PL171476B1

PL171476B1 - Method of obtaining attenuated salmonella bacterium

Info

Publication number: PL171476B1
Application number: PL92312415A
Authority: PL
Inventors: Ian G Charles; Steven N Chatfield; Neil F Fairweather
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1991-10-04
Filing date: 1992-03-05
Publication date: 1997-05-30
Also published as: GB9121208D0

Abstract

1. The method is designed for producing atennuated Salmonella bacteria, capable of expressing foreign anitgenic proteins. The expression of foreign proteins is regulated by the promotor, the activity of which is induced by anaerobic conditions. Characterized in that: The method (i) transforms atennuated Salmonella bacteria with a DNA construct, which contains the promotor. The latter is connected to, and can be removed from, the DNA sequence, which codes a foreign protein. The method (ii) multiplies bacteria in aerobic conditions.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania atenuowanej bakterii Salmonella, posiadającej zdolność ekspresji białka obcopochodnego.The present invention relates to a method for producing an attenuated Salmonella bacterium having the ability to express a foreign protein.

Zjadliwe szczepy Salmonella mogą być atenuowane przez wprowadzenie specyficznych mutacji do genów niezbędnych dla ich przeżycia oraz wzrostu in vivo. Atenuowane odmiany, które wywołują samoograniczające, nieznaczące klinicznie infekcje, mogą być brane pod uwagę jako potencjalne żywe szczepionki doustne przeciwko infekcjom Salmonella. TY21 a jest atenuowaną odmianą Salmonellea typhi, w której siedliskiem mutacji jest ga1E i inne nieznaczne uszkodzenia atenuujące i która jest w wielu krajach dopuszcza do stosowania jako żywa doustna szczepionka przeciw durowi.Virulent strains of Salmonella can be attenuated by introducing specific mutations into genes necessary for their survival and growth in vivo. Attenuated variants that cause self-limiting, clinically insignificant infections may be considered as potential oral live vaccines against Salmonella infections. TY21a is an attenuated variant of Salmonellea typhi, which breeds mutations for ga1E and other slight attenuating lesions, and which is approved in many countries as a live oral typhoid vaccine.

Ostatnio jako eksperymentalne szczepionki doustne testowano na kilku organizmach celowych genetycznie zdefiniowane szczepy Salmonella, w których siedliskiem specyficznych mutantów były różne geny. Wykazano na przykład, ze mutanty Salmonella aro, które mają auksotroficzne wymagania kilku związków aromatycznych, są skuteczne jako doustne szczepionki dla myszy, owiec, bydła, kurcząt, a ostatnio wykazano, ze są atenuowane i immunogenne w badaniach na ochotnikach. W opisie patentowym europejskim 322 237 ujawniono podwójne mutanty Salmonella aro aro. Skutecznymi szczepionkami doustnymi są również podwójne mutanty Salmonella cva crp.Recently, genetically defined Salmonella strains in which different genes have been the habitat of specific mutants have been tested on several target organisms as oral experimental vaccines. For example, Salmonella aro mutants, which have the auxotrophic requirements of several aromatic compounds, have been shown to be effective as oral vaccines for mice, sheep, cattle, chickens, and have recently been shown to be attenuated and immunogenic in volunteer studies. European Patent 322 237 discloses Salmonella aro aro double mutants. Salmonella cva crp double mutants are also effective oral vaccines.

Atenuowane Salmonellae oprócz tego, ze mogą być same szczepionkami przeciwko salmonellozie mogą być również brane pod uwagę jako nośniki antygenów obcopochodnych dlaIn addition to being a vaccine against salmonellosis, the attenuated Salmonellae can also be considered as carriers of foreign-derived antigens for

171 476 doustnych systemów immunologicznych. Jest to spowodowane tym, ze Salmonellae mogą być dostarczane drogą doustną i są silnymi immunogenami, posiadając zdolność stymulowania systemicziiych i miejscowych odpowiedzi komorkowych i przeciwciał. Przy użyciu szczepionek Salmonella do organizmu gospodarza mogą być dostarczane antygeny obcopochodne z bakterii, wirusów i pasożytów.171,476 oral immune systems. This is because Salmonellae can be delivered orally and are potent immunogens, having the ability to stimulate systemic and local cellular and antibody responses. Antigens from bacteria, viruses, and parasites can be delivered to the host organism using Salmonella vaccines.

Jedna z potencjalnie poważnych wad stosowania tego typu żywych szczepionek do dostarczania antygenu dotyczy problemów ze stabilnością ekspresji obcego antygenu in vivo. Wynikiem nieregulowanej ekspresji w bakteriach wysokich poziomów obcego białka z plazmidów wielokrotnie skopiowanych jest zwykle gwałtowna utrata plazmidu lub wyrażanego genu z komórek. Problem ten może być regulowany w fermentorach przez zastosowanie indukowanych systemów promotora, takich jak trp lub lac w celu umożliwienia kontrolowanej indukcji ekspresji genu po osiągnięciu odpowiedniej biomasy, oczywiście gdy bakterie wzrastają w tkankach gospodarza podczas samoograniczającego się wzrostu po zaszczepieniu, promotory te nie mogą być indukowane przez egzogennie stosowane induktory, takie jak PP lub IPTG.One of the potentially serious drawbacks of using this type of live vaccine for antigen delivery relates to problems with the stability of expression of the foreign antigen in vivo. Unregulated expression in bacteria of high levels of a foreign protein from multiple copied plasmids usually results in a sharp loss of the plasmid or expressed gene from the cells. This problem can be regulated in fermenters by the use of inducible promoter systems such as trp or lac to allow for controlled induction of gene expression once adequate biomass has been achieved, of course when bacteria grow in host tissues during self-limiting post inoculation growth these promoters cannot be induced by exogenously used inducers such as PP or IPTG.

