KR100697245B1

KR100697245B1 - 중금속 유도성 프로모터와 이의 생물공학적 활용

Info

Publication number: KR100697245B1
Application number: KR1020060028086A
Authority: KR
Inventors: 강현아; 박정남; 손민정; 허주형; 오두병; 정봉현
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2005-03-28
Filing date: 2006-03-28
Publication date: 2007-03-21
Also published as: KR20060104939A

Abstract

본 발명은 중금속에 선택적으로 유도되는 프로모터를 개발하고 이를 생물 공학적으로 활용하는 방법에 관한 것이다.

중금속, 중금속 유도성 프로모터, 카드뮴, 효모, 한세눌라 폴리모르파, 사카로마이세스 세레비지애, 바이오센서

Description

중금속 유도성 프로모터와 이의 생물공학적 활용{Heavy metal-inducible promoter and its biotechnological applications}

도 1은 카드뮴에 노출된 한세눌라 폴리모르파의 DNA 마이크로어레이 분석으로부터 얻은 K-mean 클러스터링 결과 그림이다.

도 2는 효모 한세눌라 폴리모르파를 카드뮴에 노출시켰을 때 발현이 증가하는 유전자들을 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 발현량을 확인한 결과이다. KH-2621;HpAct (internal control), KH-4342;HpHSP12, KH-3501;HpSEO1, KH-0629;HpFEN2, KH-1311;HpADH.

도 3은 카드뮴에 의하여 유도되는 유전자들의 프로모터들을 확보하고 이를 이용하여 한세눌라 폴리모르파 균주에서 재조합 포도당 산화효소와 녹색형광단백질을 발현하도록 구성한 형질전환용 발현벡터 그림이다. (A)는 PCR을 이용한 프로모터 단편 확보 (P _HSP12 , P _FEN2 , P _SEO1 )이고, (B)는 포도당 산화효소 발현벡터들이며, (C)는 녹색형광단백질 발현벡터들이다.

도 4는 카드뮴이 존재하지 않은 배지 (A)와 존재하는 배지 (B)에서 형질전환된 한세눌라 폴리모르파의 카드뮴 유도성 프로모터에 의하여 발현된 재조합 포도당 산화효소의 활성을 비교하여 나타낸 그림이다. 1은 한세눌라 폴리모르파 야생형 균주, 2는 pHpHSP12p-GOD 발현벡터로 형질전환된 균주, 3은 pHpFEN2p-GOD 발현벡터로 형질전환된 균주, 4는 pHpSEO1p-GOD 발현벡터로 형질전환된 균주이다.

도 5는 형질전환된 한세눌라 폴리모르파에서 카드뮴 유도성 프로모터에 의하여 발현된 재조합 녹색형광단백질의 형광 활성을 공촛점 현미경(confocal microscopy)으로 관찰한 결과이다. (A)는 pHpHSP12p-yEGFPm 발현벡터로 형질전환된 균주, (B)는 pHpFEN2p-yEGFPm 발현벡터로 형질전환된 균주, (C)는 pHpSEO1p-yEGFPm 발현벡터로 형질전환된 균주이다.

도 6은 형질전환된 한세눌라 폴리모르파에서 카드뮴 유도성 프로모터들에 의하여 발현된 재조합 녹색형광단백질의 형광 활성을 형광광도계로 측정한 결과이다.

도 7은 pHpSEO1p-yEGFPm 발현벡터가 도입된 형질전환주의 여러 중금속 이온들(비소(As), 카드뮴(Cd), 구리(Cu), 크롬(Cr), 수은(Hg), 철(Fe), 니켈(Ni), 납(Pb), 아연(Zn))에 대한 반응성(A)과 중금속 농도에 따른 반응성(B)을 조사한 결과이다.

도 8은 HpSEO1 프로모터의 구조분석 결과를 나타낸 것으로, (A)는 GFP를 발현하는 프로모터 단편 크기와 이들의 활성을 조사한 결과이며, (B)는 프로모터 내 여러 조절인자의 결합 위치를 프로모터 분석프로그램으로 조사한 결과이다.

도 9는 사카로마이세스 세레비지애에서 녹색형광단백질을 발현하도록 제작된 사카로마이세스 세레비지애의 SEO1 프로모터가 도입된 형질전환용 발현벡터 그림이다. (A)는 PCR을 이용한 프로모터 단편 확보를 나타낸 그림이고, (B)는 프로모터의 구조 분석 결과이며, (C)는 사카로마이세스 세레비지애의 SEO1 프로모터가 도입된 형질전환용 발현벡터(pScSEO1p-GFP)이다.

도 10은 pScSEO1p-GFP 발현벡터가 도입된 사카로마이세스 세레비지애 형질전환주의 여러 중금속 이온들(비소(As), 카드뮴(Cd), 크롬(Cr), 구리(Cu), 철(Fe), 수은(Hg), 니켈(Ni), 납(Pb), 아연(Zn))에 대한 반응성(A)과 중금속 농도에 따른 반응성(B)을 조사한 결과이다.

도 11은 중금속 유도성 프로모터에 의한 GFP 발현 형질전환주를 이용한 카드뮴 검출용 세포체 기반 바이오센서의 감응실험 결과이다. (A)는 세포체 기반 바이오센서의 카드뮴 노출시간에 대한 감응성능 분석 그림이며, (B)는 노출되는 카드뮴 농도에 따른 세포체 기반 바이오센서의 감응을 나타낸 그림이다(control, 한세눌라 폴리모르파 야생형균주가 고정화된 바이오센서; object, 카드뮴 유도성 프로모터에 의한 GFP 발현 형질전환주가 고정화된 바이오센서).

