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York, 1989), vol. 1, ch. 7, "Extraction, Purification, and Analysis of Messenger RNA from Eukaryotic Cells"]에 기재되어 있다. 다른 분리 및 추출 방법도 잘 알려져 있다. 전형적으로, 분리는 구아니디늄 클로라이드 또는 구아니디늄 티오시아네이트와 같은 카오트로픽제(chaotropic agent)의 존재하에서 수행되지만, 다른 세정제 및 추출 약품도 대안적으로 사용될 수 있다.
전형적으로, mRNA는 추출된 총 RNA로부터 올리고(dT)-셀룰로오스 또는 mRNA 분자의 폴리아데닐화된 3'-부분의 결합능을 가진 기타 크로마토그래피 매질상에서 크로마토그래피에 의해 분리된다. 대안적으로, 그러나 덜 바람직하게는, 총 RNA가 사용될 수 있다. 그러나, 일반적으로 폴리(A)+RNA를 사용하는 것이 바람직하다.
이중 가닥 cDNA는 역전사를 개시하기 위하여 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 집단으로부터 제조된다. 각 앵커 프라이머는 5' 말단 및 3' 말단을 가지며 ⅰ) 7 내지 40T 잔기의 트랙트(tract); ⅱ) 6개 이상의 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단 부위로서, T 잔기의 트랙트에 대하여 5'-말단을 향해 위치한 절단 부위; ⅲ) 4 내지 40개 누클레오티드의 제 1 스터퍼 분절(stuffer segment)로서, 제 1 제한 엔도누클레아제에 의한 절단 부위에 대하여 5'-말단을 향해 위치한 제 1 스터퍼 분절; ⅳ) 6개 이상의 염기를 인식하는 제 1 절단 엔도누클레아제에 의한 절단 부위와 T 잔기의 트랙트 사이에 개재된 제 2 스터퍼 분절; 및 ⅴ) -V, -V-N, 및 -V-N-N으로 구성된 군으로부터 선택되는 각각의 앵커 프라이머의 3' 말단에 위치한 파싱 잔기를 포함하는데, 여기서 V는 A, C, 및 G로 구성된 군으로부터 선택되는 데옥시리보누클레오티드이고; N은 A, C,G, 및 T로 구성된 군으로부터 선택되는 데옥시리보누클레오티드이며, 혼합물은 혼합물중의 파싱 잔기가 -V, -V-N, 또는 -V-N-N 중 어느 하나로 정의되는 V 및 N에 대한 모든 가능성을 포함하는 앵커 프라이머를 포함한다. 앵커 프라이머가 -V의 파싱 잔기를 가진 경우, 혼합물은 3개의 앵커 프라이머의 혼합물을 포함한다. 앵커 프라이머가 -V-N의 파싱 잔기를 가진 경우, 혼합물은 12개의 앵커 프라이머의 혼합물을 포함한다. 앵커 프라이머가 -V-N-N의 파싱 잔기를 가진 경우, 혼합물은 48개의 앵커 프라이머의 혼합물을 포함한다.
전형적으로, 앵커 프라이머 각각은 T 잔기 트랙트에서 18 T의 잔기를 가지고 -V-N-N으로 끝나며, 14개 잔기 길이의 제 1 스터퍼 분절을 가진다. 제 1 스터퍼분절의 바람직한 서열은 하기 서열로 구성된 군으로부터 선택된다:
전형적으로 6개 이상의 염기를 인식하는 제한 엔도누클레아제에 의한 절단 부위는 NotI 절단 부위이다.
3개의 앵커 프라이머의 한 바람직한 세트는 하기 서열을 가진다:
12개 앵커 프라이머의 다른 바람직한 세트는 하기 서열을 가진다:
48개 앵커 프라이머의 또다른 바람직한 세트는 하기 서열을 가진다.
한 바람직한 구현예에서, 3개 앵커 프라이머의 세트는 하기 서열을 가진다:
다른 바람직한 구현예에서, 12개 앵커 프라이머의 세트는 하기 서열을 가진다:
특히 바람직한 한 구현예에서, 48개 앵커 프라이머의 세트는 하기 서열을 가진다.
앵커 프라이머의 이러한 혼합물중 한 구성원(member)은 샘플중의 각 mRNA 종의 모든 복제물의 3'-말단에서 고정된 위치에서 합성을 개시함으로써, 각 종의 3'-말단 지점을 규정한다.
이 반응은 당해 분야에서 잘 알려져 있는, mRNA로부터 이중 가닥 cDNA를 제조하기 위한 조건하에서 수행된다. 이러한 기술은, 예를 들어 문헌[Volume 2 of Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory Manual" entitled "Construction and Analysis of cDNA Libraries"]에 기재되어 있다. 적합한 역전사효소는 조류의 골수아구증 바이러스(avian myeloblastosis virus: AMV) 및 멀로니 쥐과동물 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus: MMLV)로부터 얻은 것을 포함한다. 바람직한 역전사효소는 MMLV 역전사효소이다.
본 발명의 한 바람직한 구현예에서, cDNA 집단의 표본을 개선하기 위해 자석 비드를 사용한다(도 2 및 8). 전형적으로, 비오틴 부분은 앵커 프라이머의 5' 말단에 콘쥬게이션되고 제 1 제한된 cDNA는 제 1 제한된 cDNA를 스트렙트아비딘 코팅된 기질, 예를 들어 다수의 스트렙트아비딘 코팅된 비드와 접촉시킴으로써 잔류 cDNA로부터 분리된다.
B. 제한 엔도누클레아제를 사용한 cDNA 샘플의 절단
cDNA 샘플은 2개의 제한 엔도누클레아제로 절단된다. 제 1 제한 엔도누클레아제는 6개 이상의 염기를 가진 부위를 인식하고 앵커 프라이머의 혼합물의 각 구성원내의 단일 부위에서 절단한다. 제 2 제한 엔도누클레아제는 4-누클레오티드 서열을 인식하는 엔도누클레아제이다. 이러한 엔도누클레아제는 전형적으로 대부분의 cDNA에서 다수 부위에서 절단한다. 전형적으로, 제 1 제한 엔도누클레아제는NotI이고 제 2 제한 엔도누클레아제는MspI이다. 효소NotI은 대부분의 cDNA내에서는 절단하지 않는다. 이것은 앵커 부위 이외의 위치에서 cDNA의 절단으로 초래되는 클로닝된 삽입물의 손실을 최소화하는데 바람직하다.
대안적으로, 제 2 제한 엔도누클레아제는TaqI,MaeII 또는HinPlI일 수 있다. 상기 3개의 제한 엔도누클레아제의 사용으로MspI에 의해 절단되지 않는 희귀 mRNA를 검출할 수 있다. 제 2 제한 엔도누클레아제는 하기 논의되는 목적하는 벡터내로 클로닝하기에 적합성인 5'-오버행(overhang)을 생성한다. pBC SK+, pBS SK, pBC SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2 및 pBS SK+/DGT3로 구성된 군으로부터 선택된 벡터에 대한 이러한 클로닝은 하기에 논의되는 바와 같이,ClaI 부위내로 행해진다.
대안적으로, 제 2 제한 엔도누클레아제는Sau3AI일 수 있다. 또한, 이러한 제한 엔도누클레아제의 사용으로MspI에 의해 절단되지 않는 희귀 mRNA를 검출할수 있다. 제 2 제한 엔도누클레아제는 하기 논의되는 목적하는 벡터내로 클로닝하기에 적합성인 5'-오버행(overhang)을 생성한다. 벡터 pBC SK+/DGT4에 대한 이러한 클로닝은 하기에 논의되는 바와 같이,BamHI 부위내로 행해진다.
대안적으로, 제 2 제한 엔도누클레아제는NlaIII일 수 있다. 또한, 이러한 제한 엔도누클레아제의 사용으로MspI에 의해 절단되지 않는 희귀 mRNA를 검출할 수 있다. 제 2 제한 엔도누클레아제는 하기 논의되는 목적하는 벡터내로 클로닝하기에 적합성인 5'-오버행(overhang)을 생성한다. 벡터 pBC SK+/DGT5에 대한 이러한 클로닝은 하기에 논의되는 바와 같이,SphI 부위내로 행해진다.
대안적으로, 다른 적당한 제한 엔도누클레아제가 상기 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되지 않는 cDNA를 검출하는데 사용될 수 있다. 4-누클레오티드 서열을 인식하는 적당한 제 2 제한 엔도누클레아제는MboI,DpnII,Sau3AI,Tsp509I,HpaII,BfaI,Csp6I,MseI,HhaI,NlaIII,TaqI,MspI,MaeII, 및 HinPII이다.
6개 이상의 염기를 인식하는 적당한 제 1 제한 엔도누클레아제는AscI,BaeI,FseI,NotI,PacI,PmeI,PpuMI,RsrII,SapI,SexAI,SfiI,SgfI,SgrAI,SrfI,Sse8387I 및SwaI이다.
cDNA의 소화 조건은 당해 분야에서 잘 알려져 있고 예를 들어 문헌[참조: J. Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Vol. 1, Ch. 5, "Enzymes Used in Molecular Cloning"]에 기재되어 있다.
C. 절단된 cDNA의 백터내로의 삽입
제 1 및 제 2 제한 엔도누클레아제로 절단된 cDNA는 벡터내로 삽입된다. 일반적으로, 적당한 벡터는NotI제한 엔도누클레아제 부위를 가진 다중 클로닝 부위를 포함한다. 적당한 벡터는 제한 엔도누클레아제ClaI 및NotI으로 절단된 바 있는 플라스미드 pBC SK+이다. 상기 벡터는 박테리오파지 특이적 프로모터를 함유한다. 전형적으로 프로모터는 T3 프로모터, SP6 프로모터, 또는 T7 프로모터이다. 바람직한 프로모터는 박테리오파지 T3 프로모터이다. 절단된 cDNA는 박테리오파지 특이적 프로모터에 대해 안티센스인 배향으로 프로모터에 삽입된다(도 1 및 2). 다른 바람직한 구현예에서, 절단된 cDNA는 박테리오파지 특이적 프로모터에 대하여 센스인 배향으로 프로모터에 삽입된다(도 8). 한 바람직한 구현예에서, 벡터는 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, 및 SEQ ID NO: 13으로 구성된 군으로부터 선택된 누클레오티드 서열을 가진 다중 클로닝 부위를 포함한다.
바람직한 벡터는 위치 656 내지 764의 누클레오티드 서열의 부분이 제거되고NotI 제한 엔도누클레아제 부위를 포함하는 110개 이상의 누클레오티드의 서열로 대체된 플라스미드 벡터 pBluescript(pBS 또는 pBC) SK+(Stratagene)를 기재로 한다. 다중 클로닝 부위(MCS)를 지정하는 이 영역은SacI 부위에서KpnI 부위의 누클레오티드 서열의 부분을 연결(span)한다.
pBS SK+또는 pBC SK+(Stratagene)와 같은 적당한 플라스미드 벡터를 적당한 제한 엔도누클레아제로 소화시켜 다중 클로닝 부위의 100개 이상의 누클레오티드를제거하였다. pBS SK+의 경우, 다중 클로닝 부위를 제거하기에 적당한 제한 엔도누클레아제는SacI 및KpnI이다. 제 1 및 제 2 제한 엔도누클레아제로 소화후NotI 및ClaI과 적합성인 말단을 가진 새로운 다중 클로닝 부위를 포함하는 cDNA 부분을 벡터내로 클로닝하여 적당한 플라스미드 벡터를 형성하였다. 새로운 다중 클로닝 부위를 포함하는 바람직한 cDNA 부분은 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, 및 SEQ ID NO: 11에 기재된 누클레오티드 서열을 가진 것들을 포함한다. cDNA 클론은 제 2 제한 엔도누클레아제 부위의 4개 누클레오티드 서열을 포함하는, 6개 이상의 염기를 가진 서열을 인식하는 단일 제한 엔도누클레아제를 사용한 소화에 의해 선형화된다.
본원에서 pBC SK+/DGT1으로 언급되는 바람직한 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 9의 MCS를 포함한다. 제 2 제한 엔도누클레아제 및 선형화 제한 엔도누클레아제(하기 단계 E)에 대한 쌍은 각각 하기와 같다:MspI 및SmaI;HinP1I 및NarI;TaqI 및XhoI;MaeII 및AatII.
본원에서 pBS SK+/DGT2로 언급되는 바람직한 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 10의 MCS를 포함하며, pBC SK+/DGT1에 대해 상기한 바와 같이 제조하였다. 다중 클로닝 부위는MaeI1을 사용하여 제조된 cDNA 삽입물을 허용하지 않는다. 따라서, pBS SK+/DGT2에 대하여, 제 2 제한 엔도누클레아제 및 선형화 제한 엔도누클레아제(하기 단계 E)에 대한 쌍은 각각 하기와 같다:MspI 및SmaI;HinP1I 및NarI;TaqI및XhoI.
본원에서 pBS SK+/DGT3으로 언급되는 다른 바람직한 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 11의 MCS를 포함한다. 제 2 제한 엔도누클레아제 및 선형화 제한 엔도누클레아제(하기 단계 E)에 대한 쌍은 각각 하기와 같다:MspI 및SmaI;HinP1I 및NarI;TaqI 및XhoI;MaeII 및AatII.
본원에서 pBC SK+/DGT4으로 언급되는 다른 바람직한 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 12의 MCS를 포함한다. 제 2 제한 엔도누클레아제 및 선형화 제한 엔도누클레아제(하기 단계 E)에 대한 쌍은 각각Sau3AI 및BglII이다.