Niestabilność plazmidu in vivo podczas szczepienia żywymi wektorami bakteryjnymi była istotnie opisana przez wielu badaczy (Maskell et al., Microb.Path. 2, 295305, 1987; Nakayama et al., Bio/technologu 6, 693-697, 1988; Tite at al., Immunology 70,540-546, 1990). Podjęto wiele prób pokonania problemu, łącznie z zastosowaniem systemów integracyjnych do ekspresji antygenu obcopochodnego z chromosomu bakteryjnego (Hone et al., Aicrob.Path. 5, 407-418, 1988; Strugnell at al., Gene 88, 57-63, 1990). Jednakże takie podejście nadaje się do stosowania tylko z niektórymi antygenami, ponieważ poziomy ekspresji są często dość niskie (Maskell et al., 1987). Nakayama i inni opisali zastosowanie łączenia genu właściwego do plazmidu ekspresji w celu stabilizowania ekspresji in vivo. Chociaż podejście to charakteryzuje się wysoką skutecznością, nie zapobiega ono generacji wolnych odmian plazmidu, ale po prostu zapewnia, ze one nie przeżywają. Dalszy stabilny lecz konstytutywny wysoki poziom ekspresji obcego antygenu w szczepie szczepionki Salmonelli mógłby zwolnić szybkość wzrostu, a co za tym idzie, potencjalnie wpłynąć na immunogenność żywej szczepionki.In vivo plasmid instability during vaccination with live bacterial vectors has been significantly described by many researchers (Maskell et al., Microb. Path. 2, 295305, 1987; Nakayama et al., Bio / technologu 6, 693-697, 1988; Tite et al. ., Immunology 70,540-546,1990). Many attempts have been made to overcome the problem, including the use of integration systems to express a foreign-derived antigen from the bacterial chromosome (Hone et al., Aicrob. Path. 5, 407-418, 1988; Strugnell et al., Gene 88, 57-63, 1990) . However, this approach is only applicable to certain antigens as expression levels are often quite low (Maskell et al., 1987). Nakayama et al. Described the use of linking a gene to an expression plasmid to stabilize expression in vivo. While this approach is highly effective, it does not prevent the generation of free plasmid variants, but simply ensures that they do not survive. A further stable but constitutive high level of expression of the foreign antigen in the Salmonella vaccine strain could slow down the growth rate and thus potentially affect the immunogenicity of the live vaccine.

Sposób wytwarzania atenuowanej bakterii Salmonella, która jest zdolna do ekspresji obcopochodnego białka antygenowego, przy czym ekspresja białka obcopochodnego jest regulowana przez promotor, którego aktywność jest indukowana przez warunki beztlenowe, polega według wynalazku na tym, że (i) transformuje się atenuowanąbakterię Salmonella konstruktem DNA zawierającym promotor w usuwalny sposób połączony z sekwencją DNA kodującą obcopochodne białko i (ii) namnaża się hodowlę bakterii w warunkach tlenowych.A method of producing an attenuated Salmonella bacterium that is capable of expressing a foreign antigenic protein, wherein the expression of the foreign protein is regulated by a promoter whose activity is induced by anaerobic conditions, according to the invention consists in (i) transforming the attenuated Salmonella with a DNA construct containing the promoter is removably linked to the DNA sequence encoding the cross-derived protein, and (ii) propagating the bacteria under aerobic conditions.

Stabilna ekspresja białka obcopochodnego może być uzyskana in vivo. Atenuowana bakteria Salmonella może być zatem zastosowana jako szczepionka.Stable expression of the foreign protein can be achieved in vivo. The attenuated Salmonella bacterium can therefore be used as a vaccine.

Bakterie Salmonella, dokonują inwazji i wzrastają wewnątrz komórek eukariotycznych i kolonizują powierzchnie śluzówki.Salmonella bacteria invade and grow inside eukaryotic cells and colonize mucosal surfaces.

W sposobie według wynalazku można stosować następujące gatunki Salmonella:S.typhi przyczyna duru ludzkiego; S. typhimurium - przyczyna salmonellozy u szeregu gatunków zwierząt; S. enteritidis - przyczyna zatruć pokarmowych u ludzi; S. choleraesusis - przyczyna salmonellozy u świń.The following species of Salmonella can be used in the method of the invention: S.typhi cause of human typhoid; S. typhimurium - the cause of salmonellosis in several species of animals; S. enteritidis - the cause of food poisoning in humans; S. choleraesusis - the cause of salmonellosis in pigs.

Atenuacja bakterii może być spowodowana nieodwracalną mutacją genu w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych bakterii. Co najmniej dziesięć genów zaangażowanych jest w syntezę choryzmianu, kluczowego związku w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych. Kilka z nich umiejscowionych jest w znacznie różniących się pozycjach genomu bakteryjnego, na przykład aroA (syntaza 5-enolopirogronianoszikimiano -3-fosforanowa), aroC (syntaza choryzmianowa), aroD (dehydrataza 3-dehydrochinianowa) i aroE (dehydrogenaza szikimianowa). Mutacja może zatem zachodzić w genie aroA, aroC, aroD i aroE.Bacterial attenuation may be caused by an irreversible mutation of a gene in the bacterial aromatic amino acid biosynthetic pathway. At least ten genes are involved in the synthesis of chorismate, a key compound in the aromatic amino acid biosynthetic pathway. Several of them are located at significantly different positions in the bacterial genome, for example aroA (5-enolpyruvate shikimate-3-phosphate synthase), aroC (chorismate synthase), aroD (3-dehydroquinate dehydratase) and aroE (shikimate dehydrogenase). A mutation may therefore take place in the aroA, aroC, aroD and aroE genes.

Korzystnie jednakże miejscem nieodwracalnej mutacji atenuowanej bakterii są dwa oddzielne geny w szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych. Bakterie takie są ujawnione w europejskim opisie patentowym nr 322237. Odpowiednimi podwójnymi mutantami aro 'są bakterie mutanty aroA aroC, aroA aroD i aroA aroE. Zastosowanie mająjednakże inne bakterie,Preferably, however, the site of the irreversible mutation of the attenuated bacteria is two separate genes in the aromatic amino acid biosynthetic pathway. Such bacteria are disclosed in European Patent No. 322,237. Suitable aro 'double mutants are bacteria aroA aroC, aroA aroD and aroA aroE mutants. However, other bacteria are applicable

171 476 mające mutacje w innych kombinacjach aroA, aroC, aroD i aroE. Szczególnie korzystne są mutanty Salmonella podwójne aro, na przykład podwójne aro mutanty S. typhi lub S. typhimurium, w szczególności mutanty aroA aroC, aroA aroD i aroA aroE.171 476 having mutations in other combinations of aroA, aroC, aroD and aroE. Especially preferred are Salmonella double aro mutants, for example S. typhi or S. typhimurium double aro mutants, in particular aroA aroC, aroA aroD and aroA aroE mutants.

Alternatywnie, miejscem nieodwracalnej mutacji atenuowanej bakterii może być· gen. związany z regulacją jednego lub więcej innych genów (europejski opis patentowy 400958). Korzystnie mutacja zachodzi w genie ompR lub innym genie związanym z regulacją. Istnieje duża liczba innych genów, które są związane z regulacją i o których wiadomo jest, ze odpowiadająna bodźce z otoczenia (Ronson et al, Celi 49, 579-581).Alternatively, the site of the irreversible mutation of the attenuated bacterium may be a gene associated with the regulation of one or more other genes (European Patent 400958). Preferably, the mutation is in the ompR or other regulatory related gene. There are a large number of other genes that are related to regulation and known to respond to environmental stimuli (Ronson et al, Cell 49, 579-581).

Ten typ atenuowanej bakterii może mieć miejsce drugiej mutacji w drugim genie. Korzystnie drugim genem jest gen kodujący enzym biorący udział w podstawowym szlaku biosyntezy, w szczególności gen biorący udział w przedchoryzmianowej części biosyntezy związków aromatycznych. Druga mutacja zatem korzystnie znajduje się w genie aroA, aroC lub aroD.This type of attenuated bacterium may have a second mutation in the second gene. Preferably, the second gene is a gene encoding an enzyme involved in an essential biosynthetic pathway, in particular a gene involved in the pre-chorismic part of aromatic biosynthesis. The second mutation is therefore preferably in the aroA, aroC or aroD gene.

