KR100318250B1

KR100318250B1 - C형간염바이러스에대한dna면역백신

Info

Publication number: KR100318250B1
Application number: KR1019980027236A
Authority: KR
Inventors: 조재호; 이승우; 성영철
Original assignee: 허일섭; 주식회사 녹십자; 정명식; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 1998-07-07
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2002-03-08
Also published as: KR20000007752A

Abstract

본 발명은 DNA 면역방법을 이용하여 C형 간염바이러스의 외피당단백질인 외피1(E1) 과 외피2(E2) 그리고 비구조 단백질인 NS3, NS4 와 NS5에 대한 최적의 면역반응을 유도하기 위한 것으로, 과립구 및 거대 식세포-응집 촉진 인자 유전자(GM-CSF)를 HCV의 E1, E2 및 NS 유전자와 함께, 동일한 벡터(Vector)에서 발현될수 있도록 인터널 라이보좀 엔트리 서열(Internal ribosome entry sequence: IRES)를 이용한 전달 벡터를 고안하여 HCV DNA 면역방법에 이용함으로서, HCV의 E1, E2 및 NS 단백질에 대한 최적의 면역반응을 유도해낼 수 있다.

Description

Ｃ형 간염 바이러스에 대한 ＤＮＡ 면역 백신{ＤＮＡ vaccines for Hepatitis Ｃ Virus}

본 발명은 일반적으로는 C형 간염 바이러스(HCV)에 대한 DNA 면역 백신에 관한 것이고, 보다 상세하게는 DNA 면역방법(DNA Vaccination Technology)을 이용하여 HCV (Hepatitis C Virus)의 외피당단백질 (Envelope) E1, E2 및 비구조 단백질(Nonstructural protein;NS) 단백질에 대한 최적의 면역성을 얻기 위한 것이다.

HCV는 감염시 50% 이상이 만성질환으로 진행되어 궁극적으로 간경변이나 간암등의 질병을 일으키는 주요한 원인이 되고 있다(Alter, H. J. et al., N. Engl. J. Med., 321, 1494-1500(1989)). 현재 알파 인터페론이 이들에 대한 유일한 치료방법으로 일반화되어 사용되고는 있지만, 만족할만한 치료효과는 겨우 10∼30% 정도에 이를 뿐이어서(Weiland, E. et al., J. Virol., 66, 6(1992)) HCV에 대한 효과적인 백신 개발이 시급한 실정이다.

HCV의 외피당단백질인 E1과 E2 단백질은 바이러스 감염초기단계에서 표적세포와의 부착이나 침입경로에 관련되어있을 것으로 보고되었으며, 특히 침팬지 실험결과 이들 단백질에 대한 항체 면역 형성이 HCV의 보호 면역(protective immunity) 유도에 관련되어있다고 보고됨으로서(Choo, Q. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1294-1298(1994)), 이들 단백질의 중요성이 더욱 부각되기에 이르렀다. 또한 HCV NS3 단백질에 대한 T helper(Th) 세포반응이 급성 HCV 감염시 바이러스 제거에 중요한 작용을 할것이라는 보고가 있었으며(Diepolder, H. M. et al. Lancet, 346, 1006-1007(1995)), NS4와 NS5에 대해서도 유사한 보고가 있었다(Ferrari, C. et al. Hepatology, 19, 286-295(1994)). 이는 HCV NS 단백질에 대한 세포성 면역반응의 중요성과 더불어 HCV 백신개발 측면에서의 이용가능성을 시사한다.

DNA 면역방법은 병원체의 특정 성분을 코딩하는 DNA를 직접 인체에 주입하여 면역화를 달성한다는 점에서, 약독화시키거나 죽인 병원체 또는 병원체의 일부 성분을 이용하는 종래의 면역방법과 구분되며, 면역화 단백질(immunizing protein)의 실제적인 생산은 DNA를 주입받은 숙주내에서 이루어지기 때문에 생균 또는 사균을 이용하는 경우에 발생할 수 있는 감염의 위험을 제거할 수 있는 장점이 있다.

이런 DNA 면역방법에 의해 인플루엔자 바이러스, B형 간염바이러스, 제 1 형인간 면역결핍 바이러스 등과 같은 여러종류의 전염성 바이러스들에 대한 강력한 면역성을 유도할수 있는 것으로 보고되어지고 있다(Ulmer, J. B. et al., Science, 259, 1745-1749(1993), Michel, M. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 5307-5311(1995), Irwin, M. J. et al., J. Virol., 68, 5306-5044(1994)). 또한 HCV의 캡시드 단백질(core)과 E2 단백질 등에도 이러한 DNA 면역방법이 적용되어 그결과 이들에 대한 특이적인 면역성을 유도하였다는 보고가 있었다(Major, M. E. et al., J. Virol., 69, 5798-5805(1995), Tedeschi, V. et al., Hepatology, 25, 459-462(1997)). DNA 면역방법은 근육(intramuscular)이나 진피(intradermal)등의 경로를 통해 바이러스 항원을 암호화하는 유전자를 갖는 DNA 백신 벡터를 생체내에 직접 주입하고, 이러한 DNA는 형질전환된 세포내에서 발현되어 주요 조직접합성 항원 I과 II(Major histocompatibility complex I and II: MHC I and MHC II)에 부착됨으로서 적절한 항체성 및 세포성 면역반응을 일으킨다.

하지만 이러한 DNA 면역방법은 면역화 단백질이 생체내에서 발현되는 빈도가 낮기 때문에, 면역성이 낮은 항원에 대해서는 강한 면역반응을 일으키지 못하는 한계성을 지닌다. DNA 면역방법의 효과성을 높이기 위한 연구가 계속 진행되어 몇몇 싸이토카인(cytokine)유전자나 면역세포 활성화에 필요한 협력촉진물질(costimulatory molecule) 유전자와 같은 보조인자(adjuvant)를 사용하여 보다나은 면역성을 유도한 보고들이 있다(Geissler, M. et al., J. Immunol., 159, 5107-5113(1997), Iwasaki, A. et al., J. Immunol., 158, 4591-4601(1997)). 특히, GM-CSF(Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor) 유전자를 보조인자로서 사용하여 특정 바이러스 항원을 암호화 하는 유전자와 함께 주입하였을 때 항원 특이적인 항체성 및 세포성 면역반응을 모두 증가시킬수 있으며, 치명적인 동일 바이러스 주입에 의한 치사작용으로부터 보다 현저하게 보호되었다는 보고가 있었다 (Sin, J. I. et al., Vaccine, 15, 1827-1833(1997)).

DNA 면역방법에 이러한 싸이토카인 보조인자를 이용하여 면역성의 증가효과를 얻은 많은 보고에도 불구하고, 아직까지 그 기작에 대한 명확한 이해는 부족한 실정이다. 하지만 최근의 몇몇 연구보고로부터 DNA 면역방법에 의해 유도되는 면역성은 아마도 림프절(lymph node)이나 비장(spleen)등의 면역기관들 내로 유입된 DNA가 직접 혹은 간접적으로 이들 기관내의 세포, 특히 골수(bone marrow)에서 유래된 항원제출세포(antigen presenting cell: APC)들에 도입되어 이들에 의해 항원특이적인 면역성이 유도될것으로 생각되어지고 있다(Torres, C. A. et al., J. Immunol., 158, 4529-4532(1997)). 따라서 이러한 항원특이적인 국소적 면역유도 부위에 GM-CSF의 생물학적 작용이 집중될수 있도록 해준다면 그의 효과성은 다른 어떤 형태의 보조인자 전달방법보다 더 나은 결과를 가져올수 있다.

항원자체의 성질역시 DNA 면역방법에 의한 면역유도결과에 중요한 영향을 미치는데, 몇몇 예외적인 보고도 있지만, 일반적으로 세포에 연관되어 존재하는 세포내 단백질이나 막성 단백질보다 세포로부터 분비될수 있는 분비단백질이 보다 나은 면역성을 유발할수 있다고 생각되어진다. 이와 관련해서 최근 HCV E2 단백질과 동격인 플라비 바이러스(flavivirus)의 NS1 단백질을 이용한 DNA 면역방법에 있어서 이들의 분비를 저해하는 DNA 백신 벡터를 이 방법에 적용하였을 때, NS1 단백질이분비되는 경우에 비해 면역성이 감소하였다는 보고가 있다(Lin, Y. L. et al., J. Virol., 72, 191-200(1998)).

본 발명의 목적은 HCV에 대해 최적의 면역성을 유도해낼 수 있는 DNA 백신을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적에 따라서, 본 발명은 DNA 면역방법에 적용되었을때, HCV의 항원에 대한 최적화된 항체성(humoral immunity) 및 세포성 면역반응(cellular immunity)을 유도할 수 있는, 하나 또는 둘 이상의 HCV 항원을 코딩하는 유전자 및 엔세팔로미오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis virus: EMCV)의 인터널 라이보좀 엔트리 서열(Internal ribosome entry sequence: IRES)을 포함하는 것을 특징으로 하는 HCV의 DNA 플라스미드를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 하나 또는 둘 이상의 HCV 항원을 코딩하는 유전자, IRES 유전자 및 GMCSF 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 HCV의 DNA 플라스미드를 제공한다. 본 발명에 따른 HCV 항원은 E1, E2 혹은 NS(NS3, NS4, NS5)이다.