중금속은 인간의 건강에 해로운 주된 환경 위험물질이다. 특히, 카드 뮴(Cd²⁺)은 인체 신경계에 심한 손상을 일으키거나, 높은 빈도로 염색체 이상, 그리고 신장 독성 등의 증상을 나타내는 "이타이이타이" 병을 유발시키는 원인으로 알려져 있다. 카드뮴은 낮은 농도에서도 인체에 매우 해로우며 암을 유발시킬 가능성이 높고 세포에 지질 과산화반응(Manca et al., Toxicology, 67, 303-323, (1991)), 유비퀴틴/아데노신 삼인산 의존성 단백질 가수분해 경로(Figueiredo-Pereira et al., J. Biol. Chem., 273, 12703-12709, (1998)) 및 스트레스 단백질의 발현 유도(Timblin et al., Free Radic. Biol. Med., 24, 632-642, (1998)) 등의 생리 변화를 일으키는 것으로 보고되었다. 이와 같이 독성을 지닌 중금속에 노출되면 생명체들은 이를 극복하기 위한 저항 기전을 작동하는데, 여기에는 (a) 세포막에 의한 중금속의 배제, (b) 능동수송을 통한 세포내 중금속 축적 방지, (c) 중금속의 세포내 격리, (d) 세포외부에서의 중금속 흡착을 통한 중금속의 세포내 유입 방지, (e) 세포내 중금속의 화학적 변성을 통한 독성 감소 등이 알려져 있다(Rouch et al., J. Ind. Microbiol., 14, 132-141, (1995); Silver, Plasmid, 27, 1-3, (1992)). 따라서 독성물질로 인한 인체 및 자연환경의 오염을 측정 및 분석하고 치료 및 청정화하기 위하여 세포의 저항기전을 응용하고자하는 연구에 대한 관심이 높아지고 있다. 최근에는 독성 물질에 대하여 선택적인 반응을 나타내는 유전자를 유전공학적 기술로 조작함으로써 독성물질을 탐지할 수 있는 유전자 재조합 균주와 이를 활용하여 특이성과 감도가 뛰어난 세포체 기반 바이오센서(whole cell-based biosensor)를 개발하고자 하는 연구가 활발히 수행되고 있다.

바이오센서란 생물학적 구성요소(biological material)와 변환기(transducer)를 결합시켜 다양한 환경 내에 있는 물질들을 저 농도에서도 빠르고 정확하게 감지할 수 있는 분석기술이다. 바이오센서는 측정된 신호의 변환 방법에 따라 크게 전기화학적 방법과 광학적 방법으로 구분하는데, 생물학적 및 환경적 응용성과 선택성, 편리성 그리고 측정 감도 등의 관점에서 발광이나 형광을 응용하도록 고안된 광학적 방법이 선호되고 있다. 이에 따라서 측정하고자 하는 목적물에 선택적으로 유도될 수 있는 특정 프로모터를 이용하여 형광단백질을 발현함으로서 형광광도를 측정하는 연구가 활발히 진행되고 있다.(Hollis et al., Appl. Environ. Microbiol., 66, 1676-1679, (2000); Hakkila et al., Anal. Biochem., 301, 235-242 (2002); Shimshon, Curr. Opin. Microbiol., 6, 206-212, (2003)). 대부분의 경우, 숙주 균주로 원핵생물인 박테리아를 이용한 세포체 기반 바이오센서를 개발하고 있는데, 박테리아는 검출 환경에 매우 민감하게 반응하는 반면 짧은 반감기로 인한 안정된 데이터 수득이 용이하지 않으며, 진핵생물과는 다른 세포내 반응기전들을 갖기 때문에 고등 진핵생물에 대한 약제 검출과 독성 평가 등에는 이용이 제한적이다. 이에 반하여, 효모는 진핵생물이면서 단세포이기 때문에 비교적 유전적 조작이 용이하면서 원핵세포의 단점들을 해결할 수 있으므로 최근에 세포체 기반 바이오센서 개발에 적절한 숙주로 높은 관심을 받고 있다(Baronian, Biosens. Bioelectron., 19, 953-962, (2003); Lehmann et al., Biosens. Bioelectron., 15, 211-219, (2000)). 효모의 경우 전통 효모인 사카로마이세스 세레비지 애(Saccharomyces cerevisiae)를 이용한 DNA microarray 분석 기법을 활용하여 중금속 처리 후 발현이 증폭되는 유전자 발굴에 관한 연구가 보고되었다(Momose and Iwahashi, Environ. Toxi. Chem., 20, 2353-2360, (2001)). 이 연구에서 카드뮴 처리후 중금속 비독성화(detoxification)에 관련되는 GSH1 유전자(글루타치온 합성 관련), MET14와 MET17 유전자(황 및 아미노산 대사 관련)들의 발현이 현저하게 증가됨을 보고하였는데, 이들 유전자들은 중금속들과 스트레스 등에 복합적으로 영향을 받는 것으로 나타났으며 카드뮴 특이적 발현 유도 유전자는 선별하지 못하였다.

메탄올을 에너지 및 탄소원으로 이용할 수 있는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha)를 비롯한 메탄올 자화 효모들이 메탄올대사, 질산염 동화, 열과 중금속 그리고 산화적 스트레스에 대한 높은 저항성 등의 다양한 세포내 대사과정들로 인하여 이를 이용한 환경친화적 청정 생물공정기술(Clean Bioprocessing Technology) 개발에 이용하려는 연구가 활발하게 시도되고 있다(Reinders et al., J. Bacteriol., 181, 4665-4668, (1999); Mannazzu et al., Biochem. Biophys. Acta., 1475, 151-156, (2000)). 특히 한세눌라 폴리모르파를 생체원소(bioelement)로 이용하여 알코올 측정과 개미산 측정을 위한 바이오센서가 개발되었다(Gonchar et al., Biosens. Bioelectron., 13, 945-952, (1998);Korpin et al., Biosens. Bioelectron., 15, 77-83, (2000)). 그러나 사카로마이세스 세레비지애의 경우처럼 한세눌라 폴리모르파를 대상으로 중금속 처리에 의한 유전체 발현 양상의 변화 분석에 대한 연구와 중금속 특이적 프로모터들을 이용한 중금속 감지용 바이오센서나 세포체 기반 바이오센서에 대한 연구는 아직까지 보고 된 바가 없다.

본 발명의 목적은 중금속 유도성 프로모터를 제공하고, 이를 포함하는 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 중금속 물질에 대해 고민감도 및 높은 광학적, 전기화학적 또는 생화학적 발현을 갖는 바이오센서를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 바이오센서를 이용하여 중금속 물질을 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 중금속 유도성 프로모터에 관한 것이다.