Innym typem atenuowanej bakterii jest bakteria, w której osłabienia dokonuje się przez obecność nieodwracalnej mutacji DNA bakterii, który' koduje lub reguluje ekspresję kodującego białko wytwarzane w odpowiedzi na stress środowiskowy. Takie bakterie są ujawnione w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym 91/15572. Nieodwracalną mutacją może być delecja, insercja, inwersja lub substytucja. Mutacja poprzez delecję może być generowana przy użyciu transpozonu.Another type of attenuated bacterium is bacterium, in which the weakening is accomplished by the presence of an irreversible mutation in the bacterial DNA that 'codes for or regulates the expression of the encoding protein produced in response to environmental stress. Such bacteria are disclosed in International Patent Application 91/15572. The irreversible mutation can be a deletion, insertion, inversion or substitution. Deletion mutation can be generated using a transposon.

Przykładami białek, wytwarzanych w odpowiedzi na stress środowiskowy sąbiałka szoku cieplnego (które są wytwarzane w odpowiedzi na wzrost temperatury powyżej 42°C); białka pozbawienia składników pokarmowych (które są wytwarzane w odpowiedzi na spadek poziomów podstawowych składników odżywczych, takich jak fosforany lub azot, do poziomów nizszych od poziomów niezbędnych do przeżycia organizmu); białka stresu toksycznego (które sąwytwarzane w odpowiedzi na związki toksyczne, takie jak barwniki, kwasy i być może wysięki roślinne); lub białka przerwania metabolizmu (które są wytwarzane w odpowiedzi na takie fluktuacje, na przykład fluktuacje poziomujonów wpływających na zdolność organizmu do regulacji osmozy, lub poziomu witamin lub poziomy ko-czynników, które przerywają metabolizm).Examples of proteins produced in response to environmental stress are heat shock proteins (which are produced in response to an increase in temperature above 42 ° C); nutrient deprivation proteins (which are produced in response to a decline in levels of essential nutrients such as phosphate or nitrogen to levels below levels necessary for the body to survive); toxic stress proteins (which are produced in response to toxic compounds such as dyes, acids, and possibly plant exudates); or metabolic disruption proteins (which are produced in response to such fluctuations, for example fluctuations in ion levels that affect the body's ability to regulate osmosis, or vitamin levels or levels of co-factors that disrupt metabolism).

Korzystnie białkiem szoku cieplnego jest białko kodowane przez gen htrA, charakteryzowany również jako degP. Inne białka są kodowane przez geny, o których wiadomo, ze są zaangażowane w odpowiedzi na stress, takie jakgrpE, groEL, (moPA), dnaK, groES, lon i dnaJ. Istnieje wiele innych białek, kodowanych przez geny, o których wiadomo, ze są indukowane w odpowiedzi na stress środowiskowy (Ronson et al, Celi 49, 579-581). Pośród nich można wymienić następujące: układ ntrB/ntrC E. coli, który jest indukowany w odpowiedzi na pozbawienie azotu i dodatnio reguluje gnlA i nifLA (Buck et al. Nature 320, 347-378; 1986; Hirschmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82, 7525, 1985; Nixon et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 83, 7850-7854,1986; Reitzer and Magansanik, Celi, 45, 785,1986); układphoR/phoB E. coli, który jest indukowany w odpowiedzi na pozbawienie fosforanów (Makino et al., J. Mol. Biol. 192, 549-556, 1986b); system cpxA/sfrA E.coli, który jest indukowany w odpowiedzi na barwniki i inne związki toksyczne (Albin et al., J. Biol. CHem. 261, 4698, 1986; Drury et al., J. Biol. Chem. 260,4236-4272,1985). Analogicznym układem w Rhizobium jest układ dctB/dctD, który jest odpowiedzialny za kwasy 4C-dikarboksylowe (Ronson et al., J.Bacteriol. 169, 2424 i Celi 49, 579-581, 1987). Układ wirulencji tego typu został opisany w Agrobacterium. Jest to układ virA/virG, który jest indukowany w odpowiedzi na wysięki roślinne (le Roux et al., EMBO J. 6, 849-856, 1987; Stachel i Zambryski., Am. J. Vet. Res. 45, 59-66, 1986; Winans et al., Proc Natl. Acad. Sei. USA, 83,8278, 1986). Podobnie układ bvgC-bvgA w Bordetella pertussis (poprzednio znany jako vir) reguluje wytwarzanie determinantów wirulencji w odpowiedzi na fluktuacje poziomów Mg2+ i kwasu nikotynowego (Arico et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6671-6675).Preferably, the heat shock protein is a protein encoded by the htrA gene, also characterized as degP. Other proteins are encoded by genes known to be involved in the stress response such as grpE, groEL, (moPA), dnaK, groES, lon, and dnaJ. There are many other proteins encoded by genes known to be induced in response to environmental stress (Ronson et al, Cell 49, 579-581). Among them the following can be mentioned: the E. coli ntrB / ntrC system, which is induced in response to nitrogen deprivation and positively regulates gnlA and nifLA (Buck et al. Nature 320, 347-378; 1986; Hirschmann et al., Proc. Natl Acad. Sei. USA 82, 7525, 1985; Nixon et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 83, 7850-7854, 1986; Reitzer and Magansanik, Cell, 45, 785, 1986); the E. coli phoR / phoB system, which is induced in response to phosphate deprivation (Makino et al., J. Mol. Biol. 192, 549-556, 1986b); the E. coli cpxA / sfrA system, which is induced in response to dyes and other toxic compounds (Albin et al., J. Biol. CHem. 261, 4698, 1986; Drury et al., J. Biol. Chem. 260, 4236-4272, 1985). An analogous system in Rhizobium is the dctB / dctD system, which is responsible for 4C-dicarboxylic acids (Ronson et al., J. Bacteriol. 169, 2424 and Cell 49, 579-581, 1987). This type of virulence system has been described in Agrobacterium. It is a virA / virG system that is induced in response to plant exudates (le Roux et al., EMBO J. 6, 849-856, 1987; Stachel and Zambryski., Am. J. Vet. Res. 45, 59- 66, 1986; Winans et al., Proc Natl. Acad. Sei. USA, 83, 8278, 1986). Similarly, the bvgC-bvgA system in Bordetella pertussis (formerly known as vir) regulates the production of virulence determinants in response to fluctuations in Mg2 + and nicotinic acid levels (Arico et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86, 6671-6675).

