JPH01503442A

JPH01503442A - 無毒の微生物とその使用

Info

Publication number: JPH01503442A
Application number: JP63505197A
Authority: JP
Inventors: カーチス，ロイ　ザ　サード
Original assignee: モレキユラー　エンジニアリング　アソシエーツ　インコーポレーテツド
Priority date: 1987-06-04
Filing date: 1988-06-01
Publication date: 1989-11-22
Anticipated expiration: 2012-08-13
Also published as: JP2640525B2; AU623599B2; ZA883954B; DE3886506T2; AU1955088A; EP0315682A1; EP0315682A4; ATE98870T1; IE881646L; EP0315682B1; DK175512B1; IL86583A0; NZ224884A; US5389368A; WO1988009669A1; KR890701125A; DE3886506D1; DK52789A; CN1030018A; KR0139950B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】無毒のマイクローブとその使用〔技術分野〕本発明は無毒のマイクローブ、その製法及びワクチンにおけるその使用に関する。

〔背景技術〕

感染疾患に対して従来用いられていたワクチンは、一般に（１）生の抗原、その７ラグメント又は天然白米の抗原又はエピトープの合成アナローブを含む病因学的剤力λら精製された特異的成分、（■）抗イデイオタイプ抗体、（Ｉｌｌ）全く殺さｎた病因学的剤又は（ＩＶ）生ワクチンとしての病因学的剤の無毒の誘導体よりなる。これらのタイプの多くのワクチンが存在し、その中で下記のものめ二選ばれた例である。

米国特許第４２５０２６２号は、ストレプトコッカス・ミュータンスから酵素グルコシルトランスフェラーゼを回収する方法及びむし歯に対する局所免疫にこの精製した酵素を用いること（タイプｌワクチン）を開示している。ｉ菌の培養の詳細、酵素の精製そして唾液中の工μ抗体を刺激するために＃素を用℃すること＋ｔ、Ｓ、ミュータンスの血清型２．ｃ又はｇにつ℃・て提供されて（・る。細菌の精製した特別な成分からのワクチンの例ヲマ、米国特許第４２０３９７１及び３２３９７４９号に見〜・出され、それらは淋菌の外部皮膜からの糖蛋白よりなるＮｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｎｏｒｒｈｏｅａｅによる感染に対して有用なワクチンを開示している。糖蛋白の注射は殺菌性抗体を刺激する。

米国特許第３９３１３９８号に開示された経口投与のむし重に対する免疫に死んだＳ、ミュータンス細胞を用いることは、タイプｌワクチンの例である。発叫者は、免疫グロブリン（Ｉｇ人）抗体が生成される抗体でありそしてそれらがプラーク形成の低下をもたらしたことを認めた。

エツジエリシア・コリ菌の選択された菌株を含む生の細菌性ワクチン（タイプ■ ）は、米国特許第３９７５５１７号に開示されている。細菌は希ホルマリ／により処理されてメスブタの乳腺に注射される前にそれらを弱毒化又は部分的に不活性化した。それにより生成した抗体は、後でミルク中に見い出されセしてＥ、フリ感染に対して新生のブタを保護した。＆コリネ活性化を生じたホルマリン処理は、細菌の一時的な弱毒化に過ぎずそして注射前に細菌性の再生を防ぐための注意をしなければならない。

このような再生は保護よりも重大な感染をもたらしたであろう。

宿主中で実質的に生存できない菌株をもたらす無毒の菌株に突然変異を導入することにより該菌株を開発することは可能であった。これらの菌株は、遺伝子的に弱毒化されたといわれる。説明を簡単にするために、遺伝子的弱毒化の原則は、サルモネラ系について説明されるが、しかし原則は下記のように広く適用できる。

サルモネラ−ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｎ、Ｓ、　ｔｙｐｈｉ及び侵入性の他のサルモネラ種は、角に結合したリンパ球様組織の細胞（ＧＡＬＴ　；　Ｐｅｙｅｒのパッチ）に付着、侵入そして増殖することにより、口腔内の消化後深部組織に入る（　Ｃａｒｔｅｒ及びＣｏｌ　１　ｉｎｓ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ−１３９；１１８９〜１２０３（１９７４））。ＧＡＬＴへの抗原のサルモネラ仲介伝達が体液及び細胞の免疫レスポンスと同様−膜化した分節免疫レスポンスを導き出すため、ＧＡＬＴＩｉＣ付着しそして侵入するその能力を損うことなく疾患を生じさせる能力を失った無毒のサルモネラ・ミュータンスは、ＧＡＬＴへ外米の抗原例えばコロニー化又は有毒な抗原を運ぶ肩効なベクターとして働くように思われ、そしてこのような抗原から由来した病原に対する保護的免疫を誘発するように思われる。他の微生物から抗原を発現する無毒なサル七不２ワクチン株の構築は、組換えＤＮＡ技術を用いることにより、又は古典的な遺伝子移動法（Ｆｏｒｍａｌら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　３４　：　７４６−７５０（１９８１））を経て達成される。前者の場合、無毒のサルモネラ株は、通常サルモネラと遺伝子情報を交換している生吻から（５ｔｅｖｅｎｓｏｎ及びＭａｎｎｉｇ。

ＦＥＭＳ’Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１．　Ｌｅｔｔ、　２８　：　３１７−３２１（１９８５）　；　ＣｌｅｍｅｎｔｓらＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｔｎ、　５３　：６８５〜６９２（１９８６））並に遺伝子の伝達の古典的な手段によりサルモネラへの遺伝子の情報を伝達できない微生物から（Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　Ｄｅｎｔ −Ｒｅｓ、　６５　：１０３９〜１０４５（１９８６））発現遺伝子を構築した。このような二価の無毒なサルモネラ株は、抗体を引き出し、そして一つの場合では発現した抗原に対する細胞免疫レスポンスを引き出す（Ｂｒｏｗｎら、　’ 　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｄｉｓ、　１５５　：　８６＝９２　（１９８７）　）ことが示されているが、コロニー化又は有毒な抗原を供給する病原に対する採掘的免疫を誘発することに関するデータは、まだない。

Ｂａｃｏｎら（Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、　３２　：　８５ −９６　。

１９５１）が、Ｓ、　ｔｙｐｈｉの栄養要求変異体の無毒を研究した初めての人々である。彼等は、プリン、ｐ−アミノ安息香酸及びアスパルテートを要求する変異体がマウスに対する有毒を低下させることを認めた。Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ及びＦｕｒｅｒ　（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　４　：　６６３　＝　６７３（１９７１））は、初めてマウスにおける無毒化及び免疫原性についてｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍのｇａｌＥ変異体の使用を研死し、次にヒトの腸チフスに対するワクチンとしてＳ・ｔｙｐｈｉ　ｇａｌ　Ｅｆ異体Ｔｙ２１ａの使用を提案している（Ｊ。

Ｉｎｆｅｃｔ、Ｐｉｓ、１３１：５５３−５５８（１９７５））。

５ｔｏｃｋｅｒ　（米国特許第４５５００８１号）は、Ｔｎ　１０によるトランポゾン突然変異誘発次に７サール酸酎性に関する選択を用いて、ＴｎｌＯ及び隣接ＤＮＡ配列の欠失損失が生じて、Ｂａｃｏｎらにより用いられた突然変異体に明らかな問題に転することのできない欠失突然変異を生じた。Ｓ　ｔｏｃｋｅｒは、初め葉酸塩生合成に必要なｐ−アミノ安息香酸及びエンテロケリンへのプレカーサーであるジヒドロキシ安息香酸な含む化合物の芳香族アミノ酸７７ミリーを合成する能力を欠いたａｒｏム欠失に）突然変異体を単離し、そして最近アデニン生合成を欠く欠失突然変異体とΔａｒｏ　Ａ突然変異とを組合わせた。ジアミノピメリン酸を要求するＴｎｌＯ誘発且つサール酸耐性のΔａｓｄ突然変異が用いられて、一般的な分泌免疫レスポンスを誘発するその能力を欠くことな（Ｓ −ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ無毒株をもたらした。多くのサルモネラが有毒に関与するプラスミドを有しているので、プラスミドキュア誘導体が検討されそして生ワクチンとして用いられることが提案された（ナカムラら、Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｔｔｕｎｕｎ、　５０　：５８６〜５８７（１９８５））。

免疫原性を損うことなくサルモネラを無毒にする上述の手段のそれぞれは利点を有するが、それぞれに問題がある。ｇａｌＫ突然変異株は免役原性を維持しつつ生長することは襦しい。それはそれらがガラクトース感受性を有するが、ガラクトースの存狂下に生長させて正常のＬＰＳを生成させねばならないが、それはしかし非免役原住であるガラクトース耐性変異体に選択的に導かれる。

△ａ　ｒ　ｏＡ突然変異体はエンテロケリン及び葉酸の両方の合成を廃止するが、Ｓ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ有毒株に対するエンテロケリンの必要性は、Ｂｅｎｊａｍｉｎら（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｔｎｍｕｎ−５０：３９２−９７（１９８５））の広範囲な研究により疑問とされ、それは、鉄をキレートしそして移動するＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの能力と干渉する任意且全ての突然変異は、有毒について顕著な作用がないということである。それ故、Δａｒｏム突然変異体の無毒化は、ｐ−７ミノ安息香酸（ｐＡＢＡ）それ故葉酸を合成する無能力に全くよるもののようである。Ｂａｃｏｎら（同上）は、ｐＡＢＡを合成できない突然変異体により感染されたマウスの飼料にｐ−７ミノ安息香酸を投与することは、野生型のレベルの有毒に導いたことを認めたので、その合成が無毒の突然変異体でブロックされる中間代謝物の飼料消費によりワクチン株の無毒の表現型逆転に関しなければならない。Δａｓｄ突然変異体は、これらの他の回期性のあるものを有しないが、経口給餌及びＧＡＬＴの侵入後に急速に死んで、従って一般的な粘膜の免疫を引き出すことのみに有効でありそして体液及び細胞の免疫を誘発するのに無効である。

〔発明の開示〕

本発明は、トランスポゾン誘発突然変異体（無毒へ導く損失が飼料により又は動物宿主が供給できるすべてのものにより修復されない）を用いることにより、従来のワクチンの欠陥の多くを扱う。これらの欠失はもち論組換えＤＮＡ技術により導入される。

本発明は、病原性マイクローブの無毒の誘導体よりなるを椎動物又は無を椎動物の免疫用のワクチンを提供し、その誘導体は官能性アデニル酸シク之−ゼ及び環状ハ伊レセプター蛋白を実質的に生成できない。

本発明は又マイクローブの無毒誘導体よりなるを椎動物又を椎動物の免疫用のワクチンを提供し、その誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を生成できず、一方該を椎動物又は無を椎動物の病原から由来する組換え遺伝子を発現できて、該病原に対して該を椎動物又は無を椎動物において免疫レスポンスを誘発できる抗原を生成する。

本発明は又を椎動物又は無を椎動物の免疫システムを刺激する方法を提供し、それは病原性マイクローブの無毒な誘導体よりなるを椎動物又は無を椎動物の免疫用の無毒のワクチンを該を椎動物又は無を椎動物に投与する工程よりなり、該誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を生成できない。

本発明は又を椎動物又は無を椎動物の免疫システムを刺激する方法を提供し、それはマイクロープの無毒の誘導体を該を椎動物又は無を椎動物に投与する工程よりなり、該誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を生成できないが、該を椎動物又は無を椎動物の病原から由来する組換え遺伝子を発現できて、蚊病原に対して該を椎動物又は無を椎動物に免疫レスポンスを誘発できる抗原を生成する。

本発明は又病原性マイクローブの無毒の誘導体よりなるを椎動物又は無を椎動物の宿主蛋白の合成用の担体マイクローブを提供し、該誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を生成できないが、を推動物又は無を推動物の宿主から由来する組換え遺伝子を発現することができて該を推動物又は無を推動物に免疫レスポンスな抑制、調整又は増強できる生成物を生成する。

本発明は又を推動物に病原性マイクローブの無毒の誘導体を導入することよりなるを推動物又は無を推動物の免疫レスポンスを詞節する方法を提供し、該誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白な生成できないが、該を推動物又は然を推動物から由来する組換え遺伝子を発現できて該を推動物又じ、無を推動物の免疫レスポンスを抑制、調整又は増強１−ウる遺伝子を生成する。

不発タコは又アレルゲンに対１．てを推動物又は無を推動物を減感する方法を提供ｌ−１そわは該ぞ推動物に病原性のマイクローブの無毒の誘導体（該を推動物又は先を推動物に対して活性なアレルゲンを生成する生物から由来する組換え遺伝子を発現する）を投与して、該を推動物の該アレルゲンに対して該を推動物又は無を推動物を減感しうる抗原を生成し、該無毒誘導体が官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を生成できない。

不発明に又病原性マイクローブの無毒な誘導体を生成する方法を提供し、該誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を生成できず、その方法はトランスポゾン突然変異誘発の手段により病原性マイクローブを突然変異して、アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白のための遺伝子のそれぞれに欠失突然変異を形成し、そして該誘導体を単離することよりなる。

同じ目的は、又アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白のための遺伝子中に欠失を生ずる組換えＤＮＡ技術を用いることＫより達成される。

図面の簡単な説明第１図は、Ｘ、　４０６４のＺ　４　Ｘ　１０’　ｃｆｕ及びＸ３４５６の庖ＯＸ　１０’　ｃｆｕを経口投与後の時間−Ｐす・ｃｒのパッチ（即ぢＣＡＬＴ　）がらのＳ、　ｔｙｐｌｘｉｎｒｕｒ　Ｎｖｓｍ△ｃｙｈΔｃｒｐＸ　４０６４　（０）及び野生型のＸ　３４５６　（０）の回収を示すＣ蚕直の件は標準偏差を示ず４、第２図Ｃｊユ、Ｘ４０６４の７．４　Ｘ　１０’　ｃｆｕ及びＸ；う４５にの４゜ＯＸ　１０’　ｃｆｕによる詳口投与後特定の時間における腸間膜リンパ節（口Ｄ）及び牌（ΔΔ）からのＳ、ｔｙｐｈｉ＋、＋ｕｒｉｕｒｎΔＣ３””ｏΔｅｙｐＸ４０６４（口Δ）及び野生型Ｘ３４５６（口Δ）の回収を示す。組直の棒は標′＄偏差な示す。

第３図は、あるＳ−ｊ３／ｐｈｊｒｎｕｒｌｌｎ曹株のプラスミド含量を示す。

プラスミドＤＮＡはＢｉｒｎｂｏｉｍ　（Ｍｅｔｂｏｄｓ−ＥｎｚｙｍｏＬ　１００　：　２４３”２５５，１９８３）の方法により抽出され、α５チ（ｗｔ／ｖｏｗ）アガロースゲルに添加し、エチジクムブロミドにより染色した。Ｘ３３４４及ヒＸ　３３３７分解物をフェノール／クロロホルム／エーテルにより抽出しそして密度勾配遠心分＊＜かゆなかツだ。レーンの菌株（１００ｋｂプ之ススミド　：”＃Ｘ３０００（ｐｓｔＬＴｌｏｏ）；ｂ、Ｘ３３４４（→：Ｃ，Ｘ３３４７（ｐｓｔＬＴｌｏｌ）；ｄ、Ｘ３３０６（りＳ　ｔｓＲｌｏｏ　）　；　ｅ−Ｘ３３３７　（→；ｆ、Ｘ３３３８　（ｐＳ　ｔｓＲｌｏｌ　）　；　ｇ− Ｘ３３３９　（ｐｓｔｓＬｌｏｏ、９０ｋｂ、８ｋｂ）；ｈ、Ｘ３３４０　（９０ｋｂ。