본원에서 pBS SK+/DGT5으로 언급되는 다른 바람직한 플라스미드 벡터는 SEQ ID NO: 13의 MCS를 포함한다. 제 2 제한 엔도누클레아제 및 선형화 제한 엔도누클레아제(하기 단계 E)에 대한 쌍은 각각NlaIII 및NcoI이다.
한 바람직한 구현예에서, 벡터는 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위 사이에 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위를 포함하는 벡터 스터퍼 서열을 포함한다. 이러한 구현예에서, 선형화 단계는 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 절단하는 제한 엔도누클레아제를 사용한 벡터의 소화를 포함한다. 다른 구현예에서, 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제도 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 절단한다.
D. 적당한 숙주 세포의 형질전환
절단된 DNA가 삽입된 벡터를 사용하여 삽입물을 함유하는 벡터에 의해 효율적으로 형질전환 또는 트랜스펙션될 수 있는 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨다. 클로닝에 대해 적당한 숙주 세포는 문헌[Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" supra]에 기재되어 있다. 전형적으로 숙주 세포는 원핵세포성이다. 특히 적당한 숙주 세포는 대장균의 균주이다. 적당한 대장균 균주는 MC1061이다. 바람직하게는, 소량의 분취물을 사용하여 대장균 균주 XL1-Blue를 형질전환시켜 삽입물을 가진 클론의 비율을 X-gal 플레이트상의 청색 및 백색 콜로니의 상대 비율로부터 결정한다. 5x105과량의 재조합체를 가진 라이브러리만이 일반적으로 허용된다.
E. 선형화된 단편의 생성
플라스미드 표본은 각 cDNA 라이브러리로부터 제조한다. 그 후, 하나 이상의 제한 엔도누클레아제를 사용한 소화에 의해 선형화된 단편을 생성한다.
한 구현예에서, 벡터는 플라스미드 pBC SK+이고,MspI이 제 2 제한 엔도누클레아제 및 선형화 제한 엔도누클레아제 양자 모두로서 사용된다.
다른 구현예에서, 벡터는 플라스미드 pBC SK+이고, 제 2 제한 엔도누클레아제는MspI,MaeII,TaqI, 및HinP1I으로 구성된 군으로부터 선택되며, 선형화는SmaI으로 제 1 소화후에KpnI 및ApaI의 혼합물로 제 2 소화시켜 수행한다.
다른 구현예에서, 벡터는 pBC SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2, pBS SK+/DGT3, pBC SK+/DGT4, 및 pBS SK+/DGT5로 구성된 군으로부터 선택된다. 이러한 구현예에서, 제2 제한 엔도누클레아제가MspI이고 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제가SmaI인 한 적당한 효소 조합물이 제공된다. 제 2 제한 엔도누클레아제가TaqI이고 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제가XhoI인 다른 적당한 효소 조합물이 제공된다. 제 2 제한 엔도누클레아제가HinP1I이고 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제가NarI인 또다른 적당한 효소 조합물이 제공된다. 제 2 제한 엔도누클레아제가MaeII이고 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제가AatII인 다른 적당한 효소 조합물이 제공된다. 벡터가 pBC SK+/DGT4인 경우, 다른 적당한 조합물이 제 2 제한 엔도누클레아제로서Sau3AI 및 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제로서BglII에 의해 제공된다. 벡터가 pBS SK+/DGT5인 경우, 다른 적당한 조합물이 제 2 제한 엔도누클레아제로서NlaIII 및 선형화 단계에서 사용된 제한 엔도누클레아제로서NcoI에 의해 제공된다.
일반적으로, 하기 섹션 F에서 상세하게 설명되는 선형화 단계에서, cDNA 삽입물이 부족한 임의의 플라스미드 벡터는,NotI 부위 및ClaI 부위 사이에 존재하는SmaI,NarI,XhoI,AatII에 대한 6-누클레오티드 인식 부위(도 7a에서 밑출친 부분)에서 절단되었고, 인식 부위는 ClaI 부위의 3'에 존재하는SmaI,NarI,XhoI,AatII에 대한 6개 이상의 염기를 가졌다. 대조적으로, 삽입물을 함유하는 플라스미드 벡터는 ClaI 부위의 3'에 존재하는SmaI,NarI,XhoI,AatII에 대한 6-누클레오티드 인식 부위에서 절단되었다.
F. cRNA의 생성
다음 단계는 안티센스 cRNA 전사체의 cRNA 표본을 생성하는 것이다. 이것은 선형화된 단편을 박테리오파지 특이적 프로모터로부터 전사를 개시할 수 있는 RNA 중합효소와 함꼐 인큐베이션함으로써 수행된다. 전형적으로, 상기한 바와 같이, 프로모터는 T3 프로모터이며, 중합효소는 T3 RNA 중합효소이다. 중합효소를 합성에 적합한 조건하에서 선형화된 단편 및 4개의 리보누클레오티드 트리포스페이트와 함께 인큐베이션한다(Ambion, Austin, TX).
G. 제 1 가닥 cDNA의 전사
제 1 가닥 cDNA는 멀로니 쥐과동물 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소를 사용하여 전사된다(Life Technologies, Gaithersberg, ND). 이러한 역전사 효소를 가지고, 어닐링이 42℃에서 수행되고, 전사 반응이 42℃에서 일어난다. 반응은 15 내지 30 뉴클레오티드 길이이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적인 프라이머를 사용한다.
또다른 구체예에서, cRNA는 열안정 역전사 효소 및 상기 기술된 프라이머를 사용하여 전사된다. 바람직한 전사효소는 조류의 재조합 역전사 효소로서, 서모스크립트(ThermoScript) RT로 알려져 있으며, 라이프 테크놀로지사(Gattjersburg, MD)로부터 입수할 수 있다.
이것은 cRNA와 프라이머 사이에 높은 정확도의 상보성을 촉진한다. 사용된 프라이머는 15 뉴클레오티드 이하의 길이이고, 서열에서 박테리오파지 특히 촉진자의 3' 단부에 대응한다.
또다른 적당한 전사효소는 퍼킨 엘머사(Norwalk, CT)로부터 입수 가능한rTth로 알려진 호열성 테르무스(Thermus)로부터 수득된 재조합 역전사 효소이다.
박테리오파지 특이 촉진제가 T3 촉진자인 경우에, 프라이머는 전형적으로 A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G 서열(SEQ ID NO: 14) 또는 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T 서열(SEQ ID NO: 47)를 갖는다.
H.제 1 PCR 생성물의 생성
다음 단계는 중합효소 연쇄 반응 증폭 단편을 생산하기 위하여 하기 기술된 바와 같이 전사 생성물을 제 1 세트의 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응을 위한 주형으로 사용하는 것이다.
일반적으로, 제 1 스트랜드 cDNA 전사의 생성물은 제 1 3' PCR 프라이머 및 제 1 5' PCR 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응용 주형으로 사용되어 중합효소 연쇄 반응 증폭 단편을 생산한다. 제 1 3' PCR 프라이머는 전형적으로 15 내지 30 뉴클레오티드의 길이이고, 제 1 제한효소 위치 및 박테리오파지 특이 촉진자에 의해 전사 개시를 정의하는 위치 사이의 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이다. 제 1 5' PCR 프라이머는 -N1으로 구성된 3' 말단을 갖고, 여기에서 "N1"은 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 A, C, G, 또는 T 중의 하나이고, 프라이머는 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이를 갖고, cRNA의 삽입 특히 뉴클레오티드 중 하나의 뉴클레오티드 내로 연장하는 프라이머의 상보성을 갖는 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 여기에서 제 1 5' PCR 프라이머의 상이한 하나가 4개의 상이한 서브푸울의 각각에 사용된다.
벡터가ClaI 및NotI에 의해 갈라진 플라스미드 pBC SK+인 경우, 적당한 3'-PCR 프라이머가 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO: 47) 및 G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G (SEQ ID NO: 48)로 구성된 군으로부터 선택된다. 박테리오파지 특이 촉진자가 T3 촉진자인 경우, 적당한 5'-PCR 프라이머가 G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO:22) 서열을 갖고 여기에서 주어진 반응에서 N은 A, G, C 또는 T 중의 하나이다.
전형적으로, PCR은 변성을 위해 94℃에서 15초, 어닐링을 위해 50℃-65℃에서 15초, 및 PTC-200(MJ Reasearch) 또는 퍼킨 엘머 9600(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)과 같은 적당한 서머사이클러(thermocycler) 상에서 합성을 위해 72℃에서 30초를 두는 PCR 프로그램을 사용하여 수행된다. 어닐링 온도는 당업계에 공지된 원리를 사용하여 프라이머의 특이 뉴클레오티드 서열에 대해 최적화된다. 고온 어닐링 단계는 5' PCR 프라이머의 그 3'-단부에서의 인위적인 오류 프라이밍을 최소화하고, 높은 정확도의 복사를 촉진한다.
I.제 2 PCR 생성물 생성
다음 단계는 제 1 PCR 반응의 생성물을 하기 기술된 제 2 세트의 프라이머와의 제 2 중합효소 연쇄 반응을 위한 주형으로 사용하여 제 2 세트의 중합효소 연쇄 반응 증폭 단편을 생산한다.
일반적으로, PCR 반응의 생성물은 제 2 3' PCR 프라이머 및 제 2 5' 프라이머와의 중합효소 연쇄 반응용 주형으로 사용되어 중합효소 연쇄 반응 증폭 단편을 생산한다. 제 2 3' PCR 프라이머는 전형적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이를 갖고, 제 1 제한효소 위치 및 박테리오파지 특이 촉진자에 의해 전사 개시를정의하는 위치 사이의 3' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이다. 제 2 5' PCR 프라이머는 -N1-Nx로 구성된 3'-말단을 갖는 것으로 정의되고, 여기에서 N1은 그 서브푸울에 대하여 제 1 중합효소 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하며, "N"은 단계 (H)에서와 같고, "x"는 1 내지 5의 정수를 가지며, 프라이머는 15 내지 30개의 뉴클레오티드의 길이를 갖고, "x"+1개의 뉴클레오티드를 갖는 cRNA의 삽입 특이 뉴클레오티드 내로 횡단 연장하는 프라이머의 상보성을 갖는 5' 플랭킹 벡터 서열에 상보적이며, 5' PCR 프라이머의 상이한 하나는 제 2 계열의 서브푸울 중에서 상이한 서브푸울에 사용되고, 제 1 세트의 서브푸울 내의 각각의 서브푸울에 대하여 제 2 계열의 서브푸울 내에 4x개의 서브푸울이 존재한다.
또다른 구체예에서, 사용된 프라이머는 다음과 같다: (a) cDNA 샘플을 벡터에 삽입한 위치에 인접한 벡터내의 서열에 대응하는 서열의 제 2 3' PCR 프라이머 및 (b) 다음으로 구성된 군으로부터 선택된 5' PCR 프라이머: (ⅰ) 그 서브푸울에 대한 제 1 PCR 반응에 사용된 제 1 5' PCR 프라이머, (ⅱ) 제 1 스트랜드 cDNA가 추가 잔기 -N에 의한 3'-말단에서 연장된 그 서브푸울에 대하여 만들어지는 제 1 5' PCR 프라이머, (ⅲ) 2개의 추가 잔기 -N-N에 의한 3'-말단에서 연장된 그 서브푸울에 다하여 사용되는 제 1 5' PCR 프라이머, (ⅳ) 3개의 추가 잔기 -N-N-N에 의한 3'-말단에서 연장된 그 서브푸울에 대하여 사용되는 제 1 5' PCR 프라이머, 및 (ⅴ) 4개의 추가 잔기 -N-N-N-N에 의한 3'-말단에서 연장된 그 서브푸울에 대하여 사용되는 제 1 5' PCR 프라이머, 여기에서 N은 A, G, C, 또는 T 중 하나일 수 있다.
적당한 3' PCR 프라이머는 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO:47) 및 G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G (SEQ ID NO: 48)로 구성된 군으로부터 선택된다.
박테리오파지 특이 촉진자가 T3 촉진자인 경우에, 적당한 5'-PCR 프라이머는 하기 서열로 구성되는 군으로부터 선택된다:
A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 16),
A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 17)
A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 18),
G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO: 22),
G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N (SEQ ID NO: 23),
T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N (SEQ ID NO: 24),
C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N (SEQ ID NO: 25),
G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 26),
A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 16),
A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 19), 및
A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N-N-N (SEQ ID NO: 20).
전형적으로, PCR은 변성을 위해 94℃에서 15초, 어닐링을 위해 50℃-65℃에서 15초, 및 PTC-200(MJ Reasearch사) 또는 퍼킨 엘머 9600(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)과 같은 적당한 서머사이클러(thermocycler) 상에서 합성을 위해 72℃에서 30초를 두는 PCR 프로그램을 사용하여 수행된다. 어닐링 온도는 당업계에 공지된 원리를 사용하여 프라이머의 특이 뉴클레오티드 서열에 대해 최적화된다. 고온 어닐링 단계는 5' PCR 프라이머의 그 3'-단부에서의 인위적인 오류 프라이밍(mispriming)을 최소화하고, 높은 정확도의 복사를 촉진한다.