보다 바람직한 양태로서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 501 내지 1001번의 연속 염기서열을 포함하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 단편인 뉴클레오티드 서열; 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중금속 유도성 프로모터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "프로모터"는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명과 관련한 프로모터는 메탄올 자화 효모인 한세눌라 폴리모르파의 게놈정보를 토대로 한세눌라 폴리모르파 게놈 시퀀스 정보의 42번 콘티그(contig)의 ORF 108의 구조 유전자와 그 상위 1,000 bp에 해당하는 염기서열을 클로닝하여 획득하였다. 본 발명과 관련한 서열번호 1의 뉴클레오티드는 GeneBank에 승인번호 AY792972로 기탁되었다. 또한 본 발명의 프로모터는 서열번호 1의 뉴클레오티드 단편으로서 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 501 내지 1001번의 연속 염기서열을 포함하는 것이 바람직하며, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 또한 본 발명의 프로모터는 사카로마이세스 세레비지애 SEO1 구성 유전자 상위의 비해독 핵산 절편에서 유래된 서열번호 15의 뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명의 프로모터를 코딩하는 서열은 일정 정도 변형이 가능하다. 본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 염기서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에서 용어, "상동성"이란 천연형(wild type)의 핵산 서열과의 동일한 정도를 나타내는 것으로 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램 을 이용하여 2개 이상의 서열간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 본 발명의 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 프로모터 영역을 코딩하는 핵산 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상 동일한 핵산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명의 프로모터는 프로모터 활성을 보유하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이된 프로모터 핵산 서열을 갖는 변이체를 포함한다. 프로모터 핵산 서열은 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도할 수 있다. 이러한 서열 변이를 통하여 천연 프로모터와 동일한 활성을 나타낼 수도 있으나, 바람직하게는 활성이 증가된 프로모터, 유도제에 대한 특이성이 증가된 프로모터 등 목적에 적합하게 프로모터의 기능을 개선시킬 수 있다.

상기 모든 범주의 프로모터를 코딩하는 핵산 분자는 목적 유전자의 발현을 유도하는 발현 벡터의 프로모터 성분으로 제공되고, 상기 프로모터를 이용한 다양한 벡터의 변형은 본 발명의 범주에 포함된다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 중금속 유도성 프로모터를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 유전자가 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 프로모터가 중금속 유도성 프로모터인 벡터로서, 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 벡터는 숙주세포의 게놈내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된(operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 중금속 유도성 발현조절 서열과 목적하는 유전자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 "조절 요소"란 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나 이에 영향을 미치는 비해독화된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현벡터는 조절 요소로 중금속 유도성 프로모터를 필수적으로 포함하고, 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열, 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다.

폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호서열에는 숙주가 에쉐리키아속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, α-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 벡터는 복제가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점(replication origin)을 포함할 수 있다.

또한, 벡터는 선택마커(selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다. 효모에서 대표적으로 사용되는 선택마커에는 앰피실린, 테트라사이틀린에 각각 내성인 β-락타메이즈 유전자와 테트라사이클린 내성 유전자가 있다. 또한 효모의 ura3 -52, his3 -Δ1, leu2 -Δ1, trp1-Δ1, lys2 -201 등의 영양요구성 균주에서 사용될 수 있는 URA2, HIS3, LEU2, TRP1 또는 LYS2 같은 마커들을 포함할 수 있다.

상기 벡터로 목적 단백질을 코딩하는 핵산서열이 프로모터 하위에 인 플레임(in flame)으로 삽입되어 발현된다. 상기 벡터로 삽입 가능한 목적 단백질은 특별히 제한되지 않으나, 의학, 산업적으로 유용한 목적 단백질에는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등이 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

상기 벡터로 형질전환 가능한 숙주세포로는 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Strptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa) 등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 바람 직하게는 효모, 그 중에서도 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 한세눌라 속(Hansenula) 속, 피키아(Pichia) 속 또는 칸디다(Candida) 속의 효모를 숙주세포로 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환된 숙주세포를 포함하는 중금속 화합물을 탐지하기 위한 바이오센서에 관한 것이다.

본 발명의 바이오센서는 중금속 또는 중금속 화합물을 탐지하기 위한 것으로, 상기 중금속은 예를 들어, 카드뮴, 비소, 수은 등을 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 바이오센서를 중금속에 노출시키고, 중금속 유도성 프로모터의 작동에 의한 재조합 단백질의 광학적, 전기화학적 또는 생화학적 발현 정도를 측정하는 것을 포함하는 중금속을 탐지하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 바이오센서를 이용하여 중금속을 탐지하는 방법은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 적절히 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 서열번호 1의 핵산분자 서열을 가진 프로모터로 형질전환된 효모를 사용하는 경우에는, 바이오센서 세포와 접촉시키는 장치 및 세포의 광출력을 측정하는 장치를 사용하여 중금속을 측정할 수 있다. 모든 알려진 공측정 장치를 모두 본 발명의 탐지방법에 사용할 수 있으며, 예를 들면 광전자증배기(photomultipliers), 전하결합 장치(charge coupled devices), 발광측정기(luminometers), 광측정기(photometers), 광섬유케이블 또는 액체섬광 카운터(liquid scintillation counter) 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐, 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예에만 한정된 것은 아니다.