８ｋｂ）；　ｉ、Ｘ３３５１　（ｐｓｔｓＲｌｏｌ　）、？−カープラスミドＲ１ｄｖｄ　（１００ｋｂ　）及びダイマーｐＡｃＹｃ１ｇ４　（８ｋｂ）（図示せず）であった。

第４図は、１００ｋｂプ乏スミドの制＠酵素消化プロフィールを示す。プラスミドＤＮＡはＨｉｎｄｍ　Ｋより消化し、α６チ（Ｗ／Ｖ　）アガロースに移しそしてＸチジウムプロミドにより染めた。レーンはＨｉｎｄｌｌ！にょ９消化された７アージ入ＤＮＡを含む。下記の菌株（及び対応ずルフラスミド含量）を１／ −ンに示ス。ｂ、Ｘ３０００（ｐｓｔＬＴｌｏｏ）；Ｃ，Ｘ３３Ｏ６（ｐｓｔｓＲｌｏｏ）；ｄ、Ｘ３３３８（ｐｓｔｓＲｌｏｌ　）；ｅ、Ｘ３３３９（ｐｓｔｓＬｌｏｏ、９０ｋｂ、８ｋｂ）；そし、てｆ、　Ｘ３３４０　（９０ｋｂ、８ｋｂ）。

第５図は、Ｓ−ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｓ　Ｒ−１１をマウスに経口投与した後の（Ａ）　Ｐｅｙｅｒのパッチ及び（Ｂ）　Ｂｉ！臓に２ける全ＣＦＵを示す。Ｘ３３０６（Ｏｏ）、Ｘ３３３７（０口）。幾何平均上ＳＤ、ｎ＝２〜７匹のマウス。

ＣＰＵに関するｌ−ティルドスチューデントのテストのＰ値は、Ｘ３３３７よりＸ３３０６が大きい。ａ〈α０１２５％　ｂ＜０．０００５゜第６図は、野生型及び１００ｋｂプラスミドキュア５Ｒ−１１によるマウスの混合経口感染の結果を示す。

Ｐｅｙｅｒのバッチ（Ｏ）、腸間膜リンパ節（４及び牌臓（ロ）から回収した野生ＷＸ３４５６対キュアしたＸ３３３７の比の幾何平均上ＳＤ、ｎ＝３−７匹のマウス、投与７日後Ｂ＝＋ｌ、Ｘより大きい比の幾何平均に関する１−ティルドスチューデントのテストのＰ値；ａ〈α０５、ｂ＜α０１２５、ｃ＜０．００２５、ｄ＜０．０００５゜牌の比は、感染後３日（Ｐ＜０．０Ｎ２５）、４日（Ｐ＜０．０００５）そして５日（Ｐ＜Ｑ、００２５）でＰｅｙｅｒのバッチの比より太きかった３、腸間膜リンパ節の比は、感染後３日（Ｐ＜（１０５）そｔ５て５日（ｐ＜ｏ、ｏｏｓ）でＰｅｙｅ＋ｒのパッチの比より太きかった。

第７図は、５Ｌ１３４４によるマウスの経口投与後マウスの組織中のＣＦＵを示す。Ｘ３３３９（空いたシンボル）、Ｘ３３４０１！つだシンボル）。Ｐｅｙｅｒのバッチ（口、＋１）、腸間膜リンパ節（Δ、ム）、牌臓（０，・）。

幾何平均上ＳＤＳ　ｎ＝２〜７匹のマウス。ＣＦＵに関するｌ−ティルドステユーデントはＸ３３３９はＸ３３４０より大きかった。ａ〈α０２５、ｂくαｏ１２５、ｃくα０００５゜〔発明の詳細な説明〕本発明は、成る突然変異がその免疫原性に実質的に影響することなくマイクローブを無毒にするという発見に基づく。さらに詳しくは、本発明は、マイクローブがそれぞれアデニル酸シクラーゼ（ムＴＰピロホスフェートリアーゼ（環化）　Ｅ　Ｃ４，６，１−１）及び環状ＡＭＰレセプター蛋白（ＣＲＰ）を合成する能力をなくす欠失（Δ）突環化−３’５’−ＡＭＰ　（ＣＡＭＰ）及び環状ＡＭＰレセプター蛋白は、多数の代謝中間体の移動及び分解に関する多数の遺伝子及びオペロンの転写に必要である。燃料／炭素源を移動するのに用いられるシステムは、三、四のアミノ酸パーミアーゼと同じ（ｃＡＭＰによる正のコントロールの下にすべであることを示す証拠が提供された。

異化作用におけるその重要な役割に加えて、細胞中のｃＡＭＰ＃ｆもステンベレート７アージの溶原化、フィムブリエの合成、鞭毛の合成及び少くとも一つの外ＨＢの蛋白の合成に影響する。ｃＡＭＰは哺乳動物の細胞に存在するが、サルモネ５−が浸入且増慣するマクロファージ及び他の細胞に存在する濃度は、Δｃｙａ突然変異体をして生体外で野生型の表現型を示させるのに必要な０．１〜１゜ｃ　ＡＭ　Ｐの吸収により生ずるすべての利点を実質的に失わと、マイクローブはワクチンの免疫原性成分として働いてマイクローブに対する免疫を誘発させる。従って、アデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰレセプター蛋白Ｌｆ＄［ｉ！する遺伝子を有するすべてのマイクローブの使用は、本発明により考えらｎ１サルモネラ、Ｅ、コリーＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍハイブリッド、Ｓｈｉｇｅ目ａ　、Ｅｒｗｉｎａ　、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　。

Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ又はＢｒｕｃｅｌｌａを含むがこれらに限定されない。好ましいマイクローブは、サルモネシ属例えばＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、　Ｓ−ｔｙｐｈｉ　、５−ｐａｒａｔｙｐｈｉ、Ｓ、ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、５−ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓ＋ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓ、ａｒｉｚｏｎａ又はＳ、　ｄｕｂｌ　ｉｎである◎本発明の他の態様において、不発明において担体細菌として記載される＠原性１イクロープの無毒な誘導体が、選択された抗原なＧＡＬＴ例えば回腸のＰｅｙｅｒのパッチに運ぶのに用いられる。地医のある属例えばサルモネラは、Ｐｅｙｅｒのパッチに向うことが知られている（　ＣａｒｔｅらＰ、　Ｂ、及びＦ、　Ｍ、　Ｃｏ１１ｉｎｓ　、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　１３９　：１１８９（１９７４））。Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍ　−Ｅ、コリハイブリッドも又マウスにおけるＰｅｙｅｒのバラｆをコロニー化することが示されている（　Ｈｏｈｍａｎｎ　、　Ａ、　Ｗ、ら、Ｉｎｆｅｃｔ、　ａｎｄ　Ｉｏｎｍｕｎ、　２２　：　７６３　（１９７８）　）。

もしこれらの担体細Ｍが搭頂性生物から組換え遺伝子を含みしかも発現するならば、病原から生成した抗原性決定子住成物に対する組体りＸ誘発されるだろう。

組換えＤＮＡ技術の出現により、脣異的な抗原が病因剤によってではなく、その抗原に関する遺伝子を発現できる細菌の他の宿主菌株により生成される全くユニークなワクチンを開発することが現在可能くなってきた。又抗原が哺乳動物の宿主の抗原と交差反応し従って自動免疫の誘発を強化するとき、組換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子を変化して、影響する交差反応の抗原性決定子が生成されないこともできる。従って組換えＤＮＡ技術を用いて、を推動物の宿主の抗原と交差反応できるか又は自動免疫状態を出現できるすべての材料を有しないワクチンを開発できる。

本発明は、局所の免疫が重要で第一線の防御である、細菌性、かび注、寄生虫性又はウィルス性の疾患剤に対する有効なワクチンの開発に対して広い応用性を有する。

成る例は、Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｐｅｓｔｉｓＶｃより生ずる肺ベスト、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅにより生ずる淋疾、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ　ｐａｌｌｉｄｕｍにより生ずる梅毒及びクラミジア・トラコマチスにより生ずる目感染及び性病のコントロールのためのワクチンである。グループＡ及びグループＢからの５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉの種例えば咽喉炎又は心疾患を生ずる種、Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ。

Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、　Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｅ。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔ＊５ｓｉｓ、　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｅｐｒａｅ。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ａｖｉｕｍ、　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ、５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。

Ｂｒｕｃｅｌｌａ　ａｂｏｒｔｕｓ、　Ｐａ５ｔｅｕｒｅｌｌａ　ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ。

Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａ、　Ｓｈｉｇｅｌｌａ種及びＬｅｇｉｏｎｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａは、それから遺伝子が得られる本発明の範囲内のｍ画の追加の例である。フィルス性ワクチン例えばインフルエンザウィルスに対して生成されたものは、又本発明に包含される。ウィルスワクチンは又ＤＮＡ又はＲＮ人ウィルスの何れかの他のウィルス例えばパポウイルス、アデノフィルス、ヘルペスフィルス、ポックスウィルス、７寸ルポウイルス、レオウィルス、ピコルナウィルス、ミキソウイルス、パラミキソウイルス又はレトロウィルスの綱に対して生成される。病原性かび、プロトシア及び−１１Ｅｆｆｌによる感染に対して保護するワクチンは、又本発明に含まれる。

他の態様において、ワクチンの免疫原性成分が宿主のアレルゲンのとき、このようなワクチンは、アレルギー宿主を特異的に減感するようにデザインされた露出処方で用いられる。

その態様の一つでは、本発明は、を推動物又は無を推動物の免役用のワクチンとして記述され、それは病原性マイクローブの生の無毒の誘導体よりなり、該誘導体は官能性アデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰレセプター蛋白を生成できないが、該動物のアレルゲンｔｉｒ成する生物か又はその病原である生物から由来する組換え遺伝子を発現できる。

他の態様において、本発明の無毒なマイクセーブは、種々の宿主蛋白の合成用のベクターとして用いられる。

本発明の無毒なマイクローブが、宿主中への導入後Ｇ　Ａ　Ｌ　Ｔ　、　！ＩＩＦ　ｒａ３膜リンパ節及び牌臓を含む種々の免疫能構造を妨害することができるので、このようなマイクローブは、種々の免疫調節生成物を目指すのに用いられる。

従って免疫調節蛋白又はペプチドをエンコードする１個以上の遺伝子が組換え的に無毒のマイクローブの中に導入されて、適切な免疫能組ｉ＆に存在するようになったマイクローブは組換え生成物を発現できて、宿主内の免疫レスポンスを抑制、増強又は修飾する。免疫調節分子の例は、コロニー刺激因子（マクロファージ、顆粒球又は混合＊）、マクロファージ・ケモトキシン、マクロ７アージ阻害因子、白血球阻害因子、リンパトキシン、胚発生因子、インターフェロン及びインターロイキンを含むがそれらに限定されない。

不発明のさらに他の態様は、種々の生理学上の機能（即ち生長速度、血圧など）を刺激又は抑制する薬理学上活性な生成物を伝達又は生成する本発明の無毒のマイクローブの使用である。

本発明のこれらの態様における用語のそれぞれは以下の記述において分析される。

ワクチンにより、生きている生物の免疫システムを刺激して将来の被害に対する保護を提供するのに用いる剤を意味する。免役化は、遅硬した高いレベルの抗体及び／又は細胞の免疫レスポンスを誘発する方法に関し、Ｔ−リンパ球は病原を殺す及び／又は他の細胞（例えば食細胞）を活性化して生物体内でそうさせ、生物が先にさらされていた病原又は抗原に対して向けられる。「免疫システム」は、外来の物体の存在に対する単細胞の生物のレスポンス例えばインターフェロン生成を包含するが、本明細書ではこの用語は解剖上の特徴及びメカニズムに制限され、それにより多細胞の生物が生物の細胞又は生物の細胞外の液に侵入する抗原性材料に対して抗体を生成する。生成された抗体は、免疫学的クラス例えば免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｇ又はＭのすべてに属する。特に面白いのは、免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の生成を刺激するワクチンであり、それは不発明のワクチンはＩｇＡ生成を刺激するものに制限されないが、温血動物の分泌系により生成される主な免疫グロブリンであるからである。

例えば、本明細書に記載された性質のワクチンは、ＩｇＡ形成に加えて広範囲の他の免疫レスポンス例えば細胞及び体液の免疫を生成しそうである。抗原に対する免疫レスポンスは十分に研究され広く報告されている。免疫学の概説は、Ｂａｒｒｅｔｔ、Ｊａｍｅｓ、　Ｔ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　：　４版、　Ｃ，Ｖ、　Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ　。

ＭＯ（１９８３）に示され、この全部を文献として引用する。

を推動物は、そのすべてが分断された骨又は軟骨のを柱により特徴づけられる魚、両生類、爬虫類、烏及び哺乳類を含むを索動物の門の主璧な部門であるを推動物の部門のすべてのメンバーである。すべてのを推動物は、機能的な免疫システムを有しそして抗体を生成するととＫより抗［Ｋ反応する。従ってすべてのを推動物は、ワクチンに反応できる。ワクチンは最も普通には哺乳動物例えばヒト又はイヌ（恐大病ワクチン）Ｋ与えられるが、他のクラスの商業上飼っているを推動物例えば魚及び鳥のためのワクチンも、もし本明細書に記載された性質のものならば、本発明の範囲内にある。

無を推動物は、を推動物を除く動物界のすべてのメンバーである。このような動物は、を推動物の部門を構成しそしてを骨又はを柱を有しない。この分類は、魚、両生類、爬虫類、鳥及び哺乳動物を除くすべての動物を含む。多くの無を推動物は、抗原性刺激に対して原始的な免疫レスポンスを表すことができ、そしてを推動物を感染しそして不発明に従って開示された同一の微生物におかされ易い。

このような無を推動物の例は、貝及び軟体動物そして他の関連のある動物である。孟を推動物の保護におけるワクチンの使用は今迄十分に記述されていないが、当業者は、それらの原始的な免役システムの使用により該無を推動物に対する本発明の応用性を認識するだろう。例えばそして本発明によれば、サルモネ２による感染を貝がうけ易いことは、サルモネラの無毒の菌株の導入を許し、それにより反応する原始的免疫システムに関する可能性をもたらす。それ故、病ｆｆ１Ｋ対する該無を推動物に存在する免疫システムからレスポンスを刺激することは、無を推動物を感染できる病原性マイクローブの無毒な誘導体を用いる本発明の範囲内である。

