JPH06501849A - 無毒性微生物及びその使用：チフス菌 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本出願は１９９０年１１月９日出願の審査中の米国出願０７／６１２．００１号 のＣＩＰ（コンティニュアス　イン　バート）てあり、それは１９８８年６月１ 日出願の米国出願２００，９３４号のＣＩＰであり、それは１９８７年６月４日 出願の審査中の米国出願０５８．３６０号、米国出願２００，９３４号は又１９ ８８年ｌＯ月３日出願で審査中の米国出願２５１，３０４号のＣＩＰであり、そ れは１９８７年１０月７日出願て審査中の米国出願１０６．０７２号のＣＩＰで ある。これらの出願はここて引用によって合体され本発明は無毒性微生物、それ らの精製方法及びそれらのワクチンチフス菌によって引き起こされる腸チフスは 、低開発国の住民、工業国から風土性地域を訪れた旅行者、及び熟達試験を実行 する研究所の臨床微生物学者に対する重要な大衆健康問題として残っている。現 在認可されている腸管外で殺された全ての細胞の腸チフスのワクチンは防御する か許容させ得ない高い頻度でマークされた全身系のそして局所副作用を引き起こ す（プロットキンＳＡ、　モーティマーＥＡ　Ｊｒ、（ｅｄｓ）におけるレビン 、腸チフスワクチン６ワクチン。フィラデルフィフ、ＷＢサウンダース、１９８ ８年、３３３乃至３６１頁）。代替ワクチンには最近認可された経口的生ワクチ ン菌株Ｔｙ２１ａ及び実験に基つく腸管外のｖ１多糖ワクチンか含まれている。

経口的ワクチンの利点は局所応答か最大に刺激される粘膜免疫系への複製生体の 導出である。更に、弱毒性腸チフス菌が外来性抗体をイクスプレスするキャリア ワクチンとして作用しそれらを人間免疫系に導出する誘因候補である。しかし、 このアプローチを人間を免疫化するために成功するように使用するだめの臨界前 要件は免疫系へ外来性タンパク質及び多糖抗原を導出するために高度に免疫原性 であり未だ安全な腸チフス菌の弱毒性菌株を存在せしめることである。

Ｔｙ２１ａに基づく最近の経口的ワクチンは種々の欠点を有する。

Ｔｙ２１ａは比較的低い免疫原性のものであり免疫化のために多数回の経口的投 与が必要となる。成育可能な生体の産出はそれが大規模に発酵し凍結乾燥された ときに低い。更に、Ｔｙ２１ａは不確定１６７−１７４．ホーン他、（１９８８ ）、Ｊ、インフエクトイイナバ（フォレスト他、（１９８９）、Ｊ、インフエク ト、ディス。

１５９：１４５−１４６）の０抗原をイクスブレッシングするＴｙ２１ａの構成 物は人間における臨床試験を受けている。北米ポラン提供し、そこにはロフトか らロフトへの変化があり他のロットは防御的てあった（ブラック他、Ｊ、インフ エクト、ディス　（１９８チンの少数のみて及び低力価で血清イナバビプリオサ イダル抗体及び腸ＳＩｇＡ抗イナバ○抗体を誘発したくタケソト他、（１９９０ ）、イ：／７エクト、ニミュン、＋６２０　１６２７）。病原性ｙ−は下痢に対 して全体に渡って育意的に防御されなかったか、穏やかな下痢を有し、より少な い野性Ｖ　コレラエ細胞（タケ１．ト他、Ｉｄ　）をシェドした。

候補キュリア菌株としてのＴ）’２１ａの使用の欠点はその制限された免疫原性 、そのアテニュエイションの分子ベース上での正確な情報の欠如及びその菌株（ 例えば、トランスフォーメーション、エレク１へロボレーンヨン、及び組み換え 頻度において）の細菌遺伝子手技における実施上の困難さを含む。それは又凍結 乾燥培養の再構成の後の非常に乏しい生存度を示している。

本出願人は無毒性に通ずる障害か食餌によって又は動物宿主によって供給される あらゆるものによっても回復され得ない毒性因子のトランスポゾン誘発された無 毒性突然変異株を使用したワクチンを用いた有毒感染に対する防御の新たな方法 を開示した。不ズミチによる無毒性微生物を製造する方法を含む出願人の最初の 研究の内のいくつかかＥＰＯＰｕｂ、Ｎｏ、３１５，６８２　（１９８９年５月 １７日に公表された）、及びＰＣＴ　Ｐｕｂ、Ｎｏ、８８１０９６６９　（１９ ８８年１２月１５日に公表された）に述へられている。出願人は又、組み換え抗 原のイクスブレツションのためのキャリア細胞として所望される無毒性突然変異 型細胞の他の種類の生産の方法を提供した。これらの細胞は酵素が本質的な細胞 壁構造成分の生合成における過程に触媒作用を及ぼす細胞生存のために本質的な 酵素を符号化する機能擦る自生遺伝子の欠如及び最初の組み換え遺伝子か欠損染 色体遺伝子を置換することかできない自生酵素のための機能置換である酵素を符 号化する最初の組み換え遺伝子の存在によって特徴付けられる。これらの細胞に 最初の組み換え遺伝子は構造的に所望の産物を符号化する２番目の組み換え遺伝 子に連鎖されている。最初の組み換え遺伝子の損失は細胞を溶解させる。これら の方法はＷＯ８９１０３４２７（１９８９年４月２０日公表された）に記載され ている。上記の特許出願の開示は、あらゆる対応する国家特許出願と間様に、引 用によってここで合体される。

発明の詳細な説明 本発明は、幾分、ＥＰＯＰｕｂ、Ｎｏ、３１５．６８２に開示激する方法、及び 病原の免疫原性抗原に応答する免疫系を刺激する方法において、含まれる。ここ で提供される菌株はＳ、タイフィによって引き起こされる病気を防止するための 商業ワクチン、及びその抗体を用いてＳ、タイフィか交叉反応する他の腸の細菌 の生産に直接的及び関節的に適当である。これらの菌株は又細菌細胞において組 み換え遺伝子上で符号化されたイクスブレッション産物の生産のためのキャリア 微生物として役に立つ。

従って、本発明の一実施例は生理学的に許容される賦形剤におい原性組成である 。

たＳ　タイフィの分離された無毒性菌株である。

本発明のその他の実施例は旦、タイフィの無毒性派生物、二工！遺伝子における 突然変異及びａｒｐ遺伝子における突然変異を用いた該派生物である。

本発明の更に他の実施例は立ヱユ遺伝子及び二二豆遺伝子における突然変異を用 いたＳ、タイフィの分離された無毒性菌株である。

本発明の更に他の実施例はｃｄｔ遺伝子における突然変異を用いたサルモネラの 無毒性派生物よりなる個体の免疫化のための免疫原性組成である。

本発明のその他の実施例はｃｄｔ遺伝子における突然変異を含むサルモネラの分 離された無毒性派生物である。

本発明の更に他の実施例は菌株χ３９５８．　χ４３２３．　χ３９２６、χ３ ９２７．　χ４２９７．　χ４３４６．　χ３９４０．　χ４０７３及びその派 生物のグループから選択された分離された菌株である。

本発明のその他の実施例はｃｙａ遺伝子における突然変異よりなる無毒性のＳ、 タイフィの菌株を利用する方法、生理学的に許容できる賦形剤におけるその菌株 のサスペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。

本発明の更に他の実施例は且二二遺伝子における突然変異よりなる無毒性Ｓ、タ イフィの菌株の利用方法、生理学的に許容てきる賦形剤におけるその菌株のサス ペンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。

本発明の更に他の実施例はＣｄｔ遺伝子における突然変異よりなる無毒性サルモ ネラの菌株の利用方法、生理学的に許容てきる賦形剤におけるその菌株のサスペ ンディングによる免疫原性組成の精製よりなる方法である。

本発明の他の実施例はｃｄｔ突然変異株であるＳ、タイフィの分離された菌株で ある。

図面の簡単な説明 図ＩＡはχ３６３３　（Δ〔ニューｃｙｓＧ）−１且）の９ｘｌＯ”　ＣＦＵ、 χ３７３７　（ｐｓＤｌ　１０°／Δ〔二りど１１ユＧ）−１０）の１ｘｌｏ’ 及びχ３３３９　（自生型）の１ｘｌｏ”ＣＦＵを用いた経口接種の後スペシフ ァイされた回数の生後８周間ＢＡＬＢ／ＣマウスのベヤーズパッチからのＣＦＵ の回復を示すグラフである。３匹のマウスが各時点で犠牲になった。幾何平均上 標率偏差として与えられる。

図ＩＢはχ３６３３　（Δ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−１０）の９ｘｌＯ’　ＣＦＵ 、χ３７３７　（ｐｓＤｌ　１０°／Δ（ａｒｐ−Ｃ’！ＳＣ；）−１０）の１ ｘｌＯ°及びχ３３３９　（自生壓）の１ｘｌＯ”ＣＦＵを用いた経口接種の後 スペシファイされた回数の生後８周間ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスの膵臓からのＣＦＵ の回復を示すグラフである。３匹のマウスが各時点で犠牲（こなった。幾何平均 上標準偏差として与えられる。

