JP5898324B2 - 改良型ｈｃｖワクチンおよびその使用方法 - Google Patents

Description

本発明は、改良型ＨＣＶ抗原およびＨＣＶ抗原から作製されたワクチン、ならびにＨＣＶに対する免疫反応を誘導するための改良法、ならびにＨＰＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化するための改良法に関する。

本出願人は、２０１１年４月２９日に出願した係属中の米国特許出願第１３／１２７，００８号を開示し、本開示は参照により本明細書に組み込まれる。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は小型のエンベロープウイルスで、現在１億７０００万超の個体が感染している、世界的にみても主要な健康を害するプラス鎖ＲＮＡウイルスである［Ｔｈｏｍｓｏｎ， Ｂ．Ｊ． ａｎｄ Ｒ．Ｇ． Ｆｉｎｃｈ， Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｎｆｅｃｔ， ２００５． １１（２）： ｐ． ８６−９４］。全てのヒトウイルスの中でも最も成功したウイルスの１つであるＨＣＶは、優先的に、肝細胞に感染し、感染したすべての個体の内最大７０％の肝臓内に残ることができる［Ｂｏｗｅｎ， Ｄ．Ｇ． ａｎｄ Ｃ．Ｍ． Ｗａｌｋｅｒ， Ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｎａｔｕｒｅ， ２００５． ４３６（７０５３）： ｐ． ９４６−５２］。慢性的に感染した個体の最大３０％が、個体の生存期間中、肝硬変および肝細胞癌（ｈｅｐｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）（ＨＣＣ）を含む進行性肝疾患を発症し、ＨＣＶ感染は世界中で肝臓移植を引き起こす主要な要因となっている。さらに、ＨＣＶ感染およびＨＢＶ感染は、全てのＨＣＣの症例の７０％と関連があるとされ、世界中での癌による死亡をもたらす第３番目の要因である［Ｌｅｖｒｅｒｏ， Ｍ．， Ｖｉｒａｌ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ａｎｄ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ： ｔｈｅ ｃａｓｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ． Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ２００６． ２５（２７）： ｐ． ３８３４−４７］。

ウイルスの持続する性質により、ＨＣＶ感染の治療が、極端に困難となり、かつ高価となる可能性がある。ほとんどの感染した状態の個体は治療を受けることはない。しかしながら、治療を受ける個体は、標準的な治療プロトコールに対し平均１７，０００〜２２，０００ＵＳドルを支払う［Ｓａｌｏｍｏｎ， Ｊ．Ａ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｐａｔｉｅｎｔ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｊａｍａ， ２００３． ２９０（２）： ｐ． ２２８−３７］。遺伝子型１の感染は、ヨーロッパおよび北米で最も蔓延しており、予後不良であって、わずか４２％の個体が標準的な治療に反応する、［Ｍａｎｎｓ， Ｍ．Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｅｇｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｆａ−２ｂ ｐｌｕｓ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｌｆａ−２ｂ ｐｌｕｓ ｒｉｂａｖｉｒｉｎ ｆｏｒ ｉｎｉｔｉａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ： ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｔｒｉａｌ． Ｌａｎｃｅｔ， ２００１． ３５８（９２８６）： ｐ． ９５８−６５］。

したがって、広く蔓延している感染症であること、治療の効果が乏しいことおよび慢性ＨＣＶの経済的な負担は、本疾患と闘う新規の免疫療法戦略の開発が急務であることを例示するものである。現在、ＨＣＶの予防ワクチンまたは治療ワクチンは存在しない。

このウイルスに対する適応免疫を理解することは、ウイルス性感染症と闘うＤＮＡワクチンなどの設計戦略に重大な意味を有する。ウイルスに特異的な抗体は、ＨＣＶ感染後７〜８週間内に検出される［Ｐａｗｌｏｔｓｋｙ， Ｊ．Ｍ．， Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ． Ｊ Ｈｅｐａｔｏｌ， １９９９． ３１ Ｓｕｐｐｌ １： ｐ． ７１−９］が、再感染から対象を保護するものではなく［Ｆａｒｃｉ， Ｐ．， ｅｔ ａｌ．， Ｌａｃｋ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｒｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， １９９２． ２５８（５０７９）： ｐ． １３５−４０； Ｌａｉ， Ｍ．Ｅｅｔ ａｌ．，Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｐｉｓｏｄｅｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｉｎ ｐｏｌｙｔｒａｎｓｆｕｓｅｄ ｔｈａｌａｓｓａｅｍｉｃ ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ｌａｎｃｅｔ，１９９４．３４３（８８９４）：ｐ．３８８−９０］、感染症から回復した後、完全に存在しないものとなり得る［Ｃｏｏｐｅｒ， Ｓ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ， １９９９． １０（４）： ｐ． ４３９−４９； Ｐｏｓｔ， Ｊ．Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｅｍｉａ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｓｅｒｏｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｉｓｏｎｓ ｓｔｕｄｙ ｃｏｈｏｒｔ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００４． １８９（１０）： ｐ． １８４６−５５］。

したがって、ＨＣＶのワクチン開発における主要な課題の内の１つは、抗体に基づくワクチンの作製に成功したＡ型肝炎およびＢ型肝炎などの他の肝炎ウイルスとは異なり、ＨＣＶ感染症に対する防御が、抗体を媒介するものではないらしいことである。免疫保護の正確な相関が依然として明らかとなっていないにも関わらず、急性感染の患者およびチンパンジーに関する多くの研究から、より遺伝的に保存されたウイルスの非構造領域を対象とする強力なＴヘルパー１（Ｔｈ１）反応が、ＨＣＶ感染症のクリアランスに関連があるとする説得力のある証拠が提供された。Ｍｉｓｓａｌｅ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｂｅｈａｖｉｏｒｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｒｅ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖｉｇｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｖｉｒａｌ ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ， １９９６． ９８（３）： ｐ． ７０６−１４；およびＤｉｅｐｏｌｄｅｒ， Ｈ．Ｍ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ３ ｉｎ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｌａｎｃｅｔ， １９９５． ３４６（８９８１）： ｐ． １００６−７を参照。同じく重要なことに、末梢血よりも肝臓に対するＨＣＶに特異的なＴ細胞の局在が、ウイルス負荷の減少および急性感染のクリアランスの両方において重要であることが示された。Ｔｈｉｍｍｅ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２００１． １９４（１０）： ｐ． １３９５−４０６；およびＳｈｏｕｋｒｙ， Ｎ．Ｈ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｍｏｒｙ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２００３． １９７（１２）： ｐ． １６４５−５５を参照。

さらに、初期の、多特異的な肝臓内ＣＤ４＋ヘルパーおよびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞反応を開始する感染した個体でＨＣＶ感染が消失する傾向があることが明らかとなった［Ｌｅｃｈｎｅｒ， Ｆ．， ｅｔ ａｌ．， Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐｅｒｓｏｎｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２０００． １９１（９）： ｐ． １４９９−５１２； Ｇｅｒｌａｃｈ， Ｊ．Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ａｆｔｅｒ ｌｏｓｓ ｏｆ ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４（＋） Ｔ−ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ， １９９９． １１７（４）： ｐ． ９３３−４１； Ｔｈｉｍｍｅ， Ｒ．， ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ａｎｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ｄｕｒｉｎｇ ａｃｕｔｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ． Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ， ２００１． １９４（１０）： ｐ． １３９５−４０６； Ｇｒａｋｏｕｉ， Ａ．， ｅｔ ａｌ．， ＨＣＶ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｈｅｌｐ． Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２００３． ３０２（５６４５）： ｐ． ６５９−６２］。

