KR100501081B1 - 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량으로 생산하는 방법 - Google Patents

이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량으로 생산하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 세포내의 rpoS 유전자를 제거하거나 돌연변이시킴으로써 RpoS 단백질의 발현을 억제하거나 또는 RpoS 단백질의 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 증가시키거나 또는 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 이소시트릭산 탈수소화 효소의 대량 생산을 가능하게 함으로써, 비만, 고지혈증, 지방간 등의 대사성 질환의 연구 또는 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량으로 생산하는 방법{Method for overproduction of isocitrate dehydrogenase}
본 발명은 이소시트릭산 탈수소화 효소의 발현을 조절하는 전사조절인자를 규명하고, 상기 전사조절인자의 발현을 조절함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성 및 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
대장균의 TCA 사이클 효소중의 하나인 NADP+-의존성 이소시트릭산 탈수소화 효소 (isocitrate dehydrogenase)는 대장균 염색체의 25.7분 위치에 존재하는 icd 유전자에 의해 암호화된다 (Berlyn, M.K.B., et al. cellular and molecular biology, 2nd Ed, ASM press, Washington D.C. 1996, edition 9, p/1715-1902). 상기 이소시트릭산 탈수소화 효소는 α-케토글루타레이트 (α-ketoglutarate), 이산화탄소 (CO2), 그리고 항산화 과정에 필수적인 NADPH를 생성시키기 위해 이소시트릭산 (isocitrate)을 탈수소화 시키는데 관여하는 효소이다 (Choi IY et al. Redox. Rep., 2003, 8:51-6; Dean AM, et al. Biochemistry, 1993, 32:9302-9).
한편, 환원된 형태의 글루타티온 (glutathione, 이하, "GSH"라 약칭함)은 잘 알려진 항산화 물질로서 산화적 스트레스에 대한 방어기작에 있어서 다양한 기능을 하며 모든 유기체에 존재한다. 이소시트릭산 탈수소화 효소는 동물세포에서 글루타티온 퍼옥시데이즈 (glutathione peroxidase)를 위한 전자공여체로서 작용하여 활성산소종 (reactive oxygen species, ROS)과 직접적으로 반응할 수 있다. 글루타티온은 글루타티온 퍼옥시데이즈 작용에 의해 쉽게 글루타티온 디설파이드 (glutathione disulfide, 이하 GSSG)로 산화되는데 상기 GSSG는 GSH와 글루타티온 리덕테이즈 (glutathione reductase)에 의해 촉매되는 NADPH-의존성 반응에 의해 환원된다. 따라서 어떤 조직의 궁극적인 항산화 능력은 환원력의 공급에 의해 결정된다. NADPH는 글루타티온 리덕테이즈에 의한 GSH의 재생산을 가능하게 하는 필수적인 보조인자로서 작용한다.
또한, 비만, 고지혈증, 지방간 등의 대사성 질환은 이소시트릭산 탈수소화 효소의 발현 및 활성을 저해하는 것으로 알려져 있다. 따라서 일부의 그룹에서는 이 효소의 활성 및 유전자 발현 정도를 조사함으로써 이 효소가 지방산, 콜레스테롤 생합성 및 지방 축적에 절대적으로 필요한 NADPH를 생성하는 핵심 인자임이 제시되었고 이 효소의 활성 및 그 유전자의 발현을 저해하는 비만, 고지혈증, 지방간 등 대사성 질환의 치료제를 선별하는 방법이 개발되고 있다.