図２はｐＹＡ１０７７部分限定マツプである。λｇｔｌｌクロー及びｐＹＡ１０ ７８をハーバ−するＥ、コリ菌株によって生産されるタンパク質のウェスタンプ ロットを示すハーフトーン再生である。

ニトロセルロースフィルタ上のそのタンパク質は２１らい腫らい患者からのプー ルされた血清を用いて反応された。レーン１９分子サイズマーカー（サイズはプ ロットの左へ示されている）：レーン２゜ｐＹＡ２９２を用いてＳ、タイフィχ ４２９７によってスペシファイされたタンパク質：レーン３乃至５．各々かｐＹ Ａｌ０７８を含む３つの独立Ｓ　タイフィχ４２９７隔離集団によってスベンフ ァイされたタンパク質、レーン６乃至８．各々かｐＹＡ１０７７を含むＳ、タイ フィχ４２９７隔離集回の３つの独立隔離集団によってスベソファイされたタン パク質；レーン９．　ｐＹＡ　Ｉ　Ｏ７７１１い”ｒｓ、タイフィムリウムχ４ ０７２によってスペノフアイされたタンパク質、レーン１０．ｐＹＡ１０７５　 （それかｐＹＡ　＋　０７７ｉ：おいてそうであるようにラクＺプロモータの血 縁である同じ指向におけるλｇｔｌｌクローンＬＩ４からのｌ、Ｏｋｂ　Ｍ、ラ ブラよりＮＡ挿入を含むｐＵＣ８−２派生物）を用いて旦、タイフィムリウムに よってスペンファイされたタンパク質。注　それがβガラクトノダーゼのアルフ ァー領域を用いた融合タンパク質であるためｐＹＡ１０７５によってスベンファ イされた免疫反応性タンパク質はｐＹＡＩ０７７によってスペシファイされたも のよりも僅かに大きい。

図４はλｇｔｌｌ　・Ｍ、ラブラエクローンＬＩ４及びＳ、９−＜二ヱ、ｐＹＡ ２９２．ｐＹＡｌ　０７７及びｐＹＡ１０７８をバーバーしているＳ、タイフィ ムリウム及びＥ。コリ菌株によって生産されたウェスタンプロットを示すハーフ トーン再生である。

図５は人間血清における３７°ＣてのＳ、タイフィＴＹ２及びＩＳＰ］８２０の 自生及び野性菌株の成長を示すグラフである。

本発明を実行するためのモート 本発明はある突然変異か実質的にその免疫原性に影響を及ぼさずに微生物を無毒 性にし得るという発見に基づいている。特に、この発明は微生物か夫々アデニル 酸ツクラーゼ（ＡＴＰピロフォスフェートリアーゼ（環化する）ＥＣ４，６，１ ，ｌ）及び環状ＡＭＰ受容タンパク賀（ＣＲＰ）を合成する能力を除去する遺伝 子欠失（オーブントライアングル又はデルタ）突然変異△ｃｙａ及び／文理状− ３°　５°−ＡＭＰ　（ｃＡＭＰ）及び環状ＡＭＰ受容タンパク質は大量のカタ ボリティーの輸送及び衰弱に関する大量の遺伝子及びオペロンの転写に必要であ る。燃料／炭素源を輸送するために使用される系か全て、いくつかのアミノ酸透 過酵素であることから、ｃＡＭＰろによる正制御の下にあるということを示す証 拠が提供された。異化におけるその非常に重要な役割に加えて、細胞におけるｃ ＡＭＰａ縮は又温度ファージ、フィムブリエの合成、べん毛の合成及び少なくと も一つの外膜タンパク質の合成による溶原化に影響を及はす。ｃＡＭＰは哺乳類 細胞内に存するか、大食細胞及びサル０．１乃至１．０ｍＭ　ｃＡＭＰの濃縮以 下である。更に、ΔＣｒ２突然変異の包含は、本質的にそのようなΔｃｙａ突然 変異株によるｃＡＭＰインビトロ又はインビボの理解から生ずるであろういかな る恩恵をも廃止するであろう。

突然変異の旦、タイフィの立ヱ見及び二二二への導入は、他の竺ルモ不う菌株か ら旦、タイフィへの突然変異の移入のために、トランスポゾンの使用によって完 成され得る。トランスポゾンは細菌染色体へ多くの点において付加され得る。ト ランスポゾン挿入及び遺伝子欠失の特徴はタロノクナー他（１９７７）、モル、 ボイル　１１６・１２５において再調盃された。例えば、テトラサイクリンへ耐 性（及びフサリフ酸に感受性を）与えるトランスポゾンＴｎ　Ｉ　ＯはΔｃｙａ 及びΔｃｒｐ突然変異を、例えばＥ、コリ及びＳ、タイ検出する方法はＥＰＯＰ ｕｂ、Ｎｏ、３１５，６８２に記載されており、方法は又後にＴｎ　Ｉ　Ｏを使 用する例にて提供する、これらの突然変異は好ましくは高度に病原性であるＳ　 タイフィの様々な隔離集団へ転位され得る。Ｓ、タイフィムリウムから野性型Ｓ 、夕エニエ菌株へのΔ二ヱ且及びΔ旦エエ突然変異の転移の例は後に例となった ら、その微生物はその微生物に対する免疫を誘発するワクチンの免疫原性成分と して役に立つ。

本発明の他の実施例において、ｃｙａ突然変異株及び／又は。。

λ突然変異株であるＳ　タイフィは、好ましくは遺伝子欠失によって、サルモ不 うの毒性を調節する二二！遺伝子の付近の遺伝子において、突然変異される。こ の遺伝子、旦亘工遺伝子における突然変異は、例えば膵臓のような深い組織を効 果的に定着させる細菌の能力を減少させる。Ｃｒｐ”遺伝子を有する核外遺伝子 かΔ（二二二−二旦工）を用いて菌株内に配置された際、それはその無毒性及び 免疫原性を保有しよってＣ７ユ及びＣｒｐ突然変異株と同様の表現壓を有する。

核外遺伝子上に二二λ°遺伝子を含むΔ（且ｒｐ−（１工）突然変異を用いた突 然変異株は胆道及びＧＡＬＴを定着させる通常の能力を保有するが、より深い組 織を定着させる減少された能力を有する。その例においては、元のΔ（Ｌ二■− 二丈工）突然変異はχ３６２２において分離されアルギニン及びシスティンの成 長のための要求を課するａｒｇＤ及びｃｙｓＧ遺伝子を削除した。

この突然変異株対立遺伝子はΔ（−ニエｐ−ｃｙｓＧ）−１且と名付けられた。

アルギニン要求を課さなかったより短い遺伝子欠失を含む第２の突然変異株か分 離された。これはχ３９３１内に存しΔ（ａｒｐ−ｃｙｓＧ）−土工と名付けら れた。旦、タイフィにお１ブ特徴を使用した表現型選択を使用してサルモ不うの 他の菌株において製造され得る２代わりＩこ、Δｃｄｔ突然変異が例に記載され たＳトランスポゾン突然変異誘発の技術を使用して転位され得る。

本発明の更に他の実施例において病原性Ｓ、タイフィの無毒性派生物かＧＡＬＴ 、例えば回腸のペヤーズパッチへ選択された抗原を送出するキャリア細菌として 使用され得る。サルモネラはペヤーズバッチ（カーター、Ｐ、　Ｂ、及びＦＭ、 コリンズ、Ｊ、イクスプパッチを定着させることか示された（バーマン、Ａ、　 Ｗ、他、インフエクト、及びイミュン、２２ニア６３　（１９７Ｂ））。もしこ れらのキャリア細菌か病原性生体からの組み換え遺伝子を含みイクスプレスする と、その病原から説明生産された抗原遺伝子産物に対する抗原が誘発される。あ ろう。組み換えＤＮＡ遺伝子技術の出現によって、特異性抗原が生産されるユニ ークワクチンを総合的に発生させることが、病因因子によってでなく、その抗原 に関して遺伝子をイクスブレッシングすることができる細菌の他の宿主菌株によ って、全可能となっている。抗原が哺乳類の宿主の抗原を用いて交叉反応しよっ て自己免疫の誘発を相乗作用する可能性があるとき、その遺伝子を変更する組み 換え遺伝子技術を使用することが又可能でありその結果影響を及ぼす交叉反応抗 原決定郡は生産されない。

よって、組み換えＤＮＡ技術はを椎動物宿主を用いた交叉反応をなし得る又は自 己免疫状態を誘発し得るいかなる物質も存しないワクチンの発生のために使用さ れ得る。

生体、特にキャリア細菌として機能し得るサルモネラを準備する方法は、ＷＯ８ ９１０３４２７（１９８９年４月２０日発行）ニて記載され、米国シリアルナン バー０７／２５１．３０４において、１９８８年１０月３日に出願され、それは 共通に所有されている。