Bakteria atenuowana do stosowania w postaci żywej szczepionki nie powinna ulegać rewersji z powrotem do stanu zjadliwego. Prawdopodobieństwo takiego zdarzenia przy mutacji pojedynczej sekwencji DNA jest uważane za małe. Jednakże ryzyko wystąpienia rewersji wAn attenuated bacterium for use as a live vaccine should not revert back to a virulent state. The probability of this happening with a single DNA sequence mutation is considered to be low. However, the risk of a reversion in

171 476 bakterii atenuowanej przez obecność mutacji w każdej z dwóch oddzielonych sekwencji DNA jest uważane za nieznaczne. Korzystną atenuowaną bakterią jest zatem bakteria, w której atenuacu dokonuje się przez obecność mutacji w sekwencji DNA kodującej lub regulującej ekspresję DNA kodującego białko, wytwarzane w odpowiedzi na stress środowiskowy oraz przez obecność mutacji w drugiej sekwencji DNA.171,476 bacteria attenuated by the presence of mutations in each of the two separated DNA sequences are considered insignificant. A preferred attenuated bacterium is thus a bacterium in which the attenuation is effected by the presence of a mutation in the DNA sequence encoding or regulating the expression of the DNA encoding the protein, produced in response to environmental stress, and by the presence of the mutation in the second DNA sequence.

Druga sekwencja dNa korzystnie koduje enzym biorący udział w podstawowym szlaku auksotroficznym lub jest sekwencją, której produkt kontroluje regulację genów odpowiedzialnych osmotycznie, na przykład ompR (Infeck and Immun. 198,9, 2136-2140). Najkorzystniej mutacja występuje w sekwencji DNA dotyczącej szlaku biosyntezy aminokwasów aromatycznych, a zwłaszcza sekwencji DNA kodującej aroA, aroC lub aroD.The second dNa sequence preferably encodes an enzyme involved in the underlying auxotrophic pathway or is a sequence whose product controls the regulation of osmotically responsible genes, for example ompR (Infeck and Immun. 198.9, 2136-2140). Most preferably, the mutation is in a DNA sequence relating to the aromatic amino acid biosynthetic pathway, in particular a DNA sequence encoding aroA, aroC or aroD.

Atenuowana bakteria może być skonstruowana przez wprowadzenie mutacji do sekwencji DNA metodami znanymi specjalistom (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Mutacje nieodwracalne mogą być wprowadzone przez wprowadzenie transpozonu hybrydowego TnphoA na przykład do szczepów S. typhimurium. TnphoA może generować aktywne enzymatycznie fuzje białek fosfatazy alkalicznej do białek periplazmatycznych lub białek błony komórkowej. Transpozon TnphoA przenosi gen kodujący oporność na kanamycynę. Selekcji transduktantów opornych na kanamycynę dokonuje się przez namnażanie kolonii w odpowiednim medium selekcyjnym.An attenuated bacterium can be constructed by introducing mutations into a DNA sequence by methods known to those skilled in the art (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Irreversible mutations can be introduced by introducing the TnphoA hybrid transposon into, for example, S. typhimurium strains. TnphoA can generate enzymatically active fusions of alkaline phosphatase proteins to periplasmic proteins or cell membrane proteins. The TnphoA transposon carries the gene encoding kanamycin resistance. The selection of kanamycin resistant transductants is accomplished by growing the colonies in an appropriate selection medium.

Do metod alternatywnych należą klonowanie sekwencji DNA w wektorze, na przykład plazmidzie lub kosmidzie, włączenie selekcyjnego genu markerowego do klonowanej sekwencji DNA, czego wynikiem jest jego inaktywacja. Plazmid noszący inaktywowaną sekwencję DNA i różniący się marker selekcyjny mogą być wprowadzone do organizmu za pomocą znanych technik (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Następnie poprzez odpowiednią selekcję możliwa jest identyfikacja mutanta, w którym inaktywowana sekwencja DNA uległa rekombinacji z chromosomem mikroorganizmu i sekwencja DNA typu dzikiego w wyniku procesu określanego jako wymiana alleliczna została uczyniona niefunkcjonalną. W szczególności zastosowany wektor jest korzystnie niestabilny w mikroorganizmie i będzie spontanicznie utracony. Zmutowana sekwencja DNA i sekwencja DNA typu dzikiego mogą być zmienione w wyniku procesu wymiany genetycznej typu cross-over. Dodatkowe metody wykluczają wprowadzenie obcego DNA do szczepów szczepionki w miejscu mutacji i wprowadzenie do szczepów markerów opornych na antybiotyki.Alternative methods include cloning the DNA sequence in a vector, for example a plasmid or cosmid, inserting a selectable marker gene into the cloned DNA sequence, resulting in its inactivation. A plasmid bearing an inactivated DNA sequence and a different selectable marker can be introduced into the body by known techniques (Maniatis, Molecular Cloning and Laboratory Manual, 1982). Subsequently, by appropriate selection, it is possible to identify a mutant in which the inactivated DNA sequence has recombined with the chromosome of the microorganism and the wild-type DNA sequence has been rendered nonfunctional by a process known as allelic exchange. In particular, the vector used is preferably unstable in the microorganism and will be spontaneously lost. The mutant DNA sequence and the wild-type DNA sequence may be altered by a cross-over genetic exchange process. Additional methods exclude the introduction of foreign DNA into the vaccine strains at the mutation site and the introduction of antibiotic-resistant markers into the strains.

Obcopochodny antygen, do ekspresji którego zdolna jest atenuowana bakteria zawiera na przykład determinację antygenową organizmu patogennego.'*Antygen może być otrzymany ż wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta. Obcopochodne białko typowo zawiera .zatem sekwencję antygenową, otrzymaną/, wirusa, bakterii, grzyba, drożdży lub pasożyta. W szczególności sekwencja antygenowa może być otrzymana z ludzkiego wirusa niedoborów immunologicznych (HIV) typu HIV-1 lub HIV-2, wirusa zapalenia wątroby typu A lub B, ludzkiego rinowirusa takiego jak typ 2 lub typ 14, wirusa opryszczki pospolitej, wirusa polio typ 2 łub 3, wirusa pryszczycy, wirusa grypy, wirusa Coxsackie, komórkowego antygenu powierzchniowego CD4 i Chlamydia trachomatis. Antygen może zawierać miej see wiążące antygen CD4 z HIV -1 lub 2. Do innych użytecznych antygenów należą labilna termicznie podjednostka BE. coli (LT-B), antygeny E. coli K88, białko P. 69 z B.pertussis, fragment C toksyny tężcowej i antygeny przywr, obleńców, tasiemców, wirusa wścieklizny i rotawirusów.The foreign antigen that an attenuated bacterium is capable of expressing includes, for example, the antigenic determination of a pathogenic organism. * The antigen may be obtained from a virus, bacterium, fungus, yeast or parasite. The foreign protein, therefore, typically comprises an antigenic sequence, obtained from /, virus, bacteria, fungus, yeast or parasite. In particular, the antigen sequence may be obtained from human immunodeficiency virus (HIV) type HIV-1 or HIV-2, hepatitis A or B virus, human rhinovirus such as type 2 or type 14, herpes simplex virus, polio type 2 virus. or 3, foot-and-mouth disease virus, influenza virus, Coxsackie virus, CD4 surface cell antigen and Chlamydia trachomatis. The antigen may contain an HIV-1 or 2 binding CD4 antigen. Other useful antigens include the heat labile BE subunit. coli (LT-B), E. coli K88 antigens, P. 69 protein from B.pertussis, fragment C of tetanus toxin and antigens of flukes, roundworms, tapeworms, rabies virus and rotaviruses.