本発明の一つの態様において、病原又はアレルゲンに対する抗体レスポンスを刺激するのに用いられる遺伝子生成物の担体としてＧＡＬＴ又はＢＡＬＴに向う病原性マイクローブの無毒の誘導体の使用がある。無毒とは、その属又は種のマイクローブがかつて病原として機能できなかったことを意味するのではなく、用いられる特別なマイクローブが治療される特別の動物について無毒であることを意味する。マイクローブは、通常は病原性であるがしかし無毒である菌株に属さねばならない属又は種すらに属する。病原性とは、疾患を起しうるか又は正常の生理学上の機能を損うことができることを意味する。

無毒の菌株は、通常はその有毒な病原性の相手と結合している送息の徴候のすべてを誘発できない。本発明で用いられるマイクローブＩ工、Ｉ−ｉ菌、プロトシア及び単細胞かびを含む。

第一の生物から第二の生物（通常第一の生物と遺伝的材料を交換しない）へ遺伝的材料を移動する技術は、急速に組換えＤＮＡ技術を拡大するく果として広ぐ最近利用できるようになった。この明細書では、第二の生物の再生が同一の遺伝的Ｙ料を含む子孫を生じさせるやり方で、一つの生物から第二のものへ移動した遺伝的材料は、組換え遺伝子と呼ばれる。用語遺伝子は、本明細書ではその最も広い意味で用いられて、遺伝の任意の生物学上の単位を示す。組換え遺伝子が元の生物に存在するような完全な遺伝子である必要はなく、それは巨大分子例えば官能性ポリペプチドの生成を謂箇するか又は生成することができた。遺伝子は、″ ｆＬ原性生成物の生成にガイドとして用いられるテンプレートとして働きうろことのみが必要である。生成物は、元の生物に正確な形で見いだされなかったものでもよい。例えば、１００個のアミノ酸残基よりなるポリペプチド抗原についてコードする機能性遺伝子は、一部担体マイクロープに移動されて、７５個のみ又はたとえ１０（ｆｌのアミノ酸残基よりなるペプチドは、宿主細胞の細胞メカニズムにより生成する。しかし、もしこの遺伝子生成物が元の生物に存在する同様なに原に対して抗体の形成を生じさせる抗原ならば、遺伝子は不発明で規定された用語遺伝子の範囲内にあると考えられる。又は、もし特定の抗原又はその７ラグメントのアミノ酸配列が周知ならば、自動化された遺伝子合成器などの手段によりＤＮＡ７ラグメント又はそのアナローブを化学的に合成し、そして該ＤＮＡ配列を適切な発現ベクターに導入することができる。スペクトルの他の宋端において三、四の遺伝子生成物についてコードするＤＮＡの長い部分があり、その一つ又はすべては抗原的である。従って、本明細書中の遺伝子は、抗原を生成できる遺伝の任意の単位である。遺伝子は、染色体、プラスミド又はウィルス由来のものである。

遺伝子が免疫レスポンスを表すのに有効であるために、遺伝子は発現されねばならない。遺伝子の発現とは、遺伝子の構造に個有の情報（ＤＮム塩基の配列）が、遺伝子が存在する細胞の生化学的メカニズムによりＲＮＡ分子、ポリペプチド又は他の生物学的分子の形で物理的生成物に移動することを意味する。生成した生物学的分子は、遺伝子生成物と呼ばれる。こ−で用いられる用語遺伝子生成物は、遺伝子のコントロールの下で生ずる生化学的反応の結果として生成される任意の生物学的生成物と呼ばれる。遺伝子生成物は、例えばＲＮＡ分子、ペプチド又は酵素のコントロールの下生成される生成物又は遺伝子の最初の生成物である他の分子即ち代謝中間体である。例えば遺伝子は先ずＲＮＡ分子の合成をコントロールし、次にリポソームの作用により＃累（遺伝子が見い出される元の細胞とは外部の環境においてグリカンの形成をコントロールする）に翻訳される。ＲＮＡ分子、酵素及びグリカンはすべて用語が本明細書で用いられるとき遺伝子生成物である。これらのすべてそして多くの他のタイプの遺伝子生成物例えば糖蛋白及び多糖類は、もし動物の免疫システム中に導入されるならば、抗原として働く。糖蛋白及びリポ蛋白を含む蛋白遺伝子生成物は、ワクチンで抗原として用いるのに好ましい遺伝子生成物である。

ワクチンが抗体を生成するのに有効であるためには、抗原性材料は、ワクチン化動物の抗体産生メカニズムが役割を果すやり方で放出されねばならない。それ故、遺伝子生成物のマイクローブ担体は、動物に導入されねばならない。前述のように、ＧＡＬＴ又はＢＡＬＴ細胞の好ましいレスポンスを刺激するために、胃又は気管に直接マイクローブ又は遺伝子生成物を導入することは、好ましく、例えば経口投与、胃内注入又はエログルリ形がそれであるが、ワクチンを投与する他の方法例えば静脈内、筋肉内、皮下の注射又は乳房内又は陰茎内又は腔内の投与も可能である。

無毒のマイクローブが担体マイクローブとして用いられそして一度担体マイクローブが動物に存在するとき、抗原は動物の免疫システムに利用されるようになる必要がある。これは、担体マイクローブが死んだとき達成されて、抗原分子が放出される。もち論、分解なしにペリプラスムの内容物を放出する［もれやすい（ｌｅａｌｙ）　Ｊ無毒の突然変異体の使用は、又可能である。一方、遺伝子が選択され、抗原の生成をコントロールし、それは細胞の列前に担体細胞により外部の環境に利用されよう。

このやり方で、ワクチン化された動物例えばそのＰｅｙｅｒのパッチに持続する生きたマイクローブを用いることが可能であり、そして抗原を生成し続けそれにより連続的に抗体の形成を誘発する。これらの状況の下の好ましい遺伝子生成物は、細胞膜を経て外部の環境に移動する生成物又は外部の膜に付着又は埋め込まれる生成物であって、遺伝子生成物の全部又は一部は環境にさらされる。

この後者のタイプの遺伝子生成物の代表的なものは、保′Ｗｋが望まれる生物の表面に通常見い出される抗原である。

もしこれらの抗原が通常のやり方で細胞の表面に移されるならば、抗原に対する抗体の形成は増大しよう。

他の病原からＧＡＬＴ又はＢＡＬＴへ抗原を伝達する病原の使用は、もしこのような病原が無毒にされ一方Ｐｅｙｅｒのバッチ又はＢＡＬＴＫ侵入する能力を維持することが事実でないならば、不適切であろう。　９、組換え遺伝子が由来する先物は、ワクチン化される動物の任意の病原であるか、又は動物のアレルゲン又は他の抗原を生成した生物である。アレルゲンは、この場合それらに対してワクチン化さｎる動物中にアレルギー反応を生ずる物質である。多くの異る材料はアレルゲン例えば動害の鱗屑及び花粉であり、そして個々の動物のアレルギー反応は任意の特定のアレルゲンについて変化するだろう。通常アレルギーレスポンスを示す動物にアレルゲンに対する耐性を誘発することは可能である。耐性を誘発する方法は周知であり、そして一般に投与量を増しつつ動物にアレルゲンを投与することよりなる。耐性−誘発の詳しい記述は、前記のＢａｒｒｅｔの教科書に示されている。最後に、他の薬理学的に活性な物質に関する免疫調節遺伝子がベクターにより発現しつつあるとき、宿主生物それ自体が遺伝的材料の源として働くことができる。

動物への前述のタイプの生のワクチンの投与は、任意の周知又は標準の技術による。これらは、経口投与、胃内注入又は気管・鼻スプレィを含む。これらの方法のすぺては、生のワクチンを容易にＧＡＬＴ又はＢＡＬＴ細胞に達せしめ、そして抗体の形成を誘発しさらに投与の好ましい方法である。投与の他の方法例えば静脈内注射（担体マイクロープを動物の血流に違せしめる）が使用できる。静脈内、筋肉内又は乳房内の注射も又後述の本発明の他の態様により使用できる。

投与の好ましい方法が経口投与、エロゾルスプレイ及び胃内注入であるので、好ましい担体マイクローブは、ワクチン化される動物の気管又は小腸のリンパ上皮簿造のすべてに選択的に向う種に属するものである。これらの菌株は、腸病原性菌株の遺伝的増殖により生成される腸病原性菌株の無毒の誘導体であることが好ましい。

Ｐｅｙｅｒのパッチに向い従ってＩｇＡの生成を直接刺激する菌株が最も好ましい。動物においてこれらはＰｅｙｅ　ｒのパンチに向うサルモネラ及びサルモネラ・Ｅ、コリハイブリッドの特別な菌株を含む。

組換えＤＮＡ技術は現在十分に周知でありそして日常に行われていることと考えられるように広く知られている。非常に一般的且広い意味で、この方法は、一つの生物の遺伝的材料又はさらに普通には遺伝的材料の一部を第二の生物に移して、移動された遺伝的材料が、それが移された生物の遺伝的材料の永久的な部分（組換えられて）となることよりなる。これは通常はプラスミド又は元の染色体から元の生物からＤＮＡの小片を先ず得ることからなる。プラスミド（染色体外の要素とも呼ばれる）は、細胞の染色体から物理的に別の遺伝的単位である。

ＤＮＡは任意のサイズのものでありそして特別な塩基対の部位でＤＮＡ分子を分裂するように働く制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用によりしばしば得られる。

プラスミド、ファージ又は；スミドベクターへリゲーションして組換え分子を形成した後、組換え分子は、種々の手段例えば形質転換（種々の化学品例えばカルシウムイオンの存在により人工的に誘発される、外部の環境から裸のＤＮＡを採取すること）により宿三ｋＢ胞中に移される。

他の方法例えば形質導入も又好適であり、組換えＤＮＡは７アージ例えば形質導入７アージ又は；スミドベクター内に封入される。一度胆換えＤＮＡが担体細胞中にあると、それは別の片（一般に完全な伝達プラスミド）として存在し続けるか又はそれは宿主細胞の染色体くそう入されて細胞分裂中に染色体により再生される。

遺伝的材料の移動は比較的簡単である力；、どの移動物が発現された遺伝子を生ずるかを予言することは可能ではない。しかし、この選択方法は本発明にとり困をさをもたらさない。宿主マイクローズが移動された遺伝子を発現しそれにより抗原を生成しなければならないので、「ショットガン」アプローチが良く働く。

抗体は、先ず所望の抗原例えば病原性マイクロープからの細胞膜の７ラグメントについて標準的接衝により生成される。抗原の源である生物からのＤＮＡは、エンドヌクレアーゼにより多くのフラグメントＶｃ８裂され、そしてフラグメントは好ましくはクローニングベクターの手段により、担体マイクロープ中にランダムにそう人される。＠原から抗原を発現するマイクローブは、病原抗Ｊｉｌ対する抗体とのそれらの反応により容易に同定できる。抗原発現マイクローブは、選択且クローンされて所望の組換え生物を生ずる。ショットガン・クローニングは周知でありそしてＭａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、ら「Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂａｒａｔｏｒｉｅｓ　（１９８２）　Ｋ詳述されており、これを引用する。遺伝子移動の技術は、本発明の一部とは考えられず、無毒のマイクローブに発現される生物から遺伝子よりなる組換え生物を生成しうるすべての方法は十分であろう。

種が通常遺伝的情報を交換する場合、遺伝子移動のより古典的方法が用いられ、たとえば複合、形質転換又は形質導入がある。

無毒のマイクローブの誘導体は又本発明の範囲内にあると考えられる。誘導体とは、天然に存在する有毒なプラスミドにより又はなしで官能性アデニル酸シクラーゼ及びｃＡＭＰレセプター蛋白を生成する無能力を保持する、単−又は多数の塩基置換、欠失、そう入又は転化を含む無毒の菌株の有性又は無性の子孫及び突然変異体を意味する。例えば、菌株例えばＸ４０６２及びＸ４０６４は、経口注入後菌株に従う好都合なマーカーとして不発明で用いられるナリジク酸耐性を付与するｇｙｒ　Ａ突然変異を有する。しかし、薬剤耐性は、ワクチンとして用いられる菌株について望ましい属性ではない。従って、ｇｙｒ＊＋する）遺伝子を形質導入することにより容易に除去できる。

要求される投与量は、遺伝子生成物の抗原性により変化しそして存在するワクチンの代表的な免疫レスポンスを誘発するのに十分な量であることのみを要する。

日常の実験は、所望の量を容易に確立しよう。ワクチンの代表的な最初の投与量は、α００１〜ｌ”Ｐ抗原／に９体重であり、所望のレベルの保護をもたらすために必要ならば増大した量又はマルチプル投与物を用いる。

ワクチンが７！！濁又は溶解される製薬上の担体は、任意の溶媒又は固体であるか、又は注入された動物に無毒であって担体生物又は抗原性遺伝子生成物と両立しうる材料中に封入される。好適な製薬上の担体は、液体の担体例えば生理学上の濃度又にそれに近い正常の塩水及び他の無毒な塩、並に固体の担体例えばメルク又は砂糖そして又家畜用の飼料に混入できるものを含む。添加物を加えて所望ならば抗原性を増大させる。気管を経て投与するのに用いられるならば、ワクチンは好ましくはエロゾルの形で提供される。

病原由来の遺伝子主成物による免疫化は、又病原からの組換え遺伝子により特定される遺伝子生成物を発現する担体として働く病原性微生物の無毒の誘導体による従来の免疫化と組合わせて用いられる。このような非経口免疫化は、一度その病原由来遺伝子生成物への分泌免疫システムが担体マイクローブによる免疫化によりプライムされるならば、分泌免疫レスポンスの発現を増大させるブースターとして働き、病原由来遺伝子生成物を発現してＧＡＬＴ又はＢＡＬＴのリンパ球細胞を刺激する。増大されたレスポンスは二次のブースター又は既往レスポンスとして知られそして宿主の永続した免役保護をもたらす。ブースター免疫化は、多数回繰返えされて、有利な結果をもたらす。

上述の記述は一般に本発明を記載している。さらに完全な理解は下記の実施例について得られ、それらは説明のためのみに提供されそして他に特定されていない限り制限することを目的としていない。

本発明を実施するのに有用な菌株の寄託下記の医株の生物学的に純粋な培養物の寄託は、１９８７年７月１５日にＡｍｅｒ　１ｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ　ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）　、１２３０１　ＰａｒｋｌａｗｎＤｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　になされ、そして示された寄託番号は成功した生存テスト後付与されそして必要な料金を支払った。寄託はブタベスト条約の条文に従ってなされた。該培養物は、サンプルの供給についての最も最近の妥求後少くとも５年そして寄託の口径どんな場合でも３０年の期間永久に入手できるようにされる。

培養物が生存しなくなったり又は不注意で損われるならば、それは同じ分類学上の記述の生存している培養物と置き換えられよう。

菌株　ＡＴＣＣ隊Ｘ４０６２　５３６４７Ｘ４０６４　５３６４８〔発明を実施するだめの最良の形態〕笑施例１本笑施例は、ＣＡＭＰ合成及び利用に影響する欠失突然変異の導入による無毒のマイクローブの構築を示す。

細菌の菌株。用いたサルモネラｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株は第１表にリストされる。それらは、５％グリセロール含有１４　Ｂａｃｔｏ・ペプトンに石濁されそしてドライアイス・エタノールで急速凍結されて一７０℃で正副二つで貯蔵され、セして又５０％グリセロール含有１％Ｂａｃｔｏ−ペプトンに懸濁され通常の使用に一２０℃に貯蔵された凍結培養物として雑務された。