대장균에서 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성은 번역 후 또는 전사후에 조절되는 것으로 알려져 있다. 이소시트릭산 탈수소화 효소는 글리옥실레이트 우회경로 (glyoxylate bypass)의 분기점에 존재하기 때문에 그의 활성 조절은 TCA 사이클 산물의 적절한 양을 유지하는데 중요한 효소이다. 이량체인 이소시트릭산 탈수소화 효소는 활성부위인 세린잔기의 가역적인 인산화에 의해 조절된다. 아세트산, 에탄올, 기타 지방산 존재시 약 75%의 이소시트릭산 탈수소화 효소가 인산화되어 이소시트릭산을 글리옥실레이트 우회경로로 들어가게 한다. 상기 인산화 과정은 복수의 기능을 갖는 이소시트릭산 탈수소화 효소 키나제/포스파타제(isocitrate dehydrogenase kinase/ phosphatase; 이하 IDH-K/P) 에 의해 조절된다(La Porte DC and Koshland DE Jr. Nature, 1982, 300:4586-460). 한편, 혐기적 조건에서 icd 유전자는 ArcAB (anaerobic respiratory control) 및 Fnr (fumarate nitrate reduction)에 의해 조절된다고 알려져 있다 (Iuchi S and Weiner L. J. Biochem. (Tokyo), 1996, 120:1055-63).
상기한 바와 같이 비록 인산화/탈인산화에 의한 이소시트릭산 탈수소화 효소의 조절이 제시되어 있지만 호기적 조건에서의 전사적 조절과 그에 따른 이소시트릭산 탈수소화 효소 활성의 조절에 대해서는 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 스트레스에 의해 유도되는 전사 조절물질인 RpoS가 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 음성적으로 조절함을 규명하여 rpoS 유전자를 돌연변이 시킴으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소의 생산을 증가시킬 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 스트레스에 의해 유도되는 전사조절물질인 RpoS 단백질의 발현을 저해함으로써 TCA 사이클을 조절하는 주된 효소인 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 증가시키거나 또는 대량 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 세포내의 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량 생산하는 방법을 제공한다.
이소시트릭산 탈수소화 효소는 대장균의 TCA 사이클 (tricarboxylic acid cycle) 효소로, icd 유전자에 의해 암호화 되어 있다. 상기 이소시트릭산 탈수소화 효소는 RNA 폴리머레이즈 시그마 인자 (RNA polymerase sigma factor, 이하 "RpoS"라 약칭함)에 의해 그 활성이 음성적으로 조절된다.
이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성은 야생형에서는 세포생장 지수기(log phase)에서 그의 활성이 증가하고 세포생장 정지기(stationary phase)에서 활성이 감소한다. RpoS는 세포생장 지수기에서는 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 변화시키지 않으나 정지기에서는 icd 유전자의 전사발현을 억제함으로써 그의 산물인 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 낮춘다. 따라서, 본 발명에서는 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량 생산하기 위하여 RpoS 단백질의 발현을 억제한다. RpoS 단백질의 발현을 억제하기 위하여 세포내의 rpoS 유전자를 돌연변이 시킴으로써 rpoS 유전자의 전사를 저해하고 궁극적으로는 RpoS 단백질의 발현을 억제한다.
본 발명에서는 RpoS를 암호화하는 rpoS 돌연변이를 숙주균주에 도입함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 증가시킨다. rpoS 돌연변이주를 이용하면 세포 생장기에서 이소시트릭산 탈수소화 효소의 총 활성(total isocitrate dehydrogenase activity)을 야생형에 비해 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 rpoS 유전자 돌연변이를 함유한 P1 파아지를 야생형 균주에 형질도입(transduction)하여 rpoS 유전자를 돌연변이 시킴으로써 RpoS 단백질의 발현을 저해하였다.
또한, rpoS 유전자의 전사(transcription) 억제제를 첨가하여 rpoS 유전자의 발현을 억제하거나, RpoS 단백질의 활성 억제제를 첨가하여 RpoS의 활성을 억제시킴으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량으로 생산할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 이소시트릭산 탈수소화 효소가 정상적인 세포에 비하여 대량 생산하는 것을 알아보기 위하여, 이소시트릭산 탈수소화 효소가 발현되는 정도를 측정하기 위해 icd-lacZ 융합체를 만들었다. 상기의 목적을 달성하기 위하여 대장균에서 icd 유전자 상위(upstream) 부위를 클로닝하여 그의 말단에 리포터 유전자(reporter gene)인 lacZ를 붙여 새로이 제작된 재조합 플라스미드를 제작하였다.