본 발명에 따르면, HCV 항원인 E1 및 E2는 면역성을 증가시키기 위하여 분비 단백질의 형태로 변형되었으며, 이는 E1 및 E2의 카르복실 말단 부위를 제거하여 각각 E1t 및 E2t로 제작하였다. 즉, 본 발명의 DNA 백신은 HCV 항원으로서 E1t 및/또는 E2t을 코딩하는 유전자를 포함한다. 또한 본 발명에 따르면, E1t 및 E2t 단백질의 발현 및 세포외 분비를 더욱 효율적으로 만들기 위하여, 그의 아미노실 말단 부위에 허피스 바이러스(HSV)의 외피당단백질 D(gD)의 신호서열(signal sequence:s)을 연결시켜 각각 sE1t 및 sE2t로 제작하였다. 즉, 본 발명의 DNA 백신은 HCV 항원으로서 sE1t 및/또는 sE2t을 코딩하는 유전자를 포함한다.

본 발명은 또한 상기한 DNA 플라스미드를 HCV에 대한 DNA 백신으로 이용하는 것을 제공한다.

도 1은 HCV(Hapatitis C Virus)의 외피당단백질(Envelope protein) 및 비구조 단백질(Nonstructural protein)과 함께 GM-CSF를 포함하는, DNA 면역방법에 이용된 본 발명의 다양한 발현벡터들의 구조를 개괄적으로 도시한 것이다.

도 2A 및 도 2B는 본 발명의 다양한 DNA 백신 벡터로부터 HCV 유전자의 발현을 COS-7 세포에서 방사면역침전법(radioimmunoprecipitation: RIP)을 이용하여 분석한 결과이다.

도 3A 및 도 3B는 본 발명의 다양한 DNA 백신 벡터에 의해 면역화된 레트의 E1 및 E2 특이적인 항체형성 여부를 시간별로 분석하여 나타낸 결과이다.

도 4A 내지 도 4C는 본 발명의 다양한 DNA 백신 벡터에 의해 면역화된 레트의 NS3, NS4 및 NS5 특이적인 항체형성 여부를 시간별로 분석하여 나타낸 결과이다.

도 5A 내지 도 5C는 본 발명의 다양한 DNA 백신 벡터에 의해 면역화된 레트의 혈청과 다양한 HCV 스트레인(strain)으로부터 유래된 HVR1 펩티드와의 반응성과 그의 아미노산 서열들을 비교하여 나타낸 결과이다.

도 6은 면역화된 레트의 혈청내의 E1및 E2 특이적인 항체G(immunoglobulin G: IgG)의 아계열(subclass)인 항체G1 (IgG1) 및 항체G2a (IgG2a)의 상대적 빈도를 나타낸 결과이다.

도 7A 및 도 7B는 면역화된 레트의 비장기관을 마지막 DNA 주입후 5 주와 17 주째에 취하여 NS3, NS4, NS5에 대한 T 세포 증식 반응을 조사한 것이다.

도 8A 및 도 8B는 각각 HCV E1과 E2를 포함하는 N 타입 및 몇가지 다른 타입 1b의 서브타입들의 E1 및 E2 핵산염기 서열(도 8A)과 아미노산 서열(도 8B)을 상호비교한 결과이다.

본 발명자들은 DNA 면역방법을 통한 HCV E1과 E2 단백질 및 NS 단백질에 대한 최적의 면역성을 유도해내기위한 노력의 일환으로, E1과 E2 유전자를 변형하여 분비단백질 형태로 발현될수 있도록 하였으며 NS 단백질은 HCV 게놈의 NS3, NS4A, NS4B, NS5A 및 NS5B 유전자를 모두 포함시켜 이들이 각각 발현될수 있도록 제작하였다. 또한 상기 항원들에 대한 면역성을 더욱 증가시킬수 있도록 보조인자로서 GMCSF 유전자를 이용함에 있어서, 보다 최적화된 효과를 얻기위해 HCV 항원과 함께 전달방식을 달리하는 몇가지 DNA 면역 벡터를 제작하여 버팔로 레트에 주입하여 그들의 효과를 비교검토 하였다. 그결과 항원특이적인 항체성 및 세포성면역반응의 현저한 증가를 가져오는 DNA 백신 벡터를 개발하기에 이르렀다. 본 명세서 및 특허청구범위 전반에 걸쳐서 사용된 DNA 백신 벡터와 DNA 플라스미드는 동일한 의미를 갖는다.

상기 HCV 유전자들에 과립구 및 거대 식세포-응집 촉진 인자(GMCSF)유전자를 포함하는 가장 효과적인 DNA 면역 벡터를 개발하여 이를 DNA 면역방법에 적용함으로서, HCV의 E1, E2 및 NS 단백질에 대한 최적의 항체성 면역반응과 세포성 면역반응을 유도해내고자 하는 것이다.

현재까지 총 12종의 제노타입(genotype)의 HCV가 보고되어 있는데, 그중 본 발명에서 이용된 HCV E1 서열과 E2 서열은 HCV에 간염된 한국인 환자로부터 분리한 몇가지 strain중에서 HCV 타입 1b의 N 타입으로 명명된 것으로서 이들의 서열을 각각 서열번호 10과 11로 나타내었다. 서열번호 10에서 E1t는 핵산염기서열 번호 1-519 까지이며, 서열번호 11에서 E2t는 핵산염기서열 번호 1-1023까지이다. 또 본 발명에서 이용된 HCV의 NS345의 서열은 type 1b의 또다른 서브타입의 것으로서, 그의 서열을 서열번호 12로 나타내었다.

HCV E1과 E2를 포함하는 N 타입 및 몇가지 다른 타입 1b의 서브타입들의 E1 및 E2 핵산염기 서열(도 8A)과 아미노산 서열(도 8B)을 상호비교하였으며, 상동성 분석의 결과를 아래 표 1에 정리하였다.

핵산염기/아미노산의 동일성(%)	E1/E2-E	E1/E2-F	E1/E2-H	E1/E2-N	HCV -K	HCV-H	HCV-BK	HC-J6	HC-J8
E1/E2-C	93.6/92.5	94.1/93.2	83.7/80.5	94.5/92.7	87/83.9	73.7/75	85.9/86.2	66.5/60.6	63.9/60.5
E1/E2-E		96.5/95.2	83.7/81.2	96/95.2	85.4/83.5	72.6/75.3	86.4/86.9	67.1/62.4	63.8/62.4
E1/E2-F			73/80.7	96.7/95.3	86/83.5	73/80.9	86.4/86.8	66.7/61.2	63.6/60.6
E1/E2-H				85.2/81.9	73/81.8	72.4/71.7	82.9/81.9	65.2/58.9	63.2/59
E1/E2-N					85.2/83.5	73.3/75.7	86.5/87.3	66.8/62.3	61.5/61.5
HCV-K						73.2/74.4	86.6/85	66.8/61	63.6/60.5
HCV-H							72.7/76.7	66.6/64.3	64.6/63.1
HCV-BK								68.3/64	63.4/62.4
HC-J6									71.4/74.1

본 발명에서는 E1과 E2 단백질을 분비 단백질로 만들기 위하여 그의 카르복실 말단을 제거하는 변형을 가하여 각각 E1t 및 E2t를 제작했다.

본 발명에서 있어서, DNA 백신 벡터의 제작에 이용되는 출발 벡터로서 도 1에 도시한 것과 같은 pTV를 사용하였지만, 본 발명이 여기에만 국한되는 것은 아니다. 즉, DNA 백신 벡터의 제작에 사용되기 위한 출발 벡터 시스템의 요건을 만족시킬 수 있는 다른 것들, 구체적으로 항원 유전자의 발현을 유도할수 있는 프로모터 서열과 항원 유전자의 종결을 유도할 폴리아데닐화 서열, 이 콜리 내에서 벡터의 증폭에 이용될 복제 오리진(replication origin), 벡터의 선별을 위한 항생제 저항성 유전자 등을 포함하고 있는 것이면 제한없이 사용할 수 있다. pTV는 이러한 조건을 모두 만족시키는 많은 DNA 백신 벡터의 한 종류이며, 그밖에 위와 동일한 조건을 만족시키는 다른 출발 벡터로서 pCD 또는 RcCMV 등의 벡터도 이용될 수 있다.

본 발명에서 제작한 DNA 백신 벡터내의 HCV E1 및 E2 변형 유전자는 기존의 DNA 면역방법에서 보고된바 있는 E1 및 E2 유전자와는 다른 다음과 같은 특징을 갖는다. 첫째, E1 및 E2 단백질의 소수성 아미노 잔기(hydrophobic amino acids)를 포함하는 카르복실 말단(carboxyl-terminal: C-terminal) 부위를 제거하여 E1t 및 E2t 단백질을 제작함으로서 발현된 단백질의 분비를 용이하게 하였으며, 둘째, E1 및 E2 단백질의 아미노실 말단(aminocyl-terminal: N-terminal) 부위에 허피스 바이러스(Herpesvirus: HSV) 외피당단백질 D(glycoprotein D: gD) 의 신호서열(signal sequence: s)을 연결시켜 sE1t 및 sE2t 단백질을 만들어 발현 및 세포외 분비를 효율화 하였다. 본 발명에서 사용된 gD 서열을 서열번호 14로 나타내었다. 본래의 E1과 E2에서 제거된 카르복실 말단은 각각 아미노산 서열 365-383 및 720-733이다.