培地。日常の珊養用の複合培地は、Ｌ−プロス（Ｌｅｎｎｏｘ。

ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１　：　１９０＝２０６（１９６５））及びＬｕｒｉａブロス［Ｌｕｒｉａ及びＢｕｒｒｏｕｓ、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

７４　：　４６１〜４７６（１９５７）：ｌであった。Ｄｉｆｃ。

アガーをＬｕｒｉａプロスにベースアガーでは１２％、ノットアガーではα６５％加えた。ペンアッセイアガーを細菌の日常の計数に用いた。発酵は、１％の最終の濃度の適切な炭水化物を有するＭａｃ　Ｃｏｎｋｅｙベースアガー又はＥｏｓｉｎメチレンブルーアガー（Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ。

５８：９〜５４（１９６８））を補給することにより評価した。

合成巧地は、前述（Ｃｕｒｔｉｓｓ、　Ｊ、　Ｂａｃｔ、８９　：　２８〜４０（１９６５））のように最適のレベルで栄養分を補給されたミニモル液（ＭＬ）及びミニマルアガ−（ＭＡ）であった。ゼラチン含有バッファー塩水（ＢＳＧ）（Ｃｕｒｔｉｓｓ、　１９６５９　同上〕を希釈剤として日常に用方法（Ｄａｖｉｓら、”　Ａ　Ｍａｎ、　ｆｏｒ　Ｇｅｎｅｔ−Ｅｎｇ−−Ａｄｖ。

Ｂａｃｔ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　−Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ。

（１９７９））を用いて形質導入のため日常に用いた。

ドナー菌株の１晩の培養ぞを１：２０に予め加温したＬｕｒｉａプロスで希釈し、３７℃で振盪しつつ６０分間生させた。感染混合物を約１５時間１晩振盪し、クロロホルムを加えそして３７℃でさらに１０分間ａｔしそして懸濁物を遠心分離（５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｃ，８Ｓ−３４＊　−ター、　７．　ＯＯＯｒｐｍ、　１０分）して細菌の屑を除いた。

ファージ（約１０”／ｍ）を含む上澄み液をクロロホルム上で４℃で貯蔵した。

ＩＬ５声ｔ／ｍｌの濃度にテトラサイクリ／を用いてＴｉｎ１Ｏ誘発突然変異の形質導入について選択した。

欠失突然変異に関する７サ一ル酸選択。Ｍａｌｏｙ及びＮｕｎｎ　（Ｊ、　Ｂａｃｔ、　１４５　：　１１１０−１１１２（１９８１））Ｋより記載された培地及び方法を用いた。

まで３７℃で１２−５ｐｔテトラサイクリン／−を含むＬ−ブロス甲で１晩生長させた。培養物を次にｌ：４０に予め加温したＬ−グロスにより希釈しそして３７℃で通気して約２　Ｘ　１０’　ｃｆｕ　／ｄのタイターにした。ＢＳＧに希釈した適当な数（即ち１０７〜１０８）の細胞をフサール酸含有培地に置きそして３７℃で４８時間インキコベートシた。フサール酸耐性単離物を同一の選択性培地でＮ製した。羊−の単離物を取り上げ、伍長させそして１２５μｔテトラサイクリン／ｉを！する又は有しないべｙアッセイアガーでテトラサイクリン感受性についてＬｏｎｉｓ　、　ＭＯ）をすべての感染性及び免疫の実験につり・て用いた。３又は７週令の動物を置いそして笑験に用〜する前に隔離した呈で１週間置いた。実験用マウスを、ワイヤー床を有するＮａ１ｇｅｎｅフィルターで力／＜−シたケージに入れた。飼料及び水は自由に摂取させた。動物の室を、１２時間の照明をして２２〜２３℃に保った。

動物の感染性。Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＭ株の毒性は、以下の経口又は腹腔内の注入により決めた。マウスの注入用の細菌は、Ｌ−グロス中で３７℃で静置培養物として１晩生長させた。これらの培養物を１：５０に予め加温したＬ− グロスにより希釈し、約０．８〜ＬＯの０Ｄ６００Ｋまで約４時間３７℃で通気した。細胞を、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ５Ｃ遠心分離機中で４℃で１０分間７．００　ＯｒｐｍでＣＳ人口−ター中で遠心分離し次ＫＢＳＧに懸濁することにより５０倍に濃縮した。

適当な希釈物をタイター測定のためにベンアッセイアガーに置ぎそしてｃｙａ／ｃｒｐ表現型を確めるために１％マルトース含有ＭａｃＣｏｎｋｅｙアガーに置いた。

すべての経口投与では、マウスは感染４時間前に飼料及び水を与えられなかった。マウスは、次にＰｉｐｅｔｍａｎ　Ｐ　２０を用いてＢＳＧ中に懸濁された２　０　ｐｔのＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍを経口投与される５分前Ｋ　Ｐｉｐｅｔｍａｎ　Ｐ　２００を用いて３０μＡｆ）Ｉ（１（Ｗ／ｖ）重炭酸ナトリウムを投与した。飼料及び水は経口投与３０分後に元に戻した。マウスの罹病率及び死亡率を３０日間について観察した。

絶食させていないマウスの腹腔内注入は、２６ゲージ針を用いて行われて、Ｂ’ ＳＧに希釈した３００Ｐｔの細ｍＦＪ濁液を与えた。マウスの罹病率及び死亡率を３０日間について観察した。

ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｍ突然変異薗株化よる感染を生存したすべてのマウスを、経口ルートにより野生型マウス有＠ｓ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍ　Ｓ　Ｒ１１８株Ｘ３３０６のＬＤ、ｏ投与量の１０ ”−１０’倍により３１日にチャレンジした。次に１マウスの群を経口的に種々の投与量の無毒の突然変異体により免疫化し、次に最初の免疫化後種々の時間に程々の投与量の有毒なＸ３３０６細胞によりチャレンジした。罹病率及び死亡率を実験中そしてＸ３３０６細胞によるチャレンジ後少くとも３０日間観察した。

生体内の生存Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍａ胞の計測。野生型及び突然変異体Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍ　Ｓ　Ｒ１１菌株のコロニー化及び持続性は、前述の方法により約ｌＸｌ０’細胞のマウスの経口投与後に測定された。Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞のタイターは、経口感染４，２４，４８，７２及び９６時間そして７日後に、小腸及び直腸の内容物そしてＰｅｙｅｒのパッチ（８〜１０）のホモジネート、除去したＰｅｙｅｒのパッチと回腸の末端部分に位置する不腸壁のｌＯｃ！Ｒ部分そして直腸壁について測定された。腸間膜リンパ節及び牌のホモジネート中の細胞のタイターも又測定さｎた。マウスをＣＯ：窒息により安楽死させそして腸間膜リンパ節、牌、小腸及び直腸を、氷上に置いた冷却したＭ　Ｌ　＋　１　’５チ砂楯ミニマルンルト（ＭＬＳ　）に直ちに入れた。４．０艷の冷えたＭＬＳを含むベトリ皿を用いて小腸を保持し、一方Ｐｅｙｅｒのパッチを小さな外科用ハサミにより除いた。Ｐｅｙｅｒのパッチを１ｄずつの冷ＢＳＩｍより２回洗い、次に１−の冷ＭＬＳ及びガラスピーズな含むガラス栓付管（１５Ｘ　１００　ｍ　）に入れた。小腸を次に縦に切りそして内容物及び壁を５０ｍのデイポーザプル円錐管に入れ、そして冷ＭＬＳを五〇−加えて１分間攪拌した。小腸の１０ｃ＋＋＋切片を除き、５ｄのＢＳＧＫより２回洗い、ｚ５ｚＩｔの冷ＭＬＳ及びガラスピーズを含むガラス栓付管（１５Ｘ１００ｇｍ）ｋ入れた。小腸の内容物を縦の切断及び小腸の洗滌中に用いた冷ＭＬＳから回収し、小腸内容物を含む５０ｍのディスポーザブル円錐管に加えた。４０１ｄの冷ＭＬＳを含むベトリ皿を用いて直腸を保持し、一方それを縦に盲腸を通って切った。

直腸の内容物及び直腸の壁を、１分間攪拌前に５０ｍの最終容量に入れた。直ｗｋ壁を次に除きそして５Ｉｌｌ！のＢＳＧで２回洗い、次ｋｌ１５ｍの冷ＭＬＳ及びガラスピーズを含むガラス栓付管（１５Ｘ１００ｗ）ｋ入れた。直腸の内容物を、縦の切断及び直腸の洗滌中に用いた冷ＭＬＳから集めそして［９Ｉ内容物を含む５０−のディスポーザブル円錐管に加えた。腸間膜リンパ節及び結合脂肪組織をＬＯｄの冷ＭＬＳ及びガラスピーズな含むガラス栓付管（１５Ｘ１００ｍ）に入れ攪拌した。９６時間及び７日間ハーベストした牌臓をＤｏｕｎｃｅ乳棒タイプ組織ホモゲナイザーに直接イーセしてＺ５ｉ、ｄの冷ＭＩ、Ｓとともに摩砕することにより処理した。ガラスピーズ及び組織の入った台管を高速で５ｐｅｒミキサーを用いて４〜５分間攪拌した。懸濁物をＢＳＧ中で希釈しそして１％ラクトース及び４０μｔのナリジク酸／ｄを含むＭａｃ　ＣｏｎｋｅｙアガーＶｃ置いた。装生存タイターを、懸濁物の容量、希釈物差にプレートカクントを用いて決めた。１チの種々の炭水化物を含むＭａｃ　Ｃｏｎｋｅｙアガーを用いて回収した生物が予想された表現型を有することを立証した。

ｃｙａ及びｃｒｐ突然変異を有するＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　５ＲＩＩをＢＡＬＢ／Ｃマウスの経口感染に用いた。明らかに病気の動物を５日後に殺しそして次に立証された十分にマウス有毒の革離物Ｘ３１８１をＰｅｙｅｒのパッチから回収した。ナリジク＆に対する耐性を有するｇｙｒ人突然変異はＰ２２形質導入によりＸ３１８１に導入されてＸ３３０６を生じ、すべての菌株の元である（第１表）。

１００ｋｂ再毒プラスミドをキュアしたＳ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ単離物が十分にＰｅｙｅｒのパッチに付着、侵入そして持浸し５るが、腸間膜リンパ節及び牌臓に浸３３０６と同様にプラスミド・キュアされたＳ。

ｔｙｈｉｍｕｒ　ｉｕｍ　Ｓ　Ｒ１１回株Ｘ３３３７に導入された。Ｘ３３３７へのｐｓｔｓａｔｏｏプラスミドの再導入は完全にその有３性を保ち（実施例３参照）、従って有毒なプラスミドのキユアリング甲二次的突然変異がＸ３３３７に生じないことを保証することは強調されねばならない。

第２表は、種々の炭素源上の生長及び砂糖の発酵に関するすべての突然変異菌株及びそれらの元の表現型の性質をリストしている。表現互は、異化活性に関する環状ＡＭＰ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白についての要求の公表された報告に基いて予想されたものである。（例外異体のように行動したＸ４０６０である）。

すべてのコタ及びＧｏｔｓ、　Ｊ−Ｂａｃｔ、１０３：５１３−１６（１９７０）；及びコメダら、Ｍｏ１．Ｇｅｎ１　Ｇｅｎｅｔ。

１４２：２８９〜２９８（１９７５））に基いて予想されるようにフィムブリエ及び鞭毛を欠く。ｐｓｔｓＲ１００プラスミドの存在はこれらの表現型に作用を有しなかったことも明らかである。

フサール酸耐性且テトラサイクリン感受性の誘導体の選択をともなう構築の各段階で、テトラサイクリン耐性復！変異体／突然変異体が元のＸ３３０６Ｍ株について観察されるのよりも高い頻度で回収されるかどうかについて検討を行った。

全ての場合に、このようなテトラサイクリン耐性復帰変異体／突然変異体は観察されなかった。

三、四の突然変異菌株及びそれらの元のα５チグルコ一ス含有ＭＬ中のインキュベーション時間及び発生時間の関数としてのα５チグルコース含有ＨＡのコロニー直径を第３表に示す。Δｃｒｐ突然変異とともに又はなしに、さらＫｌｔＳＲ１００プラスミドの存在又は不存在に関係なく△ｃｙａ菌株が、元のＸ３３０６培養物よりはるかに遅く生長することは明らかである。

第３表　細菌の菌株の主長の性質Ｘ３３０６　ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　：ｌｌ　１１　ｍｌ　７８Ｘ３３３７　ｖｉｒｉｌｄ−ｔｙｐｅ　２［１１Ｚｌ　８２（ａ）　ＭＡ＋α５％グルコースのプレート当り〜１ｏ。

分布したコロニー（ｂ）　Ｍ　Ｌ　＋　０．５チグルコース中の生長有毒性に関する予備的な情報は、個々のマウスを１０’突熱愛異体細胞を腹腔内Ｋ又は１０”突然変異体細脂を経口的に感染させそして罹病率及び死亡率を記録することにり、そして何れの感染を生存するマウスは野生型Ｘ３３０６細胞によるチャレンジに対して免疫になるので、Ｘ３３９５及びＸ３３９６の有毒に対する次の研究に着の約１０３倍の感染を生存することな示すデータを含む。

研究は、次にＴｎｌＯ及び隣接ＤＮＡ配列が欠失した菌株について開始した。第５表は、Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＷｆ主！、Δｃｙａ及びΔｃｒｐ　ｔｉ株により経口的に感染されたマウスの罹病率及び死亡率に関するデータを示す。

感染時のマウスの週今に関係なくすべてのマウスは、すべての突然変異医株の野生型ＬＤ５．投与量の１０００−４０００倍による感染に生存することは明らかである。ｐＳ　ｔｓＲ１００キュアされた誘導体Ｘ３３３７の無ＩＨＣ関する案５表の情報は、冥施例３に示されるより詳細な研究と一致する。

第６表は、Δｃｙａ及びΔｃｙａΔｃｒｐ菌株Ｘ４０６０及びＸ４０６２（プラスミドキュア）及びＸ４０３２及びＸ４０６４（プラスミド含有）による感染に関する追加のデータを示し、それはＩ　Ｘ　１０’細菌により経口的に感染されたマウスは、感染されないままのマウスと殆んど同じように生長することを立証している。

第７表は、　Ｓ、ｔｙｐｈｉｎｏｕｒｉｕｍ突然変異体の腹腔内チャレンジに関するデータを示す。マウスは、種々の突然変異Ｍ株について野生１ＷＬＤｓ＠投与量の１０２〜１０３倍での感染に生存した。高い投与量で、一部工ントドキシンの作用によるものと思われる病状が観察された。

第４表　経口投与３０日後のＢＡＬＢ／ＣメスマウスのＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ（ａ）　免疫化の時点。