바람직한 구체예에서, 비방사능 표지를 사용한 검출 방법이 또한 사용될 수 있다. 비방사능 검출 방법에 대하여, 제 2 PCR 반응을 위한 프라이머 중 하나는 바람직하게는 형광 표지와 접합한다. 적당한 형광 표지는 하기에 의해 구성된 군으로부터 선택된다:
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산테인)-3-온, 6-카르복실산, 3',6'-디히드록시-6-카르복실플루오레세인(6-FAM, ABI);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산테인)-3-온, 5-카르복실산, 3',6'-디히드록시-5-카르복실플루오레세인(5-FAM, 분자 탐침);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산테인)-3-온, 3',6'-디히드록시플루오레세인(FAM, 분자 탐침);
9-(2,5-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸륨(6-카르복시테트라메틸로다민(6-TAMRA), 분자 탐침);
3,6-디아미노-9-(2-카르복시페닐)-크산틸륨(로다민 그린TM, 분자 탐침);
스피로[이소벤조푸란-1(3H),9'-크산테인]-6-카르복실산, 5'-디클로로-3',6'-디히드록시-2',7'-디메톡시-3-옥소-(JOE, 분자 탐침);
1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-8-이움, -(2,4-디술포페닐)-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 내부염(텍사스 레드, 분자 탐침);
6-((4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산(BODIPY FL-X, 분자 탐침);
6-((4,4-디플루오로-1,3-디메틸-5-(4-메톡시페닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산(BODIPY TMR, 분자 탐침);
6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)페녹시)아세틸)아미노)헥사노익산(BODIPY TR-X, 분자 탐침);
4,4-디하이드로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노익산(BODIPY FL-C5, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로파노익산(BODIPY FL, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5-페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산(BODIPY 581/591, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산(BODIPY 564/570, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산;
6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산(BODIPY 630/650, 분자 탐침);
6-(((4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산(BODIPY 650/665, 분자 탐침); 및
9-(2,4(또는 2,5)-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸륨, 내부염(TAMRA, 분자 탐침). 기타 적당한 형광 표지는 4,7,2',4',5',7'-헥사클로로-6-카르복시플루오레세인("HEX", ABI), 4,7,2',7'-테트라클로로-6-카르복시플루오레세인("TET", ABI) 및 "NED"(ABI)를 포함하는 것으로 알려져 있다.
바람직한 형광 표지는 스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'(9H)-크산테인)-3-온, 6-카르복실산, 3',6'-디히드록시-6-카르복시플루오레세인(6-FAM)이다.
다른 구체예에서, 자동 방사선도 검출 방법이 사용된다. 일 구체예에서, PCR은35S-dATP 존재하에 수행된다. 또한, PCR 증폭은 [32P]dCTP 또는 [33P]dCTP와 같은 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트로 표지된 방사성 핵종의 존재하에 수행될 수 있다. 그러나, 자동 방사선도 검출에 있어서, 최고 해상도를 위하여35S로 표지된 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.
다른 구체예에서, 검출 방법은 미국특허 제5,656,429호에서 이용되고 개시된 자성 입자로 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용한다. 상기 교시내용은 본원에 참고내용으로 포함되어 있다.
바람직한 구체예에서, 제 1 또는 제 2 5' 프라이머의 3'말단에서의 3개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합으로 연결된다. 참고문헌(Mullins, J. I.,de Noronha, C.M.)을 참조하라. 3' 말단 포스포로티오에이트 결합을 가진 앰플리머(amplimer)는 배출 중합효소에 의한 감성에 저항하고, Taq 중합효소 오류 프라이밍을 감소시킨다. PCR Method Appl 1992 2(2): 131-136; Otto, J. and Eckstein, F. DNA 중합효소 Ⅰ에 의한 감성에 대한 올리고뉴클레오티드 프라이머의 보호. Biochemistry 1987 26(25):8237-8241;Uhlmann, E., Ryte, A., and Peyman, A. 뉴클레오티드 감성에 대하여 부분적으로 포스포로티오에이트된 올리고뉴클레오티드를 안정화시키는 메커니즘에 대한 연구. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4):345-350; Schreiber, G., Koch, E. M., and Neubert, W.J. 포스포로티오에이트 유사체를 포함시킴으로써 뉴클레아제에 대한 생체 내 합성 cDNA의 선택적 보호. Nucleic Acids Res. 1985 13(21):7663-7672.
J.전기영동
그 다음, 중합효소 연쇄 반응 증폭 단편이 샘플 내의 mRNA의 3'-말단의 존재를 나타내는 밴드를 나타내도록 전기영동과 같은 분리 방법에 의해 해상된다.
PCR 증폭 단편을 해상하는 전기영동 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 여기에서 다시 상세하게 설명될 필요가 없다. 대응하는 PCR 생성물이 DNA 시퀀싱 젤을 변성하여 해상되고, 레이저 유도 형광제로 가시화된다. 또한, 대응 PCR 생성물은 모세관 전기영동을 사용하여 해상되고, 레이저 유도 형광제로 가시화된다.
바람직한 일 구체예에서, 제 2 PCR 반응용 프라이머 중 하나가 형광 표지에 접합된다. 적당한 형광 표지는 하기에 의해 구성된 군으로부터 선택된다:
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산테인)-3-온, 6-카르복실산, 3',6'-디히드록시-6-카르복실플루오레세인(6-FAM, ABI);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산테인)-3-온, 5-카르복실산, 3',6'-디히드록시-5-카르복실플루오레세인(5-FAM, 분자 탐침);
스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산테인)-3-온, 3',6'-디히드록시플루오레세인(FAM, 분자 탐침);
9-(2,5-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸륨(6-카르복시테트라메틸로다민(6-TAMRA), 분자 탐침);
3,6-디아미노-9-(2-카르복시페닐)-크산틸륨(로다민 그린TM, 분자 탐침);
스피로[이소벤조푸란-1(3H),9'-크산테인]-6-카르복실산, 5'-디클로로-3',6'-디히드록시-2',7'-디메톡시-3-옥소-(JOE, 분자 탐침);
1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-8-이움, -(2,4-디술포페닐)-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 내부염(텍사스 레드, 분자 탐침);
6-((4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산(BODIPY FL-X, 분자 탐침);
6-((4,4-디플루오로-1,3-디메틸-5-(4-메톡시페닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥사노익산(BODIPY TMR-X, 분자 탐침);
6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)페녹시)아세틸)아미노)헥사노익산(BODIPY TR-X, 분자 탐침);
4,4-디하이드로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜타노익산(BODIPY FL-C5,분자 탐침);
4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로파노익산(BODIPY FL, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5-페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산(BODIPY 581/591, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산(BODIPY 564/570, 분자 탐침);
4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닉산;
6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산(BODIPY 630/650, 분자 탐침);
6-(((4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥사노익산(BODIPY 650/665, 분자 탐침); 및
9-(2,4(또는 2,5)-디카르복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸륨, 내부염(TAMRA, 분자 탐침). 기타 적당한 형광 표지는 4,7,2',4',5',7'-헥사클로로-6-카르복시플루오레세인("HEX", ABI), 4,7,2',7'-테트라클로로-6-카르복시플루오레세인("TET", ABI) 및 "NED"(ABI)를 포함하는 것으로 알려져 있다.
전형적으로, 형광제는 용해된 cDNA 종을 검출하는 데 사용된다. 그러나, 기타 검출 방법, 예를 들어, 포스포로이미징 또는 자동방사선도, 또는 자기 검출이 사용될 수도 있다.
도표에 따르면, 각각의 mRNA 샘플로부터 생산된 cDNA 라이브러리는 대충mRNA의 초기 상대 농도에 따라 개시 RNA 샘플내의 모든 폴리(A)+mRNA의MspI를 위한 가장 말단 위치에서부터 폴리(A) 꼬리의 시작부까지 극단적 3'-말단의 사본을 포함한다. 각각의 종에 대한 삽입체의 양단부가 서열로 정확하게 정의되기 때문에, 그들의 길이는 각 종에 대하여 균일하여, mRNA의 조직원에 불구하고 젤 상의 불연속 밴드로 그들이 나중에 가시화될 수 있다.
전형적으로, 전기영동 후에 나타난 생성물의 농도는 원래 혼합물 내의 생성물에 대응하는 mRNA의 양에 대충 비례한다.
전형적으로, 방법은 전기영동 후에 mRNA에 대응하는 생성물의 농도로부터 원래 혼합물 내의 각각의 mRNA의 상대적 양을 결정하는 단계를 추가로 포함한다.
II. mRNA의 디스플레이를 위한 방법의 적용
패턴
조직에서 mRNA 발현 패턴의 탐지와 겔 전기영동법에 의한 이러한 패턴의 제거하기 위한 상술된 방법이 다양하게 응용된다. 이러한 응용중 하나는 생리적 또는 병리적 변화와 관련된 조직에서 mRNA 발현의 패턴에서의 변화를 탐지하는데 이용하는 것이다. 일반적으로 이러한 방법은:
(1) 생물학적 또는 병리적 변화가 되지 않은 조직의 제 1 샘플을 수득하는 단계;
(2) 조직의 제 1 샘플에서, 제 1 샘플에 존재하는 m-RNA의 3'-말단을 나타내는 밴드의 제 1 디스플레이를 발생시키도록, 앞서 개시된 것과 같은 mRNAs의 집단의 3' 말단을 나타내는 안티센스 cRNA 푸울의 구성원에 해당하는 mRNAs의 동시적인 서열-특정 식별의 방법을 수행하여, mRNA 발현의 패턴을 측정하는 단계;
(3) 생물학적 또는 병리적 변화가 이루어진 조직의 제 2 샘플을 수득하는 단단계;
(4) 조직의 제 2 샘플에서 제 2 샘플에 존재하는 mRNAs의 3-말단을 나타내는 밴드의 제 2 디스플레이를 발생시키도록, 앞서 개시된 것과 같은 mRNAs의 집단의 3'-말단을 나타내는 안티센스 cRNA 푸울의 구성원에 해당하는 mRNAs의 동시적인 서열 특정 식별 방법을 실행하여 mRNA 발현 패턴을 측정하는 단계; 및
(5) 조직에서 mRNA 발현에서 생물학적 또는 병리적 변화의 영향을 측정하도록 제 1 디스플레이와 제 2 디스플레이를 비교하는 단계를 포함한다.
전형적으로, 이러한 비교는 단일 겔의 인접한 레인(lane)에서 이루어진다.
전형적으로, 서열-특정 생성물의 디스플레이의 정량화로 생성된 데이터를 포함하는 데이터베이스는 적합한 하드웨어와 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 제작되고 유지된다. 바람직하게는, 추가로 이러한 데이터베이스가 데이터 관련 서열 관계, 유전자 맵핑 및 세포의 분포를 포함한다. 바람직한 구체예에서, PCR 생성물의 누클레오티드 서열의 일부 또는 전체, 및 길이가 누클레오티드 서열의 데이터베이스로부터 측정된 예측치와 비교된다.
조직은 중추신경계로부터 유도될 수 있다. 특히, 망막, 대뇌 피질, 후구, 시상, 시상 하부, 뇌하수체 전엽, 뇌하수체 후엽, 해마, 누클레우스 아쿰벤스(nucleus accumbens), 편도선, 선조체, 소뇌, 뇌간, 수프라키아스마틱 누클레우스(suprachiasmatic nucleus) 또는 척수인 중추신경계내의 구조에서 유도될 수 있다. 조직이 중추신경계로부터 유도되는 경우, 생물학 또는 병리학적 변화가 알쯔하이머병, 파킨슨증, 허혈증, 알코올 중독, 약물 중독, 정신분열증, 근위축성 측삭 경화증, 다발성 경화증, 우울증 및 양극성 조울증 질환이 될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 일주기성 변화, 노화 또는 자기 상승작용을 연구하기 위해 사용될 수 있으며, 후자는 해마에 영향을 미친다. 또한, 중추신경계 내의 특별한 구조에서 발생하는 mRNA 화학종을 참조하여, 이 방법은 학습과 기억, 감정, 약물 중독, 글루타메이트 긴경독성, 피딩 행동(feeding behavior), 후각, 바이러스 감염, 시력 및 운동 장애와 같은 복잡한 행동에 연관되는 것으로 공지된 뇌영역을 연구하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 이 방법은 약제 또는 독소의 투여전 및 후의 조직의 mRNA 패턴을 비교하여 개인에게 약제 및/또는 독소를 투여한 결과를 연구하기 위해 사용될 수 있다. 전기충격 치료법의 결과가 또한 연구될 수 있다.
또한, 조직은 심장혈관계, 폐기관, 소화기계, 말초신경계, 간, 신장, 골격근 및 재생기관을 포함하는 장기 또는 장기 기관, 또는 신체의 어떠한 다른 장기 또는 장기 기관이 될 수 있다. 예를들면, mRNA 패턴은 간, 심장, 신장 또는 골격근으로부터 연구될 수 있다. 추가로, 어떠한 조직에 대해, mRNA의 발현의 샘플을 일주기성 효과를 발견하기 위해 다양한 시간에 취할 수 있다. 이렇게 하여, 이 방법은 특별한 mRNA 화학종이 기능 또는 기능 장애의 특정한 패턴 때문이라고 여겼다.
바람직하게, 정상 또는 종양 조직은 심장혈관계, 림프계, 호흡기계, 소화계,말초신경계, 장관신경계, 내분비계, 외피계통(피부, 머리 및 손가락을 포함한다), 골격계(뼈 및 근육을 포함한다), 비뇨기계 및 생식기계통으로 이루어진 군으로부터 선택된 장기 또는 장기 계통으로부터 취해지거나 유도된 세포를 포함한다.
바람직한 구체예에서, 정상 또는 종양 조직은 상피, 내피, 점막, 선(glands), 혈액, 림프, 연결 조직, 연골부, 뼈, 평활근, 골격근, 심근, 뉴론, 아교 세포, 비장, 흉선, 하수체, 갑상선, 부갑상선, 부신 피질, 부신 수질부, 부신 피질, 송과체, 피부, 머리, 손톱, 치아, 간, 췌장, 폐, 신장, 방광, 요관, 유방, 난소, 자궁, 음부, 고환, 전립성, 음경, 눈 및 귀로부터 취해지거나 유도된 세포를 포함한다.