또한 본 발명의 DNA 백신 벡터의 GM-CSF 보조 유전자 전달방법은 엔세팔로미오카디티스 바이러스(encephalomyocarditis virus)의 인터널 라이보좀 엔트리 서열(internal ribosome entry sequence; IRES)(서열번호 14) 아래쪽에 GM-CSF 보조 유전자를 두어 E1 혹은 E2 유전자와 함께 한 벡터 내에서 동일하게 발현될수 있도록 하였다. 즉, 프로모터에 가까운 쪽으로부터 sE1t, sE2t 혹은 NS 서열; IRES 서열; 그리고 GM-CSF 서열의 순서로 연결된다.

이러한 특징들은 본 발명의 DNA 백신 벡터가 DNA 면역 방법을 통한 E1 및 E2에 대한 최적의 면역성 획득에 유리하게 사용될수 있음을 시사하는 것이다. HCV NS 유전자는 NS3 유전자의 5' 말단부위에 번역 개시코돈(translation start codon)을 삽입하고 NS5B 유전자의 3' 말단부위에 번역 종결코돈(translation termination codon)을 삽입시켜 HCV 게놈의 NS3, NS4, NS5 유전자가 한 벡터내에서 모두 발현될수 있도록 제작되었으며, 보조인자 GMCSF 유전자 전달방식에 있어서, 위와 동일한 방식이 적용되었다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

먼저, GM-CSF 보조유전자의 각기다른 전달방법의 효과를 비교분석하고, 이들중에서 가장 최적화된 전달방법을 찾기위해 다양한 벡터를 각각 제작한다. 이를 적절한 세포주에 일시적 형질전환(transient transfection)을 실시함으로서, 해당 산물들의 발현을 확인한다.

발현확인후, 이러한 DNA 백신 벡터를 레트의 뒷다리 근육조직에 주입하고, 일정시간 경과후 면역화된 레트로부터 피를 뽑아 혈청을 분리하고 또 비장을 분리하여 이를 모니터링한 결과, 모든 벡터가 특이적인 항체형성 및 T 헬퍼(Th) 세포를 유도할수 있었지만, 그 중에서도, IRES에 의해 GM-CSF 유전자가 발현될수 있도록 제작한 백신 벡터가 보다 우수한 항체 면역반응과 세포 면역반응을 형성할수 있음을 관찰하였다.

또한 HCV 중화를 유도하여 숙주를 바이러스 감염으로부터 보호할수 있는 가능성을 갖는다고 보고된(Zibert, A. et al., J. Virol., 71, 4123-4127(1997)) HVR1에 대한 항체형성 여부능력을 서로다른 HCV 스트레인 으로부터 유래된 HVR1 펩티드를 이용하여 확인한 결과, 상기 전달방식의 백신 벡터가 보다 강한 항체반응을 형성할수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 DNA 백신 벡터를 이용하여 HCV 면역화를 하는 것은, 기존의 DNA 면역방법에 따라 행할 수 있다. 즉, 예를 들어 염 용액에 DNA 벡신 벡터를 용해시켜 피하주사하거나 또는 DNA 백신 벡터를 코팅시킨 금 비드(gold bead)를 유전자 총(gene gun)을 이용하여 체내에 투여할 수 있다. 투여량은 투여경로와 피투여자의 상태에 따라 다르며, 투여량 및 투여경로는 당업자에 의해 어려움 없이 결정될 수 있는데, 예를 들어 유전자 총을 이용한 피하주입의 경우 0.1-1.0㎍을 투여할 수 있다.

이상과 같은 높은 효과성을 갖는 본 발명의 DNA 백신 벡터는 변형된 HCV E1 및 E2 유전자와 HCV NS 유전자를 사용하고, 이들과 함께 GM-CSF 유전자의 독특한전달 방법을 취함으로서 DNA 면역방법에 있어서 보다 최적화된 단백질 특이적인 면역성을 유도할수 있으며, 이러한 특성은 앞으로의 HCV에 대한 DNA 면역방법을 통한 백신 개발에 있어서 큰 효과성을 부여할수 있을 것으로 사료된다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 좀 더 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실시예 1 : HCV E1, E2 혹은 NS 유전자와 GM-CSF 유전자를 포함하는 다양한 DNA 백신 벡터의 제조

(1) 벡터 pTV-sE1t 및 pTV-sE2t의 제작

HCV 전형 1b(type 1b)로부터 유래된 E1 과 E2 유전자의 아미노산 서열(amino acids sequence), 192-364 및 384-719 부위를 암호화하는 게놈(genome) 조각(fragment)을 서열목록의 서열번호 1∼4의 프라이머(primer) E1S, E1AS, E2S 및 E2AS를 이용하여 PCR(polymerase chain reaction) 증폭시킨후, 제한효소(restriction enzyme) BglII/EcoRI으로 절단하여, 이를 gDs를 포함하는 플라스미드(plasmid) 벡터 pSK-s(STRATAGENE)의 아래쪽에 삽입하여 pSK-sE1t와 pSK-sE2t를 제작하였다. 이는 다시 제한효소 XbaI/XhoI을 이용하여 절단한 뒤, 진핵세포 발현벡터(eukaryotic cell expression vector)인 pTV (도1에 도시한 구조를 가짐)에 삽입하여 플라스미드 pTV-sE1t 와 pTV-sE2t를 얻었다.

(2) 벡터 pTV-GMCSF/E1t 및 pTV-GMCSF/E2t의 제작

설치류(murine) GM-CSF 유전자를 포함하는 기존의 플라스미드 pSK-GMCSF를 제한효소 NotI/XhoI으로 절단한 뒤, pTV 벡터에 삽입하여 플라스미드 pTV-GMCSF를 제작하였다. 또한 플라스미드 pSK-GMCSF를 주형으로 하고 프라이머 T7(Promega사) 및 제한효소 NdeI의 인지부위(CATATG)를 갖는 서열번호 5의 프라이머 GC598A를 이용하여 PCR 증폭시킨 후, 이를 pSK-hGH/E1t 및 pSK-hGH/E2t내의 hGH(human growth hormone) 유전자와 교환하여 pSK-GMCSF/E1t 및 pSK-GMCSF/E2t를 제작하였다. 이를 다시 제한효소 EcoRI으로 절단하여 pTV 벡터에 삽입하여 최종적으로 카이메릭(chimeric) 플라스미드 pTV-GMCSF/E1t 및 pTV-GMCSF/E2t를 제작하였다.

(3) 벡터 pTV-sE1t/IRES/GMCSF 와 pTV-sE2t/IRES/GMCSF의 제작

한편, 플라스미드 pSK-GMCSF를 주형으로 하고 프라이머 T7 및 제한효소 NcoI의 인지부위(recognition sequence) 5'-CCATGG-3'를 갖는 서열번호 6의 프라이머 GCN을 이용하여 PCR 증폭시킨 후 이를 제한효소 NcoI/BamHI으로 절단한 뒤, 이 단편을 IRES를 포함하는 벡터인 pSK-IRES 아래쪽에 삽입하여 플라스미드 pSK-IRES/GMCSF를 제작하였다.

이어서, 상기 플라스미드 pSK-IRES/GMCSF에 제한효소 HindII/EcoRI을 처리하고, 여기에 플라스미드 pSK-sE1t 와 pSK-sE2t의 sE1t 및 sE2t 단편을 각각 삽입하여 플라스미드 pSK-sE1t/IRES/GMCSF 와 pSK-sE2t/IRES/GMCSF를 제작하였다. 다음으로 이 플라스미드는 제한효소 XbaI/EcoRI 혹은 Asp718/XbaI을 이용하여 절단한후, pTV 벡터에 삽입하여 바이시스트로닉(bicistronic) 플라스미드인 pTV-sE1t/IRES/GMCSF 와 pTV-sE2t/IRES/GMCSF를 얻었다. 이들 두 플라스미드는 각각이. 콜리XL1-Blue에 삽입하여 XL1b-E1 및 XL1b-E2로 명명한 후 1998년 6월 10일자로 대전 유성구에 소재하는 한국생명공학센터내 한국유전자 은행에 기탁하여 KCTC 0493BP 및 KCTC 0494의 수탁번호를 부여받았다.

(4) 벡터 pTV-NS345 및 pTV-GMCSF-NS345의 제작

HCV type 1b 게놈의 NS 유전자 [뉴클레오티드 서열 3395 - 9391] 를 서열번호 7과 8의 프라이머 N3S 및 N5A를 이용하여 PCR 증폭한후 pTV의 XhoI/XbaI 제한효소 절단부위에 삽입하여 pTV-NS345를 제작하였다.