또한, 재조합 유전자 전달체로서 박테리오파아지 람다 (bacteriophage λ)를 이용하여 icd-lacZ 융합체를 갖는 특이적 형질전환(specialized transducing) 람다 RZ5 파아지를 제작하고 이를 숙주균주에 감염시켜 숙주균주의 람다 부착 위치 (lambda attachment site)에 끼어 들어가게 한 새로운 재조합 숙주균주를 제작하였다. 상기 icd-lacZ 융합체의 전사발현은 rpoS 돌연변이 배경에서는 야생형에 비해 증가하며 그 결과 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성이 증가하였다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 사용균주 및 배양방법
본 발명에 사용된 대장균은 모두 K-12 유도균주이며 그 종류는 하기 표 1에 나타내었다. 세포배양은 LB (배지 1 리터 당, Bacto tryptone 10 g; Bacto yeast extract 5 g; NaCl 10 g)에서 수행하였다. 배지에 첨가되는 항생제인 카나마이신 (km), 테트라사이클린 (Tc), 앰피실린 (amp) 그리고 클로람페니콜 (cm) 은 각각 최종농도가 75 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖ 그리고 30 ㎍/㎖되게 첨가하여 사용하였다.
돌연변이 균주는 P1-형질도입(transduction) 방법에 의해 제작하였다. 돌연변이를 함유한 P1 파아지를 야생형 균주에 도입한 후 적절한 항생제를 함유한 LB 배지에 도말한 후 여기서 자라난 콜로니의 표현형을 시험함으로써 돌연변이 균주를 제작하였다. 세포배양은 LB 20 ㎖을 함유한 250 ㎖ 삼각 플라스크에서 실시하였으며 효과적인 산소의 공급을 위해 200 rpm에서 진탕배양하였다.
균주(Strains) 유전자형 (Relevant genotype) 유래(Source)
대장균(Escherichia coli) K12 균주
QC2461 MG1655 lacIZ T. Touati
DH5 lacZ M15recA Lab. Collection
RKP4017 GC4468 oxyR::km R. K. Poole
GC122 GC4468rpoS13::Tn10 H. E. Schellhorn
BW831 GC4468, soxS::Tn10 B. Weiss
SP850 e14- relA1 spoT1 (cya1400)::km thi-1 CGSC(coli gene stock center)
BSN1 hns::cm B. E. Uhlin
CAG18497 fadR613::Tn10 CGSC*
JIL839 QC2461, λ(icd-lacZ) QC2461 ×λ(icd-lacZ)
JIL841 QC2461, λ(icd-lacZ),oxyR:;km JIL839 ×RKP4017
JIL842 QC2461, λ(icd-lacZ),rpoS::Tn10 JIL839 ×GC122
JIL843 QC2461, λ(icd-lacZ), soxS::Tn10 JIL839 ×BW831
JIL844 QC2461, λ(icd-lacZ),hns::cm JIL839 BSN1
JIL845 QC2461, λ(icd-lacZ),cya::km JIL839 ×SP850
JIL847 QC2461, λ(icd-lacZ),fadR::Tn10 JIL839 ×CAG18497
플라스미드 및 박테리오파아지 (Plasmids and bacteriophages)
pJIL-7 icd-lacZ 전사적 융합체 본 발명에 사용
pRS415 lacZ오페론 융합 플라스미드 R. W. Simons
λ(icd-lacZ) amp-r 본 발명에 사용
λRZ5 amp-r Lab. Collection
<실시예 2> icd-lacZ 전사적 융합체의 제작
본 발명자들은 이소시트릭산 탈수소화 효소의 전사 정도를 측정하기 위하여, PCR (Polymerization chain reaction)과 클로닝 방법 (Sambrook J. and Russell DW. Molecular cloning: A laboratory manual. 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2001)을 이용하여 icd-lacZ 전사적 융합체 (transcriptional fusion)를 제작하였다. 이를 위해 먼저 icd 유전자의 -331 염기에서 +81 염기를 포함하는 두 개의 합성 올리고머 (서열번호 1로 기재되는 icd-1, 서열번호 2로 기재되는 icd-2)를 제작하였다. 상기 두 합성 올리고머의 양 말단은 각각 BamH1과 EcoR1 제한효소 부위 (restriction site)를 갖는다. PCR 반응은 DNA 서멀 사이클러 (Perkin-Elmer Cetus Co.)와 Taq DNA 폴리머레이즈 (Promega Co.)를 사용하여 수행되었으며 94℃에서 1분, 59℃에서 1분, 그리고 72℃에서 1분을 1회로 하여 총 35회 수행하였다.