유사하게, 본 발명의 mRNA 제거 방법은 약제의 부작용을 스크리닝하는 방법의 일부로서 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은
(1) 공지된 생물학적 기능의 화합물로 처리된 유기체로부터의 조직의 제 1 샘플을 수득하는 단계;
(2) 조직의 제 1 샘플에서, 제 1 샘플에 존재하는 mRNAs의 집단의 3'-말단을 나타내는 밴드의 제 1 디스플레이를 발생시키도록 앞서 상술된 바와 같이 mRNAs의 집단의 3' 말단을 나타내는 안티센스 cRNA 푸울의 구성원에 해당하는 mRNAs의 동시 서열 특정 식별 방법을 실행하여 mRNA 발현의 패턴을 측정하는 단계;
(3) 부작용을 스크리닝하도록 약제로 처리된 유기체로부터의 조직의 제 2 샘플을 수득하는 단계;
(4) 조직의 제 2 샘플에서, 제 2 샘플에 존재하는 mRNAs의 집단의 3'-말단을나타내는 밴드의 제 2 디스플레이를 발생시키도록 앞서 상술된 바와 같이 mRNAs의 집단의 3' 말단을 나타내는 안티센스 cRNA 푸울의 구성원에 해당하는 mRNAs의 동시 서열 특정 식별 방법을 실행하여 mRNA 발현의 패턴을 측정하는 단계; 및
(5) 발현이 공지된 화합물에 의해 영향을 받지는 않지만, 스크리닝된 약제에 의해 영향을 받아, 스크리닝된 약제와 공지된 화합물의 활성의 차이와 부작용을 나타내는, mRNA 화학종의 존재를 탐지하도록 제 1 디스플레이와 제 2 디스플레이를 비교하는 단계를 포함한다.
특히, 이 방법은 항우울제, 신경이완약, 신경 안정제, 항경련제, 모노아민 산화효소 억제제 및 흥분제와 같은 중추신경계에 영향을 주는 약제에 대해 사용될 수 있다. 그러나, 이 방법은 사실 특정 조직에서의 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있다. 예컨대, 항파킨슨증제, 골격근 이완제, 진통제, 국부 마취제, 콜린성, 진경약, 스테로이드, 비스테로이드성 소염제, 항바이러스 제제 또는 mRNA 발현에 영향을 줄 수 있는 임의의 다른 약제의 mRNA 발현에 대한 영향이 연구될 수 있으며, 특정 조직 또는 구조에서 영향이 측정될 수 있다.
본 발명의 방법의 추가 응용은 디스플레이된 mRNA 화학종의 3'-말단의 서열을 수득하는데 있다. 일반적으로, 서열을 수득하는 방법은
(1) 샘플에 존재하는 mRNAs의 3'-말단을 나타내는 밴드가 디스플레이되는 엘렉트로페로그램(electropherogram)으로부터의 mRNA에 해당하는 하나 이상의 cDNA를 용출시키는 단계;
(2) 중합반응효소 사슬 반응에서 용출된 cDNA를 증폭시키는 단계;
(3) 증폭된 cDNA를 플라스미드로 클로닝하는 단계;
(4) 플라스미드로부터 클로닝된 DNA에 해당하는 DNA를 생성시키는 단계; 및
(5) 클로닝된 cDNA를 셔열화시키는 단계를 포함한다.
절단된 cDNA가 제 2 PCR 단계에서 이전에 사용된 프라이머로 증폭될 수 있다. cDNA는 이후 벡터로 TA 클로닝 및 연결에 의해 PCR II(Invitrogen, San Diego, CA)로 클로닝될 수 있다. 그리고 나서, DNA의 소형프렙(miniprep)이 생거의 디데옥시 사슬 종결 방법에 의한 자동화된 서열을 위한 두개의 부분 표본으로 변리되고 변성된 부분 및 서브클론으로부터 표준 기술에 의해 생성될 수 있다. 상업적으로 유용한 ABI 서열자와 같은 서열자가 자동화된 서열화에 사용될 수 있다. 이것은 50 내지 500bp의 길이 범위에서 연구된 대부분의 cDNAs에 대한 보충 서열의 결정을 가능하게 할 것이다.
이러한 부분 서열은 이후 BLASTN 및 BLASTX와 같은 비교 및 분석 프로그램을 사용하여 서열 식별과 유사성을 인지하도록 적당한 컴퓨터 설비를 사용하여 유전자 은행과 같은 누클레오티드 데이터 베이스들을 스캔하도록 사용될 수 있다. 이러한 방법이 단지 mRNAs의 3' 말단으로부터 서열을 발생하므로, 개방 판독 프레임(ORFs)이 단지 종종 마주칠 것으로 예측된다. 예컨대, 뇌 mRNAs의 3'-비번역된 영역은 1300 누클레오티드 보다 평균적으로 더 길다(J.G.Sutcliffe, 1988,supra). 잠재적인 ORFs는 신호 단백질 모티프에 대해 조사될 수 있다.
그리고 나서, 수득된 cDNA 서열은 조직 발현 패턴을 입증하도록 반정량적인 PCR에 대해 프라이머쌍을 설계하는데 사용될 수 있다. 또한 선택된 생성물은 추가분석을 위한 완전한 길이의 cDNA 클론을 분리하기 위해 사용될 수 있다. 프라이머쌍은 게놈 DNA의 SSCP-PCR(단일 가닥 구조 다형-PCR) 증폭을 위해 사용될 수 있다. 예컨대, 이러한 증폭은 이미 연결된 마커에 대한 각 PCR 생성물의 결합을 측정하도록 상호특정의 역교배 마이스의 패널로부터 실행될 수 있다. 이는 새로운 유전자가 맵핑될 수 있게 하고, 맵핑된 마우스 돌연변이 유전자리 및 동족 인간 질병 유전자에 대한 후보자를 식별하기 위한 자원으로 역할할 수 있다. SSCP-CPR은 PCR에 의해 소(100 내지 200bp)단편을 증폭하는 합성 올리고누클레오티드 프라이머를 사용한다(M.Orita et al., "Detection of Polymorphisms of Human DNA by Gel Electrophoresis as Single-Strand Conformation Polymorphisms," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2766-2770(1989); M. Orita et al., "Rapid and Sensitive Detection of Point Mutations in DNA Polymorphisms Using thte Polymerase Chain Reaction,"Genomics5:874-879(1989)).
mRNA 분포를 확인하고 해당하는 완전한 길이의 mRNA의 크기와 우세성을 익히도록 제자리 하이브리드 형성을 위해, 또는 노턴 블롯을 프로빙하는데 사용하기 위해 널리 공지된 방법에 의해 cDNA의 절단된 단편을 방사능 표지화시킬 수 있다. 또한 이 프로브는 보다 확실하고 완전한 서열 측정을 위해 클론을 분리하도록 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 표지된 프로브는 또한 생체외 발현을 연구하는 것과 같이 임의의 다른 목적을 위해 사용될 수 있다.
III. 프라이머의 패널과 변성(degenerate) 혼합물
본 발명의 다른 면은 프라이머의 패널과 본 발명의 실행에 적절한 프라이머의 변성 혼합물이다. 이들은 다음을 포함한다:
IV. 바람직한 구체예의 특정예
실시예 1:
향상된 방법의 응용
본 발명의 향상된 방법은 거의 진핵 mRNAs가 폴리(A) 테일로 끝난다는 관찰에 기초하지만, 미분 디스플레이와는 다르게(Liang, P. and A. B. Pardee(1992) Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science 257:967-971), 본 발명의 방법은 mRNAs를 푸울로 세분하기 위한 것이 아니라, 각 mRNA에 대한 부위를 단지 고정시키도록 테일에 결합하는 프라이머의 특이성을 이용한다. 향상된 방법은 도 1, 2, 및 8에서 세가지 구체예로 예시된다.
일반적으로, 이중 가닥의 cDNA는 역전사를 개시하기 위한 세트의 모든 48 5'-바이오티닐화된 앵커 프라이머의 동일몰의 혼합물을 사용하여 중요한 조직 샘플로부터 추출된 폴리(A0-풍부한 시토플라즘 RNA로부터 발생된다(도 2와 8)(Gubler, U. and B. Hoffman (1983) cDNA 라이브러리를 발생시키는 단순하고 매우 효과적인 방법. Gene 25:263-269)(Schibler, K., M. Tosi, A.C.Pittet, L. Fabiani and P.K.Wellauer (1980) 마우스 아밀라제 유전자의 조직 특이적 발현. J.Mol. Biol. 142:93-116). 하나의 이러한 적당한 세트는 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N (SEQ ID NO: 5), 여기에서 V는 A, C 또는 G이고, N은 a, C, G 또는 T이다. 48개의 앵커 프라이머의 이러한 혼합물의 하나의 구성원은 샘플내 각 mRNA 화학종의 모든 카피의 3' 말단의 고정 위치에서 합성을 개시하여, 각 화학종에 대한 3' 종료점을 한정하여, 이중 가닥의 cDNA를 바이오티닐화시켰다.
각 바이오티닐화된 이중 가닥 cDNA 샘플은 서열 CCGC를 인지하는 제한 엔도누클레아제MspI로 분해되었다. cDNA의 3' 단편이 스트렙타비딘이 코팅된 기질 상에서 바이오티닐화된 cDNA 단편의 포획에 의해 분리되었다. 적절한 스트렙타비딘이 코팅된 기질은 마이크로역가(microtitre) 플레이트, PCR 튜브, 폴리스티렌 비드, 상자기성 중합체 비드 및 상자기성 다공성 유리 조각을 포함한다. 바람직한 스트렙타비딘이 코팅된 기질은 상자기성 중합체 비드의 현탁액이다(Dynal, Inc., Lake Success, NY).
스트렙타비딘이 코팅된 기질과 포획된 바이오티닐화된 cDNA 단편을 세정한 후, cDNA 단편 생성물이 NotI로 분해하여 방출되며, cDNA의 mRNA-유도된 부분 내에서가 아닌 앵커 프라이머 내에서 8-누클레오티드 서열에서 분해된다. 각 mRNA 화학종에 대한 일정 길이의 3'MspI-NotI 단편이벡터의 T3 프로모터에 대하여 안티센스 배향으로ClaI-,NotI- 분해된 플라스미드 pBC SK+(Stratagene, La Jolla, CA)로 방향적으로 연결되었고, 생성물은 에쉬리치아 콜리(Escherichia coli) SURE 세포(Stratagene)를 형질변환하기 위해 사용되었다. 연결은MspI 부위가 아닌NotI 부위를 나타낸다. 각 라이브러리는 0.001% 이상의 농도를 갖는 모든 mRNAs의 3' 말단이 다양하게 표현되는 높은 가능성을 확실히하는 과량의 5x105재조합을 함유하였다. 플라스미드 프렙(Qiagen)은 연구중인 각 샘플의 cDNA 라이브러리로부터 제조되었다.
각 라이브러리의 부분 표본은MspI로 분해되고, T3 프로모터를 포함하는 온전한 3' cDNA 주입물과 이들의 측면 서열을 놓아 두면서 패런트 벡터 내의 여러 부위에서의 분해에 의해 선형화(liniarization)를 수행하였다. 생성물을 초기 cDNAs로부터MspI와NotI 부위와 인접하는 공지된 벡터 서열을 함유하는 클로닝된 주입물의 안티센스 cRNA 전사자를 발생시키도록 T3 RNA 중합체효소(MEGAscript kit, Ambion)과 함께 인큐베이팅시켰다.
이러한 단계는 주입물이 없는 플라스미드로부터 전사자와 함께 다른 범위로의 각 cRNA 샘플의 오염을 피하여, 프라이머에 대한 미분 경쟁으로 인해 상이한 샘플에 대한 추후 PCRs의 효능의 다양성을 이끌어 낼 수 있다. 그러나, 모벡터의 폴리링커(polylinker) 영역은ClaI와NotI 부위 사이의MspI를 함유하고, 이에 따라MspI 분해 단계는 하기 기술된 생성물 증폭 단계에서 불활성을 부여하는, 삽입이 없는 플라스미드로부터 전사된 cRNA로부터 5' 태그를 제거였다. 플라스미드 DNA를 RNase-비함유 DNase로의 인큐베이션에 의해 안티센스 cRNA 전사체의 혼합물로부터 제거하였다.
상기 단계에서, cRNA 제조물 각각은 3단계 방식으로 처리된다. 단계 1에서, 250ng의 cRNA를 5' RT 프라이머(도 1 및 2 및 8에서 5 PRIMER) A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G,(서열 번호: 14)를 사용하여 제 1 가닥 cDNA로 전환시켰다. 단계 2에서, 400pg의 cDNA 생성물을, 각각이 하기 프로그램을 사용하는 "보편적(universal)" 3'PCR 프라이머 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(서열 번호: 47)과 쌍을 이룬, G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N(서열 번호: 22)형의 각각 네개의 5' PCR 프라이머와의 네개의 별도의 반응으로 PCR 주형로서 사용하였다:
94℃, 15초;
65℃, 15초;
72℃, 60초;
20회 사이클.