ＤＮＡワクチンは、弱毒化生ウイルスワクチンおよび組み換えタンパク質に基づくワクチンなどの、より伝統的なワクチン接種法を上回る多くの概念的な利点を有する。ＤＮＡワクチンは、安全であり、安定であり、容易に産生され、かつヒトにおいて十分に耐容性を示し、前臨床試験はプラスミド組み込みの証拠を示さない（Ｍａｒｔｉｎ，Ｔ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｍａｌａｒｉａ ｖａｃｃｉｎｅ：ｔｈｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ａｆｔｅｒ ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，１９９９．１０（５）：ｐ．７５９−６８：Ｎｉｃｈｏｌｓ，Ｗ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ ｈｏｓｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｏｍｅ．Ａｎｎ Ｎ Ｙ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９５．７７２：ｐ．３０−９）。さらに、ＤＮＡワクチンの有効性が、ベクターに対する、以前から存在する抗体力価によって影響されないという事実により、ＤＮＡワクチンは反復投与に十分に適する（Ｃｈａｔｔｅｒｇｏｏｎ，Ｍ．，Ｊ．Ｂｏｙｅｒ，ａｎｄ Ｄ．Ｂ．Ｗｅｉｎｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ：ａ ｎｅｗ ｅｒａ ｉｎ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．ＦＡＳＥＢ Ｊ，１９９７．１１（１０）：ｐ．７５３−６３）。しかし、大型動物に移行した時、ＤＮＡワクチンの臨床導入に対する１つの重大な障害は、プラットフォームとなる免疫原性の減少であった（Ｌｉｕ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｕｌｍｅｒ，Ｈｕｍａｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ａｄｖ Ｇｅｎｅｔ，２００５．５５：ｐ．２５−４０）。コドン最適化、ＲＮＡ最適化および免疫グロブリンリーダー配列の付加などの、ＤＮＡワクチン免疫原の遺伝子工学処理における最近の技術的進歩により、ＤＮＡワクチンの発現および免疫原性が改良され（Ａｎｄｒｅ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｇｐ１２０ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｉｔｈ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，１９９８．７２（２）：ｐ．１４９７−５０３；Ｄｅｍｌ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｖａｃｃｉｎｅｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ Ｇａｇ ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００１．７５（２２）：ｐ．１０９９１−１００１；Ｌａｄｄｙ，Ｄ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｖｉａｎ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００７．２５（１６）：ｐ．２９８４−９；Ｆｒｅｌｉｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ ｇｅｎｅ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００４．１１（６）：ｐ．５２２−３３）、かつ、近年、電気穿孔法などのプラスミド送達システムの技術が開発された（Ｈｉｒａｏ，Ｌ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ／ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｐｌａｓｍｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｃｙ ｉｎ ｐｉｇｓ ａｎｄ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００８．２６（３）：ｐ．４４０−８；Ｌｕｃｋａｙ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｖａｃｃｉｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｒｈｅｓｕｓ ｍａｃａｑｕｅｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１０）：ｐ．５２５７−６９；Ａｈｌｅｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ ｖｉｖｏ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ ＤＮＡ ｂｙ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｌｏｃａｌ ＤＮＡ ｕｐｔａｋｅ，ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７．１７９（７）：ｐ．４７４１−５３）。さらに、コンセンサス免疫原を使用することで、天然の抗原のみと比較して、細胞性免疫反応の幅を拡大させることができる可能性があることを複数の研究が示唆した（Ｙａｎ．，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ−１ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００７．１５（２）：ｐ．４１１−２１；Ｒｏｌｌａｎｄ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｃｅｓｔｒａｌ ｃｅｎｔｅｒ−ｏｆ−ｔｒｅｅ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ １ ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（１６）：ｐ．８５０７−１４）。

ＨＣＶのＮＳ３およびＮＳ４をコードするＤＮＡワクチンが、Ｌａｎｇ， Ｋ．Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｖａｃｃｉｎｅ ｖｏｌ ２６， ｉｓｓｕｅ ４９， ｐｐ ６２２５−６２３１ （Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２００８）において開示される。

したがって、ＨＣＶに対して有効なワクチンに対するニーズが依然としてある。同様に、ＨＣＶに感染した個体を治療する有効な方法に対するニーズも依然としてある。

本発明の態様は、ａ）配列番号２；配列番号２と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号６の免疫原性断片を含む群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含む核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、この核酸分子は、配列番号９をコードするＩｇＥリーダーのコード配列が存在しない可能性がある。好ましくは、この核酸分子は、ａ）配列番号１；または配列番号と９８％相同性のあるコード配列と；ｂ）配列番号３；または配列番号３と９８％相同性のあるコード配列；ｃ）配列番号５；または配列番号５と９８％相同性のあるコード配列を含む群から選択される１つ以上の配列とすることができる。いくつかの実施形態において、これらの核酸分子は、配列番号７または配列番号８の配列を有するＩｇＥリーダーのコード配列が存在しない。

さらに、ＨＣＶと診断された対象の治療方法であって、本明細書に記載される核酸分子をこの対象に投与することを含む方法を含む態様が開示される。

別の態様において、ａ）配列番号２；配列番号２と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号６の免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質は、配列番号９の配列を有するＩｇＥリーダーが存在しない可能性がある。

さらに、ＨＣＶと診断された対象を治療する方法であって、本明細書のタンパク質を投与することを含む方法が本明細書に記載される。

さらに、本明細書中で提供される核酸分子および薬学的に許容可能な賦形剤を含む本明細書に記載される薬学的組成物がある。

さらに、本明細書中で提供されるタンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物がある。

ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５Ａ、およびｐＣｏｎＮＳ５Ｂの用量反応。動物（ｎ＝５）を、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５Ａ、およびｐＣｏｎＮＳ５Ｂのいずれかを用いて、５μｇ、１２．５μｇ、または２５μｇのいずれかで免疫した。動物を合計２回の筋肉内免疫処置を行い、２週間あけて各免疫で電気穿孔を行った。動物を最後の免疫後に屠殺し、脾細胞をそれぞれ単離し、かつ分析した。各個体動物の反応をＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して決定し、これにより各構築物の最適用量を決定した。 単離した脾細胞からのＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応のフローサイトメトリー分析。各動物（ｎ＝５）から脾細胞を単離し、ＮＳ４Ｂ−、ＮＳ５Ａ−またはＮＳ５Ｂ特異的Ｔ細胞反応のいずれかについてそれぞれ分析した。脾細胞を、Ｒ１０（陰性対照）、またはＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、もしくはＮＳ５Ｂのいずれかのペプチドプールで、生体外で５時間刺激した。インキュベーションの後、細胞をＩＦＮ−γに対し細胞内染色し、フローサイトメトリーで分析した。免疫特異的反応を、ペプチド刺激した群におけるＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のパーセントからＲ１０刺激した群におけるＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のパーセントを引いた値として記録した。この図は、各群の代表的な動物を示す。示される値は、未処置群および免疫化群からの５匹の個体動物の平均反応値である。有意性はスチューデントのｔ検定により決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００５）。 単離した脾細胞からの免疫特異的ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応パーセントのグラフ表示。未処置群および免疫化群から各動物（ｎ＝５）のＡ）ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応の平均パーセントおよびＢ）ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応の平均パーセントの値を記録する。有意性はスチューデントのｔ検定により決定した（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００５）。 単離した肝臓のリンパ球からの免疫特異的ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応パーセントのグラフ表示。未処置群および免疫化群からの各動物（ｎ＝５）のＡ）ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応パーセントおよびＢ）ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応パーセントの値を平均値（±ＳＥ）として記録する。有意性はスチューデントのｔ検定により決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００５）。 脾臓、静止状態の肝臓およびトランスフェクトした肝臓から単離したリンパ球からのＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応のパーセンテージのフローサイトメトリー分析。各動物（ｎ＝５）からリンパ球を単離し、ＮＳ４Ｂ−、ＮＳ５Ａ−またはＮＳ５Ｂのいずれかに特異的なＴ細胞反応についてそれぞれ分析した。単離したリンパ球をＩＦＮ−γに対し細胞内染色し、フローサイトメトリーを用いて分析した。この図は、各群から代表される動物を示す。示される値は、未処置群および免疫化群からの５匹の個体動物の平均反応値（±ＳＥ）を示す。有意性はスチューデントのｔ検定により決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００５）。 脾臓、静止状態の肝臓およびトランスフェクトした肝臓から単離したリンパ球からのＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応のパーセンテージのグラフ表示。未処置群および免疫化群からの各動物（ｎ＝５）のＡ）ｐＣｏｎＮＳ４Ｂに対するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応、Ｂ）ｐＣｏｎＮＳ５Ａに対するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応、Ｃ）ｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対するＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応、Ｄ）ｐＣｏｎＮＳ４Ｂに対するＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応、Ｅ）ｐＣｏｎＮＳ５Ａに対するＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応、Ｆ）ｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対するＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応の平均パーセント（±ＳＥ）として記録する。有意性はスチューデントのｔ検定により決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００５）。 ＤＡＰＩに対して標準化したＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５Ｂのいずれかの発現のＭＦＩ比のグラフ。各群で、各動物（ｎ＝５）に対し３つの画像を捉えた。ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、またはＮＳ５ＢのいずれかのＭＦＩ値（赤）を計算し、各画像のＤＡＰＩ（青）について、ＭＦＩ値に対して正規化した。示される値は、未処置群および免疫化群からの５匹の個体動物の平均反応（±ＳＥ）である。有意性はスチューデントのｔ検定により決定した（＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５および＊＊＊ｐ＜０．０００５）。 コンセンサス抗原ＮＳ４Ｂを含む発現構築物ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ＿ｐＶＡＸ１のプラスミドマップを示す。 コンセンサス抗原ＮＳ５Ａを含む発現構築物ｐＣｏｎＮＳ５Ａ＿ｐＶＡＸ１のプラスミドマップを示す。 コンセンサス抗原ＮＳ５Ｂを含む発現構築物ｐＣｏｎＮＳ５Ｂ＿ｐＶＡＸ１のプラスミドマップを示す。