실시예 1 : DNA 마이크로어레이를 활용한 카드뮴 특이성을 갖는 신규 유전자 발굴

한세눌라 폴리모르파 DNA 마이크로어레이 분석을 위하여 한세눌라 폴리모르파 CBS 4732(Ramezani-Rad et al., FEMS Yeast Res., 4, 207(2003))의 데이터베이스에서 5,623개의 ORF와 229개의 콘티그에 해당하는 염기서열로부터 4,741개의 ORF를 선별하였다. ORF의 선별시 유전자들의 중복 시퀀스로 인한 오류를 방지하기 위하여 우선적으로 상호 중복되지 않는 ORF를 선별하였으며, 중복되는 것들에 대하여는 가장 짧은 크기의 ORF를 대표 ORF로 선정하였다. 또한 콘티그상에서 시퀀스가 중복되어 있어도 번역 방향이 다를 경우에는 서로 다른 ORF로 분류하여 선별하였으며 이들을 PCR로 증폭하기 위하여 각각의 ORF에 대한 고유 프라이머를 제작하였다. 고유 프라이머는 EMBOSS(The European Molecular Biology Open Software Suite; /EMBOSS/)의 프라이머 디자인 도구인 eprimer3을 사용하여 제작하였으며, PCR로 증 폭된 결과물의 크기가 200bp내지 700bp를 넘지 않도록 디자인하였다. 일차적으로 디자인된 고유 프라이머 세트는 콘티그 시퀀스와 비교하여 한세눌라 폴리모르파 유전체상에서 고유 ORF만 증폭되도록 검증하였고, 최종 총 4,741쌍의 고유 프라이머 세트를 제작하였다. 각각의 프라이머 길이는 18 mer이며 전방 프라이머(forward primer)에는 5-aminolink를 갖도록 구성하여 마이크로어레이 배열시 방향성을 갖도록 하였다. 한세눌라 폴리모르파 cDNA 마이크로어레이를 제작하기 위한 전체 유전자들은 한세눌라 폴리모르파 A16 야생형 균주의 유전체 DNA를 Holm 등(Holm et al., Gene, 42, 169-173(1986))의 방법에 따라서 획득하여 위에서 준비한 프라이머들을 이용한 96-웰 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)(반응부피 100 ㎕; 5㎍의 염색체 DNA, 100 pmole의 프라이머, 50 ㎕의 2X Premix Taq DNA polymerase)로 얻었다. 이로부터 얻은 PCR 반응물은 96 UF PCR 정제 플레이트(QIAGEN, USA)로 분리 정제하여 완충용액에 0.65㎍/㎕의 농도로 농축하고 384-웰에 옮겨 ProSys5510 Microarrayer(Cartesian Technologies, Irvine, CA, USA)를 이용하여 슈퍼 알데히드 슬라이드 글라스(super-aldehyde slide glass, CEL associates, Houston, TX, USA)위에 스포팅하고 붕산화나트륨(sodium borohydride) 수용액으로 세정하여 한세눌라 폴리모르파 마이크로어레이 슬라이드를 완성하였다.

마이크로어레이를 통하여 한세눌라 폴리모르파의 유전자 발현 특성을 검토하기 위하여 한세눌라 폴리모르파 세포를 원심분리하여 취한 후 Hot phenol 방법(Elion and Warner, Cell, 39, 663-673 (1984))으로 전체 mRNA를 얻었다.

이들 mRNA는 3DNA^TM Submicro EX Expression Array Detection Kit(Genisphere, Hatfield, PA, USA)를 사용하여 간접 표지하였다. 전체 RNA 50 ㎍에 역전사용 프라이머를 첨가하고 80℃에서 가열 냉각 후 역전사 반응용 완충용액, dNTP , 역전사 효소 혼합물을 첨가하였다. 역전사 반응은 42℃에서 2시간동안 수행하였으며 0.5 M의 NaOH와 50 mM EDTA 혼합액을 첨가하여 반응을 정지시키고 65℃에서 20분간 열처리하여 DNA/RNA 혼성물을 변성시켰고, 1 M Tris-HCl을 첨가하여 반응을 중화시켰다. 위의 반응액을 Minelute PCR 정제키트(QIAGEN, USA)로 분리 농축하였다. 이로부터 얻어진 cDNA에 혼성화 완충용액, DNA dT blocker, BSA를 첨가하여 80℃에서 10분, 50℃에서 20분 동안 반응시켰다. 예열된 마이크로어레이 슬라이드에 결과물을 도입하여 커버 슬라이드를 덮은 후, 45℃에서 16 내지 18시간 동안 암반응시켰다. 반응 후 슬라이드는 2X SSC(sodium chloride/sodium citrate)/0.1% SDS(sodium dodecyl sylfate) 완충용액, 2X SSC 완충용액, 0.2X SSC 완충용액, HPLC용 정제수를 사용하여 순차적으로 세정하고 원심분리하여 완전히 건조시켰다. 그리고 혼성화 완충용액, Cy3와 Cy5, High-End differential Enhancer 및 증류수를 첨가하여 혼합물을 만들고 80℃에서 10분, 50℃에서 20분 동안 반응시켰다. 위와 동일한 방법으로 슬라이드에 도입하고 50℃에서 6시간 동안 암반응시켰으며 세정 건조하였다.

혼성화 반응으로부터 발색된 슬라이드는 ScanArray 5000(Gsi Lumonics, Kanata, OT, USA)으로 스캐닝한 다음, GenePix^TM Pro 4.0(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)와 S-PLUS 프로그램(Insightful, Seattle, WA, USA)을 사용하여 분석하여 얻은 결과를 정규화(normalization) 하였으며(Stare et al., Computer Methods Programs Biomed., 64, 45-62(2001)), 배양조건에 따른 유전자의 발현 변화가 2배 이상을 나타내는 결과를 취하여 검토하였다. 데이터 클러스터링은 Cluster 프로그램(Eisen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 95, 14863-14868(1998))을 사용하였으며 TreeView 프로그램(http://rana.lbl.gov.EisenSoftware.htm)을 사용하여 도식적으로 평가하였다.

한세눌라 폴리모르파에서 카드뮴에 특이적으로 유도되는 유전자를 선별하기 위하여 다음과 같이 전사체 분석 실험을 수행하였다. 한세눌라 폴리모르파 NCYC495(leu-) 균주를 50 mL YPD(1% yeast extract, 2% peptone, 2% glucose)배지에서 세포농도(OD₆₀₀)가 0.3(~1×10⁷ cells/mL)까지 37℃, 170rpm으로 배양한 후, 황산카드뮴 수용액(CdSO₄)을 300 uM 첨가하여 15분, 30분, 60분, 그리고 120분마다 시료를 취하였다. 카드뮴에 노출된 효모세포를 취하여 원심분리한 후, 전체 RNA를 추출하여 위에서 설명한 방법에 따라서 형광표지하였고 앞서 준비한 마이크로어레이와 혼성화 반응을 수행하여 분석하였다. 표 1에 카드뮴 처리 후 fold change가 4 이상인 유전자들을 선별하여 발현율의 증가순으로 나타내었다.