그 결과, 얻어진 PCR 산물 (422 bp)과 lacZ 유전자를 함유한 클로닝 벡터 pRS415 오페론 융합 플라스미드 (operon fusion plasmid)를 BamH1과 EcoR1 두 제한효소로 동시에 절단한 후 T4 DNA 라이게이즈 (ligase)를 사용하여 접합하였다. 상기 pRS415-icd 접합물 (ligate)을 대장균 숙주균주 DH5α에 형질전환 (transformation)한 후 20 ㎍/㎖의 X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indoyl-β-D-galactopyranoside)과 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 포함하는 LB 배지에 도말하여 16시간 배양하여 파란색을 띠는 콜로니를 취하였으며, 상기 전사적 융합체 플라스미드를 "pJIL-7"이라 명명하였다(도 1).
상기 융합 플라스미드 내의 icd 유전자 부위와 lacZ 유전자 부위의 접합부분을 확인하고자 서열분석을 실시하였다. 이를 위해 또 다른 합성 올리고머인 서열번호 3으로 기재되는 lacZ 안티센스 프라이머 (antisense primer)를 제작하였고 서열번호 1로 기재되는 icd-1과 서열번호 3으로 기재되는 lacZ 안티센스 프라이머를 이용하여 서열을 분석하였다.
접합부분에 대한 서열분석 결과는 서열번호 4로 기재되는 서열로 확인되었다.
상기 융합 플라스미드는 다수의 icd-lacZ 융합 복사본을 갖기에 그의 발현을 살펴보기에 부적절하기 때문에 적절한 숙주균주에 하나의 복사본을 갖도록 재조합 과정을 실시하였다. 이를 위해 pJIL-7을 lacZ가 제거된 숙주균주 (QC2461)에 형질전환한 후 이 균주에 직접 박테리오파아지 람다를 감염시킨 후 라이틱 사이클 (lytic cycle)을 가동시킴으로써 λ(icd-lacZ) 군집을 획득하였다. 이 군집을 QC2461에 재감염시킨 후 라이소제닉 사이클 (lysogenic cycle)을 가동시킴으로써 그의 염색체상에 하나의 icd-lacZ 융합 복사본을 갖는 새로운 균주를 제작하였다. 이 균주는 유당 (lactose) 0.4%와 20 ㎍/㎖의 X-gal, 그리고 100 ㎍/㎖의 앰피실린을 함유한 M9 (1 리터 당 Na2HPO4, 6 g; KH2PO4, 4 g; NaCl, 0.5 g; NH4Cl, 1 g; MgSO4 .7H2O, 1 mM; CaCl2, 0.1 mM) 최소배지에 도말하여 3일 간 배양한 후 푸른빛을 띠는 콜로니를 선택함으로써 분리되었다. 이 균주가 icd-lacZ 전사적 융합체를 갖고 있는지를 시험하기 위해 icd-1(서열번호 1)과 lacZ 안티센스 프라이머(서열번호 3)를 이용하여 상기에 기술한 바와 같이 동일한 방법으로 PCR 반응을 수행한 후 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 이로써 icd-lacZ 융합체의 접합부위를 최종 확인하였다.