本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」という語句は、１つの核酸分子が別の核酸分子とハイブリダイズするが、他の配列とはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境において様々である。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特異的配列の熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低く選択される。Ｔｍは、標的配列と相補的なプローブの５０％が、平衡状態でこの標的配列とハイブリダイズする（規定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。一般に、これらの標的配列はＴｍにおいて過剰に存在するので、これらのプローブの５０％が平衡状態で占有する。典型的には、ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３において、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的に約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン（または他の塩）であり、温度が、短いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくとも約３０℃であり、長いプローブ、プライマーまたはオリゴヌクレオチドに対して少なくとも約６０℃である条件であろう。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定剤の付加によっても達成され得る。

ヌクレオチドおよびアミノ酸の配列相同性を、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９７，２５，３３８９、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）ならびにＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて測定してもよい。「類似度のパーセンテージ」を、ＰＡＵＰ＊４．０ｂ１０ソフトウェア（Ｄ．Ｌ．Ｓｗｏｆｆｏｒｄ，Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を用いて計算する。コンセンサス配列の平均類似度を、系統樹の全配列と比較して計算する。

簡潔に述べると、Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌを表すＢＬＡＳＴアルゴリズムは、配列類似度の決定に適している（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０，これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴ解析を行うソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公表されている。このアルゴリズムは、データベース配列中の同一の長さのワードと整列させた時に、ある正の値の域値スコア（ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｖａｌｕｅｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｓｃｏｒｅ）Ｔと一致するかまたはそれを満足させる問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することによって、ハイスコアな配列の対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア域値（ｎｅｉｇｈｂｏｒｈｏｏｄ ｗｏｒｄ ｓｃｏｒｅ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，前出）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含むＨＳＰを見出す検索を開始するための種として機能する。このワードヒットは、累積のアラインメントスコアが増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。各方向のワードヒットの拡大は、以下の場合に停止される：１）累積のアラインメントスコアが、その最大達成値からＸ量低下する場合；２）１つ以上の負のスコア残基アラインメント（ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｃｏｒｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ）の蓄積により、累積スコアが０以下になる場合；または３）いずれかの配列の末端に到達する場合。ＢｌａｓｔアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。このＢｌａｓｔプログラムでは、初期設定として、ワード長（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９，１０９１５−１０９１９を参照、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）アラインメント（Ｂ）が５０、期待値（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較が使用される。このＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ｋａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９３，９０，５８７３−５７８７、これは、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、２つの配列間の類似度の統計解析を行う。このＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１つの測定は、２つのヌクレオチド配列間の一致が偶然に生じる確率の指標を与える最小合計確率（ｓｍａｌｌｅｓｔ ｓｕｍ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ（Ｐ（Ｎ））である。例えば、試験核酸と他の核酸の比較における最小合計確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は別の核酸と類似するとみなされる。

本明細書で使用される「遺伝子構築物」という用語は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を表す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞において発現を指示することができる、プロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節要素と作動可能に連結される開始シグナルおよび終止シグナルを含む。

本明細書で使用される「発現できる形態」という用語は、個体の細胞に存在する時に、コード配列が発現するように、タンパク質をコードするコード配列と作動可能に連結される必須の調節配列を含む遺伝子構築物を表す。

特に、ウイルス内の複数の保存領域を対象とする細胞傷害性Ｔ細胞反応ならびにＩＦＮ−γおよびＨＣＶ特異的Ｔ細胞反応を含む、亢進した細胞免疫反応を誘導することができる異なるＤＮＡワクチンを設計するための複数のステップの手法から生じる改良型ワクチンを開示する。たとえば、コンセンサス抗原ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５Ｂを含むＤＮＡワクチンを含む、改変したコンセンサス配列を作製した。コドン最適化、ＲＮＡ最適化、および高効率な免疫グロブリンリーダー配列の付加を含む遺伝子改変も開示する。

改良型ＨＣＶワクチンは、抗ＨＣＶを誘導することができる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物に基づく。

いくつかの実施形態において、ａ）配列番号２；配列番号２と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号４の免疫原性断片；ｃ）配列番号６；配列番号６と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号６の免疫原性断片を含む群から選択される１つ以上のタンパク質をコードするコード配列を含む核酸分子がある。いくつかの実施形態において、この核酸分子は、配列番号９をコードするＩｇＥリーダーのコード配列が存在しない可能性がある。好ましくは、この核酸分子は、ａ）配列番号１；または配列番号１と９８％相同性のあるコード配列；ｂ）配列番号３；または配列番号３と９８％相同性のあるコード配列；ｃ）配列番号５；または配列番号５と９８％相同性のあるコード配列を含む群から選択される１つ以上の配列とすることができる。いくつかの実施形態において、これらの核酸分子は、配列番号７または配列番号８の配列を有するＩｇＥリーダーのコード配列が存在しない。

したがって、ワクチンは治療的または予防的に免疫反応を誘導し得る。いくつかの実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。いくつかの実施形態において、このワクチンは、以下からなる群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチンおよび１つ以上の不活化ワクチン。

いくつかの実施形態によると、ワクチンが個体に送達され、この個体の免疫システムの活性を調節し、それによって、ＨＣＶに対する免疫反応が高まる。このタンパク質をコードする核酸分子がこの個体の細胞に取り込まれると、このヌクレオチド配列がこれらの細胞において発現し、それによって、このタンパク質がこの個体に送達される。プラスミドなどの核酸分子上のこのタンパク質のコード配列を、組み換えワクチンの一部としておよび弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。

別の実施態様において、a)配列番号２；配列番号２と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号２の免疫原性断片；ｂ）配列番号４；配列番号４と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号４の免疫原性断片；またはｃ）配列番号６；配列番号６と９８％相同性のあるタンパク質；または配列番号６の免疫原性断片からなる群から選択されるタンパク質がある。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるタンパク質は、配列番号９の配列を有するＩｇＥリーダーが存在しない可能性がある。

さらに、ＨＣＶと診断された対象の治療方法であって、本明細書に記載される核酸分子をこの対象に投与することを含む方法の態様を開示する。

さらに、ＨＣＶと診断された対象の治療方法であって、本明細書中のタンパク質を投与することを含む方法を本明細書に記載する。

さらに、本明細書中に提供される核酸分子および薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物が本明細書中に記載される。

さらに、本明細書中に提供されるタンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤を含む薬学的組成物が存在する。

ＨＣＶに対して予防的および／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法を提供する。この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を送達するための組成物を、調節要素と作動可能に連結する。組成物には、この免疫原をコードするプラスミド、この免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む組み換えワクチン、本発明のタンパク質をコードするおよび／もしくは本発明のタンパク質を含む弱毒化生病原体；本発明のタンパク質を含む不活化病原体；または本発明のタンパク質を含むリポソームもしくはサブユニットワクチンなどの組成物が含まれてもよい。本発明は、さらに、組成物を含む注射可能な医薬組成物に関する。

配列番号１は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに、配列番号１は、ＩｇＥリーダーからの追加的な５´上流配列と共に、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列に連結したＩｇＥリーダー配列を含む。配列番号２は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。さらに、配列番号２は、コンセンサス免疫原配列に連結したＩｇＥリーダー配列を含む。このＩｇＥリーダー配列は、コンセンサスＮＳ４Ｂに対するＮ末端であり、かつ配列番号９であり、かつ配列番号８によりコードすることができる。

本明細書に記載されるコンセンサス抗原およびその抗原から作製されるワクチンは、ＩｇＥリーダー配列を含むことができ、またはＩｇＥリーダー配列を除去させることができる。

いくつかの実施形態において、ワクチンは、好ましくは配列番号２または配列番号２をコードする核酸分子を含む。いくつかの実施形態において、好ましくは、ワクチンは配列番号１を含む。好ましくは、ワクチンは、配列番号９のＩｇＥリーダー配列またはそれと同一のものをコードする核酸配列を含む。

配列番号１の相同配列は、９０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、１８０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを、いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、８７０以上のヌクレオチドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の断片は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号１の相同配列は、ＩｇＥリーダー配列のコード配列を含まない。好ましくは、この相同配列は、配列番号１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは、９８％または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号１の免疫原性断片が存在し、好ましくは、配列番号１と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する断片が存在する。

配列番号２の相同配列は、３０以上のアミノ酸を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、配列番号２の断片は６０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、９０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１２０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１５０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１８０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２１０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２４０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２７０以上のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、この相同配列は、配列番号２と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは、９８％または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号２の免疫原性断片が存在し、好ましくは、配列番号２と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性、好ましくは９８％または９９％の相同性を有する断片が存在する。