카드뮴에 노출된 한세눌라 폴리모르파 효모에서 발현이 4배 이상 증가한 유전자들

Gene ID	Description	Fold change
KH-3233	사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)의 설폰닛/알파-케토글루타레이트 디옥시게나제(sulfonate/alpha- ketoglutarate dioxygenase)와 높은 유사성	19.6
KH-4342	사카로마이세스 세레비지애의 열충격단백질(heat shock protein) HSP12/YFL014W와 높은 유사성	14.9
KH-0629	사카로마이세스 세레비지애의 원형질막 H+-판토테네이트 심포터(H⁺-pantothenate symporter) FEN2/YCR028C와 높은 유사성	10.1
KH-2241	사카로마이세스 세레비지애의 티오레독신 페록시다제 YBL064C(thioredoxin peroxidase YBL064C)와 유사성	9.6
KH-1311	사카로마이세스 세레비지애의 알코올 디히드로게나제 PA5427(alcohol dehydrogenase PA5427)와 유사성	9.2
KH-3501	사카로마이세스 세레비지애의 설폭시드 에티오닌 저항 SE01/YAL067C(sulfoxide ethionine resistance SEO1/YAL067C)의 억제자와 높은 유사성	6.9
KH-3615	사카로마이세스 세레비재애의 단백질과 같은 식물 히드로플라보놀-4-리덕타제(plant hydroflavonol-4-reductase)와 높은 유사성	4.9

실시예 2 : 역전사 중합효소 연쇄반응을 통한 카드뮴 유도발현 검증 및 유전자 선별

상기 실시예 1에서 카드뮴 처리 후 발현이 2 배 이상 증폭된 유전자들에 대해 카드뮴 노출 시간에 따른 유전자 발현 패턴별로 구분하여 K-mean 클러스터링한 결과, 12개의 클러스터로 구분되었다. 도 1에 나타낸 바와 같이 이들 중 카드뮴 노출 초기에 발현이 높은 후보 유전자 A군(도 1의 클러스터 3과 5: KH-3233, KH-2241, KH-3615)과 카드뮴 노출 시 초기 유전자발현은 클러스터 3과 5보다 상대적으로 높지 않으나 발현이 지속적으로 증가하여 최고 120분에서의 발현율이 최대를 나타내는 후보 유전자 B군(도1의 클러스터 1: KH-4342, KH-0629, KH-3501, KH-1311)으로 구분하여 비교 실험하였다.

이들의 후보 유전자군들 중에서 유전자 A군 모두와 유전자 B군의 KH-1311 유전자는 카드뮴 특이성에 대한 기초 실험의 결과에서 카드뮴뿐만 아니라 여러 중금속 및 스트레스성 인자에 대하여 비선택적으로 발현되었기 때문에 카드뮴 특이적 유전자 선별에서 제외하였다. 이에 반하여 KH-1311 유전자를 제외한 후보 유전자 B군은 대체적으로 카드뮴에 선택성이 있는 것으로 예비 평가 되었으며, 이들 선별된 유전자들의 발현율을 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 통하여 정량적으로 상호 비교검토 하였다. 황산카드뮴 수용액에 2시간 노출시킨 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주로부터 전체 RNA를 추출하고, oligo dT를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 RT-PCR(94℃ 30초, 55℃ 30초, 72℃ 1분 30초)을 20회 수행하고 PCR 산물을 전기영동하여 분석하였다. 도 2의 RT-PCR 결과에서 나타낸 바와 같이 카드뮴 노출 전 과 노출 후 유전자 발현 선택성이 높은 것을 알 수 있었다.

실시예 3 : 카드뮴 유도성 신규 프로모터 획득

상기 실시예 2에서 선별한 3종의 유전자들[KH-4342(HpHSP12), KH-0629(HpFEN2), KH-3501(HpSEO1)]의 프로모터에 해당하는 염기서열을 확보하기 위하여 한세눌라 폴리모르파 유전체 염기서열 정보로부터 HpHSP12 전방 프라이머(서열 5)와 HpHSP12 후방 프라이머(서열 6), HpFEN2 전방 프라이머(서열 7)와 HpFEN2 후방 프라이머(서열 8), 그리고 HpSEO1 전방 프라이머(서열 9)와 HpSEO1 후방 프라이머(서열 10)로 구성된 각각의 염기서열에 해당하는 3쌍의 프라이머를 제작하였다. 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주의 염색체 DNA를 주형으로 이들 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄반응하고 각각의 구성유전자 상위 약 1,000 bp 크기의 DNA 산물들을 얻었다(도 3의 (A)). 각각의 전방 및 후방 프라이머 말단에 BamHI과 HindIII 제한효소 인식부위 링커를 연결하여 발현벡터 구성 시 두 제한효소 인식부위에 삽입되도록 하였다.

실시예 4 : 포도당 산화효소 리포터 유전자를 활용한 카드뮴 유도성 프로모터의 발현 검토

PCR로부터 확보된 각각의 유전자들의 프로모터(P _HpHSP12 , P _HpFEN2 , P _HpSEO1 )활성을 조사하기 위하여 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 유래의 포도당 산화효소(glucose oxidase, GOD)를 이용하여 프로모터 발현 활성을 검토하였다. 메탄올 산화효소 프로모터에 의하여 발현되도록 제작된 플라스미드 pDLMOX-GOD(Kang et al., Glycobioligy, 14, 243-251 (2004))를 제한효소 BamHI과 H indIII로 절단하여 메탄올 산화효소(MOX) 프로모터 부위를 제거하고 앞서 획득한 각각의 프로모터를 삽입하여 3종의 GOD 리포터 발현벡터들(pHpHSP12p-GOD, pHpFEN2p-GOD 및 pHpSEO1p-GOD)을 만들었다(도 3의 (B)). 3종의 리포터 발현벡터들을 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주에 각각 형질전환하고 이로부터 얻은 재조합 균주들의 GOD 발현 활성을 검토하였다. 형질전환은 리튬-DMSO법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991))에 의하여 수행하였다. 형질전환된 재조합 균주는 류신(Leu) 영양요구성 선별을 통한 YNB 최소 평판배지 (Yeast Nitrogen Base without amino acid 0.67%, glucose 2%, -Leu DO supplement (BD Biosciences Clontech, USA) 0.069%)에서 계대 배양하여 안정화 과정을 수행하였으며 재조합 GOD를 발현하는 형질전환 균주를 선별하여 발현특성을 검토하였다.