程に触媒作用を及はす、細胞生存に重要な酵素を符号化する染色体遺（云子にお いて突然変異を引き起こすとみなされている。染色体外の遺伝的要素、例えば組 み換えベクターは突然変異株細胞に導入される。この遺伝的要素は自生酵素に関 する機能的な置換である酵素を符号かする第１の組み換え遺伝子を含むか、その 第１の組み換え遺伝子は欠損染色体遺伝子を置換し得ない。第１の組み換え遺伝 子は構造的に所望の産物を符号化する第２の組み換え遺伝子に連鎖されており、 それはキャリア微生物においてイクスプレスされるへきものである。第１の組み 換え遺伝子の喪失はその細胞か第１の組み換え遺伝子のイクスブレノンヨンによ る産物か欠けている環境にあるときその細胞を溶解させる。

重要な細胞壁構造成分の生合成において過程に触媒作用を及ぼす、細胞生存に重 要な酵素を符号化する遺伝子の数は、例えばａｓｄ遺伝子によって符号化される アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（、へｓｄ）に関する技術において知 られている。Ｓ　タイフィ利用トランスポゾン突然変異生成のａｓｄ遺伝子にお いて遺伝子欠損突然変異を導入する方法か例に示されている。無毒性キャリアＳ 。

伝的要素の構造か文例に示されている。

本発明か局所免疫か重要でありがっ防御の第１線となる可能性のある細菌、菌類 、寄生生物、又はウィルス病因子に対する効果的なワクチンの開発に広く適用で きることは明らかである。いくつかの例はｌ・ラコーナクラミシアによって引き 起こされる眼の伝染病のみてはなくベスト菌によって引き起こされる肺ベスト、 淋菌によって引き起こされる淋病、梅毒トリボ不一マによって引き起こされる梅 毒、及び性病の制置に関するワクチンである。咽喉炎又は心臓病を引き起こす種 のような、グループＡ及びグループＢの双方からの連鎖状球菌、骨膜炎菌、肺炎 マ／コプラスマ、インフルエンサ菌、百日咳菌、ヒトヤ結核菌、らい菌、ホルデ テラアビウム、大腸菌、連鎖球菌エキ、肺炎球菌、ウソ流産菌、パスツレラへモ リティ力、コと二奥、土匹菫種、及びレジュネラニューモフィラ菌かそれらから 遺伝子から得られる本発明の範囲内の細菌の更なる例である。インフルエンサウ イルスに対して生産されているようなウィルスワクチンは又本発明によって包含 される。ウィルスワクチンは又、例えばバボウイルス、アデノウィルス、ヘルペ スウィルス、ポックスウィルス、パルポウィルス、しオウィルス、ピコルナウィ ルス、ミクソウィルス、バラミクソウイルス、又はレトロウィルス綱からの他の ウィルス、ＤＮＡ及びＲＮＡウィルスの夫々に対しても製造され得る。病原性菌 類、原生動物、及び寄生生物による伝染病に対して防御するワクチンは又本発明 によって熟慮される。

更なる実施例において、ワクチンの免疫原性成分か宿主のアレルゲンであるとき そのようなワクチンはアレルギーの宿主を特別に知覚鈍麻させるように設計され たエクスポージャー養生において使用され得る。

その実施例の一つにおいて、本発明は病原性微生物の生態毒性派生物を含むを椎 動物又は無を椎動物の免疫化のためのワクチンとして説明し得、該派生物は機能 的なアデニル酸シクラーゼ及びＣＡＭＰ受容タ受容タンパ土質し得ず該動物の病 原である又は該動物のアレルゲンを生産する生体から派生される組み換え遺伝子 をイクスブレノンングし得る。

更に他の実施例において太発明の無毒性微生物は様々な宿主タンパク質の合成の ためのベクターとして使用し得る。本発明の無毒性微生物は宿主への導入の後に ＧＡＬＴ、腸管膜リンパ腺及び膵臓を含む様々な免疫担当構造をトラバースし得 るため、そのような細菌は様々な免疫抑制産物をターゲットするために使用され 得る。よって、免疫抑制タンパク質又はペプチドを符号化する−又はそれ以上の 遺伝子かその微生物かティクアップしたときに適当な免疫担当組織にお１ブる滞 留か宿主における免疫応答を抑圧、促進又は一時的変位させる組み換え産物をイ クスブレッンングし得るような無毒性微生物へ組み換えて導入し得る。免疫抑制 分子の例は、コロニー刺激因子（大食細胞、顆粒細胞、又は混合された）、マク ロファージケモトキシン、マクロファージ抑制因子、白血球抑制因子、リンフォ トキノン、芽球化因子、インターフェロン、及びインターロイキンを含むがしか しそれに限定されない。

本発明の更に他の実施例はここで熟慮された無毒性微生物の様々な生理学上の１ ！！能（即ち、成長率、血圧、他）を刺激又は抑制する可能性のある薬物学的活 動性産物の送出及び生産のための使用てあ異味の製造は他の知られた技術を使用 して又完成され得る。これらの技術は例えば突然変異生成の標準技術及び／又は 組み換えＤＮＡ技術の使用を含む。所望の突然変異株が表現型特徴に基づいて選 択され、それらのいくつかは例において後に述へ、それらは表８に示される。本 発明のこれらの実施例における各々の用語は下記の記載によって分析される。

免疫原性因子によって、免疫系の−又はそれ以上の機能か増加され免疫原性因子 に差し向けられるように、生きた生体の免疫系を刺激するために使用される因子 が意味される。免疫原性因子はワクチンを含む。免疫原性因子は、知られた技術 を使用して、分離された多クローン性抗体及び単クローン性抗体の夫々の抗体の 生産に使用さね得る。

ワクチンによって将来の害に対する防御か提供されるように生きた生体の免疫系 を刺激するために使用される因子か意味される。免疫化はＴリンパ球を殺しかつ 又他の細胞（例えば食細胞）を生体内でそうさせるように活性化し得、生体かそ れまでに作用を受けた病原又は抗原に対して差し向けられる連続したハイレベル の抗体及び／又は細胞性免疫応答を誘発する過程を呼ぶ。「免疫系」という語は 異物の存在への単細胞生体の反応、例えばインターフェロン生産を包含し得るが 、本出願においてはその語はそれによって多細胞が生体の細胞又は生体の細胞外 液に侵入する抗原物質に対する抗体を生産する解剖学的特徴及び機構に限定され る。そのように生産される抗体は、免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、　Ｇ、又はＭの ような免疫間のどれでもに属し得る。個別の興味のものであるのは、本発明のワ クチンはＩｇＡ生産を刺激するものに限定されないか、これか温血動物の分泌系 によって生産される免疫グロブリンの原理であることから免疫グロブリンＡ（Ｉ ｇＡ）の生産を刺激するワクチンである。

例えば、ここで説明される自然のワクチンはＩｇＡ：）形成、例えば細胞及び体 液性免疫に加えて広い範囲の多の免疫応答を生産するよってある。抗原に対する 免疫応答は良く研究され広く報告されて８３）において与えられ、その全ては引 用によって合体される。

を推動物はを推動物亜門、魚類動物、両生類動物、爬虫類動物、鳥類動物、及び 哺乳類動物を含むせき索動物量の一次門のどれでものメンバーであり、それらの 全ては分節骨又は軟骨性を柱によって特徴付けられる。全てのを推動物は機能的 な免疫系を有し抗体の生産によって抗原に応答する。よって全の背椎動物はワク チンに応答し得る。ワクチンは人間又は犬（狂犬病ワクチン）等の哺乳動物に非 常に一般的に与えられているが、魚類動物及び鳥類動物等の商業的に飼養されて いる池の綱のを推動物に関するワクチンも、その種かここで説明されていれば、 本発明の範囲内にある。

そのを推動物を除いた動物界のとのようなメンバーも無腎椎動物である。そのよ うな動物は無を推動物量を構成し背骨又はを柱を育しない。この分類は魚類動物 、両生類動物、爬虫類動物、鳥類動物及び哺乳類動物を除く全ての動物を含む。

多くの無を推動物か抗原刺激への原子免疫応答をイリサイティングし得哺乳動物 に感染させ本発明によってここで開示されている同し微生物によって影響されや すい。そのような無を推動物の典壓は甲殻類及びモル−セス及び他の関連動物で ある。無を推動物の防御におけるワクチンの使用はここまで良くは記載されてい ないか、等業者は本発明かそれらの原子免疫系の使用によって無を推動物にも適 用可能であることを理解の導入を許容しそれらよって原子免疫系か応答するため のボテンシャルを提供するであろう。よって、無を推動物を感染させることかで きる病原性微生物の無毒性派生物の病原に対する該無を推動物に存する免疫系か らの応答を刺激する使用は本発明の範囲内にある。

本発明のワクチンを用いて取り扱われる「個体」はここで全てのを推動物、例え は在来鳥類動物、特に農業的重要性のものを含む哺乳動物を含むものとして定義 される。更に、軟体類及びある他の無を推動物か原子免疫系を有し「個体」に含 まれる。