HCV NS3, NS4 및 NS5를 포함하는 NS 유전자를 서열번호 8의 N5A 프라이머와 서열번호 9의 S3Nd 프라이머를 이용하여 PCR 증폭후 pTV-GMCSF의 GMCSF 유전자의 카르복실 말단부위에 퓨전(fusion)시켜 pTV-GMCSF-NS345를 제작하였다.

플라스미드 pTV-NS345의 NS345를 포함하는 XbaI/XhoI DNA 단편을 pSK-IRES/GMCSF로부터 유래된 pTV-IRES/GMCSF의 IRES 부위 앞쪽에 삽입하여 pTV-NS345/GMCSF를 제작하였다. 이 플라스미드는이. 콜리XL1-Blue에 삽입하여 XL1b-NS로 명명한 후 1998년 6월 10일자로 대전 유성구에 소재하는 한국생명공학센터내 한국유전자 은행에 기탁하여 KCTC 0492의 수탁번호를 부여받았다.

도 1은 진핵세포 발현벡터인 pTV 및 상기의 다양한 DNA 백신 벡터의 개략적인 구조를 도식화한 것으로, 시미안 바이러스 40의 복제시작점(simian virus 40 replication origin: SV40 ori), 싸이토메갈로바이러스 프로모터(cytomegalovirus promoter: CMV), 아데노바이러스(adenovirus)의 삼중리더서열(tripartite leader sequence: TPL), 다중 클로닝 서열(multiple cloning sequence: MCS), SV40 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence: polyA) 및 엠피실린 저항성 유전자(ampicilin resistance gene: AmpR)등이 도시되어 있고, E1t 및 E2t 유전자와 gDs 유전자 그리고 NS3, NS4 와 NS5 유전자가 코딩하는 아미노산 서열이 표시되어 있다.

실시예 2 : 세포 배양 및 DNA 백신 벡터의 형질감염

COS-7 세포를 10% 태아 송아지 혈청(fetal bovine serum: FBS)을 보강한 DMEM 배지에서 배양한 후, 칼슘포스페이트 침전법(Lee, K. J. et al., J. Biol. Chem., 272, 30040-30046(1997))을 이용하여 상기 실시예 1에서 얻은 각종의 발현벡터 15μg씩을 3 × 10⁵의 COS-7 세포에 형질전환 하였다.

실시예 3 : DNA 주입 및 면역화된 레트로부터 단백질 특이적인 항체 및 세포 면역반응 형성여부의 확인

생후 4∼6주된 암컷 버팔로 레트의 오른쪽 및 왼쪽 다리근육에 부피바케인(bupivacane)을 전처리한후 0.85% 염용액(saline solution)에 녹아있는 총 400㎍의 DNA를 1㎖ 주사기를 이용하여 부피바케인 처리시와 동일한 위치에 주입한 후, 같은 양의 DNA를 8주 간격으로 2회 더 주입한다. 각 DNA 주입후 3주에서 4주 간격으로 레트의 꼬리로부터 피를 뽑아 혈청을 분리한 후, NS3, NS4, NS5 및 E1, E2, HVR1 특이적인 항체형성 여부를 정제된 GST-NS3, MBP-NS4, GST-NS5 및 hGHElt, hGHE2t 단백질과 HVR1 펩티드 등을 이용하여 엘라이자(ELISA) 방법을 통해 항체 형성여부를 조사한다. 또한 마지막 DNA 주입후 3주째에 면역화된 레트로부터비장기관을 취하여 E1 과 E2 특이적인 세포성 면역반응 형성여부를 T 세포 증식분석을 통해 조사하고, NS에 대해서는 5주와 17주째에 각각 조사한다.

실시예 4 : DNA 백신 벡터로부터의 단백질의 발현

각각의 DNA 백신 벡터로부터 발현되는 단백질의 발현여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 실시예 1에서 얻은 다양한 DNA 백신 벡터를 COS-7 세포에 형질전환시켰다.

E1 및 E2 단백질에 대한 단일 클론성 항체(monoclonal antibody) 혹은 HCV 양성 환자의 혈청(HCV positive patient sera)을 이용한 방사면역침전분석법(Ralston, R. et al., J. Virol., 67, 6753-6761(1993))에 의해 세포 추출액중의 E1, E2 혹은 NS 단백질들을 동정(identification)하였다.

요약하면, DNA 형질감염후 [35S]메티오닌으로 래이블(label)하고 분해 버퍼(lysis buffer)를 이용하여 래이블된 세포를 분해시킨다. 15000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 세포 추출액(cell lysate)만을 취한다. 세포 추출물을 E1 및 E2 단백질에 대한 단일 클론성 항체 혹은 HCV 양성 환자의 혈청과 반응시킨 후, 형성된 면역 복합물질(immune complex)을Staphylococcus aureusCowan I(Calbiochem사)을 이용하여 침전 및 수집한다. 용해된 면역침전물(immunoprecipitate)은 10% 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis) 분석을 통해 단백질을 분리한 후, 건조시켜 엑스레이 필름에 노출시킨다.

또한 GMCSF 유전자를 갖는 DNA 백신 벡터의 경우에 있어서 COS-7 세포의 배양액으로 분비된 GM-CSF의 발현여부를 확인하기위해 형질감염후 48시간후 세포배양액을 분리하고, 이를 엘라이자 키트(R&D system사)를 이용하여 제작자의 지침서에 따라 수행하였다.

도 2는 본 발명의 다양한 DNA 백신 벡터로부터 만들어지는 E1, E2 혹은 NS 단백질의 발현을 COS-7 세포에서 방사면역침전법을 이용하여 분석한 결과이다. 여기에서, (a)는 E1 과 E2 단백질을 (b)는 NS 단백질의 발현을 나타내고, (a)의 제1열과 제5열은 플라스미드 pTV-GMCSF/E1t 와 pTV-GMCSF/E2t를 이용하여 형질전환 시킨 COS-7 세포 추출물로서, 분자량이 59-65 및 73-79 KD인 밴드가 나타났는데, 이는 GMCSF/E1t 와 GMCSF/E2t 단백질을 각각 나타내는 것이다. 제2열, 제3열, 제6열, 제7열은 플라스미드 pTV-sE1t/IRES/GMCSF, pTV-sE1t, pTV-sE2t/IRES/GMCSF, pTV-sE2t를 이용한 경우이며, 분자량이 34-36 및 49-51 KD인 밴드가 나타났는데, 이는 sE1t 와 sE2t 단백질을 각각 나타내는 것이다. 제4열과 제5열은 목(mock) 플라스미드인 pTV를 이용한 경우로서 어떠한 특이적인 밴드도 관찰되지 않았다. (b)의 제1열과 제2열은 pTV-NS345 와 pTV-NS345/GMCSF를 이용한 경우로서, 분자량이 70, 68, 58, 37, 27 KD인 밴드가 나타났는데, 이는 NS3, NS5B, NS5A, NS4A/NS4B, NS4B 단백질을 각각 나타내는 것이다. 제3열은 pTV-GMCSF-NS345를 이용한 경우로서, GMCSF-NS345 단백질의 비특이적인 분해산물들이 관찰되었다.

실시예 5 : E1, E2, NS 단백질에 대한 항체의 형성

DNA로 면역화된 레트로부터 E1, E2, NS 단백질에 대한 항체형성 여부를 확인하고 형성된 항체의 반 정량적인 분석을 위해, 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 혈청을 분리하고, 엘라이자 분석을 실시하였다(도 3 및 도 4). 또한 HCV 중화에 관련될 가능성이 높은 E2 단백질의 HVR1에 대한 항체형성 여부를 알기위해 HCV type 1b의 서로다른 두가지 스트레인의 HVR1 펩티드와 type 1a의 HVR1 펩티드를 이용하여 엘라이자 분석을 실시하였다(도 5).

위의 E1 및 E2 단백질에 대해 형성된 총 IgG 항체에 대한 아계열인 IgG1 및 IgG2a의 상대적 비율을 관찰하고 이를 통해 관련된 Th 세포의 아전형(subtype)을 가늠하기위해 양에서 정제한 항 레트 IgG1 및 항 레트 IgG2a의 이차 항체(Serotec사)를 사용하여 엘라이자 분석을 통한 아이소타이핑(isotyping)을 실시하였다(도 6).

도 3은 본 발명의 HCV E1 과 E2를 발현하는 DNA 백신 벡터를 주입한 레트의 항 E1 및 항 E2에 대한 항체형성여부를 백분율로서 나타낸 것으로, (a)는 항 E1에 대한 그래프이며, (b)는 항 E2에 대한 그래프이다. 도 3에서, -○-는 pTV (그룹 I), -◆-는 pTV-sE1t + pTV-sE2t (그룹 II), -■-는 pTV-sE1t + pTV-sE2t + pTV-GMCSF (그룹 III), -▲-는 pTV-GMCSF/E1t + pTV-GMCSF/E2t (그룹 IV), 그리고 -●-는 pTV-sE1t/IRES/GMCSF + pTV-sE2t/IRES/GMCSF (그룹 V)를 나타낸다. 조사한 모든 시점에서 바이시스트로닉 벡터로 면역화된 그룹 V의 레트가 가장현저한 항체반응을 형성함을 보여주고 있다.