<실시예 3> RpoS에 의한 icd 유전자의 음성적 조절
우선 icd 유전자의 전사발현 양상을 살펴보기 위해 염색체상에 icd-lacZ 전사적 융합체를 함유한 숙주 균주를 LB 배지에서 진탕 배양하면서 매시간 시료를 취해 리포터 유전자 (reporter gene)인 lacZ의 발현을 조사함으로써 RpoS의 역할을 규명하고자 하였다.
이를 위해 일정액의 세포배양액을 20 ㎍/㎖의 클로람페니콜이 들어있는 시험관에 옮긴 후 얼음에 보관하였다. icd-lacZ 융합 유전자의 발현을 조사하기 위한 β-갈락토사이데이즈 (β-galactosidase, 이하 β-gal) 활성 측정은 다음과 같이 실시하였다. Z-버퍼 (Na2HPO4 .7H2O, 16.1 g; NaH2PO 4.H2O, 5.5 g; KCl, 0.75 g; MgSO4.7H2O, 0.246 g; β-mercaptoethanol, 2.7 ㎖; pH 7.0) 0.9 ㎖에 세포 시료를 넣고 0.1 % SOD와 클로로포름을 10 ㎕를 첨가하였다. 즉시 10초간 강하게 흔들어 세포시료를 파쇄하였다. 28℃ 항온수조에서 5분간 정치시킨 후 ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) 0.2 ㎖를 더해줌으로써 β-gal 활성을 측정하였다. 단위는 다음의 식으로 계산하였다.
β-gal 활성 (Miller unit) = 600 nm 에서의 흡광도 (OD600) ×1.75 ×1000 / 420 nm에서의 흡광도 (OD420) ×시간 (분) ×용량 (volume, ㎖).
β-gal 활성을 측정한 결과, 야생형 균주는 icd-lacZ 발현이 세포생장 지수기에서 증가하였다가 세포생장 정지기에서 감소하였다(도 2의 A). 이는 TCA 사이클은 회로의 가동 결과 전자전달 과정이 유도될 것이고 따라서 정상의 야생형 균주에서는 산소가 풍부한 세포생장 지수기에서 icd의 전사발현이 높음을 의미한다. 이에 반해 rpoS 돌연변이 균주는 야생형과 동일한 정도로 세포생장기에서 증가하였지만 산소가 적은 세포생장 정지기에서도 더욱 증가하였다. 이는 rpoS의 산물인 RpoS 단백질이 icd 전사발현에 음성효과를 미침을 시사한다.
<실시예 4> icd 전사발현에 영향을 미치는 다양한 조절단백질의 역할 규명
먼저, 대장균에 존재하는 다양한 조절단백질을 암호화하는 유전자에 돌연변이가 유도된 균주로부터 형질유도를 수행함으로써 icd-lacZ 전사적 융합체를 갖는 숙주균주에서의 전사발현을 조사하여 보았다. 항산화 과정에 참여하는 OxyR과 SoxS 단백질을 암호화하는 oxyR과 soxS, DNA의 구조에 관여하는 H-NS 단백질 (hostpne-like protein)을 암호화하는 hns, 지방산의 합성 및 분해를 관장하는 FadR 단백질을 암호화하는 fadR, 세포내 광범위한 신호전달 물질인 cAMP를 생성하는데 관여하는 cya, 그리고 혐기적 호흡 조절에 관여하는 ArcA 단백질을 암호화하는 arcA 돌연변이를 P1-형질도입 (transduction) 방법에 의해 icd-lacZ 융합체를 갖는 숙주균주에 형질도입하였다. 이들 균주의 전사발현 양상을 상기의 실시예 3에 기재된 대로 LB 배지에서 배양 전과정을 통해 조사하였다.