本発明の一実施例は病原又はアレルゲンに対する抗体応答に使用される遺伝子産 物キャリアとしてのＧＡＬＴ又はＢＡＬＴに付着し、そこに侵入し、そこで生存 する病原微生物の無毒性派生物の使用である。無毒性はその属又は種の微生物が 病原としてもう機能し得ないということを意味するのではなく、使用されている 個々の微生物か取り扱われている個々の動物に関して無毒であるということを意 味する。その微生物は通常病原性であるか無毒性である菌株に属しているへきで ある属又は種にまで属している可能性かある。病原性によって病気を引き起こす 又は通常の生理学的機能を損ない得る能力か意味される。無毒性菌株は通常その 毒性病原性カウンターパートと組み合わされた病気の全組を含むことか出来ない 。ここで使用されている微生物は細菌、原生動物、及び単細胞菌類を含む。

遺伝物質を第１の生体から通常遺伝物質を第１の生体を用いて交換しない第２の 生体に転移する技術か急激に膨張する組み換えＤＮＡ技術の結果最近広く得られ るようになった。本出願において、−生体から第２へ第２の生体の再生産か同じ 遺伝物質を含むディセンプツトを起こすように転移された遺伝物質か組み換え遺 伝子と呼ばれる。用語遺伝子はここてとんな遺伝の生物単位をも表現するその最 も広い意味において使用されている。組み換え遺伝子は親生体に存するような完 全な遺伝子である必要はなく、それは高分子、例えば機能するポリペプチドの生 産を生産し又は抑制することができた。

その遺伝子は単に抗原産物の生産におけるガイドとして使用されるテンプレート として役に立つことが必要である。その産物はその親生体におけるその正確な形 において見出されなかったものの−ってあってもよい。例えば、１００アミノ酸 残基よりなるポリペプチド抗原に関して暗号づけする機能的遺伝子は７５のみ又 は＋００ものアミノ酸よりなるペプチドか宿主細胞の細胞機構によって生産され るように部分的にキャリア微生物に転移されてもよい。しかし、もしこの遺伝子 産物か親生体に存する同様な抗原に対する抗体の形成を引き起こすであろう抗原 である場合、その遺伝子は本発明において定義された用語遺伝子の範囲内にある と考えられる。その代わりに、もし個々の抗原のアミノ酸配列又はその破片が知 られている場合、そのＤＮＡ片又はそのアナログをオートメイテッド遺伝子シン セサイザー又は同様のものによって化学的に合成し該ＤＮＡ配列を適当なイクス ブレッションベクターに導入することが可能である。

そのスペクトルの他端においていくつかの遺伝子産物に関して暗号づげするＤＮ Ａの長い節かあり、その一つ又は全てか抗原性である得る。よって、ここで定義 され請求されているような遺伝子は抗原を生産し得る遺伝のとんな単位でもある 。その遺伝子は染色体、核外遺伝子、又はウィルスオリジンのものである得る。

遺伝子を免疫応答の誘発において効果的にするため（：、その遺伝子はイクスプ レスされなければならない。遺伝子のイクスプレンノヨンはその遺伝子の構造（ ＤＮＡベースの配列）において固有の情報かＲＮＡ分子、ポリペプチド又は他の 生物分子の形における物理的産物にその遺伝子か位置する細胞の生化学的機構に よって形質転換するということを意味する。そのように生産された生物分子は遺 伝子産物と称される。ここで使用されている用語遺伝子産物は遺伝子の制御の下 で起きる生化学反応の結果生産されるとんな生物産物をも呼ぶ。遺伝子産物は、 例えばＲＮＡ分子、ペプチド、又は酵素の制御の下で生産される産物又はその遺 伝子の最初の産物、即ち代謝産物である他の分子であってもよい。例えば、遺伝 子はその遺伝子か見出された元の細胞の外側の環境においてグリカンの形成を制 御する酵素へリポソームの動作によって翻訳されるＲＮＡ分子の合成を最初に制 御してもよい。そのＲＮＡ分子、酵素、及びグリカンはここて使用されている用 語としての全ての遺伝子産物である。

糖タンパク質及び多糖のような、多くの他種の遺伝子産物ばかりてはなくこれら のとれも動物の免疫系に導入されたら抗原として作用する。糖タンパク質及びリ ポタンパク質を含むタンパク質遺伝子産物はワクチンにおける抗原として使用す るのに好ましい遺伝子産物である。

ワクチンを抗原の生産において効果的にするために、抗原物質かワクチン接種さ れた動物の抗原生産機能が活動し始めるように放出されなければならない。よっ て、その遺伝子産物の微生物キャリアはその動物に導入されなければならない。

前述の如＜ＧＡＬＴ又はＢＡＬＴ細胞の好ましい応答を刺激するめだに、その微 生物又は遺伝子産物の導入は、静脈、筋肉、皮下注射又は乳房内又は陰茎内又は 膣内投与のようなワクチン投与の他の方法か可能であるか、経口投与、背押管法 によって又はエアロゾルの形でのようにその腸又は気管支に直接導入されること か好ましい。

無毒性微生物かキャリア微生物として使用されどとき、そして一旦そのキャリア 微生物か動物内に存したとき、その抗原１よその動物の免疫系で役に立つように なる必要かある。これはそのキャリア微生物かその抗原分子か放出されるように 死ぬことによって完成される。もちろん、溶解無しにその周辺質の内容物を放出 する「漏出」無毒性突然変異株の使用か又可能である。その代わりに、その細胞 の死の前に外部環境へのそのキャリア細胞によって得ることかできるようにされ るであろう抗原の生産を制御する遺伝子か選択されてもよい。この方法において は、ワクチン接種された動物において、例えばそのベヤーズバッチにおいて生存 しそして抗原を生産し続け、それによって連続的に抗体形成を誘発する生存可能 な微生物を使用することか可能である。これらの環境の下の好ましい遺伝子産物 は細胞膜を介して外部環境へ転移される産物又はその遺伝子産物の全てまたは部 分かその環境に曝されるように外膜に付着又は埋設される産物である。この後音 種の遺伝子産物の典型は通常それに対して防御か所望される生体の表面上で見出 される抗原である。もしこれらの抗原が通常の方法で細胞表面に輸送された場合 、その抗原に対する抗体形成が強化される。

抗原を他の病原からＧＡＬＴ又はＢＡＬＴへ送出するという病原の使用はもしそ れか仮にそのような病原かペヤーズバッチ又はＢＡＬＴを定着させる能力の保育 の間に無毒性とされ得るというような事実に関するものでは無い場合不適当とな るであろう。

そこから組み換え遺伝子か派生する生体はワクチン接種されている動物のとんな 病原であってもよく又その動物のアレルゲン又は他の抗原を生産した生体であっ てもよい。アレルゲンはアレルギー性反応を引き起こす物質であり、この場合そ れらに対してワクチン接種される動物におけるものである。動物のふけ及び花粉 等の多数の異なる物質かアレルゲンとなり得、個々の動物のアレルギー性反応は とのような個々のアレルゲンに対するかによって異なる。通常アレルギー性反応 を示す動物においてアレルゲンに対する寛容を誘発することか可１１ヒである。

寛容を誘発する方法は良く知られておりそして一般に増加する供与量におけるそ の動物へのアレルゲンの投与よりなる。寛容誘発の更なる記載は前に引用したム レ１．ト教科書において与えられる。最後に宿主生体それ自体は他の薬物学的な 活動物質に関する免疫抑制遺伝子かそのベクターによってイクスプレスされてい るときに遺伝物質の源として役に立つ。

上に開示された種の生ワクチンの動物への投与はとのような知られた又は障準の 技術によってもよい。これらは経口摂取、背押管法、又は気管支−鼻一眼噴霧を 含む。これらの全ての方法は生ワクチンかＧ　Ａ　Ｌ丁又はＢＡＬＴ細胞に容易 に到達し抗体形成を誘発することを許容し投与の好ましい方法である。静脈注射 等のそのキャリア微生物かその動物の血流に到達することを許容する他の投与方 法も許容され寿る。静脈、筋肉、又は乳房内注射は本発明の池の実施例を用いて 、後述する如くに又許容され得る。

投与の好ましい方法か経口摂取、エアロゾル噴霧及び背押管法であることから、 好ましいキャリア微生物はワクチン接種されている動物の腸又はブロンキーのリ ンパ上皮構造のとれてもに付着し、侵入しそこで生存する種に属するもにである 。これらの菌株は腸病原性菌株の遺伝的操作によって生産される腸病原性菌株の 無毒性派生物とするのに好ましい。ペヤーズパッチに付着し、侵入しそこで生存 し、よって直接１ｇＡの生産を刺激する菌株か最も好ましい。動組み換えＤＮＡ 技術は全十分に良く知られており日常の手順として考えられるよ・うに広く広ま った。非常に一般的で広い用語において、この方法は、遺伝物質か又はより通常 には遺伝物質の部分の、その転移された遺伝物質かそれか転移された先の生体の 遺伝物質の一部となるように一生体から第２の生体への転移よりなる。これは通 常最初の核外遺伝子又は親染色体のいずれかからの親生体からのＤＮＡの小さい 破片の獲得よりなる。核外遺伝子（又は染色体外要素と称される）はその細胞の 染色体から物理的に分離された遺伝単位である。ＤＮＡはとのようなサイズのも のでもよくしばしば特定のベースベア部位においてＤＮＡ分子を分割するように 作用する制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用によって得られる。組み換え分子を 形成するだめの核外遺伝子、ファージ又はコスミノドベクターへの結さつに続き その組み換え分子はエレクトロポレーションを含む形質転換（外部環境からの裸 のＤＮＡの取込みてあり、それはカルシウムイオンのような様々な因子の存在に よって人為的になされ得る）のような様々な手段によって宿主細胞に転移さｎ得 る。組み換えＤＮＡか形質導入ファージのようなファージ又はコスミットベクタ ー内でパッケージさｎる形質導入等の他の方法も又適用可能である。一旦組み換 えＤＮＡかキャリア細胞内にあると、それは分離された破片（一般に完全な伝達 された核外遺伝子の真）として存在し続は得るか又はそれは宿主細胞染色体へ挿 入され細胞分裂の間のその染色体を用いて再生されて得る。