配列番号３は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号４は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号３は、ＩｇＥリーダーからの追加的な５´上流配列と共に、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列に連結するＩｇＥリーダー配列をさらに含む。配列番号４は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＡのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号４は、コンセンサス免疫原配列ＮＳ５Ａに連結したＩｇＥリーダー配列をさらに含む。このＩｇＥリーダー配列は、コンセンサスＮＳ５Ａに対するＮ末端であり、配列番号９であり、かつ配列番号７によりコードすることができる。

配列番号３の相同配列は、９０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号３の断片は、１８０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、９００以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、９９０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１０８０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１１７０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１２６０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１３５０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１４３０以上のヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、この相同配列は、配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号３の免疫原性断片が存在し、好ましくは、配列番号３と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する断片が存在する。

配列番号４の相同配列は、３０以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号４の断片は、６０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、９０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１２０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１５０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１８０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２１０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２４０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２７０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３００以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３３０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３６０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３９０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、４２０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、４５０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、４７０以上のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、この相同配列は、配列番号４と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号４の免疫原性断片が存在し、好ましくは、配列番号４と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する断片が存在する。

配列番号５は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列を含む。配列番号６は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号５は、ＩｇＥリーダーからの追加的な５´上流配列と共に、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原をコードするヌクレオチド配列に連結するＩｇＥリーダー配列をさらに含む。配列番号６は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む。配列番号６は、コンセンサス免疫原配列ＮＳ５Ｂに連結したＩｇＥリーダー配列をさらに含む。このＩｇＥリーダー配列は、コンセンサスＮＳ５Ｂに対するＮ末端であり、配列番号９であり、配列番号８によりコードすることができる。

配列番号５の相同配列は、９０以上のヌクレオチドを含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号５の断片は、１８０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、２７０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、３６０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、４５０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、５４０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、６３０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、７２０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、８１０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、９００以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、９９０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１０８０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１１７０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１２６０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１３５０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１４４０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１５３０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１６２０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１７１０以上のヌクレオチドを；いくつかの実施形態において、１８００以上のヌクレオチドを含んでもよい。好ましくは、この相同配列は、配列番号５と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号５の免疫原性断片が存在し、好ましくは、配列番号５と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の相同性を有し、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する断片が存在する。

配列番号６の相同配列は、３０以上のアミノ酸を含んでもよい。いくつかの実施形態において、配列番号６の断片は、６０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、９０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１２０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１５０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、１８０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２１０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２４０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、２７０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３００以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３３０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３６０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、３９０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、４２０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、４５０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、４８０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、５１０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、５４０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、５７０以上のアミノ酸を；いくつかの実施形態において、６００以上のアミノ酸を含んでもよい。好ましくは、この相同配列は、配列番号６と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは９８％または９９％の相同性を有する。いくつかの実施形態において、配列番号６の免疫原性断片が存在し、好ましくは、配列番号６と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有し、より好ましくは、９８％または９９％の相同性を有する断片が存在する。

いくつかの実施形態によると、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡもしくはＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列、またはその機能的断片、またはその発現できるコード配列、または上述の組み合わせをこの個体に投与するステップを含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡもしくはＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片をコードする単離した核酸分子を含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡもしくはＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片をコードする組み換えワクチンを含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶ７タンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡもしくはＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列またはその断片を含むサブユニットワクチンを含む。いくつかの実施形態は、ＨＣＶタンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡもしくはＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１ａコンセンサス免疫原のアミノ酸配列を含む弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンを含む。

改良型ワクチンは、抗ＨＣＶ免疫反応を誘導することができ、特に、肝臓内ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の免疫を誘導することのできる免疫原として改良型ワクチンを特に効果的にさせるエピトープを有するタンパク質、およびそのようなエピトープを有するタンパク質をコードする遺伝子構築物を含む。したがって、治療的または予防的に免疫反応を誘導するために、ワクチンを提供することができる。いくつかの実施形態において、この免疫原を送達する手段には、ＤＮＡワクチン、組み換えワクチン、タンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む組成物、弱毒化ワクチンまたは不活化ワクチンがある。いくつかの実施形態において、このワクチンは、以下からなる群から選択される組み合わせを含む：１つ以上のＤＮＡワクチン、１つ以上の組み換えワクチン、１つ以上のタンパク質サブユニットワクチン、この免疫原を含む１つ以上の組成物、１つ以上の弱毒化ワクチン、１つ以上の不活化ワクチン。

本発明のいくつかの実施形態によると、ワクチンは、個体の免疫系の活性を調節するために個体に送達されることにより、免疫反応を高める。タンパク質をコードする核酸分子が、個体の細胞により取り込まれると、この核酸配列は細胞内で発現され、それにより、タンパク質が個体に送達される。本発明の態様は、プラスミドなどの核酸分子上のタンパク質コード配列を、組み換えワクチンの一部として、弱毒化ワクチンの一部として、単離したタンパク質またはベクターのタンパク質部分として送達する方法を提供する。

本発明のいくつかの態様によると、予防的におよび／または治療的に個体を免疫化する組成物ならびに方法が提供される。

ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，７３９，１１８号、同第５，８１７，６３７号、同第５，８３０，８７６号、同第５，９６２，４２８号、同第５，９８１，５０５号、同第５，５８０，８５９号、同第５，７０３，０５５号、同第５，６７６，５９４号、および本明細書で引用する優先出願に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。それらの出願に記載される送達プロトコールに加えて、ＤＮＡを送達する代替方法は、米国特許第４，９４５，０５０号および同第５，０３６，００６号に記載されており、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、改良型弱毒化生ワクチン、改良型不活化ワクチン、および抗原をコードする外来遺伝子を送達するために組み換えベクターを使用する改良型ワクチン、さらにサブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンに関する。弱毒化生ワクチン、組み換えベクターを使用して外来抗原を送達するワクチン、サブユニットワクチンおよび糖タンパク質ワクチンの例は、米国特許第４，５１０，２４５号、同第４，７９７，３６８号、同第４，７２２，８４８号、同第４，７９０，９８７号、同第４，９２０，２０９号、同第５，０１７，４８７号、同第５，０７７，０４４号、同第５，１１０，５８７号、同第５，１１２，７４９号、同第５，１７４，９９３号、同第５，２２３，４２４号、同第５，２２５，３３６号、同第５，２４０，７０３号、同第５，２４２，８２９号、同第５，２９４，４４１号、同第５，２９４，５４８号、同第５，３１０，６６８号、同第５，３８７，７４４号、同第５，３８９，３６８号、同第５，４２４，０６５号、同第５，４５１，４９９号、同第５，４５３，３６４号、同第５，４６２，７３４号、同第５，４７０，７３４号、同第５，４７４，９３５号、同第５，４８２，７１３号、同第５，５９１，４３９号、同第５，６４３，５７９号、同第５，６５０，３０９号、同第５，６９８，２０２号、同第５，９５５，０８８号、同第６，０３４，２９８号、同第６，０４２，８３６号、同第６，１５６，３１９号および同第６，５８９，５２９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。

細胞に取り込まれると、この遺伝子構築物（複数可）は、機能している染色体外分子としてこの細胞内に存在したままであってもよく、かつ／またはこの細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれてもよい。ＤＮＡは細胞内に導入されてもよく、そこで、１つまたは複数のプラスミドの形態の別々の遺伝物質として留まる。あるいは、染色体に組み込むことができる直鎖ＤＮＡを、この細胞に導入してもよい。この細胞にＤＮＡを導入する場合、染色体へのＤＮＡ組み込みを促進する薬剤を加えてもよい。組み込みを促進するのに有用なＤＮＡ配列が、このＤＮＡ分子に含まれてもよい。あるいは、ＲＮＡをこの細胞に投与してもよい。セントロメア、テロメアおよび複製開始点を含む直鎖ミニ染色体としてこの遺伝子構築物を提供することも考えられる。遺伝子構築物は、細胞内で生存する弱毒化された生の微生物または組み換え微生物ベクターの遺伝物質の一部のままであってもよい。遺伝子構築物は、組み換えウイルスワクチンのゲノムの一部であってもよく、ここで、この遺伝物質はこの細胞の染色体に組み込まれるかまたは染色体外に留まるかのいずれかである。遺伝子構築物は、核酸分子の遺伝子発現に必要な調節要素を含む。これらの要素には、プロモーター、開始コドン、終止コドン、およびポリアデニル化シグナルが含まれる。さらに、大抵、エンハンサーは、標的タンパク質または免疫調節タンパク質をコードする配列の遺伝子発現に必要とされる。これらの要素は、所望のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されること、およびこれらの調節要素は、これらが投与される個体において作動可能であることが必要である。