단계 3에서, 각각의 서브푸울(subpool)의 생성물을 제 2 PCT 반응을 위해 64개의 서브푸울(20㎕ 중의 2ng)으로 분할하고, 100ng 각각의 형광화된 "보편적" 3' PCR 프라이머를 사용하여, 올리고누클레오티드 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T(서열 번호: 47)를 하기 프로그램을 사용하여 6-FAM 및 C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N-N-N-N(서열 번호: 25) 형의 적합한 5'PCR 프라이머에 컨쥬케이팅시켰다:
94℃, 15초;
X℃, 15초;
72℃, 30초;
30회 사이클.
상기 단계는 각각의 5' PCR 프라이머의 Tm보다 약간 높은 온도 X에서 어닐링 (annealing) 단계를 포함하여, 인위적 미스프라이밍(mispriming)을 최소화하고, 높은 신뢰성의 복사를 조장한다. 각각의 PCR 단계는 타크스타트(TaqStart) 항체(Clonetech)의 존재하에 수행되었다.
각 조직 샘플에 대한 최종 PCR 단계로부터의 생성물을 자동 ABI 프리즘(Prizm) 377 시퀀서(sequencer)를 사용하여 일련의 변성 DNA 시퀀싱 겔 상에서 분해시켰다. 진스캔 소프트웨어 팩키지(GeneScan software package)(ABI)를 사용하여 데이타를 수집하고, 증폭 및 이동에 대해 표준화시켰다. 이러한 일련의 반응의 완전 수행이 전체 N45' PCT 프라이머 셋(set)에 대한 전체 256개의 생성물 서브푸울에 대해, N15' PCR 프라이머에 의해 성립된 4개의 푸울 각각에 대한 64개의 생성물 서브푸울을 생성시켰다.
요약하면, 개선된 방법의 상기 구현에서(도 2), 역전사효소는 cRNA로부터 5PRIMER(서열 번호: 14) 형의 비파싱(nonparsing) 프라이머 5'RT 프라이머로 cDNA 푸울을 생성시키는데 사용되고, Taq DNA 폴리머라제는 PCR(20회 사이클)에 사용되고, 5'-PCR 프라이머 및 3'-PCR 프라이머(서열 번호: 47)로서 5' PCR 프라이머 5PRIMERN1(서열 번호: 11)으로 이중 가닥 cDNA 서브푸울을 생성시켰다. 최종 PCR은 2ng의 DNA 주형 및 100ng의 각각의 5PRIMER3N1N2N3N4프라이머(서열 번호: 25) 및 6-FAM에 컨쥬케이팅된 3' PCR 프라이머(서열 번호; 47)를 사용하여 30회 사이클 동안 수행하였다.
혈청 결핍(도 3, 패널 A) 및 혈청 첨가(도 3, 패널 B) 사람 MG63 골육종 세포로부터의 두개의 mRNA 샘플을 분석하였다. 나타난 데이타에서는 5' 말단에 6-카르복시형광체(6FAM, ABI)로 표지된 "보편적" 3' 프라이머(서열 번호: 47)과 쌍을 이룬 5'-PCR 프라이머(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T-G, 서열 번호: 42)로 생성되었다. PCR 반응 생성물을 4.5% 아크릴아미드 겔 상에서 겔 전기 영동에 의해 분해하고, 형광 데이타를 ABI377 자동 시퀀서로 획득하였다. 데이타를 진스캔 소프트웨어(Perkin-Elmer)를 사용하여 분석하였다. 상기 기재된 세가지 패널에서, 표지된 PCR 생성물의 상대적 부유도를 (Y-축 = 상대적 형광 단위) 생성물의 염기쌍 길이에 대해 플롯팅하였다. 이 방법의 높은 재현성이 아래 패널에 도시되어 있으며, 이는 샘플 간의 상대적 발현 수준을 비교하기 위해 진스캔 소프트웨어를 사용하여 겹쳐진 패널 (A) 및 (B)로부터의 데이타를 도시한 것이다.
본 발명의 주 적용은 두개 이상의 조직 샘플에 대한 mRNA 발현 프로파일을 비교하는 것이다. 본 발명자들은 생성된 생성물의 패널에 대해 혈청 결핍/보충 실험의 효과를 비교하였다. 샘플 쌍으로부터의 생성물의 대다수는 동시 이동하였고, 비교가능한 증폭을 가졌다. 10% 미만의 생성물이 두배 이상 차이가 난 증폭을 가졌으며, 이들은 혈청 보충에 의해 유도된 종과 보충에 의해 억제된 종 사이에 대략적으로 동등하게 분포되었다.
두 패널에서 구별되게 나타난 일부 많은 생성물은 진뱅크(GeneBank)로부터 추출된 데이타를 기준으로 한 예상된 DST와 일치하는 위치에서 이동하는 것으로 나타났으며, 이에 따라 후보 동일성(candidate identity)을 가졌다. 이들 후보 동일성을 시험하기 위해, 올리고누클레오티드를, 진뱅크 서열에서 말단MspI 부위에 인접한 서열로부터 추가의 14개의 누클레오티드를 사용하여 3' 말단에서 연장된 각각의 후보에 대해 5PRIMER3N1N2N3N4프라이머(서열 번호: 25)에 상응하게 합성하였다. 이들은 기질로서 N1cDNA를 사용하여 PCR에서 형광 3PRIMER(서열 번호: 47)와 쌍을 이루었다.
실시예 2
하나의 PCR 단계 및 두개의 PCR 단계를 사용하는 본 방법의 구현에서의 특이성 파싱: PCR 생성물의 분석
두개의 PCR 단계를 포함하는 기본적 방법의 구현의 이점은 혈청 결핍 및 혈청 첨가 MG63 세포를 사용함을 입증하였다. 기본적 방법(도 1 및 도 2)의 두 PCR 단계 변형에 있어서, 역전사효소를 사용하여 cRNA로부터 5PRIMER(서열 번호: 14) 형의 비파싱 프라이머(N0)로 cDNA 푸울을 생성시키고, 이후, Taq DNA 폴리머라제를 PCR(20회 사이클)에 사용하고, 5'-PCR 프라이머 및 3'-PCR 프라이머(서열 번호: 47)로서 5PRIMERN1(서열 번호: 22)로 이중 가닥 cDNA 서브푸울을 생성시켰다. 하나의 PCR 단계 변형에 있어서, 역전사 효소를 사용하여 5PRIMERN1(서열 번호: 22) 형의 네개의 N1 프라이머중 하나로 전사를 개시키므로써 cRNA로부터 4개의 cDNA 서브푸울을 생성시켰다. 두 방법 모두에서, 최종 PCR은 2ng의 DNA 주형 및 100ng의 각각의 5'PCR 프라이머(서열 번호: 25) 및 6-FAM 표지된 3' PCR 프라이머(서열 번호; 47)를 사용하여 30회 사이클 동안 수행하였다.
표지된 PCR 단편을 자동 DNA 시퀀서(ABI337)로 전기영동에 의해 분해하고, 진스캔 소프트웨어에 의해 분석하였다. 결과는 도 4에 있다. N1 위치(진한)에서만 상이한 프라이머 109T(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G- T -G-C-A, 서열 번호: 43) 및 45A(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G- A -G-C-A, 서열 번호: 44)로부터의 데이타가 두 혈청 결핍(도 4a, 4c, 4e 및 4g) 및 혈청 첨가(도 4b, 4d, 4f 및 4h) 샘플에 대해 도시되어 있다.
109T 및 45A로 생성된 PCR 생성물은 하나의 PCR 단계 변형에 의해 생성된 주형와 거의 동일한 것으로 나타났다(도 4a 내지 4c, 및 도 4b 내지 4d 비교). 대조적으로, 2 PCR 단계 방법을 사용하여 생성된 주형로부터의 PCR 후에 검출된 생성물은 전반적으로 상당히 구별되었다(도 4e 내지 4g, 및 도 4f 내지 4h 비교). 따라서, 상기 방법의 2 PCR 단계 구현은 가장 최근 사전에 입수할 수 있는 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다.
실시예 3
하나의 PCR 단계 및 두개의 PCR 단계를 사용하는 본 방법의 구현에서의 특이성 파싱: 클로닝 및 서열 데이타
본 발명의 방법을 하나의 PCR 단계(표 I) 또는 두개의 PCR 단계(표 II) 구현을 사용하여 혈청 결핍 및 혈청 처리된 MG63 세포에서 수행하였다. 표 I에 기재된 실험에서, 역전사 효소를 사용하여 네개의 N1 5' PCR 프라이머(서열 번호: 22) 셋 중 하나로 전사를 개시키므로써 cRNA로부터 4개의 cDNA 서브푸울을 생성시켰다. 표 II에 있어서, 역전사효소를 사용하여 cRNA로부터 비파싱 5' RT 프라이머(서열번호: 14)로 cDNA 푸울을 생성시켰다. Taq DNA 폴리머라제를 PCR(20회 사이클)에 사용하여 5'-PCR 프라이머(서열 번호: 22)로, 그리고 3'-PCR 프라이머(서열 번호: 47)로서 이중 가닥 cDNA 서브푸울을 생성시켰다. 두개의 표 I 및 II에서 최종 PCR은 2ng의 도입 cDNA 주형를 사용하여 6-FAM 표지된 3' PCR 프라이머(서열 번호; 47)와 쌍을 이룬 256 5'-PCR 프라이머(서열 번호: 25)의 완전 배열과 동일하게 수행하였다. PCR 반응 디스플레이트로부터, 구별되게 조절된 분자를 클로닝 및 시퀀싱 목적으로 동정하고 단리하였다.
DNA 서열 데이타를 개개의 클론 및 유전자 동정을 위해 얻어, BLAST 알고리즘을 사용하여 데이타베이스 서치를 수행하여 측정하였다. 상기 표 I 및 II에서, 공지된 사람 유전자와 정확히 매치하는 것으로 판명된 클론이 유전자명 및 진뱅크 전좌 ID로 기재되어 있다. 역전사(표 I) 또는 PCR 반응(표 II)에 5PRIMERN1(서열 번호: 22)를 사용하는 파싱 단계의 신뢰도를 진뱅크 서열에 대해 N1 위치에 있는 클론의 서열 매치를 표로 작성하여 평가하였다. 2-단계 방법에서, N1 위치(실질적으로 무작위)에서 올바르게 5/22 클론이 매치된 반면, 3단계 절차의 경우에 모든 클론이 상응하는 진뱅크 서열 데이타와 올바르게 매치되는 것으로 밝혀졌다.
표 I
하나의 PCR 단계를 사용한 파싱 특이성
표 II
두개의 PCR 단계를 사용한 파싱 특이성
진하게MAD-3, Id1, Na/K ATP아제, B3, pim-1 종양 유전자 및 엔도텔린-1로 강조된 5개의 유전자 생성물이 두 실험에서 단리되었고, 각각의 경우에 두개의 PCR 단계 방법은 N1위치에서 매치되었으나, 하나의 PCR 단계 방법은 그러하지 않았음을 유의한다. 따라서, 두개의 PCR 단계 방법은 가장 최근 이전의 입수할 수 있는 방법에 비추어 상당한 개선점을 제공한다.
실시예 4:
바이오티닐화 앵커 프라이머(Biotinylated Anchor Primers)를 사용하여 얻어진 개선된 분해
상기 기재된 바와 같이, 일 바람직한 구현에서, 앵커 프라이머를 이들의 5' 말단에서 바이오티닐화시켰다(도 1 및 2 비교). 바이오티닐화된 cDNA 단편은 스트렙타비틴-코팅된 기질, 바람직하게는 스트렙타비딘 코팅된 상자성 비드(bead)(Dynal)를 사용하여 포획될 수 있다. 도 5는 표준 기본 방법으로부터의 결과와 자성 비드로 표지된 앵커 프라이머를 사용하여 수득된 결과를 비교한 것이다.
cDNA 라이브러리를 표준 기술(도 1에 개요된 바와 같음) 및 시간별(0, 0.75, 7시간, 10일 및 14일)로 취해진 할로페리돌 처리된 마우스로부터의 5개의 별도의 선조체 샘플로부터의 2㎍의 mRNA 분취액으로부터 상기 대안적인 자성 비드 구현(도 2 참조)을 사용하여 구성하였다. 결과가 5a-e(표준) 및 도 5f-j(자성 비드)에 기재된다. 5'PCR 프라이머 170G(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-G-G-T, 서열 번호: 45) 및 6-FAM 표지된 3'PCR 프라이머(서열 번호: 47)이 비교를 위해 두 경우에 기재된다. 표지된 PCR 생성물의 상대적 부유도(abundance)를 (Y-축 임의의 상대적 형광 단위) PCR 생성물의 길이(염기쌍)에 대해 플롯팅하였다. 자성 비드 라이브러리(도 5f-j)로부터의 데이타는 표준 라이브러리 기술(도 5a-e)로부터의 데이타와 비교하여 시간별 샘플에 대한 재현성이 보다 크고(단편의 유사성과 세기 값의 일관성 모두에있어서), 명백하게 가짜인 짧은(100-125bp) 단편이 보다 적음을 보여준다.
실시예 5:
3단계 방법에서의 선형성의 입증: 도입 cRNA 농도에 대한 PCR 생성물 최고 높이의 관계
선형 증폭 범위를 결정하기 위해, 단일 cRNA 종을 4개의 독립적인 cRNA 푸울에 소량첨가하고, 도 2에 도시된 바와 같은 본 발명의 방법에 의해 처리하였다. 결과는 도 6에 보여진다. 합성 RNA에 상응하는 최고 높이(상대적 형광 단위)를 측정하고 4개의 샘플에 대한 도입 농도에 대해 플롯팅하였다. 깆된 데이타는 3회 측정의 평균값이며, 오차 막대(error bar)는 ±어느 한 평균 표춘 오차의 범위를 나타낸다.