転移遺伝物質は相対的にまっすぐであるが、結果的にどの転移がイクスプレスさ れた遺伝子に到るのかを予測することは未だに可能ではない。この選択過程は、 しかし、本発明に対してとのような困難も与えない。宿主微生物か転移された遺 伝子をイクスプレスしそれによって抗原を生産しなければならないことから、「 ショットガン」アプローチかうまくゆく。抗体は所望の抗原、例えば病原微生物 からの細胞膜の破片に対して標準の技術によって最初に生産される。その抗原の 源である生体からのＤＮＡはエンドヌクレアーゼによって多数破片へ分割され、 そしてその破片はランダムに病原抗原に対する抗体を用いたそれらの反応によっ て容易に確認し得病原から抗原をイクスプレスするキャリア微生物に挿入される 。抗原イクスブレッノング微生物は選択され所望の組み換え生体を与えるために クローンされ辱る。ンヨットガンクローニングは良く知られており、マニチアテ ィス、Ｔ９、他、分子クローニング、第２版、コールドスプリングハーバ−研究 所（＋９８９）において詳述されており、それはここで引用によって合体される 。遺伝子転移の技術は本発明の部分として考慮されず、無毒性微生物においてイ クスブレスされる生体からの遺伝子よりなる組み換え生体を生産し得るとのよう な方法も十分である。

その種か通常遺伝情報を交換する場合接合、形質転換又は形質導入等の遺伝子転 移のより古典的方法か使用され得る。

無毒性微生物の派生物は又本発明の範囲内にあると熟慮される。

派生によって性的、無性的に派生される後代及び単−又は多数ベースｉ換、遺伝 子欠失、挿入又は８！能的アデニル酷シクラーゼ及び／又はｃＡＭＰ受容タンパ ク質及び／又はＣｄｔ遺伝子のイクスブレソノヨンの自然に発生する毒性核外遺 伝子を用いた又は用いない生産に対する無能性を保育する逆位を含む無毒性菌株 の突然変異株か意味される。例えば４０６２及び４０６４のような菌株はここで 菌株をか従う経口接種を介して菌株に追随するための便利な標識として使用され てきたナリジクス酸耐性を与えるｇｙｒＡ突然変異をキャリーする。しかし、薬 剤耐性はワクチンとして素養される菌株子をキャリーする親菌株上に増殖された ファージ溶解産物を用いた形質導入によるＴｎｌＯの除去によって容易に除去さ れ得る。

必要な供与量はその遺伝子産物の抗原性によって異なるてあろうし単に存在する ワクチンの免疫応答典型を誘発するのに十分な量であることか必要とさねるてあ ろう。日常の実験はそのｌ・要な量を容易に確立するであろう。多数倍の供与量 か所望レベルの防御の提供に必要なように使用される。

製薬のキャリア又はそこでそのワクチンか懸濁又は溶解する賦形剤かとのような 溶剤又は個体であり得又は接種された動物に対して無害でありキャリア生態又は 抗原性遺伝子産物と適合する物質において包囲され得る。適当な製薬のキャリア か技術において知られておＩ入例えば通常塩類液及び生理的濃度における又はそ れに近い濃度における他の無害塩等の液体キャリア、及び滑石又はショ糖等のそ して飼養又は農場動物へ又合体され得る個体キャリアを含む。望ましければアジ ュバントを抗原性の増強のために付加され得る。気管支を介した投与に使用され るとき、ワクチンはエアロゾルの形であることが望ましい。適当な製薬キャリア 及びアジュバント及び供与様式の準備か、例えはレミングトンの製薬化学、第１ ７版、（ゲナロ、Ｅｄ、、マック出版会社、イーストン、ペンシルバニア、１９ ８５）に説明されている。

病原派生遺伝子産物を用いた免疫化は又は病原からの組み換え遺伝子によってス ペシファイされた遺伝子産物をイクスプレスするキャリアとして作用する病原微 生物の無毒性派生物を用いた前の免疫化に関連して使用され得る。そのような腸 管外免疫化はその病原派生遺伝子産物に対する分泌免疫系かＧＡＬＴ又はＢＡＬ Ｔのリンパ系細胞を刺激するためのその病原派生遺伝子産物をイクスブレッソン グするキャリア細胞を用いた免疫化によってプライムされるやいなや分泌免疫応 答のイクスプレッションを増強するブースターとして役に立ち得る。その増強さ れた応答は第２の、ブースター、又は既住応答として知られその結果宿主の延長 された免疫防御がなされる。ブースター免疫化は育益な結果と共に多数回繰り返 され得る。

上記の開示は本発明の詳細な説明する。引き続くここに単に例証の目的で提供さ れ特記されない限り限定か意図されない特定例の参照によってより完全な理解か 得られ得る。

本例はｃＡＭＰ合成に影響を及ぼす遺伝子欠失突然変異の導入による無毒性最近 の分離及び利用及び表現型の安定、完全無毒性及び高免疫原性を与える突然変異 を用いた菌株の確認を説明する。

細菌菌株。大腸菌及び不ズミチフス菌菌株か表１　Ａ、及び已に記載される。そ れらは５％グリセロールを含む１％バクトーペプトン内に懸濁され一７０６Ｃで デユープリケードにおいて貯蔵のためにトライアイス−エタノールで高速凍結さ れ更に又通常使用のために一２０６Ｃで貯蔵するために５０％グリセノールを含 む１９６ハクトーベブトン内て懸濁される凍結培養として保存された。

培地。通常培養のための複合培地はＬ肉汁（レノノクス、ウィル９５７））であ った。ディフコ寒天かルリア肉汁にヘース寒天に関して］２９ｆ、及び軟寒天に 関して０．６５′％付加された。ペナセイ寒天か細菌の通常のエニニメレーンヨ ンのために使用された。醗酵か適当な炭水化物の１％最終濃度を用いてマツコン キーヘース寒天又はニオシンメチレンブルー寒天（カーティス、遺伝学　５８： ９−５４．　（１９６８））の補足によって評価された。

合成培地は最小液体（Ｎ・ｆＬ）及び前述（カーティス、バクチリオル　８９・ ２８−４０．　（＋９６５））の如くの適正レベルでの栄養素を用いて補足され た最小寒天（ＭＡ）であった。ゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）（カ ーティス、１９６５　前に）か通常希釈液として使用された。

形質導入。細菌ウィルスＰ２２ＨＴｉｎｔか通常標準方法（ダビス池、「人、ゲ 不ツトに関して　Ｅｎｇ、Ａｄｖ　細菌遺伝学Ｊ０コールトスプリングハーハー 研究所、コールドスプリングハーバ−１ＮＹ、（１９７９））を使用した形質導 入に関して使用された。供与菌菌株の夜通しの培養は予め温められたルリア肉汁 に１２０で希釈され、３７°Ｃての振どうを用いて６０分間成長させられそして ０．０１の多重度てＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて感染させられた。

その感染交合は略１５時間夜通し振とうされ、クロロホルムか３７８Ｃで更に１ ０分間の振どうを増して許容し、懸濁かセントリフユージ（ツルパル　ＲＣ５Ｃ ，５Ｓ−３４０−ター、７，０００ｒｐｍ、１０分間）し細菌デブリを除去した 。ファージ（ｃａ、１０　”／ｍ　］　）を含む上澄み　か４°Ｃでクロロホル ム上に貯蔵された。１２５μｇ／ｍＩの濃度に対するテトラサイクリンかＴｎｌ Ｏ挿入及びＴｎ　Ｉ　Ｏ−誘発突然変異の形質導入の選択に使用された。

よって説明された培地及び方法か使用された。ＴｎｌＯ誘発突然変異は３７８Ｃ で１２．５ｍｇ　テトラサイクリン／ｍｌを含むＬ肉汁内て略５ｘｌＯ’　ＣＦ Ｌ／ｍｌまで夜通し成長した。培養はそこて略２ｘｌＯ’力価までテトラサイク リン無しの予め温められたし肉汁に１．４０希釈され３７°Ｃて通気された。Ｂ ＳＧで希釈された適当多数の細胞（即ち、１０７乃至１０８）かフザリク酸含入 培地上に載置され４８時間３７°Ｃてインキニーベートされた。フザリク酸耐性 隔離集団か同し選択培地上で精製された。単一隔離集団か採集され成長させられ そして１２５μｇテトラサイクリン／ｍ］を用いて及び用いずベナッセイ上でテ トラサイクリン感受性に関して試験された。