（ｂ）　死亡した動物。

（Ｃ）　健康−疾患の認めうる徴候なし；貧弱−明らかに病気。

Ｘ３３３７　ｖｒｉｌｄ−ｔｙｐｅ　−凹ＸＩ♂ｇｄ　６／６　貧弱Ｘ４０３２　Δす１−１　＋　１３ｘｌＯ’　４ｗｋ　６／６　健康Ｘ４０３２　、ｋｙａ −１＋　Ｌ３ｘｌＯ’　８ｗｋ　６／６　健康Ｘ４ｏ６０ｔｃＹａ−３−７，８ＸｚＯ４ｗ’ｘ　６／６　健ＲＸ４０６０Δｑａ−３−７，８Ｘ１０　８Ｗｋ　６／６　健康Ｘａ２　＄３．ｋｒｐ−２　−　１．２Ｘ１０’　４％−ｋ　６／６　健１ｔＸ４０６２　すｙａ−３へ卯−２−１，２Ｘ１０”　８ｗｋ　６／６　健、東Ｘ４０６４　ヘ選一１Δｃｒｐ−１＋　ｉ、２ｘｌｏ　４ｗｋ　６／６　偉朕Ｘ４０６４　ｌ￥）１−１２−７ｐ−１＋　１．２ｘｌＯ’　８ｗｋ　６／６　健康（ａ）　チャレンジの時点（６）健康−疾患の認めうる徴候なし；貧弱−明らかに病気。

（Ｃ）　死亡の平均口＝７８後の８週令ＢＡＬＢ／Ｃメスマウスの生長の評価Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ　１９２−１−０３２１８ｆ０．３菌株による８週令ＢＡＬＢ／Ｃメスマウスの腹腔内チャレンジ３０日後の罹病峯及び死亡率Ｘ３３０６　ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ　＋　＜５０　３／６　７　貧弱Ｘ３３９５　ｃｙａ：：ＴｎｌＯ＋　ＬＯｘｌＯ’　ｏ／ｓ　１２　なし１．０Ｘ１０’　１１５　７　貧弱ＬＯＸＩＯ’　Ｏ１５３なしＸ３３９６　ｃｒｐ７７３：：ＴｎｌＯ＋　Ｌ９Ｘ１０’　５１５　−　健康四ＸＩＯ’　４１５　１８　噴１’１Ｘ１０’　１１５　１２　貧弱Ｘ４０６２へター３へ叩−２−ＬＯｘｌＯ’　５１５　−　健康ＬＯＸＩＯ’　５１５　−　健康１．０Ｘ１０’　０１５　１０　なしＸ４０６４　ム■−１なｒｐ−１＋　１．．６　ｘ　１０’　５１５　−　健康１．６Ｘ１０’　２１５　１４　貧弱Ｌ６Ｘ１０’　０１５　１６　なしく、１）死亡した動物の日（ｂ）　健康−疾患の認めうる徴候なし：中程度−中程度に病気：貧弱−明らかに病気。

無毒の突然変異体による免疫化の有効性。第８表は、十分に有毒なＳ、ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍＳＲｌｌ　Ｘ３３０６細胞のＬＤｓ・投与量の１０倍の次の経口チャレンジに対する免の悪い場合のチャレンジの下、多くのマウスは減退した飼料消費とともに中程度の病気を示すが、ただしＸ４０６４により免疫されたマウスは健康のままでありそして正常に食べそして生長した。チャレンジ３０日後の全ての動物（たとえＸ４０６４により免疫にされたものでも）を殺すと、牌ｍ腫大を示しそしてＸ３３０６野生型チャレンジ薗株を回収するが無毒のΔｃｙａ又はΔｃｙａΔｃｒｐワクチン医株を回収しない能力を示した。対照的に、牌臓腫太及びチャレンジ医株の回収は、約ｌＸ１０’Ｘ４０６４により免疫化されたマウスが十分に有毒なＸ３３０６０元のＭ株のＬＤｓｏ投与量の僅か１００〜１０００倍でチャレンジされたとき、観察されなかった。

生体内の無毒の突然変異体の組織栄養及び待伏性。第１及び２図は、経口投与後の時間の関数としてナリジク酸感受性野生型態株Ｘ　３４５６　（Ｔｎｍｉｎｉ −ｔｅｔ、ラベル；異は少くとも保護的免疫を誘発するのに十分な時間Ｐｅｙｅｒのパッチに付着、侵入及び持続するＳ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの能力を有意に損わないが（第１図）、しかし牌臓に達するか又は生存する能力を損う（第２図）。

第８茨　２Ｘ１０”　ｃｆｕ野生型有毒Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍ　Ｓ　Ｒ−１１によるチャレンジに対する保護における無毒Ｓ。

ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ　Ｓ　Ｒ−１１ΔｃｙａΔｃｒｐ突然変異体による免疫化の有効性（ａ）（ω　示された菌株による４又は８週令のマウスの免疫化３０日後。マウスはＺ　ＯＸ　１０’　ｅｆｕのＸ３３０６野生型有毒Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｓ　Ｒ−１１の経口投与によりテヤレ／ジされた。

ら）免疫化の時点。

（Ｃ）　死亡した動物の免疫化後。

（ｄ）　健康−病気又は疾患の認めうる徴候なし：中−中程度の病気。

無毒突然変異体の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与される菌株は、それらの無毒性及びそれらの免疫学的属性の両方について完全な安定性を有しなければならない。それ故三、四の候補となるワクチン菌株を通気しつつ後期対数期までＬ−グロス中で生長させ、５ｏ倍に濃縮させそして元の突然変異体の生長を助けない炭素源を含む一連のミニマルアガー培地で種々の希釈尻で橿付けた（第２表）。−組のプレートに７０−の細胞の死を生じさせる強度で紫外線を照射した。自然発生的な復帰変異体／突然変異体をΔｃｙａ菌株Ｘ４０３２において低いがしかし測定可能な頻度（第９図）で観察し、そしてΔｃｙａ　８株Ｘ４０６０では高い頻度で観察し、これらの復帰変異体の多（は多くの炭素源で生長することができそしてそのため環状ＡＭＰの不存在下でＣＲＰをして転写を活性化させるｃｒｐ”　［５ｅｈａｌｔｅ及びＰｏｓｔｍａ、　Ｊ。

Ｂａｃｔ、　１４１　：　７５１−５７　（１９８０）　；　Ｇａｒｇｅｓ及びＡｄｈｙａ、　Ｃｅ１１４１　ニア４５〜５Ｘ　（Ｉ９８５））又〜８９（１９８１））突然変異のようであった。

ΔｃｙａΔＣｒｐ鑑株例えばＸ４０６４からの復帰変異体／突然変異体は、非常にぼれて（第９図）、そしてそれらが選択された炭素源（却ちマン；、トール）で生長できたが、元の匣体が利用できなかった他の炭素源のすべてで生長できなかった（蕗２弄）。これらの復帰変異体／突然変異体は疑いなくプロモーター突然変異を有し、ＣＢＰＫ無関係に特定の遺伝子／オペロンの転写を生じさせる。

紫外融の照射は突然変異／復帰変異の頻度を増大させなかった。

６８！の復帰変異体／突然変異体を有毒性について評価した。４匹のマウスを用いて各復帰変異体をテストした。

１匹は１０’細胞の経口投与をうけ、他は約１０”細胞の仕口投与をうけ、１匹は１０２細胞の腹腔内投与をうけ、そして１匹は１０細胞の腹腔内投与をうけた。すべての場合において、すべて３２匹のマウスは健康でおりそして帰変異体は、それらの元の無雪性を保った。そのため、上記の結果は、アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰなおｐｓｔｓＲ１００プラスミドを有するワクチン菌体レセプター蛋白を合成する能力を欠きさらにｐｓｔｓＲ１００有毒プラスミドを苓するか又は有しない多数のマウス有毒Ｓ−ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｓ　Ｒ１１株Ｘ３３０６の誌導体の構築を証拠立てている。すべての菌株は投与のａロルートにより無毒でありそしてすべて有毒Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｔｎ野生型細胞による次のチャレンジに対して高度の保護的免欠失による二重突然変異体の使用は、環状ＡＭＰＫ関する必要性が全くないＣＲＰ蛋白による活性を要する、遺密接）ＣＭ合しセして又環状ＡＭＰについての必要性を回無毒にだもたれたとしても、十分な独立した復帰変異単離物は有毒についてテストされて、有毒性が保だｎていないことが結論され、それ故このような変化がなさそう異は顕著Ｋ　Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍの有毒性を低下させ（第４変異はなお菌体を無毒にする。

Ｘ６０６４は、プラスミドのない菌体４０６２によりも高度の免疫を誘発する（第８表）。これは疑いもなく一般にＸ４０６４（第１及び２図）及びプラスミド含有画体の増大した能力によるものであり、腸間膜リンパ節及び屏のプラスミドのない画体より高いタイターを達成しそして長＜Ｎ続する（実施例３参照）。一方１．Ｘ４０６４による免役化は、若い動物において又は栄養不良又はさもなければ妥Ｓされた個体においてＸ４０６２による免役化よりも十分に耐えられない。この点において、もし二つの免役化が望まれたならば、一つは先ずＸ４０６２により免疫しそして次にＸ４０６４により免疫しただろう。

ワクチン画体例えばＸ４０６２及びＸ４０６４の望ましい使用は、もしそのことが望まれるならば、−膜化された分節免疫レスポンス及び体液及び細胞の免疫を誘発するために、他の病原から胃矩合りンパ球組織へ遺伝子により発現されたコロニー化又は有毒抗原をターゲットにするために担体として働くことである。そのため、種々のクローン化ベクターがＸ４０６２及びＸ４０６４に導入されそしてこれらのプラスミドは野生型の元の菌株におけるのと同じ又はそれより大きい安定性を示す。事実、Ｘ４０６２及びＸ４０６４の遅い生長速度（第３表）は、疑いもなくプラスミドレプリ；ンの能力を増大させて、染色体複製を保ち、後代細胞がプラスミドを含むことを確実にする。さらに、種々の組換え誘導体を構築しそして唾液糖蛋白被覆の歯表面へのＳ、ｍｕｔａｎｓ及びＳ。

５ｏｂｒ　１ｎｕｓのコロニー化に必要なコロニー化抗原Ｓｐａムが、無毒の他の突然変異とともにＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ　ｉ株におけるよりもΔ ｃｙａ△Ｃｒｐ突然変異体において高度に発現されることが分った［Ｃｕｒｔｉｓｓ、Ｊ−Ｄｅｎｔ−Ｒｅｓ。

６５　：１０３４〜１０４５（１９８６）］。

笑実施例この実施例は、Δｃｙａ　、Δｃｒｐ突然変異が他のサルモネラ種に導入されて、該種を無毒にし従ってワクチン成分として有用であることを説明する。

本発明のこの態様を実施するのに有用なサルモネラ種は、トリサルモネラ菌株としてのＳ、　ａｒ　１ｚｏｎａ及びＳ。

ｇａｌ　１　ｉｎａｒｕｍ、ブタ特異性サルモネラとしてのＳ。

ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ　、ウシ特異性サルモネラとしてのＳ。

ｄｕｂｌｉｎそしてニワトリ、七面鳥、食肉用子ウシ、ブタ及びウマから単離された多くのＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ誘導体を含む。これらの菌株は、有毒なプラスミドとともに又はなしにΔｃｙａΔｃｒｐ突然変異体を構築するのに用いらｎて、マウスで先ずそして次に特定の動物宿主株における保護的免疫を評価する。これらの無毒なサルモネラ誘導体も又他の細菌性病原のコロニー化及び有毒な蛋白に対する保護的免疫の刺激のために二価の生のワクチン菌株を構築するのに用いられる。特に、Ｂ−ａｖｉｕｍ及び＆コリ即ちトリ類の高い罹病率及び死亡率に関係のある二種の呼吸器病原そしてウマの窒息を生じさせる５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ　Ｋ対するワクチンも製造される。

無毒サルモネラ菌株の構築培地中にそれぞれガラクトースの存在又は不存在に依Ｓ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ（ｒ）　８株に、そして同様な０抗原を有するＳ、　ｔｙｐｈｉ　、Ｓ、　ｐａｒａ　ｔｙｐｈｉ及び他の？ルモネラにｃｙａ：：ＴｎｌＯ及びｃｒｐ：：ＴｎｌＯ突然変異を導入する。

粗特異性の一般化形質導入７アージＰＩＬ４を用いて、Ｓ＋ａｒｉｚｏｎａ、Ｓ、ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、　Ｓ、ｄｕｂｌｉｎ及びＳ＋ｃｂｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ　ＫＴｎｌＯ誘発突然変異を導入する。前述のサルモネラ種のＰＩＬ４形質導入は、粗突然変異体の単離を要する。２−デオキシガラクトース耐性の選択ＰＩＬ４による形質導入により排除される。

安定な欠失突然変異体は、ｃｙａ：：ＴｎｌＯ及び／又はｃｒｐ：：ＴｎＩＯそう人突然変異を含む菌株のフサール酸耐性誘導体に関する選択により単離される。フサール酸耐性誘導体は、トランスポゾン及び隣接宿主染色体遺伝子の不正確な切断によりテトラサイクリン感受性である。

Ｔｎ　１０の連続した使用が望まれるとき、フサール酸耐性単離物は、例えば／・イブリッド化プローブとしてのλ二二つたことを立証する必要がある。

有毒なプラスミドをキュアしたサルモネラ菌株は、Ｓ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍについて開発された方法及び遺伝的手段を用いることにより構築される（実施例１及び３参照）。

Ｗａｙら（Ｇｅｎｅ３２：　３６９−７９）により記載されたＴｎ　ｍ１ｎｉ− ｔｅｔを構築のこの段階で用いる。トランスポイースを欠きそして自然発生的に欠失していないこのトランスポゾンは、恐ら（Ｓ−ｄｕｂｌｉｎ　、Ｓ、　ｇａｌｌ　ｉｎａｒｕｍ及びＳ、　ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓの有毒なプラスミドと相同である１　００　ｋｂ有毒プラスミドの有＠結合領域にそう入される（　Ｐｏｐｏｆｆら、Ａｎｎ−Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　（Ｉｎ５ｔ。

Ｐａ５ｔｅｕｒ）１３５Ａ：３８９−３９８（１９８４））。

ルした有毒プラスミドを約４３℃の高温度でノボビオシン、ＤＮＡジャイレース阻害剤中で細菌を生長させることによりキュアする。有毒プラスミドのキユアリングは、３２Ｐラベルした生の有毒なプラスミドによるキュアされた誘導体のハイブリッド化により確められうる。

構築されたすべての菌株は、遺伝的属性の安定性について評価され、そしてＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ朶然変異体に示される表現型を他のサルモネラ種に示されるかどうかを決める。動物における研究を助ける最後の段階は、医薬耐性マーカーな導入して、動物の実験中サルモネラ菌株に従って助けるととＫある。元来、これら耐性はマウス、ニワ）　ＩＪ又は七面鳥の正常のフロラに優勢でないので、ナリジク酸又はり７アンビシンの倒れかに対する耐性を用いる。

形質導入によりサルモネラ種のあるものにトランスポゾン誘発突然変異のあるものを導入することは、不可能である。一方、複合が有利に用いられ、それはトランスポゾン誘発突然変異が、組み込みＩｎｃＦ又はＩｎｃＰプラスミドによるＨｆｒからサルモネラへ移動するプラスミドにクローンされる。形質転換は他の一つの方法を提供し、それは染色体への配列の組換えの選択、プラスミドの排除及び正確な遺伝的欠陥の確認の工程が行われる。