開始コドンおよび終止コドンは、一般に、所望のタンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部であると考えられる。しかし、これらの要素は、この遺伝子構築物が投与される個体において機能的であることが必要である。開始および終止コドンはコード配列と共にフレームの中になければならない。

使用されるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、個体の細胞内で機能的でなければならない。

本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なプロモーターの例として、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）プロモーター、マウス乳ガンウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＢＩＶ末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、ＡＬＶプロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。

本発明を実行するのに有用な、特にヒトの遺伝子ワクチンの産生において有用なポリアデニル化シグナルの例として、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、それらに限定されない。特に、プラスミドｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ）内に存在し、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルと称されるＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを使用する。

ＤＮＡ発現に必要な調節要素に加えて、他の要素もこのＤＮＡ分子の中に含まれてもよい。かかる追加の要素はエンハンサーを含む。このエンハンサーは、以下を含む群から選択されてもよいがそれらに限定されない：ヒトアクチンエンハンサー、ヒトミオシンエンハンサー、ヒトヘモグロビンエンハンサー、ヒト筋肉クレアチンエンハンサーならびにＣＭＶ、ＲＳＶおよびＥＢＶのエンハンサーなどのウイルスエンハンサー。

遺伝子構築物は、染色体外にこの遺伝子構築物を維持し、細胞内でこの構築物の複数のコピーを産生するために、哺乳類複製開始点が供給され得る。インビトロジェン（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のプラスミドｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４およびｐＲＥＰ４は、組み込まれることなく、高コピーのエピソーム複製を行うエプスタイン・バーウイルス複製開始点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含む。

免疫化の適用に関連するいくつかの好ましい実施形態において、本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列、および追加として、かかる標的タンパク質に対する免疫反応をさらに高めるタンパク質の遺伝子を含む核酸分子（複数可）を送達する。かかる遺伝子の例として、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびシグナル配列が除去され、任意でＩｇＥのシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５などの他のサイトカインならびにリンホカインをコードする遺伝子が挙げられる。有用であり得る他の遺伝子には、以下をコードする遺伝子が含まれる：ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異型、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２およびそれらの機能的断片。

何らかの理由で、この遺伝子構築物を受け取る細胞を除去することが望ましい場合、細胞破壊の標的として機能を果たす追加の要素を加えてもよい。発現できる形態のヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子を、この遺伝子構築物に含めることができる。薬剤ガンシクロビルはこの個体に投与され得、かつこの薬剤はｔｋを産生する全細胞を選択的に死滅させるため、この遺伝子構築物を有する細胞の選択的破壊のための手段をもたらす。

タンパク質産生を最大限するために、この構築物が投与される細胞における遺伝子発現に十分に適した調節配列を選択してもよい。さらに、細胞内で最も効率的に転写されるコドンを選択してもよい。当業者は、細胞内で機能的なＤＮＡ構築物を作製することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質のコード配列がＩｇＥシグナルペプチドと連結される遺伝子構築物を提供し得る。いくつかの実施形態において、本明細書記載のタンパク質は、ＩｇＥシグナルペプチドと連結される。

タンパク質が用いられるいくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質を産生および単離することができる。タンパク質が用いられるいくつかの実施形態において、例えば、当業者は、周知の技術を用いて、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ分子を、周知の発現系で使用するための市販の発現ベクターに挿入することができる。例えば、市販のプラスミドｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を、酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現系（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を昆虫細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。例えば、市販のプラスミドｐｃＤＮＡ ＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ）を、チャイニーズハムスター卵巣細胞などの哺乳類細胞における（タンパク質）産生のために使用してもよい。当業者は、これらの市販の発現ベクターおよび発現系または他のものを使用して、通例の技術およびすぐに入手できる出発物質によりタンパク質を産生することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照、これは参照により本明細書に組み込まれる）。従って、所望のタンパク質を原核細胞系および真核細胞系の両方において調製することができ、このタンパク質の一連のプロセシング型をもたらすことができる。

当業者は、他の市販の発現ベクターおよび発現系を使用してもよく、または周知の方法およびすぐに入手できる出発物質を用いてベクターを産生してもよい。プロモーターおよびポリアデニル化シグナル、ならびに好ましくはエンハンサーなどの必須の制御配列を含む、様々な種類の宿主に対する発現系は、すぐに入手でき、当業で知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照。遺伝子構築物は、この構築物がトランスフェクトされる細胞株において機能的であるプロモーターと作動可能に連結されるタンパク質コード配列を含む。構成的プロモーターの例として、サイトメガロウイルスまたはＳＶ４０のプロモーターが挙げられる。誘導できるプロモーターの例として、マウス乳腺白血病ウイルスまたはメタロチオネインプロモーターが挙げられる。当業者は、すぐに入手できる出発物質から、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡで細胞をトランスフェクトするのに有用な遺伝子構築物を容易に作製することができる。このタンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを用いて、適合性宿主を形質転換し、その後、外来ＤＮＡの発現が起こる条件下で培養し、維持する。

産生させたタンパク質を、必要に応じて、かつ当業者に知られるように、これらの細胞を溶解するまたは培地から回収することによって、培養物から回収した。当業者は、周知の方法を用いて、かかる発現系を用いて産生されるタンパク質を単離することができる。上記の特異的タンパク質と特異的に結合する抗体を用いて天然源からタンパク質を精製する方法を、組み換えＤＮＡ法によって産生されるタンパク質の精製に同様に適用してもよい。

組み換え技術によるタンパク質産生に加えて、自動化ペプチド合成機も使用して、本質的には純粋な単離されるタンパク質を産生してもよい。かかる技術は当業者に周知であり、置換を有する誘導体がＤＮＡにコードされるタンパク質産生において供給されない場合に有用である。

ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、組み換えアデノウイルス、組み換えアデノウイルス関連ウイルスおよび組み換えワクシニアなどの組み換えベクターを含むいくつかの周知の技術のいずれかを用いて、これらの核酸分子を送達してもよい。

投与経路には、筋肉内経路、鼻腔内経路、腹腔内経路、皮内経路、皮下経路、静脈内経路、動脈内経路、眼球内経路、および経口経路、ならびに粘膜組織への吸入剤もしくは坐薬による、例えば、膣、直腸、尿道、頬および舌下の組織への洗浄による局所的経路、経皮的経路が含まれるが、それらに限定されない。好ましい投与経路には、筋肉内注射、腹腔内注射、皮内注射および皮下注射が含まれる。遺伝子構築物は、電気穿孔の方法および装置、従来の注射器、無針注射器具、または「微粒子衝撃遺伝子銃」を含むがそれらに限定されない手段により投与されてもよい。

これらのＤＮＡワクチンの送達を促進するのに好ましい電気穿孔装置および電気穿孔法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらにより出願された米国特許公開第２００５／００５２６３０号（これらの内容は、参照によりこの全体が本明細書に組み込まれる）に記載される例が含まれる。３５ＵＳＣ１１９（ｅ）条の下、２００６年１０月１７日に出願された米国特許仮出願第６０／８５２，１４９号および２００７年１０月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／９７８，９８２号の利益を主張する、２００７年１０月１７日に出願された同時係属で共同所有の米国特許出願第１１／８７４０７２号（これらの全ては、この全体が本明細書に組み込まれる）に提供されるＤＮＡワクチンの送達を促進する電気穿孔装置および電気穿孔法も好ましい。

以下は、電気穿孔技術を用いた実施形態の例であり、上記で論じた特許参考文献の中で詳細に論じられる：電気穿孔装置は、使用者により事前に設定された電流入力と同じような定電流を生み出すエネルギーのパルスを、哺乳類の所望の組織へ送達するように配置され得る。この電気穿孔装置は、電気穿孔構成要素および電極集合体またはハンドル集合体を含む。この電気穿孔構成要素は、制御装置、電流波形発生器、インピーダンス試験器、波形自動記録装置、入力要素、状況報告要素、伝達ポート、記録構成要素、電源、および電源スイッチを含む電気穿孔装置の１つ以上の様々な要素を含み、かつ組み込むことができる。この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の１つの要素として機能することができ、他の要素は、この電気穿孔構成要素と連通する別々の要素（または構成要素）である。いくつかの実施形態において、この電気穿孔構成要素は、電気穿孔装置の２つ以上の要素として機能することができ、それは、この電気穿孔構成要素から分離する電気穿孔装置のさらに他の要素と連通することができる。これらの要素は１つの装置として、または互いに連通する別々の要素として機能することができるので、改良型ＨＣＶワクチンを送達するためにこの電気穿孔技術を用いることは、１つの電気機械装置または機械装置の一部として存在する電気穿孔装置の要素に限定されない。この電気穿孔構成要素は、所望の組織に定電流を生み出すエネルギーパルスを送達することができ、フィードバック機構を含む。電極集合体は、空間的配置に複数の電極を有する電極アレイを含み、ここで、この電極集合体は、この電気穿孔構成要素からエネルギーパルスを受け取り、電極を通して所望の組織にエネルギーパルス送る。複数の電極の少なくとも１つは、エネルギーパルスの送達の間は中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、この電気穿孔構成要素へインピーダンスを伝える。このフィードバック機構は、測定されるインピーダンスを受け取ることができ、この電気穿孔構成要素によって送達されるエネルギーパルスを調節し、定電流を維持することができる。