マウス。雌ＢＡＬＢ／ｃ　マウス（生後６乃至８週間）（サク゛人オマハ、ＮＢ ）か感染性及び／又は免疫化実験に関して使用された。

動物は実験に使用される前に１週間隔離室に置かれる。実験マウスはワイヤフロ アを用いたナルゲ不フィルター力バードケージに置かれた。食料と水は不断で与 えられた。動物室は２２乃至２３°Ｃで１２時間照明で保持された。

動物感染性。旦　タイフィムリウム菌株の毒力は経口（ｐ、。

）又は腹腔内（ｉ、ｐ、　）接種に従って決定された。マウスにおける接種に関 する細菌はＬ肉腫内て３７°Ｃでスタンディングカルチャーとして夜通し成長さ せられた。これらの培養は予め温められたし肉腫に１５０希釈され略０，８乃至 １．０のＯＤ、。。まて３７°Ｃて略４時間通気された。その細胞はＢＳＧにお ける懸濁に続くツルパルＲＣＴＣ遠心器において４６Ｃで１０分間、７，０００ ｒｐｍ、ＧＳＡローターての遠心沈澱法によって５０フオルト濃縮された。力価 決定に関してベナッセイ寒天上にそしてＣｙａ／Ｃｒｐ表現型を確かめるために １％マルトースを用いたマツコンキー寒天上に適当な希釈溶液か置かれた。Ｓ、 タイフィムリウムを用いた全てのｐ、ｏ　接種に関して、マウスは感染の前に４ 時間食料と水か与えられなかった。それらはそして３０ｍ１ピペツトマンＰ２０ を使用したＢＳＧ内に懸濁された２０μｍのＳ、タイフィムリウムのｐ、Ｏフィ ーディグのＩＯ乃至１５分前にピペットマンＰ２Ｏ０を使用して］Ｑ％（ｗ／ｖ ）重炭酸塩ナトリウム３０ｍ１か与えられた。食料と水は経口接種の３０分後に 戻された。マウスの罹患率及び死亡率か３０日の間観察された。アンプァステッ ドＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内接種が２６ゲージ３／８”ニードルを使用してＢ ＳＧに希釈された１００μｍのＳ　タイフィムリウム細菌懸濁を送出するために 実行された。マウスの罹患率及び死亡率は３０日の間観察された。

親菌株を用いた１０７乃至１ｏ“倍ＬＤ、。供与量をｐ、ｏ　経路にて３１日に 挑戦させられた。その後、マウスのグループは様々な毒性突然変異株の供与量に よって経口的に免疫化されそして最初の免疫化の後に様々な倍数で様々な供与量 の毒性野性型親細胞に挑戦させられた。罹患率及び死亡率は実験の間通して及び 野性型親による挑戦の後生なくとも３０日の間観察された。

Ｓ　タイフィムリウム菌株のΔｃｙａ−１２及びΔｃｒｐ−１１突然変異を用い た分離。野性型、マウスパノセージト毒性Ｓ　タイフィムリウムＳＬ＋３４４菌 株は遺伝的に下記の如くにカーティス及びケリー（＋９８７）によって説明され たものと同様に古典的遺伝的方法を使用してモディファイされた。手順は００１ ０３７からの元のｃｒｐ−７７３：　：ＴｎｌＯ突然変異及びＰＰ　Ｉ　ＯＯ２ からそして最も大きい遺伝子型安定ばかりてなくマウスにおける完全な無毒性及 び最も高度な免疫原性のだめの多数の独立フザイク酸耐性、テトラサイクリン感 受性遺伝子欠失突然変異株のスクリーニングよｐ−７７３：　：Ｔｎ　ｌ　Ｏ突 然変異を含む旦、タイフィムリウム菌株ＰＰｌ００２上での他の溶解産物の最初 の製造によって促進される。

ドースネガティブ表現型に関するスクリーニングを用いてテトラサイクリン耐性 へ形質導入するのに使用される。そのファージ細菌感染混合は１２．５μｇテト ラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマツ コンキー寒天（ディフロ研究所、デトロイト、Ｍ＋）上に筒布される前に３７° Ｃで２０分間インキュベートされた。３７°Ｃての略２６時間インキュベーショ ンの後、Ｐ２２ＨＴｉｎｔ　（ＰＰ１０３７）−χ３３３９惑染の結果得られた テトラサイクリン耐性、マルトースネガティブコロニー及びＰ２２ＨＴ上立工（ ＰＰ１０３７）−χ３３３９惑染の結果得られたテトラサイクリン耐性、マルト ースネガティブコクニーが０５ｍ１ＢＳＧへ採集され同し選択培地上に線条接種 された。結果的４へ　）　。

れた。復帰突然変異体及び突然変異株は４８時間成長期間の後°に検出されなか った。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株かテトラサイクリン感 受性野性型親菌株に関して観察され得たよりも高頻度でフサリフ酸耐性ΔＣｙａ 及びΔｃｒｐ突然変異株から回復され得たかとうか１こ関して研究かなされた。

全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変 異株は観察されなかった。

性及び外皮（スクラフィ対円滑）の外観、食欲、活動性（高低）によって示され る如くの病気症候学を決定するために経口的接種によってＢＡＬＢ／ｃマウスに おいてスクリーニングされた。グループ当たり５匹のマウスか独立したΔｃｙａ 又はａｒｐ遺伝子欠失突然変異株の各々の略］　０’　ＣＦＵを用いてｐ、ｏ、 接種された。動物は上記判断基準て採点され３０日の実験で生存者は野性型毒性 親菌株χ３３３９のＩＯ”ＣＦＵを用いて挑戦させられた。ｃｙａ又は二二二遺 伝子欠失突然変異株によって感染された２０グループの内の３つにおいて、５匹 のマウスの内の５匹かΔｃｙａ−１２，Δｃｒｐ−Ｉｆ及びΔｃｒｐ−１０突然 変異株による感染にもかかわらず生存し又野性型挑戦の１０″Ｌ　Ｄ　ｓ　０に 対して完全に防護された。

特に−グループ、Δｃｒｐ−ＩＱ突然変異株、は無毒性、免疫原性及び安定性に おいて匹敵するものかなかった。これらの実験の後、マウスはΔｃｒｐ−１０突 然変異株（例３９表６参照）のｐ。

又は１　ｐ、を与えられたとのような供与量によっても全く影響を及はされてい ないよってあった。

ｉＲＩＥ子娶であると判断された。３つの菌株の表現型特性上のデータは表２に 示される。表３は毒性野性型膜χ３３３９及び夫々ｃｙａ：：Ｔｎ工旦及びｃｒ ｐ−７７３：　：ＴｎｌＯ突然変異を用いたχ３６０４及びχ３６０５菌株を用 いた結果の比較におけるこれらの菌株の無毒性及び免疫原性上のデータを示す。

親χ３３３９におχ３６２２要求上て課された。この観察に関するベース及びΔ Ｃｒ例２ 本例は無毒性網ｌの構造を遺伝子欠失突然変異影響ＣＡＭＰ合成の導入及び表現 梨の安定性、完全無毒性及び高免疫原性に関する二つの遺伝子欠失突然変異を用 いた菌株の利用と特徴付けによって説に記載されている如くである。

培地。細菌の通常培養、エニニメレーション及び確認に関する複合培地は例Ｉに 説明されている如くである。

Ｔｎ　Ｉ　Ｏの損失に関する形質導入及びフザリク酸選択。培地及び方法は例１ に述へた如くである。

動物感染及び防護免疫の評価。Ｓ、タイフィムリウム菌株の毒性及び免疫原性は 例１にて説明された如く決定された。

よって得られるよってある。５Ｌ１３４４（χ３３３９）、ＵＫ−１（χ３７６ ］）及び７９８のようなこれらの高病原性Ｓ、タイフィムリウム野性型菌株の選 択に関する判断基準はマウス毒性アッセイ、抗生物質感受性、毒性核外遺伝子の 保有、遺伝的操作（細菌ウィルスＰ２２ＨＴｉｎｔ又はＰ１惑受性、形質転換能 力及び動員された核外遺伝子を受け取る容易性）の容易性、及びコリシン感受性 において低ＬＤ、。値（表４参照）を含んだ。

野性Ｙ毒性Ｓ　タイフィムリウム菌株５ＬＩ３４４（χ３３３９）、７９３及び ＵＫ−１（χ３７６１）はカーティス及びケリー（１９８７）において記載され たものと同様の古典的遺伝的方法を使用して遺伝的に下記の如くに一時的変異さ れた。手順はＳ　タイｙ　ａ　−１２又はΔｃｒｐ−ｚ突然変異の近くてトラン スポゾンエされ特徴付けられた一ニエ２−及び且ヱ且遺伝子の動員遺伝子欠失及 び連鎖された形質の高毒性旦、タイフィムリウム菌株ＵＫ−］　χ３７６１．７ ９８及び５ＬＩ３４４　χ３３３９へのテトラサイクリン耐性に関する選択及び マルトース負表現梨に関するスクリーニングを用いたＰ２２ＨＴｉｎ工媒介形質 導入を介した形質導入よりなる。何れの挿入も単独では旦　タイフィムリウムの 毒性に影響を与えない。