免疫原性、コロニー化及び丹続性の評価前記のようＫｌｌ築された無毒のサルモネラ菌株は、経口投与、胃内注入又は腹腔内注射を用いてマウスで評価される。

方法は、サルモネラ菌株を対数相に生長させ、そしてゼラチン含有バッファーされた塩水中で約１０１０ａ胞／−にそれらを濃縮することＫより開始される。経口投与又は胃内注入される動物に、投与４時間前に飼料及び水を与えない。重炭酸ナトリウムを投与５分前にマウスに投与して胃の酸性を中和する。飼料及び水を投与３０分後にマウスに再び与える。マウスにおけるＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕ− ｒｉｕｍのこれらの突然変異菌体による以前の実験に基づいて、元来マウスによるチャレンジは１０”ＬＤｓ・投与量による。これは、もし種々のサルモネラ種の野生型がマウス有毒Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕ＋ｎについて既に観察されたのと同様のＬＤ、を与えないならば、実際的ではない。これは、１０９より多い生物の投与が難しいので、経口投与についてさらに問題となる。腹腔内投与は又工／トドキシンショックをもたらすレベル（約１０７細胸）以内の投与量で行われる。動物の体重及び健康状態が１箇月間モニターされる。

３０分間生存した突然変異サルモネ之菌株を投与されたマウスは、経口又は腹腔内ルー）Ｋより１０”ＬＤＳＯの有毒なサルモネラの元の菌株によりチャレンジされる。

感染された動物の健康状態は、生長の程度に関する周期的な評価により毎日追求する。チャレンジ前、唾液のサンプルをピロカルピン刺激により採取し、各動物な採血して血清を集める。サルモネラ表面抗原に対する血清中のＩｇＡ及びＩｇＧ並に唾液中の分泌ＩｇＡ及びＩｇＧの定量タイターを測定する。抗体タイター及び免疫の持続性に対する二次的免疫化の作用も又記録される。

無毒であり、高度の免疫を誘発しそして体重に悪影響を与えないワクチン菌株を用いて、４−　２４．４８．　。

７２及び９６時間にそしてもし必要ならばその後退の間隔で、小腸及び直腸の壁に付着しそしてＰｅｙｅｒのパッチ、小腸及び直腸の内容物、腸間膜リンパ節及び牌に存在する菌株の定量的タイターを測定する。この情報は、得られた免疫レスポンスに関するデータにより補正される。

マウスにおいて無毒且免疫的である菌株は、次に適当な動物においてテストされ、例えばニワトリ及び七面鳥のひなにおけるＳ、ａｒｉｚｏｎａ、Ｓ、ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及びトリＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍ　３株である。トリ宿主忙おゆる無毒性及び免疫原性の評価に従って、Ｆａｂｒｉｃｉｏｕｓの錫製、盲腸及び滑液包における有毒なサルモネラのタイターを、マウスにおいて検査された組織に加えて測定される。

Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ａｖｉｕｍＫ対して免疫するための二価のワクチン菌株の構築及びテストＢ、ａｖｉｕｍ　に対するワクチンは、コロニー化に関する表面構造及び抗原性を発現しなければならないが、皮膚壊死トキシンの毒性決定子であってはならない。表面蛋白に対するワクチンは、気管のコロニー化をブフツクすることにより免疫を生ずべきであるが、皮膚壊死トキシンｉｃ対する抗体はその有害な作用を中和しなければならない。コロニー化に関するＢ、ａｖｉｕｍ表面構造は未知であるが、λｇｔｌ　１発現ベクターにおけるＢ、　ａｖｉｕｍ並にトランスポゾン誘発Ｂ−ａｖｉｕｍ突然変異体の遺伝子ライブラリーの利用可能性は、底面蛋白をエンコードする遺伝子の単離及び同定を可能にする。無毒のサルモネラへの表面蛋白及び／又は皮膚壊死トキシン決定子Ｋｉｄする遺伝子を含む組換えプラスミドの導入により、コロニー化を防ぐことにより（そして従ってコロニー化に関する遺伝子を同定し）又はトキシンを中和することにより、保護的免疫を誘発する二価の菌株を選択できる。

Ｂ、　ａｖｉｕｍの外部の膜蛋白及び／又は皮膚壊死トキシンの遺伝子は、Ｃｕｒｔｉｓｓの方法（Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈ。

ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、ムＳＭ、ワシントン、Ｄ、Ｃ，（１９８１））に従って形質転換を経て適切な無毒のＳ、　ａｒｉｚｏｎａ　、　Ｓ−ｇａｌ　ｌ　ｉｎａｒｕｍ及び／又はＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ誘導体に移され、そしてこれらの蛋白の発現はクエスターン・プロット法（Ｔｏｗｂｉｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（Ｕ　Ｓ　Ａ　）７６：４３５０〜５４（１９７９））を用いて検査される。形質転換前の５０℃の５分間の熱ショックは、サルモネラのすべての制限バリヤーを克服するのに用いられよう。今迄の報告は、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａの遺伝子がＥ、コリプロモーターから転写されない限り、＆；りに有効に発現しないことを示している。Ｂ、　ａｖｉｕｍの遺伝子の発現及びサルモネラの外部の膜への蛋白の移送に関するこのような問題は、遺伝子がＥ−；’Ｊ１ａｍＢ又はｏｍｐＡ遺伝子へ融合する組換えベクターを用いることにより排除される。

さらに、Ｂ、ａｖｉｕｍ蛋白はサルモネラの外部の膜に移送しセして二価のワクチン囚株がＰｅｙｅｒのパッチをコロニー化するならば、強い免役レスポンスを刺激する可能性を増大させる。一度Ｂ、ａｖｉｕｍ遺伝子がサルモネラにそう入されるならば、組換えクローンは、Ｃｈｏｒｂｉｔら、ＥＭＢＯ，Ｊ、５　：　３０２９〜３７（１９８６）により開示されたように免疫ラベルされたサルモネラの特異性抗体及び電子顕微鏡を用いてコロニー免役プロットにより遺伝子の発現について分析される。

１〜３日令のひなを二価のワクチンにより経口的に免疫し、そして血清及び呼吸器の切片をモニターして、抗体レスポンスのタイプ（ＩｇＹ（ＩｇＧ、　７ｓｘｇ）、ｘｇｙｔ及びＩｇＡ（ＩｇＢ））並に量を測定する。免疫化及び非免疫化のひなを体重の減少について比較して、二価ワクチンの起りうる副作用をモニターする。さらに、七面鳥のひなを、１０’有毒Ｂ、ａｖｉｕｍによる鼻内注入により又は感染した鳥にさらすことによりチャレンジする。チャレンジされた七面鳥のひなを、疾患について観察し、剖検し、そして気管の組織の損傷並に生物のタイターの変化について検査する。

もしＢ、ａｖｉｕｍＫ対する粘膜の免疫レスポンスが、非常に若いニワトリ及び七面鳥を保護するのに不適切であれば、飼育しているニワトリをＢ、　ａｖｉｕｍ　’：ｊロニー化及び／又は有毒な抗原を発現する無毒のサルモネラにより免疫されて母系の抗体の卵移動を行わせる。このような処理は、Ｂ、ａｖｉｕｍへの免疫を増強し、一方若いニワトリ又は七面鳥のひなは成熟しつつある。同一の組換え担体を用いる保護的経口免疫化も又成熟中に投与される。

トリＥ、コリに対して免疫するための二価ワクチン菌株の構築及びテスト無毒のＥ、コリに増大した有毒性又はニワトリの気の５をコロニー化する能力を付与する組換えクローンは、前述の方法によりＳ、　ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ及び／又はＳ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの無毒の菌株に導入される。サルモネラ細胞表面上の有毒な決定因子の発現は、螢光抗体技術により決定されるが、Ｅ、コリ細胞表面決定因子はサルモネラの表面上で発現し勝ちであることは注意すべきである。

ニワトリは二価ワクチン菌株により経口的に免疫化されそして尾部の気のうに有毒なＥ、コリを注射することによりチャレンジする。もし敗血症が生じないならば、鳥は剖検されて、気のうをコロニー化する能力が影響されたかどうかについて決定する。次に１七面鳥のひなについて前述した呼吸器の切片及び血清における抗体のレスポンスのタイプ、量及び持続時間の包括的な研究を行う。

ワクチンの投与及び評価の技術は、Ｂ、ａｖｉｕｍワクチンについて前述したのと同一である。

５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ　Ｋ対する免疫を有するための二価ワクチン菌株の構築及びテストＳ−ｅｑｕｉＭ蛋白を発現するＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍの無毒の誘導体を構築した。

Ｓ、　ｅｑｕｉ　Ｍ蛋白遺伝子のＤＮプアーエ発生ランダムフラグメントをλｇｔｌ　１発現ベクターにクローンする。ライブラリーを、出血性紫斑病を有するウマの免疫コンプレックスに存在するＭ蛋白決定因子に対する保護的免疫及び抗血清を現すＭ蛋白７ラグメントに対して抗血清を順次にスクリーンする。保護的決定因子を発現するがしかし紫斑病決定因子を発現しないクローンした遺伝子を、ｌ　ａｔｎ　Ｂ又はｏｒｎｐ　Ａ遺伝子の何れかについて融合することについて選択する。これらの決定因子を有する無毒のサルモネラに対する免疫レスポンス番１、先ずマウス、次に子ウマ又はウマについて検討される。

その表面にＳ、　ｅｑｕｉのＭ蛋白の関連のエピトープを発現する前述のサル上半う菌株の利用可能性は、ウマにおける窒息に対する粘膜性の鼻咽頭の保護的免疫レスポンスを刺激する非常に有効な方法を構成する。Ｍ蛋白の紫斑病決定因子の切断は、ワクチンの安全に役立つ。

実施例３本実施例は、五、六のサルモネラ菌株の免疫原性及び有毒性に対する有毒プラスミド欠失の作用を説明する。

細菌の菌株本実施例で用いる細菌の菌株は、プラスミドの記述とともに第１Ｏ表にリストされる。三つのＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｒｒ、ｕ　−ｒ　ｉｕｍ菌株を用いた。マウス継代有毒菌株５Ｒ−１１及び５Ｌ１３４４及び毒性のより低い菌株ＬＴ２゜エツジエリシア・コＩＪＨＢＩＯＩ及びＣ６００を遺伝的増４に用いた。

培地及び生長条件他に示されない限り、ａ薗はＬ−グロス、又は下記の濃度（μ２／ｄ）で適切な抗生物質を補給されたＬアガープレー）　（Ｌｅｎｎｏｘ、　ＶｉｒｏｌｏｇＹ　１　：　１９０−２０６（１９５５））上で生長した。アンピシリン（Ａｍｐ　）　−１００−２００、テトラサイクリア　（Ｔｅｔ）−１１５−２５、クロラムフェニコール（Ｃｈｉ）−３０，カナマイシン（Ｋａｎ）−５０、ストレプトマイシン（Ｓｔｒ）−５０及びナリジク酸（Ｎａｌ）−５０゜付着、侵入及びマクロ７アージ感染のために１戚る培養物は、この培地が用いた哺乳動物細胞への細菌の付着を増大したために１Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎプロス（ディ７；、デトロイト）で生長させた。すべての培養物は適切な培地の静置ブロス中で３７℃で１晩生長させ、生長の後期対数相まで（ＯＤｓｏｅ約α４〜α７）振盪プロス中にサブ培養した。

遺伝的交換形質転換はＢａｇｄａｓａｒｉａｎ及びＴｉｍｍ１ｓ　（Ｃｕｒｒ−Ｔｏｐ・Ｍｉｃｒｏｂｉ’ｏ１．　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　９６　：　４７　”　６７　（１９８１）　）質導入は、Ｓｃｈｍｅｉｇｅｒ　（Ｍｏ１．　Ｇｅｄｌ　Ｇｅｎｅｔ、　１１９　ニア５〜８ｇ（１９７２））により記載されたように行われた。複合はプレート交配又はフィルター交配の何れかにより行った［Ｗｉｌｌｅｔｓ、　Ｍｅｔｈ、　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、１７：３３〜５ｇ（１９８４））。

ＤＮＡの増殖太量且急速のミニ分解プラスミド抽出をＢｉｒｎｂｏｉｍ［：Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　ｌ　００　：　２４３−２５５（１９８３））の方法を用いて行った。塩化セシウム密度勾配遠心分離、サイーン・ブラット・ハイブリッド化、コロニー・プロット・ハイブリッド化及びゲル電気泳動を標準的方法を用いて行った。［γ−３２Ｐ　］　Ａ　Ｔ　Ｐ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、アーリントン・ハイツ、イリノイ；比活性＝１４４５ｃｉ／ｍモル）ＫよるＤＮＡの切り込み翻訳は、製造者の指示にょ゛すＢｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ。

Ｍｄ、（ＢＲＬ）キットによった。制限酵素の消化は、製造者の指示に従ってＢＲＬからの酵素によった。

Ｔｎ　ｍ１ｎｉ−ｔｅｔによるＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ　１００　ｋｂｂプスミドのラベル化ｊｅｔを有するｐＮＫ８６１により形質転換した（Ｗａｙら、Ｇｅｎｅ３２：３６９−７９（１９８４））。Ｔｎｍｉｎｉ−嬰は、転化反復内のＴｅｔＲ遺伝子より主としてなる。

ｐＮＫ８６１を、Ｆ：：Ｔｎ５を用いてＸ３０００（ｐＮＫ２５９、Ｆ：：Ｔｎ５）から両立できないプラスミドｐＮＫ２５９中で動員することにより、ＡｍｐＲ，ＴｅｔＲＸ３０００（ｐｓｔＬＴｌｏｏ、ｐＮＫ８６１　）のライブラリーから除いた。ＦＫより動員可能な１００　ｋｂプ之ススミドのＴｎｍｉｎｉ−ｔｅｔそう人について選択するために、Ｘ３０００：　：Ｔｎ　ｍ１ｎｉ−ｔｅｔ　（ｐＮＫ２５９．　Ｆ：　：Ｔｎ　５　）　ライブラリーを、　ＴｅｔＢ、　ＫａｎＲ，５ｔｒＲについて選択したｇ、ｙすＨＢＩＯＩと交配した。ＨＢＩＯＩ中の潜在的なＴｎｍｉｎｉ−ｔｅｔ　：７ぺ／’　１００　ｋｂｂプスミドを、ＴｅｔＲ及びＮａｌ　について選択することによりＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ菌株Ｘ３１４７に動員戻す。三、四のＮａ１Ｒ，ＴｅｔＲ。

Ｋａｎｓ単離物（Ｆ：：Ｔｎ５を有しなかった）をピックアブラスミド含有野生型Ｓ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｕｍ　９株のそれぞれに形質導入された。ＴｅｔＲ形質導入体を増大したサイズの１００　ｋｂプラスミド並に元のプラスミドのそれからの制限酵素プロフィルにおける変更についてスクリーニングした。