Korzystnie jako promotor do kontrolowania ekspresji białka obcopochodnego stosuje, się promotor nirB. Promotor nirB został wyizolowany z E. coli, gdzie kieruje ekspresją, operonu, zawierającego gen reduktazy azotynowej nirB (Jayaraman et al., J. Mol. Biol. 196, 781-788, 1987) i nirD, nirC i cysG (Peakman et al., Eur. J. Biochem. 191, 315-323, 1990). Jest on regulowany zarówno przez azotyn jak i zmiany ciśnienia tlenu w środowisku, stając się aktywny przy pozbawieniu tlenu (Cole, Biochim, Biophys. Acta, 162, 356-368, 1968). Odpowiedź na anaerobiozę wywierana jest za pośrednictwem białka FNR, działającego jako aktywator transkrypcji według mechanizmu wspólnego dla wielu genów oddychania beztlenowego.Preferably, the nirB promoter is used as the promoter to control expression of the foreign protein. The nirB promoter was isolated from E. coli, where it drives the expression, of an operon containing the nirB nitrite reductase gene (Jayaraman et al., J. Mol. Biol. 196, 781-788, 1987) and nirD, nirC and cysG (Peakman et al. ., Eur. J. Biochem. 191,315-323,1990). It is regulated by both nitrite and the changes in oxygen pressure in the environment, becoming active in the deprivation of oxygen (Cole, Biochim, Biophys. Acta, 162, 356-368, 1968). The response to anaerobiosis is mediated by the FNR protein, which acts as a transcriptional activator according to a mechanism common to many genes of anaerobic respiration.

171 476171 476

Część promotora, odpowiadającą wyłącznie anaerobiozie wyizolowano poprzez delecję i analizę mutacjonalną, a poprzez porównanie z innymi promotorami regulowanymi anaerobowo ziaeniyiiKOwano miejsce wiązące πνκ (oen er ar., Nuci, wcius rces. 1/, jooj-jo/m·, iyc»y, Jayaraman et al, Nuci. Acids Res. 17, 135-145,1989). Wykazano również, że odległość między przypuszczalnym miejscem wiązania FNR a regionem homologowym 10 jest krytyczna (Bell et al, Molec. Micorbiol. 4, 1753-1763, 1990). Korzystnie zatem stosuje się tylko część promotora nirB, która odpowiada wyłącznie za anaerobiozę. Stosowane tu odniesienia do promotora nirB odnoszą się do samego promotora lub jego części lub pochodnej, zdolnej do promowania ekspresji kodowanej sekwencji w warunkach beztlenowych. W rzeczywistości stosowaliśmy następującą sekwencję, zawierającą promotor nirB:The part of the promoter, corresponding only to anaerobiosis, was isolated by deletion and mutational analysis, and by comparison with other anaerobically regulated promoters, the πνκ binding site was determined (oen er ar., Nuci, wcius rces. 1 /, jooj-jo / m ·, iyc »y, Jayaraman et al, Nuc. Acids Res. 17, 135-145, 1989). The distance between the putative FNR binding site and the homologous region has also been shown to be critical (Bell et al, Molec. Micorbiol. 4, 1753-1763, 1990). Preferably, therefore, only the part of the nirB promoter that is solely responsible for anaerobiosis is used. Reference to the nirB promoter as used herein refers to the promoter itself, or a portion or derivative thereof, capable of promoting expression of the encoded sequence under anaerobic conditions. In fact, we used the following sequence, containing the nirB promoter:

AATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAATTCAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTA

AGGTAGGCGGTAGGGCCAGGTAGGCGGTAGGGCC

Według wynalazku sposób wytwarzania atenuowanej bakterii polega na tym, że transferuj e się atenuowaną bakterię konstruktem DNA zawierającym promotor, którego aktywność jest indukowana przez warunki beztlenowe, taki jak promotor nirB, połączony usuwalny z sekwencją DNA kodującą białko obcopochodne. Stosuje się dowolną odpowiednią.technikę transformacji, taką jak elektroporacja. W ten sposób otrzymuje się bakterię, zdolną do ekspresji białka obcopochodnego dla bakterii. Hodowlę atenuowanej bakterii można namnażać w warunkach tlenowych. W ten sposób otrzymuje się bakterię w ilości wystarczającej do przygotowania preparatu szczepionki przy minimalnej ekspresji białka obcopochodnego.According to the invention, the method for producing an attenuated bacterium comprises transferring the attenuated bacterium with a DNA construct containing a promoter whose activity is induced by anaerobic conditions, such as a nirB promoter, removably linked to a DNA sequence encoding a foreign protein. Any suitable transformation technique, such as electroporation, is used. In this way, a bacterium is obtained that is capable of expressing a foreign protein for the bacteria. The culture of the attenuated bacterium can be grown aerobically. In this way, a sufficient amount of bacteria is obtained to prepare a vaccine formulation with minimal expression of the foreign protein.

Jako konstrukt DNA stosuje się zwykle zdolny do replikacji wektor, zawierający promotor nirB, połączony w sposób usuwalny z sekwencjąDNA koduj ącąbiałko obcopochodne. Promotor nirB może być włączony do wektora ekspresji, który ma już w miejsce istniejącego promotora regulującego ekspresję białka włączony gen kodujący białko obcopochodne. Wektor ekspresji powinien oczywiście być kompatybilny z atenuowaną. bakterią, do której wektor ma być włączony.Typically, a replication-competent vector containing a nirB promoter and removably linked to a DNA sequence encoding a foreign protein is used as the DNA construct. The nirB promoter may be inserted into an expression vector which already has a gene encoding a cross-derivative protein inserted in place of an existing promoter regulating protein expression. The expression vector should of course be compatible with the attenuated one. the bacterium into which the vector is to be incorporated.

Wektor ekspresji posiada odpowiednie elementy regulacji transkrypcji i translacji, oprócz promotora nirB oraz kodonów początku i zakończenia translacji. Posiada odpowiednie miejsce wiązącc rybosomy. Wektor zwykle zawiera sekwencję origin of replication i w razie potrzeby selekcyjny gen markerowy, taki jak gen oporności na antybiotyki. Jako wektor może być stosowany plazmid.The expression vector has appropriate transcriptional and translational regulatory elements in addition to the nirB promoter and translation start and stop codons. It has a suitable ribosome binding site. The vector usually contains the sequence of origin of replication and, if desired, a selectable marker gene such as an antibiotic resistance gene. A plasmid can be used as a vector.