連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の遺伝子導入はΔｃｒｐ−１１及 びｚｉｃ−１４３１：　：Ｔｎ上且突然変異を含む旦。

タイフィムリウム菌株χ３７７３上の高力価細菌ウィルスＰ２２ＨＴ上ユニ溶解 産物及びΔｃｙａ−１２及びｚｉｄ−６２：：Ｔｎｌ且突然変異を含む旦、タイ フィムリウム菌株χ３７１１上の池の溶解産物の最初の製造によって促進された 。その結果得られたＰ２２ＨＴｉｎ工溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主 菌株χ３３３９．７９８及びχ３７６１へ形質導入するために使用された。

旦、タイフィムリウムχ３７７３　（Δｃｒｐ−ＩＩ　ｚｈｃ−１４３１：：Ｔ ｎ上旦）上で増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔはＭａｌ−に関するスクリーニングを 用いて毒性菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用された。ファー ジ−細菌感染混合は１００μｍサンプルか１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ によって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマツコンキー寒天（ディ フコ研究所、デトロイト、Ｍｌ）上に塗布される前に３７８Ｃで２０分間インキ ュベートされた。３７’Ｃで略２６時間インキュベートの後、テトラサイクリン 耐性Ｍａｌ−形質導入体が同し培地上に採集され精製された。結果的に得られた ７９８派生物はχ３８２５と称されＵＫ−１派生物はχ３８２８と称された。菌 株χ３７７３゜χ３Ｂ２５及びχ３８２Ｂは遺伝子型ΔＣｒ１）−１１ｚｈｃ− １各々はセラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１１０希釈され、各々の １００μｍはフサリフ酸倉入（ＦＡ）培地（マロイ及びアン、１９８＋）上に塗 布され、そのプレートは３７８Ｃて略３６時間インキュベートされた。各菌株の フサリフ酸耐性コロニーは０．５ｍｌ　ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に精製され た。精製されたフサリフ酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃて成 長させられＴｎｌＯ（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳの存在及 び栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は双方か遺伝子型Δｃｒｐ −］１　Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ上旦〕の遺伝子型を有するχ３８７６ （７９８）及びχ３９５４（ＬｉＫ−］）及びχ３６２３　（ＳＬ１３４４　Δ ｃｒｐ−１１は元々例１にて説明したりａくに分離された）（表１．　Ｂ、　） と称された。

Ｃｙ　ａ−及びＣｒｐ−突然変異株の表現梨は同じ（Ｎ（ａｌ−、ＳｔＭ、Ｍｔ ｌ−、他）であるので、クローンされたｃｒｐ−遺伝子をキャリーしアンピシリ ン耐性（シュローダ−及びドブロゴマツ、Ｊ　ハクテリオル　１６７：６１６− ６２２　（１９８６））を与える、核外遺伝子、ｐｓＤ］ＩＯ，かΔｃｙａ突然 変異の確認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時 的にΔｃｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３６２３．　χ３８７６ 及びχ３９５４のＬ肉汁成長培養はＳ　タイフィムリウムχ３６７０上に増殖さ れたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐｓＤｌｌｏを 含む（表ＩＢ、）。選択はマツコンキー寒天−１％マルトース＋１００μｇアン ピシリン／ｍ１上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピンリン耐性、Ｍａｌ ”コロニ一つ・採集されマンコンキー寒天＋１％マルトース寒天↓１１００ｕア ンピノリン／ｍｌ上に精製され双方か遺伝子型Δｃｒｐ−１±　Δ（ｚｈｃ−１ ４３１：：ＴｎｌＯ）ｐｓＤｌｌｏ”を有するχ３９３８　（７９８）及びχ３ ９６１　（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δｃｒｐ−１］　ｐｓＤＩ］０”を有する χ３７７４　（ＳＬＩ３４４）と称された。

菌株χ３７７４．　χ３９３８及びχ３９６１はＬ閂汁＋１１００ｕアンピンリ ン／ｍ＋において成長させられ連鎖されたΔｃｙａ一旦及びｚｉｄ−６２：　： ＴｎｌＯ突然変異を導入するために各々は独立してχ３７１１上に増殖されたＰ ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入さｎた。その形質導入混合はマツコンキー寒天 ＋１％マルトース÷１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイク リン／ｍｌ上に載置された。アンビンリン耐性（ｐＳＤＩＩＯ゛）、テトラサイ クリン耐性（ｚｉｄ−６２：　：ＴｎｌＯ）、Ｍａｌ−（Δ三二且）コロニーか 採集されマツコンキー寒天÷１％マルトース÷１００μｇアンピッリン／ｍ　］ 　＋　１２．　５μｇテトラサイク’Ｊン／ｍｌ上で精製された。精製されたコ ロニーはＬ肉汁ｉ：採集され混濁に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ及び栄 養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は双方が遺伝子型Δ ｃｒｐ−ＩＩ　Δ（ｚｈｃ−！４３１　：　：Ｔｎ上旦）ｐｓＤＩＩＯ゛Δｃｙ ａ−＋２　ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ上旦を有するχ３９７８（７９８）及びχ３９ ６２　（ＴＪＫ−１）並びに遺伝子型Δｃｒｐ二上±　ｐｓＤｌｌｏ”Δｃｙａ −１２ｚｉｄ−６２：：Ｔｎｌ旦を有するχ３９３６　（ＳＬＩ３４４）と称さ れた。χ３９３６゜χ３９７８及びχ３９６２の培養はＬ肉汁＋１００μｇアン ピシリン＋１２５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、Ｂ ＳＧに１　ｌｏ希釈され、そして各培養の１００μｍサンプルかフサリフ酸含入 培地上に塗布され３７９Ｃて略３６時間インキュベートされた。各菌株のフサリ フ酩酊性コロニーが採集されＦ、へ培地上に精製された。精製されたＦＡ耐性コ ロニーはし肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ工旦（テトラサイクリン 感受性）の損失、完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関してチェックされた。ｐｓ ＤＩＩｏｔｌ外遺伝子はｐｓＤＩＩＯを消去するために二つの過程を必要とする ５Ｌ１３４４派生物を除いてその結果アンピンリン感受性を得るこの過程の間た いてい菌株から自然に失われた。

ｉｐｋ後の菌株は双方か遺伝子型Δｃｒｐ−ＩＩ　Δ（ｚｈｃ−＋４３１：：Ｔ ｎｌｏ）Δｃｙａ−＋２　Δ（ｚｉｄ−６２：　：ＴｎｌＯ〕を育するχ４０３ ９　（７９ｇ）及びχ３９８５（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δｃｒｐ−ＩＩ　Δ （ｙａ−１２Δ（ｚｉｄ−６定性を決定する方法は例１に説明した如くである。

△ｃｙａ　ΔＣｒｐ突然変異による全ての遺伝子型及び表現型形質は運動性を除 いて完全に安定である。機能的べん毛の合成及び運動性の表出が野性盟二ヱ上及 びユニ２遺伝子機能に依存しているとはいえ、ｌ１！（構成性へん毛合成）遺伝 子における抑圧遺伝子突然変異かへん毛合成及び運動性かｃｙａ及びａｒｐ遺伝 子機能から独立するように容易に選択され得る。旦、タイフィムリウムΔＣｙａ 　Δｃｒｐ菌株に３いて、運動型突然変異株は菌株構成過程間ですでに選択され た。へん毛抗原への免疫は防護的であり得るので全てのワクチン菌株の運動型突 然変異株か選択された。

Ｓ　タイツイム・ノウムグループＢ　〇−抗原合成は抗血清を用いたスライド凝 集（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術に よるＰ２２ＨＴｉｎｔ細菌ウィルスによって確認された。

二つの突然変異株菌株の様々な炭素源上での砂糖の醗酵及び成長は表２に記載さ れた如くのΔｃｒｐ又は△ｃｙａ単独を用いた菌株に対して等しい。表現型は環 状ＡＭＰに関する要求及びカタホリック活性に関する環状ＡＭＰ受容タンパク質 の発行された報告書に基づくことか期待される９口くのものであった。

フサリフ酸耐性テトラサイクリン感受性派生物の選択に続く構成における核過程 において、テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株か親テトラサイク リン感受性野性嬰菌株に関して観察され辱たより高頻度で回復され得たかに関す る研究かなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰 突然変異体／突然変異株は観察されながった。

マウスに関する突然変異株菌株の毒性。Ｓ　タイフィムリウムの毒性上の予備情 報は個体マウスを１０’突然変異株細胞を用いて経口的に感染させ罹患率及び死 亡率を記録培地することによって得ら口約に感染させられたマウスの罹患率及び 死亡率のデータを示す。

無毒性突然変異株を用いた免疫化の可動性。表５はＳ、タイフィ量１０“倍を用 いた経口挑戦に対する免疫を誘発する能力上のデータを示す。これらの高供与量 挑戦の下で、健康を！！！持し食し正常に成長したχ４０３９を用いて免疫化さ れたマウスを除いて多くのマウスか減少した食料消費と共にがなりの病気である ことを示してぃ例３ 伝子を色合する遺伝子欠失突然変異を所存する無毒性細菌の分離を示す。