도 4는 본 발명의 HCV NS345를 발현하는 DNA 백신 벡터를 주입한 레트의 항 NS3, 항 NS4, 항 NS5에 대한 항체형성여부를 백분율로서 나타낸 것으로, (a)는 항 NS3를 나타내며, (b)는 항 NS4, (c)는 항 NS5에 대한 그래프이다. 도 4에서, -●-는 pTV-NS345 (그룹 I), -■-는 pTV-GMCSF-NS345 (그룹 II), -◆-는 pTV-NS345/GMCSF (그룹 III), -▲-는 pTV-NS345 + pTV-GMCSF (그룹 IV)를 나타낸다. DNA 면역에 있어서 가장 현저한 항체반응은 pTV-NS345로 면역화된 그룹 I의 레트에서 나타났다.

또한 형성된 항체의 반 정량적인 분석을 위해 DNA 면역후 19주된 레트의 혈청을 이용하여 각 그룹별로 항체의 역가를 조사하였으며, 이는 표 2와 3에 각각 나타내었다.

HCV 당단백질인 E1과 E2에 대한 항체의 역가

그룹	플라스미드	레트의 수	역가
그룹	플라스미드	레트의 수	항-E1	항-E2
I	pTV	9	NT	NT
II	pTV-sE1t + pTV-sE2t	18	442	5,662
III	pTV-sE1t + pTV-sE2t + pTV-GMCSF	18	532	8,294
IV	pTV-GMCSF/E1t + pTV-GMCSF/E2t	18	686	16,729
V	pTV-sE1t/IRES/GMCSF+ pTV-sE2t/IRES/GMCSF	18	1,615	71,647

HCV NS3, NS4, NS5 단백질에 대한 항체의 역가

그룹	플라스미드	역가
그룹	플라스미드	항-NS3	항-NS4	항-NS5
I	pTV-NS345	1,127	3,101	1,249
II	pTV-GMCSF-NS345	201	1,199	1,094
III	pTV-NS345/GMCSF	803	1,367	220
IV	pTV-NS345 + pTV-GMCSF	326	1,484	1,188

도 5는 본 발명의 HCV E1 과 E2를 발현하는 DNA 백신 벡터를 주입한 레트의 혈청으로부터 HCV E2 단백질의 아미노 말단에 존재하며, HCV 중화에 중요한 역할을 할것이라고 보고되어있는, 동종(homologous) 및 이종(heterologous) HVR1 펩티드에 대한 항체반응을 보여주는 것으로, (a)는 각 그룹들의 동종 HVR1 펩티드에 대한 항체반응을 나타내고, (b)는 서로다른 HCV 스트레인으로부터 유래된 HVR1의 아미노산 서열을 비교한 것이며, (c)는 상기 (b)에 표시된 동종 과 이종 HVR1 펩티드에 대한 그룹 I과 V의 항체반응을 나타낸다. 이에 따르면, pTV-sE1t/IRES/GMCSF 와 pTV-sE2t/IRES/GMCSF를 이용한 DNA 면역방법이 가장 현저한 항체 반응을 형성할수 있으며, 동시에 이러한 항체는 동일한 스트레인의 HVR1 부위에 대해서는 물론이고, 서로다른 HCV 스트레인의 HVR1 부위에 대해서도 반응을 보여줌으로서, 이는 항체 형성에 있어서 그 효과성을 입증하는 것이다.

도 6는 본 발명의 HCV E1 과 E2를 발현하는 DNA 백신 벡터를 주입한 레트의 항 E1 및 항 E2에 대한 항체의 IgG 아이소타이핑 결과로서 각 그룹별로 IgG2a의 현저한 반응이 형성됨을 나타내고, 이는 Th type 1(Th1) 반응의 마커(marker)로서 이러한 세포들은 주로 세포성 면역반응 형성에 기여하는 것으로 보고되어 졌다. 역시 바이시스트로닉 벡터를 이용한 DNA 면역방법이 가장 현저한 IgG2a 반응을 보여줌으로서 HCV 외피 단백질에 대한 항체성 반응을 유도해 내는데 있어 탁월한 우수성을 다시한번 시사하고 있다.

실시예 6 : 항원 특이적인 T 면역세포

상기의 항체성 면역반응 외에도, DNA 면역화된 레트가 E1, E2 및 NS 단백질 특이적인 세포성 면역반응중에서, 항원 특이적인 T 면역세포를 형성하였는지의 여부를 확인하기 위해, 마지막 DNA 주입후 3주 혹은 5주와 17주째에 비장기관을 분리하고, 이들중 3×105 세포를 24 웰 플레이트의 각 웰에 넣고, 정제된 hGHE1t, hGHE2t 단백질을 1μg 혹은 10μg의 농도에서, 그리고 GST-NS3, MBP-NS4, GST-NS5단백질을 0.5μg 및 1μg 의 농도에서 각각 반응시킨 후, [³H]싸이미딘으로 래이블된 정도를 판별하는 T 세포 증식반응 분석(T cell proliferation assay)을 실시하였다.

도 7은 본 발명의 HCV NS DNA 백신 벡터로 면역화된 레트의 T 세포의 증식반응을 마지막 면역후 5주와 17주에 각각 조사한 것이다, 여기에서, ○ : 5주째 조사한 것으로서 NS에 대한 항체반응을 보이지 않은 레트, ● : 5주째 조사하였으며 항체반응을 나타낸 레트, △: 17주째 조사하였으며 항체반응을 보이지 않은 레트, ▲: 17주째 조사하였으며 항체반응을 나타낸 레트를 의미한다. 이는 DNA 면역에 의해 형성된 반응이 오랜기간 유지될수 있으며, 아울러 항체성 면역반응과 관계없이 T 세포반응이 DNA 면역방법에 의해 효과적으로 유도될 수 있음을 의미한다. 이러한 사실은 HCV 감염을 제어하는데 있어서 NS에 대한 T 세포반응이 중요한 인자임을 감안할 때 큰 의미를 가질수 있다.

표 4와 표 5는 HCV E1/E2 DNA 면역화된 레트와 HCV NS DNA 면역화된 레트의 T 세포 증식반응을 나타내는 것으로, 사용된 각각의 항원의 양에 비례하여 T 세포 반응이 증가하는 것을 보여준다. 또한 표 III의 hgh 항원과 표 IV의 GST-core 항원은 음성 대조군(negative control)으로 사용되었으며, E1, E2, NS 항원과는 달리 어떠한 도스 의존성(dose-dependent) T 세포 반응도 관찰되지 않았다. 이는 DNA 면역화된 레트가 보여주는 T 세포 반응이 항원 특이적임을 암시하는 것이다. 아울러 항체성 반응에서 나타났듯이 T 세포성 반응에서도 바이시스트로닉 벡터를 이용한경우가 E1, E2에 대해서는 물론이고 NS3, NS4, NS5에 대해서도 가장 현저한 세포성 면역반응을 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 결과적으로 HCV 항원 유전자와 GMCSF 유전자를 한 벡터내에서 IRES를 통해 발현될수 있도록 제작한 플라스미드 pTV-sE1t/IRES/GMCSF, pTV-sE2t/IRES/GMCSF 와 pTV-NS345/GMCSF가 DNA 면역방법을 통해 HCV 특이적인 최적의 면역반응을 유도해낼수 있는 가장 효과적인 DNA 백신 벡터임을 시사하는 것이다.

HCV 당단백질인 E1과 E2에 대한 T 세포 증식 반응

플라스미드 (그룹)	자극물질(stimulant)에 의한 자극지수(stimulation index)^a
	hgh	hgh-E1t	hgh-E2t
	1㎍/㎖	1㎍/㎖	1㎍/㎖	1㎍/㎖	1㎍/㎖	1㎍/㎖
pTV(I)	0.8±0.06	0.7±0.05	3.1±0.45	3.4±0.49	0.9±0.07	1.2±0.21
pTV-sE1t +pTV-sE2t(II)	0.8±0.13	0.9±0.07	4.8±1.79	9.8±3.89	1.6±3.89	4.4±1.74
pTV-sE1t + pTV-sE2t+ pTV-GMCSF (III)	0.9±0.13	0.9±0.10	7.0±3.23	13.0±5.00	2.5±0.57	6.3±2.09
pTV-GMCSF/E1t + pTV-GMCSF/E2t (IV)	0.8±0.13	0.9±0.11	0.9±0.11	11.9±2.94	2.7±1.39	7.0±3.61
pTV-sE1t/IRES/GMCSF +pTV-sE2t/IRES/GMCSF (V)	0.9±0.14	0.9±0.10	0.9±0.10	14.7±6.12	4.6±1.47	11.2±1.81
a: 자극물질로 반응시킨 경우의 래이블된 싸이미딘의 cpm값/배양액(media)만으로 반응시킨 경우의 래이블된 싸이미딘의 cpm값