GOD 활성은 강 등(Kang et al., Glycobioligy, 14, 243-251 (2004))의 방법에 따라서 평판배지상에서 효소활성으로 나타나는 환(halo)의 크기를 비교하여 결정하였다. 평판배지는 YPD 복합배지를 사용하였다. YPD 복합 액상배지에서 지수성장기까지 세포를 배양 후, 임의의 세포농도에 도달 시 600 uM의 카드뮴을 첨가하여 GOD 발현을 유도하였으며 세포농도(OD₆₀₀)가 1이 되도록 배양액을 취하여 GOD 활성 측정용 평판배지에 옮겨서 발색되는 환의 크기를 검토하였다. 발현용 벡터 제작과 이들의 형질전환 균주 제작에 사용된 일반적인 실험방법은 강 등(Kang et al., Biotechnol. Bioengineer., 76, 175-185(2001))의 방법에 준하여 수행하였다.

도 4의 (B)에 나타낸 바와 같이 카드뮴 농도가 증가함에 따라 3종의 프로모터에 의하여 GOD를 발현하는 형질전환주 주위에 환의 크기가 증가하는 것을 볼 수 있었으며, 카드뮴 처리 전(도 4의 (A))과 비교하여볼 때, P _HpHSP12 보다는 P _HpFEN2 와 P _HpSEO1 의 발현이 높은 것을 알 수 있었다.

실시예 5 : 녹색 형광 단백질 리포터 유전자를 활용한 카드뮴 유도성 프로모터의 발현 양상 검토

녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein, GFP)을 리포터 단백질로 사용하여 카드뮴 유도성 프로모터의 GFP 단백질의 발현을 검토하였다. GFP 발현용 벡터는 도 3(C)에 나타낸 바와 같이 제작하였다. GOD를 발현하도록 제작한 실시예 4의 발현벡터들을 제한효소 EcoRI과 HindIII로 절단하여 GOD 유전자를 제거하고 여기에 박과 최(Nok-Hyun Park and Wonja Choi, Yeast, 19, 1057-1066(2002))로부터 제공받은 pUC19/yEGFP3 플라스미드로부터 서열 11과 12의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 이로부터 제한효소 EcoRI과 HindIII 인식부위가 삽입된 GFP DNA 단편을 얻었으며, 이를 각각 발현벡터에 삽입하여 3종류의 카드뮴 유도성 GFP 발현용 벡터를 얻었고(pHpHSP12p-yEGFPm, pHpFEN2p-yEGFPm 및 pHpSEO1p-yEGFPm), 한세눌라 폴리모르파 NCYC495 균주에 도입하여 각각의 프로모터에 대한 재조합 GFP 발현 형질전환주를 얻었다. 상기 발현벡터 중에서 pHpSEO1p-yEGFPm 발현 벡터는 한국유전자은행(KCTC)에 KCTC 10712BP(DH5@/pHpSEO1p-yEGFPm)의 번호로 기탁하였다.

GFP의 발현 특성을 조사하기 위하여 선별된 형질전환 균주를 YPD 복합 액상배지에서 배양하면서 300 uM의 황산카드뮴 수용액을 첨가하여 재조합 GFP 발현을 유도하였으며, 재조합 GFP의 발현정도를 일정 세포농도를 기준으로 형광광도계(Spectrofluorophotometer, RF 5310PC, Shimadzu, Japan)를 사용하여 측정하였다. GFP의 형광측정을 위한 여기 흡광도 파장(excitation wavelength)은 488 nm이었고 방출 흡광도 파장(Emission wavelength)은 510 nm이었다. 또한, 형광 현미경을 이용한 발현을 검토하였다. 형광 현미경은 Carl Zeiss Confocal Laser scanning system (LSM 510 META, Carl Zeiss GmbH, Germany)을 이용하였으며, 여기 및 방출파장은 형광광도계 분석조건과 동일하였다.

도 5에 나타낸 바와 같이 카드뮴 처리 전에는 3종류의 프로모터 모두에서 재조합 GFP의 발현이 나타나지 않았으나, 카드뮴 처리 후에는 GFP의 발현이 정교하게 유도되는 것을 알 수 있었다.

3종의 카드뮴 유도성 프로모터들의 GFP 발현 활성을 정량적으로 비교하기 위하여 배양한 재조합 균주들을 300 uM 황산카드뮴 수용액에 2시간 동안 처리한 후에 배양세포를 취하여(OD₆₀₀=10) 발현된 재조합 GFP의 발현양을 형광 흡광광도계를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 6과 같이 P _HpSEO1 (KH-3501 유전자 프로모터)의 활성이 가장 높게 나타났으며, 카드뮴의 농도변화(100, 300, 그리고 600 uM)에 따라서 GFP 발현활성이 선형적으로 증가하는 것을 알 수 있었다.