ｐｓｔＬＴｌｏｏ：：Ｔｎ三肋ｊ−嬰そう入を単離する別の方法は、Ｘ３０００　（ｐｓｔＬＴｌｏｏ、ｐＮＫ８６１）からプラスミドＤＮＡを得てそしてＦ− ；すＨＢ　１０１（、りＮＫ２５９）を形質転換し、ＴｅｔＲ及びＣｈｉＲについて選択することであった。

Ｔｎｍｉｎｉ−ｔｅｔラベル１００　ｋｂｂプスミドのキユアリングＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍるＳ、　ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉｎｍ菌株に、２種のキユアリング処方即ち４３ ℃における生長又はノボビオシン含有プロスにおける生長を行った。Ｔｎ　ｍ１ｎｉ−ｔｅｔラベル菌株を、キユアリング処方のそれぞれについて少い注入量（１０３〜１０４コロニー形成単位（ＣＦＵ））で毎日継代した。培養物が定常相（ＯＤ＠ｅｏ約α９）に達したとき、一部を希釈しそして７サール酸含有Ｌアガーに橿付けた。７サール醒耐性コロニーをＴｅｔ’についてスクリーニングし、そして７サール酸耐性Ｔｅｔ’コロニーのプラスミド含量をミニ分解物分析を用いて検査した。キュアした誘導体をさらにミニ分解物のサーザン・ブラット・ハイブリッド化工に３２ｐラベルｐｓｔｓＲ１００による細菌細胞の；口二一・プロット・ハイブリッド化により検査して染色体組み込みプラスミドのキユアリング並に欠損を確認した。

７〜１０週令メスＢＡＬＢ／Ｃ−ｒウス（ＨａｒｌａｎＳｐｒａｇｕｅ／Ｄａｗｌｅｙ　［インディアナポリス〕及び５ａｓｃ。

いたマウスを用いて腹腔内マクロファージを得た。正常のマウスの血清を種々の週令のオスのマウスから得た。

ｐ−ｏ−注入では、マウスに６時間飼料及び水を与えず、次に５０ｐｔの１０％（ｗｔ／ｖｏｔ）重炭酸ナトリウムを与え、次にαｌ−（ｗ　ｔ／ｖｏ！　）ゼラチン（ＢＳＧ）を含むバッファーした塩水中に懸濁した細菌２０ｐＬを与えた。経口投与は、口腔内粘膜への損傷を避けるため切歯の後に直接入れたマイクロピペットの先により行った。

マウスは投与３０分後に飼料及び水を与えられた。

ｉ、ｐ、投与及び外側尾靜脈内（ｉ、　ｖ、　）投与では、絶食していないマウスにＢＳＧＫ懸濁させた細菌αｌ−α２ｉを注射した。感染したマウスの巻管及び組織を下記の如くサルモネラの存在について検査した。マウスをＣＯ２窒息により殺した。牌臓を無菌的に取り出しそしてマイクロカップを備えたＯＭＮＩミキサー（デュポン、クイルミントン、プラウエア）又はガラス組織ホモゲナイイーの何れかでＺ５ｍ＜７）ＢＳＧ中でホモゲナイズした。

Ｐｅｙｅｒのパッチを小腸から取り出しモして２ｄのＢＳＧ中で攪拌することにより２回洗った。洗ったＰｅｙｅｒのパッチなＯＭＮＩミキサー中又はガラスピーズな含むガラス管中の攪拌により２−５ｗｔのＢＳＧ中でホモゲナイズした。

腸間膜リンパ節をガラス組織ホモゲナイイー中でＺ５１１ｔのＢＳＧ中でホモゲナイズした。組織及び巻管のホモジネートの希釈は、適切な抗生物質を含むＬアガープレートに植付けた。

枕計的方法野生型又はキュアされたＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの何れかくより感染されたマウスの組織のＣＦＵの比較では、幾何平均が決定されそしてキュアされたＣＦＵより大きい野生ｆｆ１ｃＦＵについてｌ−ティルト・ステニープントのテストで比較した。混合感染の分析のため、個々のマウスからの野生型対プラスミド・キュアＣＦＵの比の幾何平均は、０より大きい比（ｌより大きい比）のＩＯｇｘｏの平均についてｌ−ティルト・ステニープントのテストで比較された。マウスＬＤ、、値は、Ｒｅｅｄ及びＭｕｅｎｃｈ（Ａｍｅｒ、Ｊ、Ｈｙｇ−２７：　４９３−４９７　（１９３８））の方法によりめられた。組織培養物及びマクロ７アージ感染における細菌のＣＦＵを、２−ティルト・テストにおける平均ＣＦＵ／穴のステニープントのテストにより比較した。

在研究したｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのすべての３種の菌株は、１００　ｋｂｂプスミドを有した（第３図）。さらに、　Ｘ３３３９は９０ｋｂ８ｋｂの２種の他のプラスミドを有した。Ｓ、　ｔｙｐｈｉｒｒ、ｕｒ　ｉｕｍ菌株の１００ｋｂプラスミドに関する次の三部の命名システムをこの研究で用いた。Ｓ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍとして血清型を同定するために、命名「ｓｔＪを含んだ。菌株の命名（Ｌ’ｒ２についてｒＬＴＪ。

５Ｒ−１１にツイテ「ＳＲ」そして５Ｌ１３４４に一’）いてｒｓＬＪ）が続く。数の命名は最後に野生型（１ｏｏ）又は誘導体（特別なＴｎ　ｍ１ｎｉ−ｔｅｔそう入について１０１など）であるとしてプラスミドを同定する。菌株５Ｒ− １１の野生型プラスミドはそれ故ｐｓｔｓＲ１ｏＯである。精製したプラスミドは制限酵素消化により分析され、そして同一のプロフィルは、Ｈｉｎｄｌｌｌ　（第４図）及びＥｃ。

ＲＩ（データを示さす）を有するすべての３ｍｔｖｉｉ株からｌ　００　ｋｂｂプスミドについて得られた。１００　ｋｂプ乏ススミドキュア５Ｌ１３４４Ｘ３３４０の制限酵素消化（第４図、レーｙｆ）は、Ｘ３３３９（レーｙｅ）に存在したｐｓｔＬＴｘｏｏ　（第４図、レーンｂ）及びｐＳｔＳＲｌｏｏ（第４図、レーンＣ）からのバンドに相当するバンドの損失を示した。それ故、これらの研究で検査された３種のＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのそれぞれの１００　ｋｂｂプスミドは、もし同一でないならば、非常に似ていた。

Ｗａｙら（同上）により記載されたトランスポゾンＴｎ体は、転化反復内ＫＩＳＩＯＲ）ランスボイーゼ遺伝子を有せず、従ってトランスポイーゼ遺伝子はドナープラスミドｐＮＫ８６１からの転位で失われ、そして次にＴｎ定である。

ｐｓｔＬＴｌｏｌを生ずる菌株３０００の１００ｋｂプラ発生−１の頻度で１００　ｋｂｂプスミドのキュアされた誘導体の選択を行い、次にノボビオシン中の生長又は４３℃人され、それらの１００　ｋｂｂプスミドのこれらの菌株をキュアするのに使用されて、それぞれＸ３３４０及びＸ３３３７を生じた。Ｘ３３４０は９０　ｋｂ及び８　ｋｂｂプスミドを維持した（第３図、レーンｈ）。１００　ｋｂｂプスミドのキユアリングは、きれいな分解物からのプラスミドＤＮＡのゲル電気泳動（第３図）及び３２ＰラベルｐｓｔｓＲ１００によるサーザン・プロットにおけるミニ分解物及びコロニープロットにおける分解した細菌のハイブリッド化（データは示さず）により確認された。キュアされた誘導体のコロニープロットにおけるハイブリッド化がないことは、染色体的に組込まれたプラスミドが存在しなかったことを示した。組込まれたプラスミドを有したプラスミドキュア誘導体は観察されなかった。

Ｘ３０００．ｐｓｔＬＴｌｏｌ及びＸ　３３０６．　ｐｓｔｓＲｌｏｌのＴｎ　ｍ１ｎｉ−ｔｅｔラベルプラスミドは、形質転換によりキュア誘導体に再導入され、それぞれＸ３３４７及びＸ３３３８を生じた。ｐｓｔｓＲｌｏｌをＸ３３４０に形質転換されてＸ３３５１を生じた（第３表、第３図。

レーンｉ）。

マウス有毒性野生型、キュア及び再形質転換誘導体のそれぞれのＢＡＬＢ／Ｃｆｆクスにおけるｐ−ｏ、　ＬＤＳ（１を測定した（第１１表）。マクス継代Ｘ３３０６及びＸ３３３９のｐ、　０−　ＬＤ１１６はそれぞれ３　Ｘ　１０５ＣＦ　Ｕ及び６　Ｘ　１０’ＣＦＵでありそしてＸ　３０００　ノｐ−Ｑ＋　ＬＤｓｏは〉１ｏ８ＣＦＵであった。それぞれのキュアした誘導体のｐ、Ｑ＋Ｌ　Ｉ）ｓｏは＞ｌＯ ”ｃＦＵであった。Ｘ３３３７及びＸ３３４０により感染したマウスは病気になりそして死亡がときどき観察された。１００ｋｂプラスミド再形質転換誘導体のＬＤｓ、は、元の野生型菌株のそれらに戻った。

これは、キュア誘導体の遺伝的損傷は墨笑１００　ｋｂプラスミドの損失であることを確証した。

第１１辰　野生型及び１００　ｋｂプラスミドキュアＳ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍに関する。つ２ＬＤ、。値（ωＸ３３０６　＋　３Ｘ１０’　＜５０Ｘ３３３７　＞１０”　＜５０ｂＸ３３３８　＋　１０’　＜５０ＳＬ１３４４：Ｘ３３３９　＋　６Ｘ１０’　＜５０Ｘ３３４０　＞６Ｘ１０’　４００Ｘ３３５１　＋　＜５Ｘ１０’　＜５０ＬＴ２−Ｚ二Ｘ３０００　＋　）１０”　２Ｘ１０３Ｘ３３４４　ＮＴｃ　２Ｘ１０” Ｘ３３４７　＋　＞１０’　ＮＴ（ａ）Ｒｅｅｄ及びＭｅｕｎｓｃｈの方法（同上）により測定（ｂ）Ｘ３３０６のそれ（７，０日）より大きいＸ３３３７についての死亡の平均時間（１２３日）（ｐくα００１ステニープントのテスト）（ｃ）ＮＴ−テストせず野生型及びキュア誘導体のｉ、　ｐ、　ＬＤ４・はｐｅ　ｏ、　ＬＤ６６とは異らなかった（案１１表）。Ｘ３３０６及びＸ３３３９のｉ、　り−ＬＤ、、は＜５０ＣＦＵであり、これらの投与量のそれぞれについて１００％死亡率を達成した。

Ｘ３３０６．Ｘ３３３７のキュア誘導体は又５０ＣＦＵより少い量を注射された多くのマウスを殺した。しかし、死亡への平均時間は、Ｘ３３０６（７，０日）に比べてＸ３３３７（１２３日）について大きかった（　ｐ　＜０．００１゜１ −ティルト・ステニープントのテスト）。対照的に、１００　ｋｂプラスミドキュア５Ｌ１３４４，３３４０のｉ、　ｐ、　ＬＤ５６を＜５０ＣＦＵから４００　ＣＦＵに上昇した。Ｘ３３４０へのＴｎ　ｍ１ｎｉ−ｊｅｔ　：ｙベル１００　ｋｂプラスミドの再導入は、野生型ｉ、　ｐ、　ＬＤ５６を保った。野生型及びキュアＬＴ２１株に関するｉ、　ｐ、　ＬＤＳＯは、それぞれ約２０００ＣＦＵであった。

菌体５Ｒ−１１及びＬＴ２の間のプラスミド交換の効果菌体ＬＴ２は、ｐ、ｏ、経路により菌株ＳＲ’−１１より遥かに有毒ではなかった（第１１辰）。これらの二つの菌株が有毒性のこの差に役割を有しているかどうかを決ｐｓｔＬＴ１０１又はｐｓｔｓＲｌｏｌの何れかを有する菌株５Ｒ−１１の１０’　ＣＦ　Ｕによりｐ、　ｏ、感染されたマウスは投与後７日までに死んだが、菌株ＬＴ２は何れのプラスミドによっても無毒であった（　ｐ−ｏ、投与１０’ＣＦＵ）。

それ故菌株ＬＴ２の無毒はその１００　ｋｂプラスミドにおける欠陥によるものではなかった。５Ｒ−１１プ２スミドｐｓｔｓＲ１０１を菌株５Ｌ１３４４に導入して有毒なＸ３３５１を生ずることにより得られるのに加えて（第１１ｉ）、この結果は、これらの三種の菌株の１００ｋｂプラスミドは機能的に同等であることを示した。

ｐ、　ｏ、投与後の病因ｐ、　ｏ−ルート対ｉ、　ｐ、ルートによる野生型とキュア誘導体との関の有毒性におけるより明確な差は、ｘＯｏｋｂプラスミドが、侵入した疾患の後期中の代りに胃における有毒性に関する可能性を生じた。この可能性を検査するために、マウスは野生型５Ｒ−１１，Ｘ３３０６又は１００　ｋｂプラスミドキュア５Ｒ−１１，Ｘ３３３７の何れかに上りｐ、　ｏ−感染され、そしてＰｅ）’ｅｒのパッチ及び１ｉ＝ａ′ｆｔ感染後の種々の時間でＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍについて検査した。三種の実験の合わせた結果は第５図に示される。感染３時間後に、非常に少いＳ、　ｔｙｐｋｘｉｍｕｒ　ｉｕｍがＰｅｙｅｒのパッチに検出された（＜１００ＣＦＵ）。これは、殆んど１００％の投与物が投与２時間以内に両生として大腸の内容物から回収されたので、口腔から腸への不十分な通過の結果ではなかった。その上、小腸の内容物中のＣＦＵは投与３日間以内まで野生型とキュア５Ｒ−１１との間では同じであった。投与１及び２日で、ＰｅｙｅｒのパッチのＣＰＵは次第に１０”　−Ｎｏ’　ＣＦ　Ｈに増大し、そして牌臓中のＣＦＵは低いままであった。投与３日目に、Ｐｅｙｅｒのパンチ及びｊｉ？−臓は、キュアＸ３３３７よりもはるかに多い野生ＩｕＸ　３３０６を有した。ＰｅｙｅｒのパッチにおけるＣＦＵの差は、異る実験について常に観察されず、そして他の時点に関するデータが示すように、一時的であった。しかし、Ｘ３３０６により感染したマウスが投与８日後までに死ぬまで、屏風のＣＦＵはＸ３３０６によりかなり異って残りそして増大する量でＸ３３３７を越えた。屏風中のＸ３３３７は１０’　ＣＦ　Ｕのオーダーのレベルに達し、そして投与２５日後まで屏風に検出可能のまま残った。従って、野生型と有意なプラスミドキュアＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｓ　Ｒ−１１との間のｐ。

０、投与後の病因の主な差は、ｙ＃臓に達する及び／又は増殖するＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの数であった。