HCV NS3, NS4, NS5 단백질에 대한 T 세포 증식 반응

플라스미드 (그룹)	자극물질에 의한 자극지수^b
	GST-core	GST-NS3
	0.5 ㎍/㎖	1.0 ㎍/㎖	0.5 ㎍/㎖	1.0 ㎍/㎖
pTV-NS345 (I)	1.12±0.13	1.03±0.14	6.93±2.60	9.23±2.70
pTV-GMCSF-NS345 (II)	0.99±0.05	1.04±0.16	2.50±0.89	4.10±1.83
pTV-NS345/GMCSF (III)	0.86±0.05	0.97±0.09	13.9±4.23	18.4±5.51
pTV-NS345 + pTV-GMCSF (IV)	0.92±0.10	0.84±0.08	9.82±4.83	12.8±5.40
pTV (V)	0.88±0.02	0.92±0.01	0.87±0.03	0.93±0.02
b:[자극물질로 반응시킨 경우의 래이블된 싸이미딘의 cpm값/배양액(media)만으로 반응시킨 경우의 래이블된 싸이미딘의 cpm값

플라스미드 (그룹)	자극물질에 의한 자극지수^b
	GST-NS4	GST-NS5
	0.5 ㎍/㎖	1.0 ㎍/㎖	0.5 ㎍/㎖	1.0 ㎍/㎖
pTV-NS345 (I)	6.01±2.76	8.25±2.58	6.10±2.34	8.69±2.94
pTV-GMCSF-NS345 (II)	2.30±0.96	3.80±1.77	3.14±1.58	4.56±1.83
pTV-NS345/GMCSF (III)	11.1±2.40	13.0±2.71	10.2±2.49	13.9±2.96
pTV-NS345 + pTV-GMCSF (IV)	6.42±1.60	9.80±2.04	6.21±1.16	11.7±1.56
pTV (V)	2.20±0.05	2.40±0.09	2.03±0.01	2.21±0.02

HCV E1 과 E2 단백질에 대한 항체성 면역반응이 침팬지 실험을 통해 HCV 감염을 막을수 있는 인자가 될 수 있음이 보고되어졌으며, 특히 HVR1 부위에 대한 항체는 HCV 중화(neutralization)를 유도할수 있는 중요한 부위로서 보고되어졌다. 또한 HCV NS 단백질에 대한 세포성 면역반응이 HCV 감염을 막을수 있는 중요한 인자로서 작용할수 있음이 HCV 감염으로부터 회복된 사람들을 통한 연구로부터 보고되어지고 있다. 본 발명의 바이시스트로닉 벡터를 이용한 DNA 면역방법은 E1, E2에 대한 최적의 항체반응은 물론이고, HCV 중화를 유도할 가능성이 있는 여러 type의 HVR1 부위에 대해서도 최적의 항체반응을 보여주고 있으며, 또한 HCV 감염을 막을수 있는 E1, E2 및 NS 단백질에 대한 최적의 세포면역반응을 유도할수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 특징은 본 발명의 바이시스트로닉 벡터가 HCV 백신 개발에 유리하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

[서열표]

서열목록

서열의 수: 14

서열 번호 1:

서열의 길이: 27 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 1]

CCAGCTTCCA GATCTGAAGC GCGTAAC 27

서열 번호 2:

서열의 길이: 27 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 2]

GCCGAATTCT ACACCATGGA ATAGTAG 27

서열 번호 3:

서열의 길이: 24 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 3]

CCATATGCGA GATCTAGGAG GAAC 24

서열 번호 4:

서열의 길이: 29 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 4]

GCGAATTCTA ATACTCCCAC CTGATCGCA 29

서열 번호 5:

서열의 길이: 29 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 5]

CCGCCTCCCA TATGGCATTT TTGGACTGG 29

서열 번호 6:

서열의 길이: 27 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 6]

GGAACCATGG GGATGTGGCT GCAGAAT 27

서열 번호 7:

서열의 길이: 27 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 7]

GGGGTCGAGA TGCCTCGCGG TGGCAGT 27

서열 번호 8:

서열의 길이: 27 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 8]

GGGAATCTAG ATGGAGTGTT TAGCTCC 27

서열 번호 9:

서열의 길이: 27 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원: 합성(Artificial)

[서열 9]

GGGAATTCAT ATGCTCGCGG TGGCAGT 27

서열 번호 10:

서열의 길이: 6195 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명 : C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus)

주명 : type 1b

[서열 10]