실시예 6 : HpSEO1 프로모터 발현 특성 분석

상기의 결과에서 카드뮴 노출에 가장 높은 GFP 발현활성을 나타낸 P _HpSEO1 에 대하여 여러 중금속과의 반응성을 조사하였다. 함께 비교하기 위한 중금속 이온들로는 비소(As), 구리(Cu), 크롬(Cr), 수은(Hg), 철(Fe), 니켈(Ni), 납(Pb) 및 아연(Zn)을 선정하여 이들의 염화합물 수용액을 이용하였다. 일정세포농도(OD₆₀₀=0.3)로 배양한 한세눌라 폴리모르파 형질전환주에 대하여 각각의 중금속을 300 uM의 농도로 2시간 동안 처리하고 형질전환주를 원심분리한 후 세포(OD₆₀₀=1)를 취하여 발현된 GFP의 형광 세기를 비교하였다. 그 결과, 도 7의 (A)에 나타낸 바와 같이 P _HpSEO1 가 카드뮴과 비소에 대하여 높은 선택성을 갖는 것을 알 수 있었다. 또한, 다양한 중금속 농도에서의 반응성을 조사한 결과, 도 7의 (B)에 나타낸 바와 같이 P _HpSEO1 의 활성이 카드뮴의 경우에 농도에 따라서 점차 증가하는 반면, 비소의 경우 카드뮴에 비하여 상대적으로 낮은 농도에서 증가한 후 감소하는 것을 알 수 있었다.

상기의 결과들을 종합적으로 검토하면, P _HpSEO1 는 카드뮴과 비소에 높은 특이성을 보이는 프로모터로서 재조합 단백질 발현을 유도하므로, 본 발명에서 제공하는 P _HpSEO1 와 이에 의한 GFP를 비롯한 여러 재조합 단백질 발현 시스템은 중금속, 특히 카드뮴과 비소 검출용 세포체 기반 바이오센서 개발에 매우 유용한 것으로 평가된다.

실시예 7 : HpSEO1 프로모터의 구조분석

HpSEO1 프로모터(F0 단편(서열 1), 1,001 bp)와 이의 여러 단편들(F1 단편(서열 2), 751bp; F2 단편(서열 3), 501bp; F3 단편(서열 4), 251bp)을 리포터 유전자인 GFP 발현정도를 통해 각 단편들의 프로모터 활성과 형질전환주 염색체내에 삽입된 GFP 발현 카세트의 카피수를 함께 검토하여 프로모터 단편의 크기가 GFP의 발현에 미치는 영향을 조사하였다.

HpSEO1 프로모터의 F0, F1, F2, 및 F3 각각의 단편이 결합된 GFP 발현벡터로 형질전환된 한세눌라 폴리모르파 재조합 균주를 무작위로 선별하여 YPD 액상배지에서 37℃, 16시간동안 배양한 후 원심분리하여 세포를 얻고 카피수 검토를 위하여 염색체 DNA를 추출하였다. 추출한 염색체 DNA를 제한효소 SmaI으로 처리후 정제하였다. 본 발명의 발현벡터에서 획득한 HpLEU2 유전자의 약 1.2kb를 클레나우 중합효소(Klenow polymerase)로 반응하고 딕옥시제닌(digoxigenin, DIG, Boehrimger Mannheim GmbH, Germany)을 표지하여 DNA 프로브를 얻었다. 이를 앞서 제조한 염색체 DNA 단편들과 서던 혼성화 반응(southern hybridization)을 수행하여 카피수를 결정하였다. Anti-DIG은 알카리 인산화효소로 표지되었으며, BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)와 NBT (nitrobluetetrazolium) 기질을 사용하여 발색 및 정량하였다.

각각의 단편에 대한 GFP의 발현활성은 형질전환주 염색체에 삽입된 GFP 발현 카세트의 카피수로 나누어 단위 카피수당 GFP 발현활성으로 비교하여 백분율로 나타냈다. 도 8의 (A)에 나타낸 바와 같이, HpSEO1 프로모터 단편 F1(751bp)과 단편 F2(501bp)를 갖는 형질전환주는 단편 F0(1,001bp)를 갖는 형질전환주에 상응하는 GFP 발현활성을 나타내었다. 이에 반하여 HpSEO1 프로모터의 251bp크기의 단편(F3 단편)을 갖는 형질전환주에서의 GFP 발현활성은 상대적으로 매우 낮게 나타났다. 이 결과로부터 P _HpSEO1 는 카드뮴에 의한 프로모터 유도활성을 조절하는 구성 엘리먼트가 적어도 251bp 이상의 상류 부분에 있음을 알 수 있었다.

HpSEO1 프로모터의 조절부위를 분석하기 위하여 이의 염기서열을 프로모터 분석 프로그램()을 통하여 조사하였다. 그 결과, 도 8의 (B)에 보인 바와 같이 P _HpSEO1 는 유전자 전사에 필수적인 조절부위(TBP), 세포 내 아미노산 대사와 스트레스 관련 전사(AP-1 like seq.), 세포주기 조절(MCB, SWI5), 세포 내 황 함유 아미노산 합성에 관련된 유전자들의 발현 조절(CBF1)에 관련된 조절인자들이 결합하는 염기서열들이 있는 것으로 조사되었다.

실시예 8 : 사카로마이세스 세레비지애 SEO1 프로모터 발현 특성 분석

HpSEO1 프로모터와 유사한 중금속 반응성을 나타내는지 비교하기 위하여 사카로마이세스 세레비지애의 SEO1 유전자의 프로모터(P _ScSEO1 )를 염색체 DNA로부터 PCR을 통해 확보하고 다중 카피 발현벡터 (YEp352, Hill et al., Yeast, 2, 163-167, 1986)에 도입하여 여러 가지 중금속들에 대한 반응성을 조사하였다.