SalI-NotI cDNA 단편(서열 번호: 51)을 라이브러리 벡터 pBSCK+로 클로닝시키고, 선형화시키고, T3 프로모터 합성 cRNA로부터의 전사에 의해 생성된 cRNA를 구성하여 PCR에서 공지된 크기(492bp)의 피크를 야기시켰다. 여러가지 양의 cRNA(0, 25, 100 또는 250pg)를 N0프라이머(서열 번호:14)로 역전사시키기 전에 250ng 푸울의 cRNA에 도입시켰다. 400pg의 cDNA를, 각각 5'PCR 프라이머(서열번호: 22) 및 3'PCR 프라이머(서열 번호:47)을 사용하는 PCR 반응을 위해 주형로서 사용하였다. 2ng 분취액의 cDNA를, 5'PCR 프라이머 221C(C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-C-T-C-A, 서열 번호: 46) 및 3'PCR 프라이머(서열 번호:47)를 사용하는 최종 PCR에 사용하였다. 도 6에 기재된 결과는, 주어진 조직 형에 대해, PCR 생성물의 최고 높이가 도입 PNA 농도에 비례함을 입증한다.
상술된 내용은 본 발명을 설명하고자 하는 것으로, 제한하려는 것은 아니다. 본 발명의 사상 및 범주에서 출발하지 않고도 본 발명의 많은 변형 및 변경이 이루어질 수 있다.
서열목록

Claims (87)

  1. (a) 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 집단으로부터 이중 가닥 cDNA 집단을 준비하는 단계로서, 각각의 앵커 프라이머가 5' 말단과 3' 말단을 지니며, (ⅰ) 7개 내지 40개의 T 잔기의 트랙(tract); (ⅱ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위로서, 절단 부위가 T 잔기의 트랙에 대해 5'-말단쪽에 위치한 절단 부위; (ⅲ) 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위에 대해 5'-말단쪽에 위치한 4개 내지 40개 누클레오티드의 제 1 스터퍼(stuffer) 절편; (ⅳ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위와 T 잔기의 트랙 사이에 개재된 제 2 스터퍼 절편; 및 (ⅴ) -V, -V-N, 및 -V-N-N (여기서, V는 A, C 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이고, N은 A, C, G 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이다), 및 V와 N에 대한 모든 가능성을 함유하는 앵커 프라이머를 포함하는 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 각각의 앵커 프라이머의 3' 말단에 위치한 페이싱(phasing) 잔기를 포함하는 단계;
    (b) 이중 가닥 cDNA 집단을 제 1 제한 엔도누클레아제와 제 2 제한 엔도누클레아제로 절단하는 단계로서, 제 2 제한 엔도누클레아제가 4-누클레오티드 서열을 인식하여 각각 제 1 말단과 제 2 말단을 지니는 이중 가닥 cDNA 분자의 집단을 형성시키는 단계;
    (c) 벡터내의 박테리오파지 특이적 프로모터에 대해 안티센스인 배향으로 단계(b)로부터의 각각의 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내로 삽입시켜서 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물의 집단을 형성시킴으로써, 각각 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 인접해 있는 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 규정하게 하고, 상기 구성물이 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 상기 프로모터에서 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 길이가 15개 이상의 누클레오티드인 3' 플랭킹 벡터 서열을 지니게 하는 단계;
    (d) 절단된 cDNA가 삽입되어 클로닝된 삽입체를 함유하도록 생성된 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    (e) 생성된 선형화된 단편이 이중 가닥 cDNA 분자의 제 2 말단의 5'에서 벡터내로 삽입된 15개 이상의 누클레오티드의 5' 플랭킹 벡터 서열을 지니게 되도록, 삽입된 cDNA 분자 또는 박테리오파지 특이적 프로모터내의 서열은 인식하지 못하지만 벡터내의 서열은 인식하는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 단계(c)에서 생성된 구성물을 분해시킴으로써 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 생성시키는 단계;
    (f) 선형화된 단편을 박테리오파지 특이적 프로모터로부터 전사를 개시시킬 수 있는 박테리오파지 특이적 RNA 중합효소와 인큐베이션시킴으로써 안티센스 cRNA 전사체의 cRNA 프레퍼레이션(preparation)을 생성시키는 단계;
    (g) 역전사효소와, 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 5' RT 프라이머를 사용하여 cRNA를 전사시킴으로써 제 1 가닥 cDNA를 생성시키는 단계;
    (h) 제 1 가닥 cDNA를 제 1 시리즈(series)의 서브푸울로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 1의 3' PCR 프라이머와 -N1(여기서, "N"은 4개의 데옥시누클레오티드 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 1의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 1 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 1 세트를 생성시키는 단계로서, 제 1의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 5' PCR 프라이머의 상보성이 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드 중의 하나의 누클레오티드로 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 단계;
    (i) 각각의 제 1 시리즈의 서브푸울내의 PCR 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 세트로 추가로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 2의 3' PCR 프라이머와 -N1-Nx(여기서, N1은 이러한 서브푸울에 대한 제 1 중합효소 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하고, "N"은 단계(h)에서와 같고, "x"는 1 내지 5의 정수이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 2의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 2 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계로서, 제 2의 5' PCR 프라이머가 길이가15개 내지 30개 누클레오티드이고, 프라이머의 상보성이 "x"+1과 동등한 누클레오티드의 수로 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드로 교차 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적이고, 제 2의 5' PCR 프라이머 중 또 다른 하나가 제 2 시리즈의 서브푸울의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 서브푸울의 제 1 세트내의 각각의 서브푸울에 대해 제 2 시리즈의 서브푸울에 4X서브푸울이 존재하는 단계; 및
    (j) PCR 생성물의 제 2 세트를 분석하여 mRNA 집단에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계를 포함하여 mRNA 집단에서 mRNA를 동시 서열 특이적으로 확인하기 위한 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 비오틴 잔기가 앵커 프라이머에 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 비오틴 잔기가 앵커 프라이머의 5' 말단에 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 2항에 있어서, 제 1의 제한된 cDNA를 스트렙타비딘 코팅된 기질과 접촉시킴으로써 제 1의 제한된 cDNA가 제 1항의 단계(b)의 cDNA의 나머지로부터 분리됨을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 제 1의 5' PCR 프라이머의 3' 단부에 있는 3개의 누클레오티드가 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 제 2의 5' PCR 프라이머의 3' 단부에 있는 3개의 누클레오티드가 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 제 1의 5' PCR 프라이머와 제 2의 5' PCR 프라이머의 3' 단부에 있는 3개의 누클레오티드가 포스포로티오에이트 결합에 의해 결합됨을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 제 2 PCR 반응을 위한 프라이머 중의 하나가 형광 표지에 컨쥬게이션됨을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 형광 표지가 하기 화합물로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법:
    스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산텐)-3-온, 6-카복실산, 3',6'-디하이드록시-6-카복시플루오레세인;
    스피로(이소벤조푸란-1(3H,9'-(9H)-크산텐)-3-온, 5-카복실산, 3',6'-디하이드록시-5-카복시플루오레세인;
    스피로(이소벤조푸란-1(3H),9'-(9H)-크산텐)-3-온, 3',6'-디하이드록시-플루오레세인;
    9-(2,5-디카복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸리움 6-카복시테트라메틸로다민;
    3,6-디아미노-9-(2-카복시페닐)-크산틸리움;
    스피로[이소벤조푸란-1(3H),9'-크산텐]-6-카복실산, 5'-디클로로-3',6'-디하이드록시-2',7'-디메톡시-3-옥소-;
    1H,5H,11H,15H-크산테노[2,3,4-ij:5,6,7-i'j']디퀴놀리진-8-이움, -(2,4-디설포페닐)-2,3,6,7,12,13,16,17-옥타하이드로-, 분자내염;
    6-((4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥산산;
    6-((4-,4-디플루오로-1,3-디메틸-5-(4-메톡시페닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피오닐)아미노)헥산산;
    6-(((4-(4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)페녹시)아세틸)아미노)-헥산산;
    4,4-디플루오로-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-펜탄산;
    4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로판산;
    4,4-디플루오로-5-페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산;
    4,4-디플루오로-5-(4-페닐-1,3-부타디에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산;
    4,4-디플루오로-5-스티릴-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-프로피온산;
    6-(((4,4-디플루오로-5-(2-티에닐)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥산산;
    6-(((4,4-디플루오로-5-(2-피롤릴)-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-일)스티릴옥시)아세틸)아미노헥산산;
    9-(2,4(또는 2,5)-디카복시페닐)-3,6-비스(디메틸아미노)-크산틸리움,분자내염; 및
    4,7,2',4',5',7' 헥사클로로 6-카복시플루오레세인 및 4,7,2',7' 테트라클로로 6-카복시플루오레세인.
  10. 제 1항에 있어서, 숙주 세포가 대장균 세포임을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 단계(a)의 페이싱 잔기가 -V-N-N임을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 단계(a)의 페이싱 잔기가 -V-N임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 단계(a)의 페이싱 잔기가 -V임을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 단계(i)의 "x"가 3임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 단계(i)의 "x"가 1임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 단계(a)의 페이싱 잔기가 -V-N-N이고, 단계(i)의 "x"가 3임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 단계(a)의 페이싱 잔기가 -V이고, 단계(i)의 "x"가 2임을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 앵커 프라이머가 각각 T 잔기의 트랙 중 18개 T 잔기를 지님을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 앵커 프라이머의 제 1 스터퍼 절편의 길이가 14개 잔기임을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 1항에 있어서, 제 1 스터퍼 절편의 서열이 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A (SEQ ID NO:2)임을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 1항에 있어서, 박테리오파지 특이적 프로모터가 T3 프로모터, T7 프로모터 및 SP6 프로모터로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항에 있어서, 박테리오파지 특이적 프로모터가 T3 프로모터임을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 1항에 있어서, cRNA로부터의 cDNA의 전사를 프라이밍하기 위한 프라이머가 서열 A-G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G (SEQ ID NO:14)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 1항에 있어서, 벡터가ClaI과NotI로 절단되는 플라스미드 pBC SK+이고, 단계(h)와 (i)의 3' PCR 프라이머가 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO:47)임을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 1항에 있어서, 벡터가ClaI과NotI로 절단되는 플라스미드 pBC SK+이고, 단계(h)와 (i)의 3' PCR 프라이머가 G-A-G-C-T-C-G-T-T-T-T-C-C-C-A-G (SEQ ID NO:48)임을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 1항에 있어서, 4-누클레오티드 서열을 인식하는 제 2 제한 엔도누클레아제가MspI임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 1항에 있어서, 4-누클레오티드 서열을 인식하는 제 2 제한 엔도누클레아제가MboI,DpnII,Sau3AI,Tsp509I,HpaII,BfaI,Csp6I,MseI,HhaI,NlaIII,TaqI,MspI,MaeIISau3AI,BglII 및HinPII로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 1항에 있어서, 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제가AscI,BaeI,FseI,NotI,PacI,PmeIPpuMI,RsrII,SapI,SexAI,SfiI,SgfI,SgrAI,SrfI,Sse8387I 및SwaI로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 1항에 있어서, 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제가NotI임을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 1항에 있어서, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가 단계(b)에서 사용된 제 2 제한 엔도누클레아제의 4-누클레오티드 서열을 포함하는 누클레오티드 서열 인식 부위를 지님을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 제 2 제한 엔도누클레아제가MspI이고, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가SmaI임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 제 2 제한 엔도누클레아제가TaqI이고, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가XhoI임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 30항에 있어서, 제 2 제한 엔도누클레아제가HinPII이고, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가NarI임을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 30항에 있어서, 제 2 제한 엔도누클레아제가MaeII이고, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가AatII임을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 30항에 있어서, 제 2 제한 엔도누클레아제가Sau3AI이고, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가BglII임을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 30항에 있어서, 제 2 제한 엔도누클레아제가NlaIII이고, 단계(e)에서 사용된 제한 엔도누클레아제가NcoI임을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 1항의 방법을 실시하기에 적합한 벡터로서, 단계(c)의 벡터가 벡터 스터퍼 서열을 플랭킹하는 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위를 지닌 환형 DNA 분자의 형태이고, 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 절단하는 제한 엔도누클레아제로 벡터를 분해시키는 단계를 추가로 포함하는 벡터.
  38. 제 37항에 있어서, 벡터 스터퍼 서열이 제 1 및 제 2 벡터 제한 엔도누클레아제 부위 사이에 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위를 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  39. 제 38항에 있어서, 단계(e)가 내부 벡터 스터퍼 제한 엔도누클레아제 부위에서 벡터를 절단하는 제한 엔도누클레아제로 벡터를 분해시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 벡터.
  40. 플라스미드 pBC SK+/DGT1, pBS SK+/DGT2, pBS SK+/DGT3, pBC SK+/DGT4 및 pBS SK+/DGT5로 구성된 군으로부터 선택된 벡터.
  41. SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 및 SEQ ID NO:13으로 구성된 군으로부터 선택된 다중 클로닝 부위를 포함하는 벡터.
  42. 제 1항에 있어서, mRNA 집단이 폴리아데닐화된 mRNA 종에 대해 부화되어 있음을 특징으로 방법.