いくつかの実施形態において、複数の電極は、分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができる。いくつかの実施形態において、複数の電極は、プログラムされた順番の下で、電極制御を介して分散的パターンでエネルギーパルスを送達することができ、使用者が、プログラムされた順番を電気穿孔構成要素に入力する。いくつかの実施形態において、プログラムされた順番は、順に送達される複数のパルスを含み、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの次のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性極と共に少なくとも２つの活性電極の別の１つによって送達される。

いくつかの実施形態において、このフィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行される。好ましくは、このフィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって行われる。好ましくは、このフィードバックは、毎５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓで生じるが、好ましくはリアルタイムなフィードバックつまり瞬間的（すなわち、反応時間を決定するために利用できる技術によって決定されるような事実上瞬間的）である。いくつかの実施形態において、中性電極は、所望の組織においてインピーダンスを測定し、インピーダンスをこのフィードバック機構へ伝達し、このフィードバック機構はインピーダンスに応答し、事前設定電流と同じような値で定電流を維持するためにエネルギーパルスを調節する。いくつかの実施形態において、このフィードバック機構は、エネルギーパルス送達の間、連続的にかつ瞬間的に定電流を維持する。

いくつかの実施形態において、この核酸分子を、ポリヌクレオチド機能エンハンサーまたは遺伝子ワクチン促進剤の投与と併用して、これらの細胞に送達する。ポリヌクレオチド機能エンハンサーは、米国特許第５，５９３，９７２号、同第５，９６２，４２８号および１９９４年１月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００８９９号に記載されており、これらは参照により各々が本明細書に組み込まれる。遺伝子ワクチン促進剤は、１９９４年４月１日に提出された米国特許第０２１，５７９号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。核酸分子と併用して投与する助剤を、核酸分子の投与前後に、この核酸分子との混合物として投与するか、または別々に、同時に投与してもよい。さらに、トランスフェクション剤および／または複製剤および／または炎症性薬剤として機能し得、かつＧＶＦと一緒に投与され得る他の薬剤には、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦ、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５などの増殖因子、サイトカインおよびリンホカイン、ならびに線維芽細胞増殖因子、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバンド、モノホスホリルリピドＡ（ＷＬ）を含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体およびスクアレンスクアレンなどの小胞が含まれ、かつヒアルロン酸も、この遺伝子構築物と併用して投与に使用してもよい。いくつかの実施形態において、免疫調節タンパク質を、ＧＶＦとして使用してもよい。いくつかの実施形態において、この核酸分子はＰＬＧと関連して提供され、送達および取り込みを高める。

本発明による医薬組成物は、約１ｎｇ〜約２０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による医薬組成物は、約５ｎｇ〜約１０００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１０ｎｇ〜約８００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約０．１〜約５００μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１〜約３５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約２５〜約２５０μｇのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、これらの医薬組成物は、約１００〜約２００μｇのＤＮＡを含む。

本発明による医薬組成物を、使用する投与方法に従って処方する。医薬組成物が注射可能な医薬組成物である場合において、注射可能な医薬組成物は無菌であり、発熱物質も粒子も含まない。好ましくは、等張製剤を使用する。一般に、等張にするための添加剤には、塩化ナトリウム、Ｄ型グルコース、マンニトール、ソルビトールおよび乳糖が含まれ得る。場合によっては、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤には、ゼラチンおよびアルブミンが含まれる。いくつかの実施形態において、血管収縮剤をこの製剤に加える。

本発明のいくつかの実施形態によると、免疫反応を誘導する方法が提供される。このワクチンは、タンパク質に基づく、弱毒化生ワクチン、細胞ワクチン、組み換えワクチンまたは核酸もしくはＤＮＡワクチンであってもよい。いくつかの実施形態において、粘膜免疫反応を誘導する方法を含む、免疫原に対する免疫反応を個体において誘導する方法は、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片またはそれらの発現できるコード配列のうちの１つ以上を、本発明のタンパク質をコードする単離した核酸分子および／または本発明のタンパク質をコードする組み換えワクチン、および／または本発明のタンパク質のサブユニットワクチンおよび／または弱毒化生ワクチンおよび／または不活化ワクチンと組み合わせて、この個体に投与するステップを含む。ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質およびそれらの機能的断片のうちの１つ以上を、免疫原をコードする単離した核酸分子；および／もしくは免疫原をコードする組み換えワクチンおよび／もしくは免疫原を含むサブユニットワクチンおよび／もしくは弱毒化生ワクチンおよび／もしくは不活化ワクチンの投与前に、それらの投与と同時に、またはそれらの投与の後に投与してもよい。いくつかの実施形態において、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣおよびそれらの機能的断片からなる群から選択される１つ以上のタンパク質をコードする単離した核酸分子を、この個体に投与する。

本発明を、以下の実施例においてさらに説明する。この実施例は本発明の実施形態を示すが、単なる説明の目的で与えられるということが理解されるべきである。上記の説明およびこの実施例から、当業者は本発明の本質的特徴を突き止めることができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に本発明を適用するために、本発明の様々な変更および改良を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載される改良に加えて、本発明の様々な改良は、先の記載から当業者に明らかになるであろう。かかる改良は、添付の特許請求の範囲に入ることも意図される。

米国特許、米国特許出願、および本開示の全体を通して引用される参考文献の各々は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
実施例

実施例１
ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂの設計および発現
ＨＣＶタンパク質ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、およびＮＳ５ＢのＨＣＶ遺伝子型１aコンセンサス配列を、ロスアラモス国立研究所のＨＣＶ配列データベースから得た１７０の異なる配列から生成した。その後、これらの発現および検出を高めるために、各構築物のＣ末端にＩｇＥリーダー配列を加えかつＮ末端にＨＡ−タグを加えることを含むいくつかの改変をこのコンセンサス構築物に対して行った。さらに、各構築物を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）（ＧＥＮＥＡＲＴ、ドイツ）を使用してコドンおよびＲＮＡの最適化を介してさらに改変し、ＣＭＶプロモーターの制御下で臨床発現ベクターｐＶＡＸにサブクローニングした。最終的な構築物を、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂと名付けた（プラスミドマップを、図８Ａ〜図８Ｃに示す）。

各構築物のタンパク質発現を、各個別の構築物でヒトＲＤ筋肉細胞を一過的にトランスフェクションすることで確認した。製造者のガイドラインにしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５ＢでＲＤ筋肉細胞を一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、この細胞を固定し、透過処理した。各タンパク質の発現を、抗ＨＡポリクローナルウサギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＣｙ３コンジュゲートヤギ抗ウサギ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて検出した。

この細胞を、共焦点顕微鏡を用い２５０倍の拡大率で視覚化した（画像は図示せず）。３つの構築物はすべて発現していることが示され、トランスフェクトされた細胞数が最も多かったのはｐＣｏｎＮＳ４Ｂであり、最も少なかったのはｐＣｏｎＮＳ５Ｂであった。空のベクターｐＶａｘを用いたトランスフェクションを、対照として使用した。

実施例２
ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂを用いたＣ５７ＢＬ／６マウスの免疫は、強力な細胞免疫反応を誘導する
本構築物の発現を確認した後、本構築物の免疫原性を判定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫した。生後６〜８週間のメスのＣ５７ＢＬ／６マウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入し、国立衛生研究所およびペンシルバニア大学の研究機関の動物管理および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）（ＩＡＵＣＵＣ）のガイドラインにしたがって飼育した。動物を、群あたり５匹とし、各構築物の３つの異なる用量群に分けた。この動物を、５μｇ、１２、５μｇ、または２５μｇいずれかのｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡまたはｐＣｏｎＮＳ５Ｂで筋肉注射により免疫し、続いて電気穿孔を行った。

電気穿孔はＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（商標）適合型一定電流の電気穿孔装置および電極アレイ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ．， Ｂｌｕｅ Ｂｅｌｌ， ＰＡ）を使用して実行した。

２週間あけて動物に合計２回の免疫処置を行い、第２の免疫処理から１週間後に屠殺した。本構築物の免疫原性を、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを使用して判定した。

マウスのＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイは、Ｙａｎ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ．， Ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ｂｙ ａｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ＨＩＶ−１ ｓｕｂｔｙｐｅ Ｂ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ−ｂａｓｅｄ ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ， ２００７． １５（２）： ｐ． ４１１−２１において以前に記載される通りに行った。マウスの脾細胞を、８アミノ酸ずつ重複し各構築物の長さにわたる１５ｍｅｒのペプチドのプールで刺激した。ペプチドを、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）により合成し、ＤＭＳＯ中で再懸濁し、２μｇ／ｍｌ／ペプチドの濃度でプールした。この脾細胞をウェルあたり２００，０００細胞の濃度でプレーティングした。結果を、１×１０⁶脾細胞あたりのスポット形成単位（ＳＦＵ）の平均数として調節し、グラフにした。この結果を図１中に見ることができる。

本構築物の免疫原性は、免疫蛍光法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により判定される構築物の発現レベルと良好に相関した。すべての構築物は強力な免疫原性を有していたが、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂに対する反応が最も強力であり、一方ｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対する反応が最も弱かった。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂの最適用量は１２．５μｇ（１６８７±２３７ＳＦＵ／１０⁶脾細胞）であり、ｐＣｏｎＮＳ５Ａの最適用量は５μｇ（１０９１±１１１ＳＦＵ１０⁶脾細胞）であり、ｐＣｏｎＮＳ５Ｂの最適用量は１２．５μｇ（７３６±１３６ＳＦＵ／１０⁶脾細胞）であった。

各構築物の用量を決定した後、各構築物により誘導される細胞免疫反応のより詳細な分析を実行した。動物を上述した通りに免疫し、群分けした。屠殺後脾臓を単離し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ装置を用いてそれぞれ粉砕した。この脾細胞を４０μＭの細胞濾過器で濾過し、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）で５分間処置し、ＲＢＣを除去した。脾細胞を完全培地（１０％の熱失活させたＦＢＳ、１×抗生剤／抗真菌剤、および５５μＭ／Ｌ β‐メルカプトエタノールを追加した２ｍＭ／ＬのＬグルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁した。細胞数を、血球計算器を用いて判定した。

各構築物についてＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞反応の相対的寄与を判定するために、脾細胞をＩＦＮ−γに対し細胞内染色し、図２のようにフローサイトメトリーで視覚化した。細胞内サイトカイン染色の結果は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイで以前に見られた結果と良好に相関した。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂに対する反応が最も大きく、一方ｐＣｏｎＮＳ５Ｂの免疫原性が最も低かった。各構築物に特異的なＣＴ４＋Ｔ細胞も同定されたが、ｐＣｏｎＮＳ４ＢおよびｐＣｏｎＮＳ５Ａに対するＩＦＮ−γ反応の大部分は、ＣＤ８＋Ｔ細胞により産生された。興味深いことに、ｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対するＩＦＮ−γ反応の大部分はＣＤ４＋Ｔ細胞を媒介したものであり、ＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞はほとんど同定されなかった。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対するＩＦＮ−γ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の平均パーセンテージは、図３Ａの通り、それぞれ０．５０％±０．１１％、０．２７％±０．０６％および０．３２％±０．１１％であった。ｐＣｏｎＮＳ４ＢおよびｐＣｏｎＮＳ５Ａに対するＩＦＮ−γ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の平均パーセンテージは、図３Ｂの通り、それぞれ３．２９％±１．３３％および０．６８％±０．２２％であった。

実施例３
免疫が誘導したＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂに特異的なＴ細胞を、筋肉内免疫処置後の肝臓内で検出した
実施例１に上述されている通りにマウスを免疫した。最後の免疫から１週間後、これらの動物を屠殺した。屠殺後肝臓を単離し、Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ ｍａｃｈｉｎｅを用いてそれぞれ粉砕した。その結果得られた混合物を濾過し、１０ｍｌのＡＣＫ溶解緩衝液（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で５分間処置して、ＲＢＣを除去した。この混合物を沈殿させ、３５％パーコールによる勾配を用いてリンパ球から肝細胞を分離した。沈殿させたリンパ球は完全培地中に再懸濁した。実験を、肝臓灌流を行う場合と行わない場合の両方で実行したが、両者に差異は観察されなかった。

Ｔ細胞を各肝臓から単離し、各個別の構築物に対応する重複ペプチドで刺激した。免疫が誘導したＨＣＶ特異的Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを介して検出したＩＦＮ−γ発現により同定した。各動物をそれぞれ分析した。興味深いことに、ＨＣＶ特異的Ｔ細胞は、すべての免疫マウスの肝臓内で同定された。ＣＴ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞反応の両方がｐＣｏｎＮＳ４ＢおよびｐＣｏｎＮＳ５Ａで免疫したマウスの肝臓内で検出され、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応のみがｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫したマウス内で検出された。肝臓内で検出された主要なＴ細胞反応は、脾臓内で同定されたものと同一であった。ｐＣｏｎＮＳ４ＢおよびｐＣｏｎＮＳ５Ａで免疫したマウスは、肝臓内に強力なＣＤ８＋Ｔ細胞反応を有したのに対し、ｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫したマウスは、主にＣＤ４＋Ｔ細胞反応を示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞反応をほとんど示さなかった。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対するＣＴ４＋Ｔ細胞反応は、図４Ａの通り、それぞれ０．２９％±０．０７％、０．４１％±０．０９％および０．４１％±０．０６％であった。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂに対するＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、図４Ｂの通り、それぞれ３．７３％±０．７３％、２．２８％±０．６８％および０．０６％±０．０２％であった。

実施例４
３．４ 肝細胞によるＨＣＶ抗原の肝特異的発現により、ＩＦＮ−γ産生の増加およびトランスフェクトされた肝細胞のクリアランスが起こる
次に、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂタンパク質のいずれかの肝特異的発現が、肝臓内で検出されるＨＣＶ特異的Ｔ細胞を活性化できるかどうかを判定しようと試みた。ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂの肝特異的発現を誘導するために、免疫したマウスの肝細胞を、Ａｈｌｅｎ， Ｇ．， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎ ｖｉｖｏ ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ３／４Ａ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ ｂｙ ＤＮＡ ｖａｃｃｉｎｅ−ｐｒｉｍｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｊ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ， ２００５． １９２（１２）：ｐ． ２１１２−６で既に記載されたように、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡまたはｐＣｏｎＮＳ５Ｂのいずれかの尾静脈注射によりトランスフェクトした。肝臓を４８時間トランスフェクトした後回収し、上の実施例３に記載される通り肝臓のリンパ球を単離した。前述の通り、免疫が誘導したＨＣＶ特異的Ｔ細胞を、細胞内サイトカイン染色およびフローサイトメトリーを介して検出したＩＦＮ−γ分泌により同定した。

細胞内サイトカイン染色
脾細胞を、１×１０⁶細胞／１００μｌの濃度で完全培地中に再懸濁し、９６ウェルプレートの丸型の底部にプレーティングした。脾細胞を、１００μｌの：いずれもＧｏｌｇｉＳｔｏｐおよびＧｏｌｇｉＰｌｕｇ （ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を追加した完全培地中に希釈された１）２μｇ／ｍｌのｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡまたはｐＣｏｎＮＳ５Ｂ重複ペプチド、２）１μｇ／ｍｌのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（陽性対照：Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）または３）０．１％ジメチルスルホキシド（陰性対照）のいずれかで刺激した。脾細胞を３７℃で合計５時間刺激した後、ＰＢＳで３回洗浄し、生存率を調べるために染色した。脾細胞を、表面マーカー；抗ＣＤ４、ＣＤ８に対し４℃で３０分間細胞外染色した。その後脾細胞をＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて透過処理し、かつ洗浄し、それから抗ＩＦＮ−γおよびＣＤ３を用いて、４℃で４５分間細胞内染色した。染色後、脾細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定し、分析まで４℃で保存した。特異的機能を、各動物についてペプチド刺激群のパーセント関数から０．１％ジメチルスルホキシド刺激群（陰性対照）のパーセント関数を引いた値として記録した。

フローサイトメトリーの試薬
以下の直接コンジュゲートされる抗体を使用した：抗マウス ＣＤ３−アロフィコシアニンシアニン色素７（ＡＰＣ−Ｃｙ７）［ｃｌｏｎｅ １４５−Ｃ１１］、抗マウスＣＤ４−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）［ｃｌｏｎｅ Ｈ１２９．１９］、抗マウス ＣＤ８−ペリディニンクロロフィルタンパク質５．５（ＰｅｒＣＰ５．５）［ｃｌｏｎｅ ５３−６．７］、抗マウスＩＦＮ−γフィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｙｉｎ）シアニン色素７（ＰＥ−Ｃｙ７）［ｃｌｏｎｅ ＸＭＧ１．２］（全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、サンノゼ，ＣＡ）。肝細胞を同定するために、製造者のプロトコールにしたがって、Ａｑｕａ Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｆｉｘａｂｌｅ ｄｅａｄ ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、ＯＲ）を使用した。

ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，フランクリンレイクス、ＮＪ）上で試料を収集した。 ＢＤ ＣｏｍｐＢｅａｄｓ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および単一の蛍光色素を補正のために使用した。データはＭａｃ用ＦｌｏｗＪｏソフトウェア バージョン８．７．１（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ、アシュランド、ＯＲ）を使用して分析した。

尾静脈注射の後、図５にあるように、脾臓および静止状態の肝臓中で検出したＨＣＶ特異的Ｔ細胞のパーセンテージに比べＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞のパーセンテージの大幅な上昇が、３つ全ての免疫群において見られた。図６Ａにある通り、ＣＤ４＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞のパーセンテージは、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫したマウスで、それぞれ２．２７％±０．７０％、２．５５％±０．７０％および１．２２％±０．２２％であった。図６Ｂにある通り、ＣＤ８＋ＨＣＶ特異的Ｔ細胞のパーセンテージは、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫したマウスで、それぞれ９．４６％±１．５３％、６．９８％±０．４８％および０．４７７％±０．１６％であった。尾静脈注射の前後で、肝臓中のＨＣＶ特異的ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のパーセンテージにより決定されるように、最大倍数増加が、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応で見られた。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂ免疫マウスにおける肝臓内ＣＤ４＋Ｔ細胞反応の倍数増加は、それぞれ約８、６、および３倍であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞反応は、尾静脈注射の前後いずれの肝臓においても主要反応のままであったが、ＣＤ４＋Ｔ細胞反応と比べＣＤ８＋Ｔ細胞反応の倍数増加はわずかに小さかった。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡおよびｐＣｏｎＮＳ５Ｂ免疫マウスにおける肝臓内ＣＤ８＋Ｔ細胞反応の倍数増加は、それぞれ、約３、３、および８倍であった。

各構築物により産生された肝臓内ＨＣＶ特異的ＩＦＮ−γ反応を評価した後、免疫賦与が肝臓内の細胞傷害性ＨＣＶ特異的Ｔ細胞を産生したかどうかを判定する試験も実行した。各群の各動物から肝臓のローブを採取し、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかの肝細胞での発現を調べるため染色した。各構築物での免疫賦与により産生される肝臓内Ｔ細胞反応の細胞傷害性を、免疫未処置の対照のトランスフェクトと比べ各免疫動物がトランスフェクション後にＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかを発現している肝細胞を除去する能力により評価した。各群の染色の代表的な共焦点画像を観察した（画像は図示されない）。

共焦点顕微鏡
肝臓を切除し、生検を２％パラホルムアルデヒドで固定し、その後３０％スクロース中で一晩凍結保護した。生検を、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ （Ｂａｙｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ピッツバーグ、ＰＡ）中に浸し、ドライアイス窒素上の２−メチルブタン中で急速凍結した。Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｐｌｕｓ ｇｌａｓｓ ｓｌｉｄｅｓ （Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ピッツバーグ、ＰＡ）上に置かれた組織切片（６μｍ）上で染色を実行し、使用するまで８０℃で保存した。免疫蛍光染色を行う前に、スライドを室温に戻しリン酸緩衝塩溶液（ＰＢＳ）で各１０分間３回洗浄し、２次試薬が産生された種の１０％の通常の血清および０．１％のトリトンを含むＰＢＳにおいてブロックした。１次試薬を切片に適用し、室温で１時間または４℃で一晩インキュベートした。この切片を、ＰＢＳで各１０分間３回洗浄し、必要である際には、２次試薬を室温で３０分間適用した。この切片を再び、ＰＢＳで各１０分間、３回洗浄した。カバーガラスを、Ｐｒｏｌｏｎｇ Ｇｏｌｄ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ｍｅｄｉａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッドＣＡ）で乗せ、スライドを試験および撮影まで暗所に４℃で保存した。すべての染色は湿度のある環境において実行した。使用した抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎあるいは抗体を製造する競合会社から入手した。全ての画像はＺｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ １００倒立共焦点顕微鏡を用いて得て、蛍光強度（ｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ）の分析および定量化は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、ロックビル、ＭＤ）を使用して行った。

図９にある通り、各群のトランスフェクトされた肝細胞のクリアランスを、核のＤＡＰＩ染色のＭＦＩにより測定した各領域内に存在する肝細胞数により標準化したＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂ発現のいずれかの平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって定量化した。未処置の対照と比べ、トランスフェクトされた肝細胞数の劇的な低下が、免疫した群の動物で３つの構築物全てについて見られた。ｐＣｏｎＮＳ４Ｂ、ｐＣｏｎＮＳ５ＡまたはｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫した動物は、未処置の対照と比べトランスフェクトされた肝細胞の発現が、約９、３、および２倍低下した。各免疫群中で観察されたクリアランス量は、トランスフェクトされた肝臓内で検出されたＨＣＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応と良好に相関した。最大のクリアランス量は、ｐＣｏｎＮＳ４Ｂで免疫した動物において観察され、最少のクリアランスは、ｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫した動物において見られた。

提供された結果は、全身性の免疫を介して誘導されたＨＣＶ特異的Ｔ細胞が同種の抗原の肝特異的発現がないとき肝臓内に取り込まれ、肝臓内ＨＣＶ特異的Ｔ細胞の大きなプールの形成を引き起こすことを示す。これらのＴ細胞は、肝臓内で依然として完全に機能しており、静止状態の肝臓へのこれらの取り込みが免疫監視の連続的な工程の一部として代わりに機能しており、また肝臓が感染を防ぐための重要な機構であると証明し得ることを示唆している。このことを支持するものとして、ＨＣＶの抗原の肝特異的な発現に応答し、肝局在のＨＣＶ特異的Ｔ細胞の集団が、ＩＦＮ−γ発現を急速に誘導しトランスフェクトされた肝細胞を除去できたことがある。Ｔ細胞の浸入が、肝臓トランスフェクションの７２時間後まで観察されない（Ａｈｌｅｎ ｅｔ ａｌ．、上記）ことが報告されていることから、ＨＣＶをトランスフェクトされた肝細胞の急速なクリアランスは、トランスフェクション前に肝臓内に存在する肝局在のＨＣＶ特異的Ｔ細胞の集団に依存しているように思われる。さらに、ｐＣｏｎＮＳ５Ｂで免疫した動物において見られるように、ＩＦＮ−γ産生により測定されるワクチン特異的反応のパーセンテージがかなり低くても、肝臓内のトランスフェクトされた肝細胞を大きく２倍減少させるのに十分であった。このことは末梢で検出されるワクチンに特異的のわずかなパーセンテージが、肝臓内で非常に大きな効果を発揮する能力を有することを示唆している。

肝臓誘導型Ｔ細胞寛容は、全身性免疫を介して妨害することができ、有効な肝特異的免疫は、静止状態下で、抗原特異的なＴ細胞の取り込みおよび封鎖のいずれも行える肝臓の能力を利用することにより達成できる。この肝臓独特の特性は、感染症の第１の兆候に急速に反応しかつ動員される能力を有する未処置の個体の肝臓内部にＨＣＶ特異的Ｔ細胞のプールを作製するためだけでなく、ウイルスにすでに感染している患者におけるＨＣＶ特異的反応を促進するために利用されてもよい。まとめると、これらの結果は、肝臓内のエフェクター機能を保存すると共に、肝臓に抗原特異的Ｔ細胞を取り込むことが、免疫監視工程において、重要であり、かつ以前に認められていなかった役割を果たしており、このことが将来のＴ細胞に基づくＨＣＶワクチンに利用できることを示唆している。

Claims (12)

1. 配列番号２のタンパク質をコードするコード配列を含む核酸分子。
2. 前記核酸分子が、配列番号９の配列を有するＩｇＥリーダーのコード配列が存在しない、請求項１に記載の核酸分子。
3. ａ）配列番号１の配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
4. 前記核酸分子が、ＩｇＥリーダーのコード配列が存在せず、前記存在しないコードが、配列番号７または配列番号８である、請求項３に記載の核酸分子。
5. 前記核酸分子がプラスミドである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子。
6. 前記核酸分子が、発現ベクターであり、かつ前記１つ以上のタンパク質をコードする配列が、調節エレメントに作動可能に連結する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸分子。
7. ＨＣＶと診断された対象の治療のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、医薬組成物。
8. 配列番号２のタンパク質。
9. 前記タンパク質中に、配列番号９の配列を有するＩｇＥリーダーが存在しない、請求項８に記載のタンパク質。
10. ＨＣＶと診断された対象の治療のための、請求項８または９に記載のタンパク質を含む、医薬組成物。
11. 請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸分子および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。
12. 請求項８または９に記載のタンパク質および薬学的に許容可能な賦形剤を含む、薬学的組成物。

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