Szczepionka korzystnie ma formę liofilizowaną, na przykład w postaci kapsułki do doustnego podawania pacjentom. Takie kapsułki mogą być zaopatrzone w powłokę nierozpuszczlnąw soku żołądkowym, wykonanąnaprzykład z Eudragitu S, Eudragitu L, octąnu celulozy, ftalanu celulozy lub hydroksypropylocelulozy. Kapsułki te mogą być stosowane jako takie lub alternatywnie liofilizowany materiał może być użyciem roztwarzany na przykład do postaci zawiesiny. Roztwarzanie korzystnie przeprowadza się w buforze przy pH odpowiednim dla zapewnienia żywotności organizmów. W celu zabezpieczenia kwaśnego środowiska żołądka przed każdym podaniem szczepionki korzystnie podaje się preparat węglanu sodowego. Alternatywnie, szczepionka może być przygotowana do podawania pozajelitowego donosowego lub dosutkowego.The vaccine is preferably in a lyophilized form, for example in the form of a capsule for oral administration to patients. Such capsules may be provided with a coating which is insoluble in gastric juice, made, for example, of Eudragit S, Eudragit L, cellulose acetate, cellulose phthalate or hydroxypropyl cellulose. These capsules may be used as such or, alternatively, the lyophilized material may be reconstituted, for example into a suspension. The reconstitution is preferably carried out in a buffer at a pH suitable to ensure the viability of the organisms. A sodium carbonate preparation is preferably administered before each administration of the vaccine to protect the acidic environment in the stomach. Alternatively, the vaccine may be prepared for parenteral intranasal or intramammary administration.

Szczepionka może być zastosowana w profilaktycznym działaniu na gospodarza, w szczególności na gospodarza ludzkiego, ale także na gospodarza zwierzęcego. W ten sposób przez podanie skutecznej dawki szczepionki wytworzonej sposobem według wynalazku można zapobiegać infekcji spowodowanej przez mikroorganizm, w szczególności patogen. W bakterii w szczepionce zachodzi następnie ekspresja białka obcopochodnego, zdolnego do zwiększania poziomu przeciwciał przeciwko mikroorganizmowi. Zastosowana dawka będzie zalezna od różnych czynników, w tym od wielkości i wagi gospodarza postaci szczepionki oraz białka obcopochodnego. Jednakże dla atenuowanej S. typhi na ogół dogodna jest dla dorosłego gospodarza ludzkiego dawka doustna zawierająca od 10⁹ do 10 organizmów S. typhi.The vaccine can be used for prophylactic action against the host, in particular the human host, but also the animal host. Thus, by administering an effective dose of a vaccine according to the invention, an infection caused by a microorganism, in particular a pathogen, can be prevented. The bacterium in the vaccine then expresses a foreign protein capable of increasing the level of antibodies to the microorganism. The dosage employed will depend on a variety of factors including the size and weight of the host vaccine form and the foreign protein. However, for attenuated S. typhi it is usually convenient for an adult human host oral dose comprising 10 to 10 ⁹ organisms of S. typhi.

171 476171 476

Ponizszy przykład ilustruje wynalazek. W załączonych rysunkach:The following example illustrates the invention. In the attached drawings:

Figury 1 do 4 przedstawiają zdolności izolatorów S. typhimuri do wzrostu in vivo odpowiednio w wątrobie, śledzionie, płytkach Peyersa i krezkowych węzłach chłonnych myszy BALB/c. Na osi X zaznaczono ilość dni po iniekcji, na osi Y ilość żywych organizmów na organ, Δ oznacza izolaty BRD509, □ oznacza izolaty BRD847, O oznacza izolat BRD743, oznacza próbę bez ampicyliny, a-----oznacza próbę z dodaniem tmipicyimy.Figures 1 to 4 show the ability of S. typhimuri isolators to grow in vivo in the liver, spleen, Peyers plates, and mesenteric lymph nodes of BALB / c mice, respectively. The number of days after injection is indicated on the X axis, the number of viable organisms per organ on the Y axis, Δ means BRD509 isolates, □ means BRD847 isolates, O means BRD743 isolate, means no ampicillin assay, and ----- means tmipicymin assay.

Figura 5 przedstawia miana fragmentu C toksyny prziciwtężcowej w surowicy myszy. Oś X przedstawia typ bakterii użytych do prowokacji myszy. Liczba dawek jest podana w nawiasach. Na osi Y podano odczyty absorbancji przy 492 nm.Figure 5 shows the serum levels of anti-tetanus toxin fragment C in mice. The X axis represents the type of bacteria used to challenge the mice. The number of doses is shown in parentheses. The absorbance readings at 492 nm are given on the Y axis.

PrzykładExample

Konstrukcja pTETnir 15Construction pTETnir 15

Plazmid ekspresji pTETnir 15 skonstruowano z pTETtacH5 (Makoff et al., Nuci. Acids Res. 17, 1O191-l02O2, 1989) przez zastąpienie regionu EcoRI-Apal (1354bp) zawierającego gen lacl i promotor tac następującą parą oligosekwencji 1 i 2:The pTETnir 15 expression plasmid was constructed from pTETtacH5 (Makoff et al., Nucl. Acids Res. 17, 10191-102O2, 1989) by replacing the EcoRI-Apal (1354bp) region containing the lacI gene and the tac promoter with the following oligos sequence 1 and 2:

oligo-1 5 ' -AATTCAAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATC oligo-2oligo-1 5 '-AATTCAAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATC oligo-2

3'gtccatttaaactacatgtagtttaccatggggaacgacttaggttaaggtaggcgg3'gtccatttaaactacatgtagtttaccatggggaacgacttaggttaaggtaggcgg

TAGGGCC-3'TAGGGCC-3 '

CAATTCCATCCGCCATC-5'CAATTCCATCCGCCATC-5 '

Oligonukleotydy zsyntetyzowano na urządzeniu Pharmacia Gene Assembler, a strukturę uzyskanych plazmidów potwierdzono przez sekwencjonowanie (Makoff et al, Bio/Technology 7, 1043-1046, 1989). Konstrukcja SL1334 aroA aroD zawierającego pTETnirl5.Oligonucleotides were synthesized on a Pharmacia Gene Assembler and the structure of the obtained plasmids was confirmed by sequencing (Makoff et al, Bio / Technology 7, 1043-1046, 1989). Design of the SL1334 aroA aroD containing pTETnirl5.