  43. 제 1항에 있어서, 증폭된 단편의 단계(j)의 분석 단계가 생성물을 디스플레이하도록 전기영동에 의해 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 전기영동 후 디스플레이된 생성물의 강도가 최초의 혼합물내의 생성물에 상응하는 mRNA의 양에 거의 비례함을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 43항에 있어서, 전기영동 후에 mRNA에 상응하는 생성물의 강도로부터 최초 혼합물내의 각각의 mRNA의 상대적인 양을 결정하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 43항에 있어서, 전기영동에 의해 중합효소 연쇄 반응 증폭된 단편을 분석하는 단계가 두 개 이상의 겔상에서 단편을 전기영동시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
  47. 제 40항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법:
    (k) 샘플에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 밴드가 디스플레이된 일렉트로페로그램(electropherogram)으로부터 mRNA에 상응하는 하나 이상의 cDNA를 용리시키는 단계;
    (l) 용리된 cDNA를 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시키는 단계;
    (m) 증폭된 cDNA를 플라스미드내로 클로닝시키는 단계;
    (n) 클로닝된 DNA에 상응하는 DNA를 플라스미드로부터 생성시키는 단계; 및
    (o) 클로닝된 cDNA를 시퀀싱하는 단계.
  48. (a) mRNA 집단을 단리시키는 단계;
    (b) 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 집단으로부터 이중 가닥 cDNA 집단을 준비하는 단계로서, 각각의 앵커 프라이머가 5' 말단과 3' 말단을 지니며, (ⅰ) 7개 내지 40개의 T 잔기의 트랙; (ⅱ) 8개 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위로서, 절단 부위가 T 잔기의 트랙에 대해 5'-말단쪽에 위치한 절단 부위; (ⅲ) 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위에 대해 5'-말단쪽에 위치한 4개 내지 40개 누클레오티드의 제 1 스터퍼 절편; (ⅳ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위와 T 잔기의 트랙 사이에 개재된 제 2 스터퍼 절편; 및 (ⅴ) 각각의 앵커 프라이머의 3' 말단에 위치한 -V, -V-N, 및 -V-N-N (여기서, V는 A, C 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이고, N은 A, C, G 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이다), 및 V와 N에 대한 모든 가능성을 함유하는 앵커 프라이머를 포함하는 혼합물 중 하나로 규정된 페이싱(phasing) 잔기를 포함하는 단계;
    (c) 이중 가닥 cDNA 집단을 제 1 제한 엔도누클레아제와 제 2 제한 엔도누클레아제로 절단하는 단계로서, 제 2 제한 엔도누클레아제가 4-누클레오티드 서열을 인식하여 각각 제 1 말단과 제 2 말단을 지니는 이중 가닥 cDNA 분자의 집단을 형성시키는 단계;
    (d) 벡터내의 T3 프로모터에 대해 안티센스인 배향으로 단계(b)로부터의 각각의 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내로 삽입시켜서 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물의 집단을 형성시킴으로써, 각각 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스가닥의 3' 말단에 인접해 있는 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 규정하게 하고, 상기 구성물이 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 상기 프로모터에서 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 길이가 15개 이상의 누클레오티드인 3' 플랭킹 벡터 서열을 지니게 하는 단계;
    (e) 절단된 cDNA가 삽입되어 클로닝된 삽입체를 함유하도록 생성된 벡터로 대장균을 형질전환시키는 단계;
    (f) 삽입된 cDNA 분자 또는 T3 프로모터내의 서열을 인식하지 못하는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 단계(c)에서 생성된 구성물을 분해시킴으로써 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 생성시키는 단계;
    (g) 선형화된 단편을 T3 프로모터로부터 전사를 개시시킬 수 있는 T3 RNA 중합효소와 인큐베이션시킴으로써 안티센스 cRNA 전사체의 cRNA 프레퍼레이션을 생성시키는 단계;
    (h) 역전사효소와, 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 5' RT 프라이머를 사용하여 cRNA를 전사시킴으로써 제 1 가닥 cDNA를 생성시키는 단계;
    (i) 제 1 가닥 cDNA를 제 1 시리즈의 서브푸울로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 T3 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 1의 3' PCR 프라이머와 -N1(여기서, "N"은 4개의 데옥시누클레오티드 A, C,G 또는 T 중 어느 하나이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 1의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 1 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 1 세트를 생성시키는 단계로서, 제 1의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 5' PCR 프라이머의 상보성이 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드 중의 하나의 누클레오티드로 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적이고, 제 1의 5' PCR 프라이머 중의 또 다른 하나가 각각의 4개의 상이한 서브푸울에서 사용되는 단계;
    (j) 각각의 제 1 시리즈의 서브푸울내의 PCR 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 세트로 추가로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 T3 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 2의 3' PCR 프라이머와 -N1-Nx(여기서, N1은 이러한 서브푸울에 대한 제 1 중합효소 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하고, "N"은 단계(i)에서와 같고, "x"는 3과 4로 구성된 군으로부터 선택된 정수이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 2의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 2 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계로서, 제 2의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 프라이머의 상보성이 "x"+1과 동등한 누클레오티드의 수로 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드로 교차 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적이고, 제 2의 5' PCR 프라이머 중 또 다른 하나가 제 2 시리즈의 서브푸울의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 각각의 서브푸울에 대해 제 2 시리즈의 서브푸울에 4X서브푸울이 존재하는 단계; 및
    (k) PCR 생성물의 제 2 세트를 분석하여 mRNA 집단에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계를 포함하여 mRNA 집단에서 mRNA를 동시 서열 특이적으로 확인하기 위한 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 48개 앵커 프라이머의 혼합물이 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N (SEQ ID NO:5)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  50. 제 48항에 있어서, 48개 앵커 프라이머의 혼합물이 서열 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N-N (SEQ ID NO:8)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  51. 제 48항에 있어서, 12개 앵커 프라이머의 혼합물이 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID NO:4)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 48항에 있어서, 12개 앵커 프라이머의 혼합물이 서열 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V-N (SEQ ID NO:7)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 48항에 있어서, 3개 앵커 프라이머의 혼합물이 서열 A-A-C-T-G-G-A-A-G-A-A-T-T-C-G-C-G-G-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO:3)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 48항에 있어서, 3개 앵커 프라이머의 혼합물이 서열 G-A-A-T-T-C-A-A-C-T-G-G-A-A-G-C-G-G-C-C-C-G-C-A-G-G-A-A-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-T-V (SEQ ID NO:6)를 지님을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 48항에 있어서, 제 1 제한 엔도누클레아제가MspI이고, 제 2 제한 엔도누클레아제가NotI임을 특징으로 하는 방법.
  56. 제 48항에 있어서, 제 1의 5' PCR 프라이머가 G-G-T-C-G-A-C-G-G-T-A-T-C-G-G-N (SEQ ID NO:22)임을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 48항에 있어서, 제 1의 3' PCR 프라이머와 제 2의 3' PCR 프라이머가 G-A-G-C-T-C-C-A-C-C-G-C-G-G-T (SEQ ID NO:47)임을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 48항에 있어서, 단계(j)의 "x"가 3임을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 48항에 있어서, 단계(j)의 "x"가 4임을 특징으로 하는 방법.
  60. (a) 생리학적 또는 병리학적 변화를 입기 쉽지 않은 조직의 제 1 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 제 1 샘플로부터 mRNA 집단을 단리시키는 단계;
    (c) 제 1항의 단계(a) 내지 (j)를 수행하여 제 1 샘플에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 제 1 디스플레이를 생성시킴으로써 조직의 제 1 샘플에서 mRNA 발현의 패턴을 결정하는 단계;
    (d) 생리학적 또는 병리학적 변화를 입기 쉬운 조직의 제 2 샘플을 수득하는 단계;
    (e) 제 2 샘플로부터 mRNA 집단을 단리시키는 단계;
    (f) 제 1항의 단계(a) 내지 (j)를 수행하여 제 2 샘플에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 제 2 디스플레이를 생성시킴으로써 조직의 제 2 샘플에서 mRNA 발현의 패턴을 측정하는 단계; 및
    (g) 제 1 디스플레이와 제 2 디스플레이를 비교하여 조직에서의 mRNA 발현의 패턴에 대한 생리학적 또는 병리학적 변화의 효과를 측정하는 단계를 포함하여, 생리학적 또는 병리학적 변화과 관련된 조직에서의 mRNA 발현의 패턴의 변화를 검출하는 방법.
  61. 제 60항에 있어서, 생리학적 또는 병리학적 변화가 전사 인자에 의해 매개된 작용, 세포내 2차 메신저, 호르몬, 신경전달물질, 성장 인자, 신경조절물질, 세포-세포 접촉, 세포-기질 접촉, 세포-세포외 매트릭스 접촉 및 세포막과 세포골격 사이의 접촉으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 60항에 있어서, 조직이 중추신경계로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 62항에 있어서, 생리학적 또는 병리학적 변화가 알츠하이머병, 파킨슨증, 허혈, 알코올중독, 약물 중독, 정신분열증, 근위축성 측삭경화증, 다발성경화증, 우울증, 및 양극성 조울증 질환으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 62항에 있어서, 생리학적 또는 병리학적 변화가 학습 또는 기억력, 정서, 글루타메이트 신경독성, 섭식 거동, 후각, 시각, 운동 장애, 바이러스 감염, 전기충격요법, 또는 약물 또는 독소의 투여와 관련됨을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 60항에 있어서, 생리학적 또는 병리학적 변화가 일주기 변화, 노화 및 장기간 활성화로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 60항에 있어서, 조직이 망막, 대뇌 피질, 후구, 시상, 시상하부, 뇌하수체 전엽, 뇌하수체 후엽, 해마, 측중격핵, 편도, 선조체, 소뇌, 뇌간, 시상상핵 및 척수로 구성된 군으로부터 선택된 중추신경계내의 구조물로부터 유래됨을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 60항에 있어서, 조직이 심혈관계, 폐계통, 소화계, 말초신경계, 간, 신장, 골격근 및 생식계로 구성된 군으로부터 선택된 장기 또는 장기 계통으로부터의 정상 또는 종양 조직임을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 60항에 있어서, 조직이 심혈관계, 림프계, 호흡계, 소화계, 말초신경계, 중추신경계, 장관신경계, 내분비계, 외피(피부, 머리카락 및 손톱 포함), 골격계(뼈 및 근육 포함), 비뇨기계 및 생식계로 구성된 군으로부터 선택된 장기 또는 장기 계통으로부터 취해지거나 유래된 세포를 포함하는 정상 또는 종양 조직임을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 60항에 있어서, 조직이 상피, 내피, 점막, 선(腺), 혈액, 림프, 결합 조직, 연골, 뼈, 평활근, 골격근, 심근, 뉴런, 아세포, 비장, 흉선, 뇌하수체, 갑상선, 부갑상선, 부신피질, 부신수질, 부신피질, 송과, 피부, 머리카락, 손톱, 치아, 간, 췌장, 폐, 신장, 방광, 요관, 유방, 난소, 자궁, 질, 고환, 전립선, 음경, 눈 및 귀로 구성된 군으로부터 취해지거나 유래된 세포를 포함하는 정상 또는 종양 조직임을 특징으로 하는 방법.
  70. (a) 공지된 생리학적 기능을 지닌 화합물로 처리된 생물체로부터 조직의 제 1 샘플을 수득하는 단계;
    (b) 제 1 샘플로부터 mRNA 집단을 단리시키는 단계;
    (c) 제 1항의 단계(a) 내지 (j)를 수행하여 제 1 샘플에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 제 1 디스플레이를 생성시킴으로써 조직의 제 1 샘플에서 mRNA 발현의 패턴을 측정하는 단계;
    (d) 약물과 공지된 화합물의 작용의 차이를 위해 스크리닝하려는 약물로 처리된 생물체로부터 조직의 제 2 샘플을 수득하는 단계;
    (e) 제 1 샘플로부터 mRNA 집단을 단리시키는 단계;
    (f) 제 1항의 단계(a) 내지 (j)를 수행하여 제 2 샘플에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 제 2 디스플레이를 생성시킴으로써 조직의 제 2 샘플에서 mRNA 발현의 패턴을 측정하는 단계; 및
    (g) 발현이 공지된 화합물의 영향을 받지는 않지만 스크리닝하려는 약물의 영향을 받는 mRNA 종의 존재를 검출하기 위해 제 1 디스플레이와 제 2 디스플레이를 비교하는 단계를 포함하여, 스크리닝하려는 약물과 공지된 화합물의 작용의 차이를 검출하는 방법.
  71. 제 70항에 있어서, 스크리닝하려는 약물이 항우울제, 신경이완제, 신경안정제, 항경련제, 모노아민 옥시다아제 억제제 및 자극제로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 70항에 있어서, 스크리닝하려는 약물이 항파킨슨증 제제, 골격근 이완제, 진통제, 국소 마취제, 콜린작용제, 항바이러스제, 진경제, 스테로이드 및 비스테로이드성 항염증제로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 1항의 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 정량함으로써 생성된 데이터를 포함하는 데이터베이스.
  74. 서열 관계, 유전자 맵핑 및 세포 분포에 관한 데이터를 추가로 포함하는 제 1항의 데이터베이스.