野生型及びプラスミドキュア５Ｒ−１１の相対的有毒性をさらに詳しく比較するために、ＴｅｔＲ，野生ｆｆ１ｓＲ−１１，Ｘ３４５６及びＮａ１Ｒ，プラスミドキュア５Ｒ−１１，Ｘ３３３７による混合感染実験を行った。野生ｆｆ１ｃＦＵ対プラスミドキユアＣＦｔＪの比は、それぞれのマウスについて決められた。

さらに、ＣＦＵの比は腸間膜リンパ節について決められ、それはＰｅｙｅ　ｒのパッチからｙ＃臓への侵入過程で中間である。ＣＦＵＶｃ＃ける大きな範囲及び個々のマウス間の比が観察され、比の幾何平均の分析を必要とした。三種の実験の合わせた結果が第６図に示される。野生型又はプラスミドキュアＳ。

ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの何れかにより感染されたマウスに関する実験について観察されるように（第５図）　、Ｐｅｙｅｒのパッチ又は屏風におゆるＣＦＵの有意差は、Ｐｅｙｅｒのパッチ、腸間膜リンパ節、屏風における野生型対キュアの比がそれぞれ１に１．２００　：　１及び７９：１のとき、投与３日まで混合感染されたマウスでは検出できなかった。投与４日後に、屏風＄Ｃ関する比のみがＬＯより有意に大きく（比＝１６０８１）、一方Ｐｅｙｅｒのパッチ及び層間ＩＩ　１７ンパ節はそれぞれＬ５：１及び１３：１の比を有した。又、別々の感染をうけたマウスについて観察されるように、ｐｅｙｅｒのパッチのＣＦＵは、投与３日後に認められる一時的な差の後、野生型及びキュアＳ　Ｒ−Ｈについてほとんど等しかった。投与５日後に１腸間膜リンパ節及び屏風はそれぞれ２０００１及び１６００：１の比を有し、Ｐｅｙｅｒのパンチの比は１−１：１であった。

投与７日後くい一匹のマウスのみが、それぞれＺｌ：１．２９０　：　１及び２１０：１のＰｅｙｅｒのパッチ、腸間膜リンパ節及び屏風の比で生存した。種々の器管におけるＣＦＵの最大の差は、Ｐｅｙｅｒのパンチに比較してｉａ及び腸間膜リンパ節にあった。投与３，４及び５日後に、牌臓の比はＰｅｙｅｒのパッチの比よりかなり大きく、そして投与３及び５日後に腸間膜リンパ節の比はＰｅｙｅｒのパッチの比より有意に大きかった（第６図）。

野生型５Ｌ１３４４．Ｘ３３３９及び１００ｋｂプラスミドキユア５Ｌ１３４４．Ｘ３３４０の病因をｐ、０．感染マウスについて検討した。二種の実験の結果を第７図に示す。投与３日後に、Ｐｅｙｅｒのパッチ、腸間膜リンパ節又は屏風におけるＣＦＵの有意差は、野生型とキュア５Ｌ１３４４との間に観察されなかった。投与７又は８日後に、キュアＸ３３４０より有意に大きい数の野生型Ｘ３３３９が、すべての三種の器管において検出された。

Ｐｅｙｅｒのパッチより腸間膜リンパ節及び屏風においてより大きな差が観察された。その上、実験の一つにおいて、ＰｅｙｅｒのパッチにおけるＣＦＵの差は、有意ではなかった。従って、腸間膜リンパ節及び屏風の感染が、野生型と１００　ｋｂプラスミドキュア５Ｌ１３４４との間の病原性の主な一定の差を示した。投与１４日までに、野生型Ｘ３３３９により感染したすべてのマウスは死んだが、キュアＸ３３４０により感染したマウスは、それぞれ２びｙ＃臓の感染を有した。投与３１日後に、Ｘ３３４０により感染したマウスのＰｅｙｅｒのパッチ及び屏風はそれぞれ４００ＣＦＵ及び３２０ＣＦＵを有した。従って、１００ｋｂプラスミドキユア５Ｌ１３４４は、ｐ、０．投与後の長期にわたってＰｅｙｅ　ｒのパッチ及び屏風中に生存した。

ｉ、ｖ、投与後のＮＷｌ、の感染前述の結果は、１００ｋｂプラスミドが、Ｐｅｙｅｒのパンチの感染又は初期の事態に関連するよりも、ｐ。０．投与後のＰｅｙｅｒのパッチから層間ＩＩ　ｌｊンパ節及び屏風への侵入に主として関連することを示していた。屏風におけるＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｒｎの生長を検査するために、マウスに野生型５Ｒ −１１，Ｘ３４５６及びプラスミドキュアＳＲ−１１Ｘ３３３７の混合物をｉ− Ｖ＋投与し、そして屏風をＣＦＵｋついてモニターした（第１２表）。マウスに１０’ＣＦＵｌ’）Ｘ３４５６及びＸ３３３７をｉ、　ｖ、投与したとき、菌株は投与１時間後等しく屏風にクリアされた。

従って、１００ｋｂプラスミドの存在は血液からのクリアランスに影響しなかった。他のマウスには１ｘ１０〜４Ｘ１０”ＣＦＵのＸ３４５６及びＸ３３３７の混合物をｉ。

■、投与した。屏風におけるＣＦＵの有意差は、投与４日後に検出されなかった（第１２表）。しかし投与６〜７日後口径牌臓屏風回収される野生型対キュアＳ。

ｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　１ｕｔｎＱ比は、Ｉ　Ｌ５　：　１であった。このとき、Ｘ３４５６及びＸ３３３７の屏風の平均レベルはそれぞれ１７Ｘ１０’及びＺ３Ｘ１０ｓＣＦＵ”ｅあった。従ッテ、プラスミドキュア５Ｒ−１１は、ｉ、ｖ、投与後長期間屏風に住存且複製した。ｉ、　ｖ、投与１週間後のＩ　Ｌ５　：　１の屏風に２ける５Ｒ−１１に関する野生型対キュアの比は、ｐ、　ｏ−投与５及び７日後に得た１６００：１及び２１０　：　１の比と極立って対照的であった。混合ｉ、ｖ。

投与により得た低い比は、Ｘ３４５６とＸ３３３７との間の相乗作用によるものではなかった。それは、投与６日後に、２Ｘ１０’ＣＦＵのＸ３３３７のみ又は等量ノｘ３４５６と混合したＸ３３３７により感染したマウスは、Ｘ３３３７について２．３　Ｘ　１０’　ＣＦＵノ平均牌臓屏風しを達成したからである（第１２表）。

第１２表　マウスのｉ、マ、投与後の屏風の感染２投与後の時間ＣＦＵ　Ｘ３３３７ｄＬ４Ｘ１０’　ｚｓｘｘｏ’　１３Ｘ１０”比土ＳＤｇ　Ｏ，１１±（Ｌ２５　０．２６±０．３８　ＬＯ６±０．３９（ａ）　−ｒウス＋ｔ、等量ノ野生ＷＸ　３４５６及び１００　ｋｂプラスミドキュアＸ３３３７の混合物をｉ、　Ｖ、投与された。ｎ　＝　３〜５匹のマウス。

（ｂ）　投与量＝Ｘ３４５６及びＸ３３３７のそれぞれの５Ｘ１０　ＣＦＵ（ｃ）　投与量＝Ｘ３４５６及びＸ３３３７のそれぞれの１×１０〜４Ｘ１０ＣＦＵ（等量がそれぞれの実験において投与した）。

（ｄ）　牌臓からのＣＦＵの幾何平均。

（ｅ）　投与６日後に、２Ｘ１０　ＣＦＵのＸ３３３７単独を感染したマウスは、２−３Ｘ１０　ＣＦＵのＸ　３３３７の牌臓レベルを有した。

（ｆ）Ｘ３４５６：Ｘ３３３７の比の幾何平均（比〉ｌ：１についてｌ−ティルト・ステニープントのｔテストにおけるｐ値）。

■　統計的方法に用いられる北上標準偏差のｌｏｇｌｏの平均プラスミドキュアＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍは、ｐ、　Ｑ＋投与後Ｐｅｙｅｒのパッチで増殖することができ、そして腸間膜リンパ節及び屏風に遺した（第５．６．７図）。

しかし、腸間膜リンパ節及び屏風に侵入する野生型対プラスミドキュアＳ、　ｔｈｐｈｉｍｕｒｉｕｍの能力の差は、常に見いだされた。野生型Ｓ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが、マウスのｐ、０．投与後屏風を感染するとき非常にさらに有効であることも又決定された（１６００：１の野生型対キュアの比：第６図）。

しかし、キュア誘導体ですら約１０　ＣＦＵの屏風のレベルに達しそして投与約３１日後Ｎ臓に検出可能のままであった（第５図）。野生型及びキュア５Ｒ−１１の混合物によるｐ、　ｏ、投与後、野生型対キュア５Ｒ−１１の有意の高い比は、ｐｅｙｅｒのパッチと比べて屏風及び腸間膜リンパ節に見いだされた（第６図）。

プラスミドキュア５Ｒ−１１及び５Ｌ１３４４のｉ、ｐ。

ＬＤ５゜はそれぞれ＜５０ＣＦＵ及び４００ＣＦＵであり、１００　ｋｂプラスミドキュアＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが投与のこのルートにより有意な有害を保持することを示した（第１１表）。いずれのキュアした菌株は　Ｐラヘル有害プラスミドとハイブリッドせず、そして有害に寄与するプラスミドの染色体的に組込まれた；ビーの存在が除外されることを注意するのは重要である。ｉ、ｖ、投与後ｙ＃臓を感染する野生型及びキュア菌株の能力が検討され、そして野生型及びキュアＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒ　ｉｕｍの混合物（７，５：１及び２０：１の平均野生型対キュアの比）によるｉ、ｖ、投与１週間後の屏風におゆるＣＦＵの有意差が見いだされた。ｉ、ｖ、投与後の屏風ＣＦＵの差は、ｐ、ｏ。

投与後５又は７日で得られたもの（１６００：１倍及び２１０：１倍）より大きくなかった。これらの実験は、プラスミドキュアＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍが屏風で高いレベルに達しそして増殖できること、さらに病因に対する１００ｋｂプラスミドの最大の効果がｐ、　ｏ、投与後であることを立証した。本発明者は、細菌が細胞外で急速に増殖しそして腹腔内では有効に食菌されないので、１Ｏｏｋｂプ２スミドキュアＳ、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍがｉ、　ｐ、ルートにより有毒性を保持し、それ故マウスが細菌をマクロファージにクリアすることにより感染をチェックできる前に優勢な感染が発達することを仮説として取り上げる。ｐ−ｏ。

ルートにより投与されるとき、すべて又は多くの侵入する細菌は、腸間膜リンパ節に達したとき細胞内にあるものと予想される。

浄書（内容に変更なし）Ｌｏζ’１４′ＣＦＣＪＦ　Ｉ　Ｇ、３ａ　ｂｃｄｅｆＦＩＧ、４０−ローＬｌ’）ＬＩ’Ｔ［９９ＲＪ手続補正書平成１年３月９日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１事件の表示ＰＣＴ／υ３８８１０１８９９２発明の名称無毒のマイクローブとその使用３、補正をする者事件との関係　特許出願人インコーホレーテッド６、補正の内容悶瞭頂査報告ｍｍｗＭ＋ｍ１１ｍ１ｍＴｈｅ、、−、、、、、、、、Ｃ，。

Claims

【特許請求の範囲】

１．官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を実質的に生成できない、病原性マイクロープの無毒の誘導体よりなる脊椎動物又は無脊椎動物の免疫化用ワクチン。
２．マイクローブが、該脊椎動物又は無脊椎動物の病原から由来する組換え遺伝子を発現することができて、該病原に対して該脊椎動物又は無脊椎動物に免疫レスポンスを誘発可能な抗原を生成する請求項１記載りワクチン。
３．該組換え遺伝子が薬理学上活性の生成物をエンコードする請求項２記載のワクチン。
４．該病原性マイクローブが細菌である請求項１又は２記載のワクチン。
５．該細菌がＳｈｉｇｅｌｌａ，Ｅｒｗｉｎｉａ，Ｙｅｒｓｉｎａ，Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ，Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ又はＢｒｕｃｅｌｌａである請求項４記載のワクチン。
６．細菌が該脊椎動物のリンパ上皮構造に向うか又は該無脊椎動物を感染する種に属する請求項４記載のフクチン。
７．該細菌がサルモネラ又はサルモネラ・エツエリシアハイブリッドである請求項６記載のワクチン。
８．該細菌がＳ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ，Ｓ．ｔｙｐｈｉ，Ｓ．Ｐａｒａｔｙｐｈｉ，Ｓ．ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ，Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ，Ｓ．ｄｕｂｌｉｎ，Ｓ．ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ及びＳ．ａｒｉｚｏｎａよりなる群から選ばれる請求項７記載のワクチン。
９．該細菌がＸ４０６２（ＡＴＣＣ５３６４７）及びＸ４０６４（ＡＴＣＣ５３６４８）及びその誘導体よりなる群から選ばれた誘導体菌株である請求項８記載のワクチン。
１０．該病原がウイルス、細菌、プロトゾア、寄生虫又はかびである請求項１〜９の何れか一つの項記載のワクチン。
１１．該病原が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ，Ｃｈｌａｍｙｄｉａｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｅｐｒａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ，Ｔｒｅｐｏｎｍａ　ｐａｌｌａｄｉｕｍ，Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍａｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ，Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ　Ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ，Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ａｖｉｕｍ，Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，又はＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ．である請求項１０記載のワクチン。
１２．官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を実質的に生成できないが、脊椎動物の宿主から由来する組換え遺伝子を発現して該脊椎動物又は無脊椎動物において免疫レスポンスを抑制、調整又は増強しうる生成物を生成することのできる、病原性マイクローブの無毒の誘導体よりなる脊椎動物又は無脊椎動物の宿主蛋白の合成のための担体マイクロープ。
１３．該担体マイクロープが細菌である請求項１２記載のマイクロープ。
１４．該細菌がサルモネラ又はサルモネラ・エツエリシアハイブリッドであつて、該脊椎動物のリンパ上皮構造に向うか又は該無脊椎動物に感染する請求項１２又は１３記載のマイクロープ。
１５．該細菌がサルモネラｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍである請求項１４記載のマイクロープ。
１６．該細菌がＸ４０６２（ＡＴＣＣ５３６４７）又はＸ４０６４（ＡＴＣＣ５３６４８）及びその誘導体である請求項１５記載のマイクロープ。
１７．該脊椎動物又は無脊椎動物に請求項１〜１１の何れか一つの項記載のワクチンを投与する工程よりなる脊椎動物又は無脊椎動物の免疫システムを刺激する方法。
１８．該脊椎動物又は無脊椎動物に請求項１〜１１の何れか一つの項記載のワクチンを投与する工程よりなる脊椎動物又は無脊椎動物の免疫システムを刺激、調節又は減感する方法。
１９．組換えＤＮＡ技術又はトランスポゾン突然変異により病原性マイクロープを突然変異させてアデニル酸シクラーゼ及び理状ＡＭＰレセプター蛋白に関する遺伝子のそれぞれに火矢突然変異を形成し、そして該誘導体を単離することによりなる、官能性アデニル酸シクラーゼ及び環状ＡＭＰレセプター蛋白を実質的に生成できない、病原性マイクロープの無毒の誘導体を生成する方法。