W celu skonstruowania szczepu szczepionki Salmonella zdolnego do ekspresji . fragmentu C toksyny tężcowej pod kontrolą promotora nirB, szczep pośredni, S. typhimurium LB5010 (rm⁺) (Bullas and Ryo, J. Bact. 156, 471/474, 1983) przekszałcono za pomocą pTETnir 15. Kolonie zdolne do ekspresji fragmentu C wykrywano przez selekcję antybiotykiem, a następnie wydzielono zapomocątechniki immunoblotting z fragmentem C surowicy toksyny przeciwtęzcowej. Kolonie namnażano przez noc, po czym indukowano przez inkubowanie przed immunoblottingiem przez cztery godziny w warunkach beztlenowych. Jeden ze szczepów, który był zdolny do ekspresji fragmentu C w sposób stabilny zastosowano do wytworzenia plazmidu DNA. Użyto go do transformacji i wydzielenia S. typhimurium SL1344 aroA, aroD oznaczonego jako BRD509 przez elektroporację. Szczep, który był zdolny do ekspresji fragmentu C w sposób stabilny (sprawdzono za pomocą techniki immunoblotting, jak opisano powyżej) wybrano do badań in vivo i oznaczono. Porównanie kinetyki in vivo BRD743 i BRD847 u myszy BALB/cTo construct a Salmonella vaccine strain capable of expression. fragment C of tetanus toxin under control of the nirB promoter, intermediate strain, S. typhimurium LB5010 (rm ⁺ ) (Bullas and Ryo, J. Bact. 156, 471/474, 1983) was resized with pTETnir 15. Colonies capable of expressing fragment C were detected by antibiotic selection followed by isolation of the anti-tetanus toxin serum fragment C by immunoblotting. Colonies were grown overnight and then induced by incubation prior to immunoblotting for four hours under anaerobic conditions. One of the strains that was stably capable of expressing fragment C was used to generate plasmid DNA. It was used to transform and isolate S. typhimurium SL1344 aroA, aroD designated as BRD509 by electroporation. A strain that was stably able to express fragment C (checked by immunoblotting as described above) was selected for in vivo studies and assayed. In vivo comparison of BRD743 and BRD847 in BALB / c mice

Porównano zdolność BRD743 (BRD509 zawierający pTET85) i BRD847 do wzrostu in vivo po podaniu doustnym myszom BALB/c. pTET85 skonstruowano z PTETtacl 15 (Makoff et al.Nucl. Acids Res. 17,10191-10202,1089) przez delecję fragmentu 1,2 kb EcoRI noszącego gen lacl. W wyniku tego uzyskano konstytutywną ekspresję fragmentu C w szczepach Salmonella. Zliczano ilość bakterii w wątrobach, śledzionach, płytkach Peyersa i krezkowych węzłach limfatycznych. Oceniano również zdolność bakterii wyizolowanych z myszy do wzrastania na płytkach zawierających ampicylinę jako wskaźnik ilości organizmów, które zatrzymały jeszcze plazmid posiadający zdolność ekspresji fragmentu C. Wyniki przedstawiono na figurach 1 do 4.The ability of BRD743 (BRD509 containing pTET85) and BRD847 to grow in vivo after oral administration to BALB / c mice was compared. pTET85 was constructed from PTETtacl 15 (Makoff et al. Nucl. Acids Res. 17,10191-10202,1089) by deleting the 1.2 kb EcoRI fragment carrying the lacI gene. As a result, fragment C was constitutively expressed in Salmonella strains. The amount of bacteria in the livers, spleens, Peyers' plates and mesenteric lymph nodes was counted. The ability of bacteria isolated from mice to grow on ampicillin-containing plates was also assessed as an indicator of the number of organisms that still retained the plasmid expressing fragment C. The results are shown in Figures 1 to 4.

Przy użyciu podobnych początkowych ilości mikroorganizmów (5 x 10⁹) do zainfekowania myszy stwierdzono, ze zarówno BRD743 jak i 847 były zdolne do inwazji i przetrwania we wszystkich badanych tkankach mysich, ale przy nizszych poziomach niż BRD509. Jednakże interesującą jest, ze ilość mikroorganizmów opornych na ampicylinę, otrzymanych z myszyUsing similar initial amounts of microorganisms (5 x 10 ⁹ ) to infect mice, both BRD743 and 847 were found to be able to invade and survive in all mouse tissues tested, but at lower levels than BRD509. However, it is interesting that the amount of ampicillin resistant microorganisms obtained from mice

171 476 zainfekowanych BRD743 znacznie się zmniejsza i wszystkie uzyskane organizmy były w dniu 14 wrażliwe na ampicylinę. Wskazuje to, że selekcja in vivo bardzo szybko powoduje utratę pTET85 ze szczepu szczepionki salmonelli. W przeciwieństwie do tego zliczenia dla BRD847 zarówno z ampicyliną jak i bez ampicyliny byty zasadniczo takie same w czasie, w którym infekcje obserwowano. Wskazuje to na dodatkową zaletę pTETnirl 5 w szczepie szczepionki S. typhimurium, dzięki której uzyskuje się organizmy o potencjale ekspresji fragmentu C in vivo przez dłuzszy okres czasu, co ma oczywiste zalety w odniesieniu do immunogenności.171,476 infected with BRD743 decreased significantly and all organisms obtained were sensitive to ampicillin on day 14. This indicates that in vivo selection causes the loss of pTET85 very quickly from the salmonella vaccine strain. In contrast, counts for BRD847 with and without ampicillin were essentially the same at the time infections were observed. This demonstrates the added advantage of pTETnirl 5 in a S. typhimurium vaccine strain, which produces organisms with the potential to express fragment C in vivo over a longer period of time, with obvious advantages in terms of immunogenicity.

Szczepienie myszy BALB/c przy użyciu szczepów Salmonella zawierających pTET85 (BRD743) lub pTETnirl 5 (BRD847) 'Vaccination of BALB / c mice with Salmonella strains containing pTET85 (BRD743) or pTETnirl 5 (BRD847) '

Grupę dwudziestu myszy zaszczepiono doustnie przy użyciu BRD743, BRD847 albo BRD509 w ilości 5 x 10⁹ komórek na mysz. 25 dnia pobrano surowicę od wszystkich myszy i przeprowadzono analizę przeciwciał przeciwtężcowych przy pomocy testu ELISA. Wszystkie myszy zaszczepiono BRD847 miały 25 dnia wykrywalne przeciwciała przeciwko fragmentowi C, podczas gdy myszy szczepione BRD743 lub BRD509 nie miały takich przeciwciał (fig. 5). Dnia 25 dziesięciu myszom z każdej grupy podano dodatkowo doustnie podobną ilość organizmów homologowych. Analiza ELISA surowicy pobranej od tych myszy dnia 46 wykazała, ze odpowiedzi przeciw fragmentowi C zwiększyły się dla grup zaszczepionych BRD743 i BRD847. Miana dla myszy, którym podano dodatkowe ilości BRD847 były znacznie wyższe niz dla myszy, którym podano dodatkową ilość BRD743. Myszy, którym podano doustnie dodatkową ilość BRD509 nie wytwarzały przeciwciał fragmentowi C w wykrywalnej ilości.A group of twenty mice were orally inoculated with BRD743, BRD847 or BRD509 at 5 x 10 ⁹ cells per mouse. On day 25, serum was collected from all mice and analyzed for anti-tetanus antibodies by ELISA. All mice vaccinated with BRD847 had detectable antibodies against fragment C on day 25, whereas mice vaccinated with BRD743 or BRD509 did not have such antibodies (Figure 5). On day 25, ten mice from each group were additionally orally dosed with a similar amount of homologous organisms. An ELISA analysis of serum from these mice on day 46 showed that anti-fragment C responses increased for the BRD743 and BRD847 vaccinated groups. The titers for the mice given additional amounts of BRD847 were significantly higher than for the mice given additional amounts of BRD743. Mice dosed orally with additional BRD509 failed to produce detectable amounts of fragment C antibodies.