  75. (a) 앵커 프라이머의 혼합물을 사용하여 mRNA 집단으로부터 이중 가닥 cDNA 집단을 준비하는 단계로서, 각각의 앵커 프라이머가 5' 말단과 3' 말단을 지니며, (ⅰ) 7개 내지 40개의 T 잔기의 트랙; (ⅱ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위로서, 절단 부위가 T 잔기의 트랙에 대해 5'-말단쪽에 위치한 절단 부위; (ⅲ) 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위에 대해 5'-말단쪽에 위치한 4개 내지 40개 누클레오티드의 제 1 스터퍼 절편; (ⅳ) 6개가 넘는 염기를 인식하는 제 1 제한 엔도누클레아제에 의해 절단되는 부위와 T 잔기의 트랙 사이에 개재된 제 2 스터퍼 절편; 및 (ⅴ) -V, -V-N, 및 -V-N-N (여기서, V는 A, C 및 G로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이고, N은 A, C, G 및 T로 구성된 군으로부터 선택된 데옥시리보누클레오티드이다), 및 V와 N에 대한 모든 가능성을 함유하는 앵커 프라이머를 포함하는 혼합물로 구성된 군으로부터 선택된 각각의 앵커 프라이머의 3' 말단에 위치한 페이싱 잔기를 포함하는 단계;
    (b) 이중 가닥 cDNA 집단을 제 1 제한 엔도누클레아제와 제 2 제한 엔도누클레아제로 절단하는 단계로서, 제 2 제한 엔도누클레아제가 4-누클레오티드 서열을 인식하여 각각 제 1 말단과 제 2 말단을 지니는 이중 가닥 cDNA 분자의 집단을 형성시키는 단계;
    (c) 벡터내의 박테리오파지 특이적 프로모터에 대해 안티센스인 배향으로 단계(b)로부터의 각각의 이중 가닥 cDNA 분자를 벡터내로 삽입시켜서 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 구성물의 집단을 형성시킴으로써, 각각 삽입된 cDNA의 센스 가닥의 5' 말단 및 센스 가닥의 3' 말단에 인접해 있는 5' 및 3' 플랭킹 벡터 서열을 규정하게 하고, 상기 구성물이 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 상기 프로모터에서 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 길이가 15개 이상의 누클레오티드인 3' 플랭킹 벡터 서열을 지니게 하는 단계;
    (d) 절단된 cDNA가 삽입되어 클로닝된 삽입체를 함유하도록 생성된 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    (e) 생성된 선형화된 단편이 이중 가닥 cDNA 분자의 제 2 말단의 5'에서 벡터내로 삽입된 15개 이상의 누클레오티드의 5' 플랭킹 벡터 서열을 가지게 되도록, 삽입된 cDNA 분자 또는 박테리오파지 특이적 프로모터내의 서열은 인식하지 못하지만 벡터내의 서열은 인식하는 하나 이상의 제한 엔도누클레아제로 단계(c)에서 생성된 구성물을 분해시킴으로써 삽입된 cDNA 분자를 함유하는 선형화된 단편을 생성시키는 단계;
    (f) 선형화된 단편을 박테리오파지 특이적 프로모터로부터 전사를 개시시킬 수 있는 박테리오파지 특이적 RNA 중합효소와 인큐베이션시킴으로써 안티센스 cRNA 전사체의 cRNA 프레퍼레이션을 생성시키는 단계;
    (g) 역전사효소와, 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 누클레오티드 서열을 포함하는 5' RT 프라이머를 사용하여 cRNA를 전사시킴으로써 제 1 가닥 cDNA를 생성시키는 단계;
    (h) 제 1 가닥 cDNA를 제 1 시리즈의 서브푸울로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 1의 3' PCR 프라이머와 -N1(여기서, "N"은 4개의 데옥시누클레오티드 A, C, G 또는 T 중 어느 하나이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 1의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 1 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 제 1 가닥 cDNA를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 1 세트를 생성시키는 단계로서, 제 1의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 5' PCR 프라이머의 상보성이 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드 중의 하나의 누클레오티드로 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적이고, 제 1의 5' PCR 프라이머 중 또 다른 하나가 각각의 4개의 상이한 서브푸울에서 사용되는 단계;
    (i) 각각의 제 1 시리즈의 서브푸울내의 PCR 생성물의 제 1 세트를 서브푸울의 제 2 세트로 추가로 분할시키고, 제 1 제한 엔도누클레아제 부위와 박테리오파지 특이적 프로모터에 의한 전사 개시를 규정하는 부위 사이에 있는 3' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적인 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드인 제 2의 3' PCR 프라이머와 -N1-Nx(여기서, N1은 이러한 서브푸울에 대한 제 1 중합효소 연쇄 반응에서 사용된 N1과 동일하고, "N"은 단계(h)에서와 같고, "x"는 1 내지 5의 정수이다)로 구성된 3' 말단을 지니는 것으로 규정된 제 2의 5' PCR 프라이머를 사용하는 제 2 중합효소 연쇄 반응을 위해 주형으로서 PCR 생성물의 제 1 세트를 사용함으로써 PCR 생성물의 제 2 세트를 생성시키는 단계로서, 제 2의 5' PCR 프라이머가 길이가 15개 내지 30개 누클레오티드이고, 프라이머의 상보성이 "x"+1과 동등한 누클레오티드의 수로 cRNA의 삽입체 특이적 누클레오티드로 교차 신장되는 방식으로 5' 플랭킹 벡터 서열에 대해 상보적이고, 제 2의 5' PCR 프라이머 중 또 다른 하나가 제 2 시리즈의 서브푸울의 상이한 서브푸울에서 사용되고, 서브푸울의 제 1 세트내의 각각의 서브푸울에 대해 제 2 시리즈의 서브푸울에 4X서브푸울이 존재하는 단계;
    (j) PCR 생성물의 제 2 세트를 분석하여 mRNA 집단에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 서열 특이적 생성물의 디스플레이를 생성시키는 단계;
    (k) 샘플에 존재하는 mRNA의 3' 단부를 나타내는 밴드가 디스플레이된 일렉트로페로그램으로부터 mRNA에 상응하는 하나 이상의 cDNA를 용리시키는 단계;
    (l) 용리된 cDNA를 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시키는 단계;
    (m) 증폭된 cDNA를 플라스미드내로 클로닝시키는 단계;
    (n) 클로닝된 DNA에 상응하는 DNA를 플라스미드로부터 생성시키는 단계;
    (o) 클로닝된 cDNA의 서열을 결정하는 단계;
    (p) 누클레오티드 서열의 데이터베이스로부터 상응하는 누클레오티드 서열을 결정하는 단계로서, 상응하는 누클레오티드 서열이 제 2 엔도누클레아제에 대한 최원위 인식 부위 및 폴리(A) 테일의 개시점에 의해 경계지워지는 단계; 및
    (q) 클로닝된 cDNA의 서열을 상응하는 누클레오티드 서열과 비교하여 샘플에 존재하는 mRNA 분자의 3' 단부의 서열과 서열의 데이터베이스 사이의 서열 동일성과 유사성을 인식하는 단계를 포함하여, 샘플에 존재하는 mRNA 분자의 3' 단부의 서열과 서열의 데이터베이스 사이의 서열 동일성과 유사성을 인식하는 방법.
  76. 제 76항에 있어서,
    (r) PCR 생성물의 길이와 양을 2차원 그래픽 디스플레이로 비교하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  77. 제 76항에 있어서,
    (s) 데이터베이스로부터 결정된 상응하는 누클레오티드 서열의 길이, 벡터서열에 하이브리드화될 수 있는 5' PCR 서열의 길이, 남아있는 앵커 프라이머 서열의 길이, 벡터 서열의 개재 절편 및 벡터 서열에 하이브리드화될 수 있는 3' PCR 서열의 길이의 합과 동등한 상응하는 누클레오티드 서열의 예상 길이를 결정하는 단계; 및
    (t) PCR 생성물의 길이를 상응하는 누클레오티드 서열의 결정된 예상 길이와 비교하는 단계로서, 상응하는 누클레오티드 서열의 예상 길이가 그래픽 기호 또는 텍스트 문자를 사용함으로써 2차원 그래픽 디스플레이로 나타나는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  78. 샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편을 용리시키는 단계;
    용리된 cDNA 단편을 중합효소 연쇄 반응으로 증폭시켜서 증폭된 cDNA 단편을 생성시키는 단계;
    증폭된 cDNA 단편을 플라스미드내로 클로닝시키는 단계;
    클로닝된 cDNA 단편에 상응하는 DNA 분자를 생성시키는 단계;
    생성된 DNA 분자를 시퀀싱하여 용리된 cDNA 단편의 서열을 결정하는 단계; 및
    용리된 cDNA 단편의 서열을 데이터베이스의 서열과 비교하여 서열 동일성과 유사성을 인식하는 단계를 포함하여, 샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편의 서열과 서열의 데이터베이스 사이의 서열 동일성과 유사성을 인식하는 방법.
  79. 제 78항에 있어서, 용리된 cDNA 단편의 서열을 데이터베이스의 서열과 비교하는 단계가 컴퓨터를 사용하여 수행됨을 특징으로 하는 방법.
  80. 제 78항에 있어서, 비교 결과를 그래픽적으로 디스플레이시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  81. 샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편을 용리시키는 단계로서, cDNA 단편이 mRNA 분자의 제한 엔도누클레아제 인식 부위와 폴리(A) 테일의 위치에 의해 결정되는 길이를 지니는 단계;
    제한 엔도누클레아제 인식 부위의 서열에 상응하는 5' PCR 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응을 수행함으로써 cDNA 단편의 부분 서열을 결정하는 단계 및
    용리된 cDNA 단편의 결정된 부분 서열과 cDNA 단편의 길이를 데이터베이스의 서열과 비교하여 서열 동일성과 유사성을 인식하는 단계를 포함하여, 샘플에 존재하는 mRNA 분자에 상응하는 cDNA 단편의 서열과 서열의 데이터베이스 사이의 서열 동일성과 유사성을 인식하는 방법.
  82. 폴리누클레오티드 서열 데이터베이스 엔트리로부터 원서열(source sequence)을 선택하는 단계;
    원서열내에서 폴리(A) 테일 서열의 위치를 알아내는 단계;
    제 1 인식 부위에 가장 근접한 원서열내의 엔도누클레아제 인식 부위 서열의 위치를 알아내는 단계;
    엔도누클레아제 인식 부위에 인접해 있는 약 2개 내지 약 6개 누클레오티드로 구성된 인덱스 서열을 결정하는 단계;
    원서열내에서 상관(correlate) 서열을 결정하는 단계로서, 상관 서열이 폴리(A) 테일과 엔도누클레아제 인식 부위에 의해 경계지워진 서열을 포함하고 엔도누클레아제 인식 부위의 일부 또는 전부를 포함하는 단계;
    상관 서열의 길이를 결정하는 단계; 및
    폴리(A) 테일의 위치와 서열, 엔도누클레아제 인식 부위의 위치와 서열, 및 원서열에 대한 상관 서열의 길이에 관한 정보를 저장하여 변환된 데이터베이스 엔트리를 생성시키는 단계를 포함하여, 변환된 폴리누클레오티드 서열 데이터베이스 엔트리를 생성시키는 방법.
  83. 제 82항에 있어서,
    인덱스 서열에 대한 상관 서열의 길이를 그래픽적으로 디스플레이하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
  84. 제 83항에 있어서, 제한 엔도누클레아제가 MspI, TaqI 및 HinPII로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  85. 각각의 cRNA 분자가 삽입체 서열과 벡터 유래된 서열을 포함하는 cRNA 집단의 샘플을 선택하는 단계;
    벡터 유래된 서열에 하이브리드화하고 약 5개의 누클레오티드 내지 약 6개의 누클레오티드를 삽입체 서열내로 신장시켜서 cDNA 역전사 생성물을 생성시키는 역전사 프라이머를 사용하여 역전사를 수행하는 단계;
    cDNA 역전사 생성물을 세분시키는 단계;
    세분된 cDNA 역전사 생성물, 3' PCR 프라이머 및 벡터 유래된 서열에 하이브리드화하고 약 7개 누클레오티드 내지 약 9개 누클레오티드를 삽입체 서열로 신장시켜서 PCR 생성물을 생성시키는 5' PCR 프라이머를 사용하여 1회 이상의 중합효소 연쇄 반응을 수행하여 표적화되지 않은 cDNA의 증폭으로 인한 백그라운드를 감소시키는 단계를 포함하여, 표적화되지 않은 cDNA의 증폭으로 인한 백그라운드를 감소시킴으로써 PCR 생성물의 길이와 양을 분석하는 방법.
  86. 제 85항에 있어서, 역전사 반응의 16개 푸울이 존재하고, 16개의 상이한 역전사 프라이머가 존재함을 특징으로 하는 방법.
  87. 제 86항에 있어서, 중합효소 연쇄 반응의 4x서브푸울이 존재하고, 여기서, X는 5' PCR 프라이머가 삽입체 서열로 신장시키는 누클레오티드의 수 및 역전사 프라이머가 삽입체 서열로 신장시키는 누클레오티드의 수 사이의 차임을 특징으로 하는 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6110680A (en) * 1993-11-12 2000-08-29 The Scripps Research Institute Method for simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and measurement of relative concentrations
US6096503A (en) * 1993-11-12 2000-08-01 The Scripps Research Institute Method for simultaneous identification of differentially expresses mRNAs and measurement of relative concentrations
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US20030215839A1 (en) * 2002-01-29 2003-11-20 Peter Lonnerberg Methods and means for identification of gene features
US9353405B2 (en) 2002-03-12 2016-05-31 Enzo Life Sciences, Inc. Optimized real time nucleic acid detection processes
WO2003105761A2 (en) * 2002-06-12 2003-12-24 Research Development Foundation Immunotoxin as a therapeutic agent and uses thereof
CN101538606B (zh) * 2009-02-19 2012-03-21 上海浩源生物科技有限公司 检测一种或多种靶核酸的方法及其试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0592626B1 (en) * 1992-03-11 2003-01-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. METHODS TO CLONE mRNA
US5459037A (en) * 1993-11-12 1995-10-17 The Scripps Research Institute Method for simultaneous identification of differentially expressed mRNAs and measurement of relative concentrations
AU2264197A (en) * 1996-02-09 1997-08-28 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Restriction display (rd-pcr) of differentially expressed mrnas

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