사카로마이세스 세레비지애 유전체 염기서열 정보()로부터, 사카로마이세스 세레비지애 SEO1 구성 유전자 상위 약 1,000 bp에 해당하는 P _ScSEO1 의 발현 조절부위를 분석하였다. 도 9의 (A)에서 보는바와 같이, P _ScSEO1 는 세포의 중금속을 포함한 다양한 스트레스에 저항성을 부여하는 유전자들의 발현을 유도한다고 알려진 MSN2/MSN4 단백질의 결합 부위가 특이적으로 존재하고 있음을 보여주며, 이는 P _ScSEO1 가 P _HpSEO1 과는 다른 중금속 반응성을 나타낼 것임을 암시해준다. P _ScSEO1 의 중금속 유도성을 조사하기 위하여, 먼저 SEO1 전방 프라이머(서열 13)와 SEO1 후방 프라이머(서열 14)를 이용하여 SEO1 유전자 상위 약 1,000 bp 크기의 DNA 산물을 얻었다(서열 15, 도 9의 (B)). 각각의 전방 및 후방 프라이머 말단에 BamHI과 HindIII 제한효소 인식부위 링커를 연결하여 발현벡터 구성 시 두 제한효소 인식부위에 삽입되도록 하였다. 녹색 형광 단백질을 리포터 단백질로 사용하여 SEO1 프로모터에 의한 GFP 단백질의 발현을 검토하였고, 사카로마이세스 세레비지애에서의 GFP 발현용 벡터는 도 9의 (C)에 나타난 바와 같이 제작하였으며, 이 pScSEO1p-GFP 발현 벡터는 한국유전자은행(KCTC)에 KCTC 10918BP의 번호로 기탁하였다. 실시예 6에서 수행한 것과 동일한 방법(단, 온도조건은 30℃에서 수행함)을 이용하여 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에 GFP 발현용 벡터를 도입하여 재조합 GFP 발현 형질전환주를 얻었고, 카드뮴을 포함한 다양한 중금속에 대한 반응성을 조사하였다. 도 10의 (A)에서 나타낸 바와 같이, P _ScSEO1 는 다른 중금속에 비해 카드뮴과 비소 그리고 수은에 대하여 높은 반응성을 나타냈다. 또한, 도 10의 (B)에서 나타낸 바와 같이, P _ScSEO1 은 낮은 농도의 카드뮴에 대해 높은 반응성을 보이는 반면, 100 uM 이상의 농도에서는 카드뮴에 대한 반응이 급격히 감소되고 수은에 대한 반응성이 우세해 짐을 알 수 있다. 상기의 결과로부터 P _ScSEO1 은 P _HpSEO1 와는 다른 발현 조절 인자들이 결합하고, 그로 인해 P _HpSEO1 비해 낮은 농도의 카드뮴에 대해서는 그 민감성이 뛰어난 반면 높은 농도의 카드뮴에 대해서는 반응성이 크게 저하되어 높은 농도의 수은과 비소에 대한 반응성과 구별할 수 있는 분별능이 감소됨을 보여준다.

실시예 9 : 카드뮴 유도성 GFP 발현 효모 형질 전환주를 이용한 세포체 기반 바이오센서 제작

상기 발명에서 제공하는 카드뮴 유도성 GFP 발현 한세눌라 폴리모르파 형질전환주를 이용하여 카드뮴 측정용 세포체 기반 바이오센서를 제작하고 바이오센서 감응성을 검토하였다.

세포체 기반 바이오센서는 Pat 등(Biosens. Bioelectron. 16, 811-818(2001))이 제시한 세포체 기반 바이오센서 제작 예에 준하여 제작하였다. YPD 복합 액상배지에서 지수성장기까지 배양된 카드뮴 유도성 GFP 발현 형질전환주를 세포농도(OD₆₀₀)가 1이 되도록 취하여 원심분리하고 0.5%의 아가(agar) 수용액과 혼합하여 세포-아가 혼합물을 만들었으며, 아가 포괄법으로 형질전환주를 24-Well의 마이크로타이터용 ELISA 플레이트에 고정화하였다.

카드뮴 유도성 GFP 발현 형질전환주가 고정화된 세포체 기반 카드뮴 측정용 바이오센서에 30 내지 300 uM의 농도로 제조된 카드뮴 시험용액을 가하여 카드뮴에 대한 센서 반응성을 확인하였다. GFP 활성은 형광 ELISA 측정이 가능한 ELISA 리더(Fusion^TM alpha, PerkinElmer, USA)를 이용하여 측정하였다. GFP의 형광측정을 위한 여기 흡광도 필터(excitation filter)는 Fluorescein 485를 사용하였고 방출 흡광도 필터(Emission filter)는 Fluorescein 530을 사용하였다.

도 11의 (A)에 나타낸 바와 같이, 카드뮴 시험용액에 노출 초기부터 높은 형광감도를 보였으며, 노출시간 최대 120분까지 매우 높은 형광감도를 유지하였다. 그리고 도 11의 (B)에서 보인 바와 같이, 본 발명이 제공하는 세포체 기반 바이오센서는 카드뮴 농도에 선형적으로 비례하는 감응을 나타내는 것을 볼 수 있었다. 따라서 본 발명에서 제공하는 한세눌라 폴리모르파 카드뮴 유도성 프로모터와 이를 이용한 측정용 단백질 발현 시스템은 본 시스템뿐만 아니라 형질전환주를 이용하는 세포체 기반 바이오센서로서 매우 유용함을 알 수 있었다.

본 발명의 중금속 유도성 프로모터는 중금속에 매우 선택성이 높으므로, 인체 및 환경에 대한 중금속 선택성 바이오센서 및 세포성 기반 바이오센서로서 매우 유용하다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 1, 서열번호 15 또는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열 중 501 내지 1001번의 연속 염기서열을 포함하는 서열번호 1의 뉴클레오티드 단편인 뉴클레오티드 서열; 또는 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 중금속 유도성 프로모터.
제1항에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 단편은 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오티드인 프로모터.
제1항 또는 제2항에 있어서, 중금속은 카드뮴, 비소 또는 수은인 프로모터.
제1항의 중금속 유도성 프로모터를 포함하는 발현 벡터.
제4항에 있어서, KCTC 10712BP인 발현 벡터.
제4항에 있어서, KCTC 10918BP인 발현 벡터.
제4항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
제7항에 있어서, 효모인 숙주세포.
제8항에 있어서, 효모가 사카로마이세스(Saccharomyces ) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 피키아(Pichia) 속, 칸디다(Candia) 속인 숙주세포.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 형질전환된 숙주세포를 포함하는 중금속 화합물을 탐지하기 위한 바이오센서.
제10항에 있어서, 중금속이 카드뮴, 비소 또는 수은인 바이오센서.
제10항의 바이오센서를 중금속에 노출시키고, 중금속 유도성 프로모터의 작동에 의한 재조합 단백질의 광학적, 전기화학적 또는 생화학적 발현정도를 측정하여 중금속을 탐지하는 방법.
제12항에 있어서, 중금속이 카드뮴, 비소 또는 수은인 방법.