CTCGCGGTGG CAGTAGAGCC CGTTGTCTTC TCTGACATGG AGACCAAGGT CATCACCTGG 60

GGGGCAGACA CCGCAGCGTG TGGGGACATT ATCTTGGGTC TACCTGTCTC CGCCCGAAGG 120

GGTAGGGAGA TTCTTCTGGG GCCGGCCGAT AGCCTTGAAG GGCAGGGGTG GCAACTCCCC 180

GCTCCCATCA CGGCCTACTC CCAACAGACG CGGGGCCTAC TTGGTTGCAT CATCACTAGC 240

CTCACAGGCC GGGACAAGAA CCAAGTCGAG GGGGAGGTTC AAGTGGTTGC CACCGCAACA 300

CAATCTTTCC TGGCGACCTG CGTCAATGGC GCTTGGACTG TCTTCCATGG TGCCGGCTCA 360

AAGACCCTAG CCGGCCCAAA GGGGCCAATT ACCCAAATGT ACACCAATGT AGACCTCGAC 420

CTCGTCGGCT GGCAGGCACC CCCCGGGTCG CGTCCCCTGA CACCATGCAC CTGCGGCAGC 480

TCAGACCTTT ACTTGGTCAC GAGACATGCT GATGTCATTC CGGTGCGCCG GCGGGGCGAC 540

AGTAGGGGGA GCCTACCCTG TCCCAGACCA GTCTCCTACT TGAAGGGCTC CTCGGGTGGT 600

CCACTGCTCT GCCCTTCGGG GCACGCTGTT GGCATCTTTC GGGCTGCTGT ATGCACCCGG 660

GGGGTTGCGA AGGCGGTGGA CTTCATACCC GTTGAATCTA TGGAAACTAC TATGCGGTCT 720

CCGGTCTTCA CAGATAACTC AACCCCCCCG GCCGTACCGC AGACATTCCA AGTGGCCCAT 780

CTACACGCCC CCACTGGCAG TGGTAAGAGC ACTAAAGTGC CGGCTGCGTA TGCAGCCCAA 840

GGGTACAAGG TGCTTGTCCT GAACCCGTCC GTTGCCGCCA CCTTGGGTTT TGGGGTGTAT 900

ATGTCTAAAG CACATGGTAT CGACCCCAAC ATCAGAACTG GGGTTAGGGC CATCACCACG 960

GGCGCCCCTA TTACATACTC TACCTATGGC AAGTTTCTTG CCGATGGTGG TTGCTCCGGG 1020

GGCGCCTACG ACATCATAAT ATGTGATGAG TGCCACTCAA CTGACTCAAC TTCCATCTTG 1080

GGCATTGGCA CATGCCTGGA CCAAGCGGAG ACGGCTGGAG CGCGGCTCGT CGTGCTCGCC 1140

ACCGCTACGC CTCCGGGATC GGTCACCGTG CCACACCCCA ATATCGAGGA GGTGGCTCTG 1200

TCCAACACTG GAGAGATCCC CTTCTACGGC AAAGCCATCC CCATTGAGGT CATCAAGGGG 1260

GGAAGACATC TCATTTTCTG CCATTCCAAG AAGAAGTCTG ACGAGCTCGC CGCAAAGCTG 1320

TCAGCCCTCG GACTTAATGC TGTAGCATAT TACCGGGGTC TTGATGTGTC CGTCATACCG 1380

ACCAGCGGAG ACGTCGTTGT CGTGGCGACA GACGCTCTAA TGACGGGCTA TACCGGCGAT 1440

TTTGACTCAG TGATTGACTG TAACACATGT GTCACCCAGA CAGTCGATTT TAGCTTGGAT 1500

CCCACCTTCA CCATTGACAC GACGACCGTG CCCCAAGACG CAGTGTCGCG CTCACAGCGG 1560

CGGGGCAGGA CTGGCAGGGG CAGGAGAGGC ATCTACAGGT TTGTGACTCC AGGAGAACGG 1620

CCTTCGGGCA TGTTCGATTC TTCCGTCCTG TGTGAGTGCT ATGACGCGGG CTGTGCTTGG 1680

TATGAGCTCA CGCCTGCTGA GACTTCAGTT AGGTTGCGGG CTTACCTGAA TACACCAGGG 1740

TTGCCCGTCT GCCAGGACCA TCTGGAGTTT TGGGAGAGCG TCTTCACAGG CCTCACCCAC 1800

ATAGATGCCC ACTTCCTATC CCAGACTAAG CAGGCAGGAG ACAACTTCCC CTATCTGGTA 1860

GCATACCAAG CCACAGTGTG CGCCAGAGCT CAAGCTCCGC CTCCATCATG GGATCAAATG 1920

TGGAAGTGTC TCACGCGGCT CAAACCTACG CTGCACGGGC CAACACCCCT GCTGTATAGG 1980

CTAGGAGCCG TCCAAAATGA GGTCACCCTC ACACACCCCG TGACCAAATT CATCATGGCA 2040

TGCATGTCGG CTGACCTGGA GGTCGTCACT AGCACTTGGG TGCTAGTAGG CGGGGTCCTT 2100

GCAGCTCTGG CCGCGTACTG CTTGACAACA GGCAGCGTGG TCATTGTGGG CAGGATCATC 2160

TTGTCCGGGA GGCCAGCCGT CATTCCCGAC AGGGAAGTCC TCGACCGGGA GTTCGATGAA 2220

ATGGAAGAGT GCGCTTCACA CCTCCCTTAC ATCGAACAGG GGATGCTGCT CGCCGAGCAA 2280

TTCAAGCAGA AGGCGCTCGG GTTGCTGCAA ATGGCCACCA AACAAGCGGA GGCTGCTGCT 2340

CCCGTGGTGG AGACTAAGTG GCAAGCCCTT GAGGTCTTCT GGGCAAAGCA CATGTGGAAC 2400

TTCATCAGCG GGATACAGTA CTTGGCAGGC TTATCCACTC TGCCCGGGAA CCCCGCGATA 2460

GCATCACTGA TGGCATTCAC ATCCTCTATC ACCAGCCCGC TCACCACCCA AAGTACCCTC 2520

CTGTTTAACA TCCTGGGGGG GTGGGTGGCT GCCCAGCTTG CCCCCCCCAG CGCTGCTTCG 2580

GCTTTTGTGG GCGCTGGCAT CGCCGGTGCG GCCGTTGGCA GCATAGGCCT TGGGAAGGTG 2640

CTTGTGGACA TCCTGGCAGG CTATGGAGCA GGGGTGGCCG GCGCACTCGT GGCCTTTAAG 2700

GTCATGAGTG GCGAGGTGCC CTCCACCGAG GATCTGGTTA ATTTACTTCC TGCCATCCTG 2760

TCTCCTGGCG CCCTGGTCGT CGGGGTTGTG TGCGCAGCAA TACTGCGCCG ACACGTGGGT 2820

CCAGGAGAGG GGGCTGTGCA GTGGATGAAC CGGCTGATAG CGTTCGCCTC GCGGGGTAAC 2880

CACGTCTGGG GGACGCACTA TGTGCCTGAG AGCGACGCAG CACAACGTGT TACTCAGATC 2940

CTCTCCAGCC TTACCATGAC TCAGTTGCTA AAGAGGCTTC ACCAGTGGAT TAATGAGGAC 3000

TGCTCCACGC CATGCTCCGG CTCGTGGCTA AGGGATGTCT GGGACTGGAT ATGCACGGTG 3060

CTGACAGACT TCAAGACCTG GCTCCAGTCC AAGCTTCTGC CGCGGTTACC GGGCGTCCCT 3120

TTCTTCTCGT GCCAACGCGG GTACAAGGGA GTCTGGCGGG GGGAAGGCAT CATGCAAACC 3180

ACCTGCCCAT GTGGAGCACA GATCGCCGGA CATGTCAAAA ACGGTTCCAT GAGGATCGTC 3240

GGGCCTAGAA CCTGCAGCAA CACGTGGCAT GGAACATTTC CCATCAACGC ATACACCACG 3300

GGCCCTTGCT CGCCCTCCCC GGCGCCAAAT TATTCCAGGG CGCTGTGGCG GGTGGCCGCT 3360

GAGGAGTACG TGGAGGTTAC GCGGGTGGGG GATTTCCACT ACGTGACGGG CGTGACCACT 3420

GACAACGTGA AATGCCCATG CCAGGTTCCG GCCCCTGAAT TCTTCACAGA ATTGGATGGG 3480

GTGCGGTTGC ACAGGTACGC TCCGGCGTGC AAGCCTCTCC TACGGGATGA GGTCTCATTC 3540

CAGGTCGGGC TCAACCAATA CCTGGTTGGA TCGCAGCTCC CATGCGAGCC CGAACCGGAT 3600

GTAGCAGTGC TCACTTCCAT GCTCACCGAC CCCTCCCACA TTACAGCAGA GACGGCTAAG 3660

CGTAGGCTGG CCAGAGGGTC TCCCCCCTCC TTGGCCAGCT CTTCAGCTAG CCAGTTGTCT 3720

GCGCCTTCCT TGAAGGCGAC ATGCACCATC CATCATGACT CCCCGGACGC CGACCTCATT 3780

GAGGCCAACC TCCTGTGGCG GCAGGAGATG GGCGGGAACA TCACCCGTGT GGAGTCAGAG 3840

AATAAGGTAG TGATACTGGA CTCTTTCGAA CCGATTCGAG CGGAGGAGGA TGAGAGGGAA 3900

GTATCCGTTC CGGCGGAGAT CCTGCGGAGA TCTAGGAAGT TCCCCGCAGC GATGCCCATA 3960

TGGGCACGCC CGGATTACAA TCCTCCCCTG CTAGAGTCCT GGAAGGATCC GGACTACGTT 4020

CCTCCGGTAG TACACGGATG CCCATTGCCA CCTACCAAGG CCGCTCCGAT ACCACCCCCA 4080

CGGAGGAAGA GGACGATTGT CCTGACAGAG TCCACTGTGT CTTCTGCCTT GGCGGAGCTC 4140

GCTACTAAGA CCTTCGGCGG CTCCGGATCG TGGGCCGCCG ACAGCGGCAC GGCGACTGCC 4200

CCTCCTGACC AGACCTCCGA CGACGGCGAC AAAGAATCTG ACGTTGAGTC TGACTCCTCC 4260

ATGCCCCCCC TTGAGGGAGA GCCGGGGGAC CCCGATCTCA GCGACGGGTC TTGGTCCACC 4320

GTGAGCGAGG AAGCCAGTGA GGACGTCGTC TGCTGCTCGA TGTCCTACAC ATGGACGGGC 4380

GCCCTGATCA CGCCATGCGC TGCGGAGGAA AGCAAGCTGC CCATCAACCC GTTGAGCAAC 4440

TCCTTGCTGC GTCACCACAA TATGGTGTAC GCCACAACAT CCGCGAGCGC AAGTCTGCGG 4500

CAGAAGAAGG TCACCTTTGA CAGACTGCAA GTCCTGGACG ATCACTACCG GGACGTGCTC 4560

AAGGAGATGA AGGCGAAGGC GTCCACAGTT AAGGCCAAAC TTCTATCTGT AGAGGAAGCC 4620

TGCAAGCTGA CGCCCCCACA TTCGGCCAAA TCAAAATTTG GCTATGGGGC GAAGGACGTC 4680

CGGAGCCTAT CCAGCAGGGC CGTCAACCAC ATCACCTCCG TGTGGAAGGA CTTGCTGGAA 4740

GACACTAAGA CACCAATTGA CACCACCATC ATGGCAAAAA ATGAGGTTTT CTGCGTCCAA 4800

CCAGAGAAAG GAGGCCGCAA GCCAGCTCGC CTTATCGTAT TTCCAGACCT GGGAGTTCGT 4860

GTATGCGAGA AGATGGCCCT CTACGACGTG GTATCCACCC TCCCTCAGGC CGTGATGGGC 4920

TCCTCATACG GGTTCCAGTA TTCTCCTGGG CAGCGGGTCG AGTTCCTGGT GAAAACCTGG 4980

AAATCGAAGA AATGCCCCAT GGGCTTTTCA TATGACACCC GCTGCTTTGA CTCAACGGTC 5040

ACTGAGAATG ACATCCGTAT TGAGGAGTCG ATTTACCAAT GTTGTGACTT GGCCCCCGAA 5100

GCCAGGCAGG TCATAAGGTC GCTCACAGAA CGGCTTTATA TCGGGGGTCC CTTGACTAAT 5160

TCAAAAGGGC AGAACTGCGG TTATCGCCGG TGCCGCGCAA GCGGCGTGCT GACGACTAGC 5220

TGCGGCAATA CTCTCACATG TTACTTGAAG GCCTCTGCTG CCTGTCGAGC TGCGAAGCTC 5280

CAGGACTGCA CGATGCTCGT GAACGGAGAC GACCTTGTCG TTATCTGTGA GAGCGCGGGA 5340

ACCCGAGAGG ATGCGGCGAG CCTACGAGTC TTCACGGAGG CTATGACTAG GTACTCTGCC 5400

CCCCCCGGGG ACCCGCCTCA ACCGGAATAT GACTTGGAGT TGATAACATC ATGTTCCTCC 5460

AATGTGTCGG TCGCGCACGA TGCATCCGGC AAAAGGGTGT ACTACCTCAC CCGTGACCCC 5520

ACCACCCCCC TTGCGCGGGC TGCGTGGGAG ACAGCTAGAC ACACTCCAGT TAACTCCTGG 5580

CTGGGCAACA TCATCATGTA TGCGCCCACC TTCTGGGCAA GGATGATTCT GATGACTCAC 5640

TTCTTCTCCA TCCTTCTAGC CCAGGAGCAA CTTGGAAAGG CCCTAGATTG TCAGATCTAC 5700

GGGGCCTGTT ACTCCATTGA GCCACTTGAC CTACCTCAGA TCATTGAGCG ACTCCATGGT 5760

CTTAGCGCAT TTTCACTCCA TAGTTACTCT CCAGGTGAGA TCAATAGGGT GGCTTCATGC 5820

CTCAGGAAAC TTGGGGTTCC ACCCTTGCGA GTCTGGAGAC ATCGGGCCAG AAGTGTCCGC 5880

GCTAAGCTGC TGTCCCAGGG GGGGAGGGCC GCCACATGTG GCAAGTACCT CTTCAACTGG 5940

GCAGTAAGGA CCAAGCTTAA GCTCACTCCA ATCCCAGCTG CGTCCCAGTT GGACTTGTCC 6000

AGCTGGTTCG TTGCTGGTTA CAGTGGGGGA GACATATATC ACAGCCTGTC TCGTGCCCGA 6060

CCCCGCTGGT TCATGTTATG CCTACTCCTA CTTTCTGTAG GGGTAGGCGT CTACCTGCTC 6120

CCCAACCGCT GAACGGGGAG CTAAACACTC CAGGCCAATA GGCCGTCCCC TGTTTTTTTT 6180

TTTTTCTGCG TCTAG 6195

서열 번호 11:

서열의 길이: 1075 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명 : C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus)

주명 : 타입 1b의 N 타입

[서열 11]

AGCACCCGCG TGACAGGAGG AACGGAAGGC CGCACGACCA ACCGGTTCGT GAGCATCTTT 60

GCGTCCGGAC CATCTCAGAA AATCCAGCTT GTAAACAACA ACGGCAGTTG GCACATCAAC 120

AGGACTGCTC TGAACTGCAA TGACTCCCTC AGCACTGGGT TTATTGCCGC ACTGTTCTAC 180

GTACACAAGT TCGACTCGTC CGGATGCCCA GAGCGTATGA CCAGTTGCCG CCCCATTGAC 240

AAGTTCGCTC AGGGATGGGG TCCAATCACG TATGCTGAGT CTGCGCTCCA GGACCAGAGG 300

CCTTACGACT GGCACTACGC GCCCCGACAG TGCGGTATCG TACCCGCATC GCAGGTGTGT 360

GGTCCAGTAT ATTGTTTCAC CCCAAGCCCT GTTGTAGTGG GGACTACCGA GCGTTCCGGT 420

GCCCCTACGT ACACCTGGGG GGAGAATGAG ACGGACGTGC TGCTCCTCAA CAACACGCGG 480

CCGCCGCAAG GCAACTGGTT CGGCTGTACA TGGATGAATA GCACTGGGTT CACCAAGACG 540

TGCGGGGGCC CCCCGTGTAA CATCGGGGGG AGCGGCAATA ATACCTTGGT CTGCCCCACG 600

GACTGCTTCC GGAAGCACCC CGAGGCCACT TACACAAAAT GTGGTTCGGG ACCTTGGTTG 660

ACACCTAGGT GCTTAGTTGA CTACCCATAC AGGCTCTGGC ACTACCCCTG CACTGTCAAC 720

TTTACCATCT TTAAGGTCAG GATGTACGTG GGGGGCGTGG AGCACAGACT GAGTGCTGCA 780

TGTAACTGGA CTCGAGGAGA GCGTTGTGAC TTGGAGGACA GAGATAGATC AGAGCTCAGC 840

CCATTGCTAC TGTCTACGAC AGAGTGGCAG ATACTGCCCT GCAGCTTCAC CACCCTACCA 900

GCCCTGTCCA CTGGGTTAAT CCACCTCCAC CAGAACATCG TGGACGTGCA ATACCTGTAC 960

GGTATAGGGT CAGCGGTTGT CTCCTTTGCG ATCAGGTGGG AGTATATCGT GCTGCTTTTC 1020

CTTTTCCTGG CGGACGCGCG CGTCTGTGCC TGCTTGTGGA TGATGCTCCT CTAGA 1075

서열 번호 12:

서열의 길이: 576 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명 : C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus)

주명 : 타입 1b의 N 타입

[서열 12]

TATGAAGCGC GTAACGTGTC CGGGATATAC CATGTCACGA ACGACTGCTC CAACTCAAGC 60

ATTGTGTATG AGGCAGCGGA CGTGATCATG CATACTCCCG GGTGCGTCCC CTGCGTTCGG 120

GAGAATAATT CCTCCCGTTG CTGGGTAGCG CTCACTCCCA CGCTCGCGGC CAGGAACGCC 180

AGCGTCCCCA CTACGACAAT ACGACGCCAT GTCGACTTGC TCGTTGGGGC GGCTGCTTTC 240

TCGTCCGCTA TGTACGTGGG GGATCTGTGC GGATCTGTCT TCCTCGTCTC CCAGCTGTTC 300

ACCTTCTCAC CTCGCCGGCA TGAGACGACA CAGGACTGCA ATTGCTCAAT CTATCTCGTC 360

CACGTATCAG GTCATCGCAT GGCCTGGGAT ATGATGATGA ATTGGTCGCC TACAGCAGCC 420

CTGGTGGTGT CACAGATGCT CCGGATCCCA CAAGTCGTCG TGGATATGGT GGCGGGGGCC 480

CACTGGGGAG TCCTGGCGGG CCTCGCCTAC TATTCCATGG TGGCCAACTG GGCTAAGTGG 540

TTGGTTGTGC TGCTGCTCTT TGCCGGCGTT GATGGG 576

서열 번호 13:

서열의 길이: 102 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명 : C형 간염 바이러스 (Hepatitis C virus)

[서열 13]

ATGGGGGGGG CTGCCGCCAG GTTGGGGGCC GTGATTTTGT TTGTCGTCAT AGTGGGCCTC 60

CATGGGGTCC GCGGCAAATA TGCCTTGGCG GATGCCTCTC TC 102

서열 번호 14:

서열의 길이: 610 염기쌍

서열의 타입: 핵산

쇄의 수: 1본쇄

토폴로지: 선형

분자의 타입: DNA

기원:

생물명:엔세팔로마이카르디티스 바이러스

(Encephalomyocarditis virus)

[서열 14]

TACCGAGCTC GAATTCCCCC TCTCCCTCCC CCCCCCCTAA CGTTACTGGC CGAAGCCGCT 60

TGGAATAAGG CCGGTGTGCG TTTGTCTATA TGTTATTTTC CACCATATTG CCGTCTTTTG 120

GCAATGTGAG GGCCCGGAAA CCTGGCCCTG TCTTCTTGAC GAGCATTCCT AGGGGTCTTT 180

CCCCTCTCGC CAAAGGAATG CAAGGTCTGT TGAATGTCGT GAAGGAAGCA GTTCCTCTGG 240

AAGCTTCTTG AAGACAAACA ACGTCTGTAG CGACCCTTTG CAGGCAGCGG AACCCCCCAC 300

CTGGCGACAG GTGCCTCTGC GGCCAAAAGC CACGTGTATA AGATACACCT GCAAAGGCGG 360

CACAACCCCA GTGCCACGTT GTGAGTTGGA TAGTTGTGGA AAGAGTCAAA TGGCTCTCCT 420

CAAGCGTATT CAACAAGGGG CTGAAGGATG CCCAGAAGGT ACCCCATTGT ATGGGATCTG 480

ATCTGGGGCC TCGGTGCACA TGCTTTACAT GTGTTTAGTC GAGGTTAAAA AACGTCTAGG 540

CCCCCCGAAC CACGGGGACG TGGTTTTCCT TTGAAAAACA CGATGATAAT ATGGCCATGG 600

AAGATCCCGT 610

Claims

외피당단백질(Envelope protein: "E")인 E1 및 E2, 및 비구조 단백질(Nonstructural protein:"NS")인 NS3, NS4 및 NS5로 이루어진 군으로부터 선택된 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus;"HCV")의 항원 단백질을 코딩하는 유전자 하나 또는 둘 이상; 엔세팔로미오카디티스 바이러스(Encephalomyocarditis virus)의 인터널 라이보좀 엔트리 서열(Internal ribosome entry sequence;"IRES"); 및 과립구 및 대식세포-콜로니 자극 인자 (Granulocyte Macrophage-Colony Stimulating Factor: "GM-CSF")를 포함하며, 상기 IRES는 상기 HCV 항원 유전자와 GM-CSF의 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 바이시스트로닉 DNA 플라스미드.
제 1항에 있어서, 상기 HCV 항원 유전자 E1과 E2는 각각 그의 소수성 아미노산 잔기를 포함하는 카르복실 말단이 제거된 것임을 특징으로 하는 DNA 플라스미드.
제 2항에 있어서, 상기 HCV 항원 유전자 E1과 E2는 나아가 그의 N-말단에 허피스 바이러스(Herpesvirus)의 외피당단백질 D("gD")의 신호서열("s")이 연결되어 있음을 특징으로 하는 DNA 플라스미드.
제 1항에 있어서, 상기 HCV 항원 유전자는 NS3, NS4 및 NS5가 모두 포함된 NS345임을 특징으로 하는 DNA 플라스미드.
제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, pTV-sE1t/IRES/GMCSF, pTV-sE2t/IRES/GMCSF 또는 pTV-NS345/GMCSF임을 특징으로 하는 DNA 플라스미드.
제 1항에 따른 DNA 플라스미드를 유효량으로 함유하는 HCV에 대한 DNA 면역법에 의한 백신.
제 3항에 따른 DNA 플라스미드에 의해 발현되는 변형된 단백질.