발현양상 분석 결과, cAMP 외의 다른 조절인자들은 icd 전사발현에 거의 영향을 미치지 못했지만 cAMP를 만들지 못하는 cya 돌연변이 균주는 세포생장의 지수기에서 icd 발현이 야생형에 비해 증가하였는데 이는 cAMP가 icd 발현에 음성효과를 나타냄을 의미한다(도 3).
<실시예 5> 야생형과 rpoS 돌연변이에서의 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성 측정
상기 실시예 3에서 기술한 바와 같이 rpoS 돌연변이 균주는 그의 모균주 야생형에 비해 icd의 전사발현이 세포생장 정지기에서 5.4배 더 증가하였다. 이러한 전사발현의 증가가 단백질 수준에서의 활성에도 적용되는지를 조사하기 위하여 야생형과 rpoS 돌연변이 균주에서의 이소시트릭산 탈수소화 효소 활성을 측정하여 보았다.
이를 위해 세포생장 지수기 및 정지기에서 세포를 획득하여 완충용액 PB *S (phosphate buffered saline)로 세척하여 동일 완충용액에 현탁한 후 초음파분쇄기 (sonicator)를 이용하여 파쇄한 후 원심분리하여 그 상등액을 모았다. 이 상등액의 단백질 함량을 로우리(Lowry) 방법 (Sigma Co.)에 의해 결정하였다. 활성측정은 기질로서 구연산과 NADP+를 이용하였다. 반응용액은 1.2 ×10-3 M NADP+, 5 × 10-3 M 이소시트릭산 및 2 ×10-3 M MgCl2를 함유하며, 100 ㎍ 의 단백질이 함유되어 있다. 여기에 반응 개시물질로서 NADP+를 첨가하여 반응을 개시하였다. 340 nm에서 반응결과 생성된 NADPH의 양을 흡광도 분석기 (spectrometer)를 이용하여 정량하였다.
그 결과, 역시 세포 생장 지수기에서는 야생형 및 rpoS 돌연변이 균주에서 icd의 발현 및 이소시트릭산 탈수소화 효소 활성에 커다란 차이를 보이지 않았지만 세포 생장 정지기에서는 icd의 전사발현이 약 5.4배 그리고 이소시트릭산 탈수소화 효소 활성이 약 2.2배 증가하여 전사발현과 비슷한 양상을 보였다 (도 4). 이것은 RpoS가 세포생장 정지기에서 icd의 전사적 발현을 억제하는 인자로서 작용함을 의미하며 RpoS를 유전적으로 제거시킨 rpoS 돌연변이 균주는 icd의 발현 및 이소시트릭산 탈수소화 효소 활성이 증가함을 의미한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법으로 RpoS 단백질의 발현 및 활성을 억제하면 이소시트릭산 탈수소화 효소를 대량으로 생산할 수 있다. 이소시트릭산 탈수소화 효소는 미생물 및 동식물 등 대부분의 유기체에서 TCA 사이클의 주요한 대사산물로서 생성된다. 상기 이소시트릭산 탈수소화 효소는 그의 효소적 작용 결과 항산화 기작에 관여하는 NADPH를 생성하기 때문에 주요한 연구대상이 되고 있고, 질병을 유발하는 산소자유 라디칼의 제거와 관련된 연구는 이러한 질병의 예방 및 억제에 중요한 역할을 할 수 있다. 또한, TCA 사이클을 통한 에너지 대사와 지방산의 효과적인 산화에 따른 생리적 이해를 증진시킬 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 방법은 산업적으로 이소시트릭산 탈수소화 효소의 대량생산이 가능하며, 비만, 고지혈증, 지방간 등의 대사성 질환의 연구 또는 치료제 개발에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 icd-lacZ 융합체를 갖는 재조합 플라스미드 pJIL-7을 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 야생형(wt) QC2461 (A)과 그의 rpoS 돌연변이 균주(B)에서의 icd 전사발현 양상을 나타낸 그래프이다.