Prowokacja toksyną tężcową myszy zaszczepionych doustnie BRD847 i 743.Tetanus toxin challenge in orally vaccinated mice with BRD847 and 743.

Myszy zaszczepione doustnie za pomocąBRD743, 847 i 509 przetestowano na odporność na prowokację toksyną tężcową po jednej lub dwóch dawkach szczepu uodpamiającego. Grupy dwudziestu myszy otrzymały jedną pojedynczą dawkę doustną 5 x 109 organizmów, a grupy dziesięciu myszy prowokowano 25 dnia 500 dawkami 50% śmiertelnej dawki toksyny tężcowej (patrz tabela 1). Myszy szczepione BRD847 były całkowicie zabezpieczone przeciwko prowokacji po pojedynczej dawce doustnej, podczas gdy myszy szczepione BRD743 były jedynie częściowo zabezpieczone (2/10 osobników przeżyło). Pozostałe grupy po 10 myszy otrzymały drugą dawkę organizmów (5 x 109) dnia 25 i były prowokowane dnia 46 (po pierwszej dawce). Ponownie myszy szczepione BRD847 były całkowicie zabezpieczone po prowokacji toksyną tężcową, podczas gdy szczepione BRD743 były tylko częściowo zabezpieczone (5/10). Wszystkie myszy zaszczepione 1 lub 2 dawkami BRDF509 i prowokowane toksyną tężcową zmarły. BRD847 jest skuteczną w jednej dawce doustną szczepionką przeciwko prowokacji toksyną tężcową u myszy. Grupy myszy poddawano również prowokacji toksyną tężcową po otrzymaniu 1 lub 2 dożylnych dawek 1(P organizmów BRD847 i BRD743. Wszystkie myszy były całkowicie zabezpieczone przeciwko prowokacji toksyną tężca po 1 lub 2 dawkach szczepu szczepionki.Mice orally vaccinated with BRD743, 847, and 509 were tested for resistance to a tetanus toxin challenge after one or two doses of the immunization strain. Groups of twenty mice received one single oral dose of 5 x 109 worms, and groups of ten mice were challenged on day 25 with 500 doses of 50% of a lethal dose of tetanus toxin (see Table 1). BRD847 vaccinated mice were completely protected against challenge after a single oral dose, while BRD743 vaccinated mice were only partially protected (2/10 individuals survived). The remaining groups of 10 mice received a second dose of the worms (5 x 109) on day 25 and were challenged on day 46 (after the first dose). Again, the BRD847 vaccinated mice were completely protected after challenge with tetanus toxin, while the BRD743 vaccinated mice were only partially protected (5/10). All mice vaccinated with 1 or 2 doses of BRDF509 and challenged with tetanus toxin died. BRD847 is a single dose effective oral vaccine against tetanus toxin challenge in mice. Groups of mice were also challenged with tetanus toxin after receiving 1 or 2 intravenous doses of 1 (P organisms BRD847 and BRD743. All mice were completely protected against challenge with tetanus toxin after 1 or 2 doses of the vaccine strain.

TabelaTable

Doustne szczepienie myszy przeciwko tężcowi przy użyciu S. typhimurium SL1344 aroA aroD pTET85 i S. typhimurium SL1344 aroA aroD pTETnirl5Oral vaccination of mice against tetanus with S. typhimurium SL1344 aroA aroD pTET85 and S. typhimurium SL1344 aroA aroD pTETnirl5

Szczepionka Vaccine Dawka Dose Liczba dawek Number of doses Liczba myszy, które przezyły prowokację tężcową Number of mice surviving a tetanus challenge SL1344 aroA aroD SL1344 aroA aroD 8,6x109 8.6x109 1 1 0/10 0/10 (BRD509) (BRD509) 7,4x109 7.4x109 2 2 0/10 0/10 SL1344 aroA aroD SL1344 aroA aroD 6,4x109 6.4x109 1 1 2/10 2/10 pTET85 (BRD743) pTET85 (BRD743) 8,2x109 8.2x109 2 2 5/10 5/10 SL1344 aroA aroD SL1344 aroA aroD 9,5x109 9.5x109 1 1 10/10 10/10 PTETnir l5(BRD847) PTETnir l5 (BRD847) 7,5x109 7.5x109 2 2 9/10 9/10

171 476171 476

Fig. 5 y,Fig. 5 y,

201-5108 •201-5108 •

BRD743BRD743

BRD847BRD847

BRD509BRD509

171 476171 476

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 9U egz. Cena 4,UU złPublishing Department of the UP RP. Circulation of 9U copies. Price 4 UAH PLN

Claims

Patent claims

A method for producing an attenuated Salmonella bacterium that is capable of expressing a foreign antigenic protein, where the expression of the foreign protein is regulated by a promoter whose activity is induced by anaerobic conditions, characterized by (i) transforming the attenuated Salmonella bacterium with a DNA construct containing the promoter is removably linked to the DNA sequence encoding the cross-derived protein; and (ii) the bacterial culture is expanded under aerobic conditions.

The method according to claim 1, characterized in that the attenuated bacterium is an attenuated strain of Salmonella typhi Salmonella typhimurium.

3. The method according to p. The method of claim 1, wherein the attenuation is caused by an irreversible mutation in a gene of an aromatic amino acid biosynthetic pathway.

4. The method according to p. The method of claim 1, wherein the attenuation is due to an irreversible mutation in the bacterial DNA that encodes or regulates the expression of the DNA encoding a protein produced under environmental stress.

5. A method according to claim 3, characterized in that the attenuated bacterium is used in which the site of the irreversible mutation is both of two separate genes in its aromatic amino acid biosynthetic pathway.

A method according to claim 1, characterized in that the aroA aroC, aroA aroD or aroA aroE mutant is used as the attenuated bacterium.

7. The method according to p. The method of claim 1, wherein the promoter is the nirB promoter.

8. The method according to p. The method of claim 1, characterized in that the foreign-derived protein comprises an antigen sequence obtained from a virus, bacteria, fungi, yeast or parasites.

The method according to claim 8, characterized in that the foreign protein is a P.69 protein from Bordetella pertussis or fragment C of tetanus toxin.

* * *