● : 흡광도 600 nm에서의 생장곡선,
○ : β-갈락토시데이즈 활성 (Miller units) 측정.
도 3은 다양한 전사적 조절인자에 의한 icd의 전사발현 양상을 나타낸 그래프이다.
oxyR : OxyR 단백질을 암호화하는 oxyR 돌연변이 균주
soxS : SoxS 단백질을 암호화하는 soxS 돌연변이 균주
hns : DNA의 구조에 관여하는 H-NS 단백질 (hostpne-like protein)을 암호화하는 hns 돌연변이 균주
cya : 세포내 광범위한 신호전달 물질인 cAMP를 생성하는데 관여하는 cya 돌연변이 균주
fadR : 지방산의 합성 및 분해를 관장하는 FadR 단백질을 암호화하는 fadR 돌연변이 균주
arcA : 혐기적 호흡 조절에 관여하는 ArcA 단백질을 암호화하는 arcA 돌연변이 균주
● : 흡광도 600 nm에서의 생장곡선,
○ : β-갈락토시데이즈 활성 (Miller units) 측정.
도 4는 배양단계 및 균주에 따른 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성을 나타낸 그래프이다. 활성은 단백질 mg 당 분당 생성된 NADPH의 양을 정량한 것이다.
A : 세포생장 지수기(log)에서의 icd 발현양상 및 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성;
B : 세포생장 정지기(stationary)에서의 icd 발현양상 및 이소시트릭산 탈수소화 효소의 활성,
wt : 야생형 (wild type), rpoS : rpoS 돌연변이 균주
<110> KOREA ATOMIC ENERGY RESEARCH INSTITUTE <120> Method for production of isocitrate dehydrogenase <130> 3p-06-14B <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icd-1 primer <400> 1 atgaattctg ttttgcgtcc ggc 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icd-2 primer <400> 2 atggatccca ggaacgttga gtt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lacZ antisense primer <400> 3 aggcgattaa gttgggtaac gcc 23 <210> 4 <211> 621 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> icd-lacZ transcriptional fusion gene <400> 4 atgaattctg ttttgcgtcc ggctcatcgg gtgaactgcg gaagaccatc gtagggttta 60 ttgaacagga tcacacgcgt gggctggttt tcaggtttac gcctggtaga acgttgcgag 120 ctgaatcgct taacctggtg atttctaaaa gaagtttttt gcatggtatt ttcagagatt 180 atgaattgcc gcattatagc ctaataacgc gcatctttca tgacggcaaa caatagggta 240 gtattgacaa gccaattaca aatcattaac aaaaaattgc tctaaagcat ccgtatcgca 300 ggacgcaaac gcatatgcaa acgtggtggc agacgagcaa accagtagcg ctcgaaggag 360 aggtgaatgg aaagtaaagt agttgttccg gcacaaggca agaagatcac cctgcaaaac 420 ggcaaactca acgttcctgg gatccgacaa ccgatgaaag cggcgacgcg cagttaatcc 480 cacagccgcc agttccgctg gcggcatttt aactttcttt atcacacagg aaacagctat 540 gaccatgatt acggattcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg 600 cgttacccaa cttaatcgcc t 621

Claims (4)

  1. 세포내의 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소 (isocitrate dehydrogenase)를 대량으로 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 세포내의 rpoS 유전자를 돌연변이시켜 RpoS 단백질의 발현을 억제하는 것은 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항에 있어서, rpoS 유전자 돌연변이를 함유한 P1 파아지를 야생형 균주에 형질도입(transduction)하여 rpoS 유전자를 돌연변이 시킴으로써 RpoS 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 세포내의 RpoS 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 이소시트릭산 탈수소화 효소의 총활성을 증가시키는 방법.
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