細菌菌株。使用される大腸菌及び不ズミチフス菌菌株は表１．Ａ。

及び已　に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１にて説明した如 くである。

培地。通常の細菌の培養、エニュメレーション及び確認に関する複合培地は例】 にて説明した如くである。

形質導入及びＴｎｌＯの損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて 説明した如くである。

動物感染及び防護的免疫の評価。Ｓ、タイフィムリウム菌株の毒性及び免疫原性 は例１にて説明した如くに決定された。

Δｃｒｐ−ＩＣＩ突然変異を用いたＳ　タイフィムリウムの分離。

例１にて説明した如く、１０のΔＣｒｐ突然変異の内の−か（ａｒｇＤの遺伝子 欠失による）アルギニン及び（ｃｙｓＧの遺伝子欠失による）システィンに関す る栄養素要求性を与えるＸ３６０５において分離された。旦、タイフィムリウム ５Ｌ１３４４菌株χ３６２２における突然変異は元々Δｃｒｐ−ＩＱとして参照 されていたか、システィンに関する栄養素要求性のために今はΔ（ｃｒｐ−ｃｙ ｓＣ）−１０と称される。１０”Ｘ３６２２細胞を用いて経口的に感染された５ 匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのグループは健康を維持し総合的に影響を及ぼされなか った（表３）。更に、これらのマウスはｌＯＩ親χ３３３９細胞を用いた経口挑 戦に対する高レベルの免疫原性を得た（表３）。

菌株の系列はＸ３６２２の表現型特徴の各々を独立して評価するように構成され た。クローンされたａｒｐ”遺伝子をキャリーしアンピンリン耐性（シュローダ −及びトゴロゴッツ、Ｊ　バクテリオｐｓＤ］　Ｉ　Ｏか染色体においてムユニ 二突然変異を補足するために使用された。Ｘ３６２２のＬ肉汁培養かＳ、タイフ ィムリウム上に増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて形質導入され、それは核外 遺伝子ｐｓＤｚｏを含む。選択はマシコンキー寒天＋１９４５マルトース＋１０ ０μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、アンピンリン耐性、〜（ ａ］”コロニーか採集されマツコンキー寒天十１％マルトース寒天＋１００μｇ アンピシリン／ｍｌ上て精製されＸ３７０６と称された。Ｘ３７０６は経口的に マウスに接種され膵臓から再分離された。その動物通過菌株はＸ３７３７と称さ れた。

、へｒｇ−又はＣｙｓ−栄養素要求形質を与えない二つの池のａｒｐ突然変異株 、Ｘ３６０５　（ｃｒｐ−７７３：　：Ｔｎ土旦）及びＸ３６２３（Δｃｒｐ− ＩＩ）か又、夫々、形質導入によってｐＳＤ１１０核外遺伝子を用いて補足され Ｘ３７３１及びＸ３７７４と称された。独立してｃｙｓＧ及びａｒｇ突然変異を キャリーするＳ、；に つの池の高病原性旦　タイフィムリウム菌株かΔｃｒｐ−１０突然変異の導入に よる弱毒化に関して選択された。Ｘ３７６１（ＵＫ−１）及び７９８は瀕死の馬 及びブタから、夫々時１ｘｌＯ’ｃＦＵのマウスにおけるＬＤ５゜を用いて分離 された毒性、侵入性菌株である。連鎖ミれたトランスポゾンｚｈｃ−１４３１： 　：ＴｎｌＯを用いたΔｃｒｐ−１０の形質導入かＳ、タイフィムリウム菌株χ ３７］２　（表］、Ｂ　参照）上の高力価細菌ウィルスＰ２２ＨＴｉｎ　を溶解 産物の最初の製造によって促進された。そのファージ溶解産物はそこで遺伝的形 質を野性梨宿主菌株χ３７６１及び７９８へ形質導入するのＣ：使用された。テ トラサイクリン耐性コロニーウｊＭａｌ−、、へｒｇ−灸びＣｙｓ−表現型に関 して選択されスクリーンされ結果的に得られた７９８派生物はＸ４２４６と称さ れχ３７１　（ＵＫ−１）派生物はＸ４２４８　（表１）と称された。

ユニ２突然変異は一一二」５゛野性型対立遺伝子をキャリーするｐｓＤＩＩＯの Ｘ４２４６及びＸ４２４８への導入によって補足された。

Ｘ４２４６及びＸ４２４８のＬ肉汁成長培養はＳ　タイフィムリウ止χ３６７０ 上に増殖されたＰ２２ＨＴｉｎ工を用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐｓ ＤｌＩＯを含む（表１）。選択はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μ ｇアンピシリン／ｍ　］　＋　１２５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上でなされた 。２６時間後、各菌株のアンピシリン、Ｍａｌ”コロニーか同し培地上に採集さ れ精製されそして双方共か遺伝平型ｐｓＤＩＩＯ”／Δｃｒｐ−！０ｚｈｃ−］ 　４３］　：　：Ｔｎ上旦を有するＸ４２４７　（７９８）及びＸ４２６２（Ｕ Ｋ−］）と称された。

Ｓ　タイフィムリウムχ３６２２．　ｙ３７３］、Ｘ３７３７、χχ３９１０． 　Ｘ４０６３及びＸ４０７１によって経口的に感染させられたマウスの罹患率及 び死亡率上のデータを示す。菌株χ３７３７は野性盟χ３３３９親菌株に関する ＬＤＳ、供与量の１０’倍を受げたマウスに関して完全に無毒性であった。３０ 日観察期間を通してマウスは全く病気となってはいないよってあった。この実験 に間する制御として、Ｘ３６０５におけるｃｒｐ−７７３：：ＴｎｌＯ突然ＫＩ Ａ６Ｊｆ性梨Ｃｒ　ｐ　−Ｈ現型（Ｘ３７３１）へのｐｓＤｌ　１０による補足 かなされそしてマウスは感染し死んだ。略１ｘｌＯ’ｃ１１”Ｕ供与量はＸ３７ ３１及びＸ３７７４　（ｐｓＤｌ　１０”／ΔＣｒｐ−１１）によってｐ、○、 接種された５匹のマウスの内４匹を殺した。Ｃｙｓ−及びＡ１２〜表現型を用い た菌株の毒性を独立して試験するために菌株、Ｙ３９］０　（ｃｙｓＧ：　：Ｔ ｎｌＯ）、Ｘ４０６３　（ａｒｇ：　：Ｔｎよ且）及びＸ４０７１　（ａｒｇ： 　：Ｔｎｌ４０６３及びχ４０７１か同様の又はより低い供与量かｐ、０　接種 されたときに殺した。よってΔ〔ユニｐ−ｃｙｓＧ）−１旦突然変異に関する無 毒性は単にユニ二遺伝子の遺伝子欠失によるものではな（ａｒｇＤ又はｃ　ｙ　 ｓ　Ｇ座の何れかの遺伝子欠失によって与えばならない。

χ３６２２．　χ３７３７、χ４２４７及びχ４２６２を用いた免疫化の有効性 。完全毒性野性型Ｓ、タイフィムリウム細胞のＬＤ、。

供与の１０′倍を用いたその後のｐ　ｏ　又はｌ　ｐ　挑戦に対する免疫を誘発 するχ３６２２．　χ３７３７、χ４２４７及びχ４２６２の能力上のデータか 表７に示されている。野性型親菌株の過度の供与量か与えられた全てのマウスは 実験の３０日間を通して全く病気にはなっていないよってあった。よってΔ（ｃ ｒｐ−Ｃｙｓ旦〕−上皇突然変異は双方か旦、タイフィムリウムを完全に無毒性 とし高免疫原性とする少なくとも二つの遺伝子を欠失させる。

符表千６−５０１８４９　（２０） 形質導入体ｊま固し培地上に採集され精製され結果的に得られた菌株に無毒であ った。３０日間を通してマウスは全く病気ではなかった“倍によるｐ、ｏ　挑戦 に対する免疫を誘発する能力を示す。親菌株の過度の供与量か与えられたマウス は実験の間の３０日を通して全く病気て：よなう・ったようだ。

た。９．４ｘｌＯ’　ＣＦＵ　（χ３６２２）、１．２ｘｌＯ”　ＣＦＵ（χ３ ７３７）又は１．ＩｘｌＯ’ＣＦＵ（χ３３３９）によるｐ。

０　接種の野地１．　３．　５及び７日経過後に犠牲となった。グループ毎に３ 匹のマウスかランダムに選択され、安楽死させられそしてロビレンチューブ内に 載置され、ブ連鎖マンＭｉ織ホモジナイサーによって均質化されそして氷上に載 置された。希釈されない又は希釈されたサンプル（１００μｇ）は直接マツコン キー寒天÷１％ラクトース−５０μｇストレプトマイシン／ｍ１　（χ３３３９ 及びχ３７３７）上に及びマツコンキー寒天＋１％マルトース＋５０μｇストし ブトマインン／ｍ１　（χ３６２２）上に載置されそのプレートは３７°Ｃて２ ６時間インキュベートされた。そのパースペクティブ組織にお１ブる力価は各時 間間隔及びサンプリングの各時間におけるグループ毎３四のマウスに関して計算 された幾何平均に関して決定された。

この分析の結果は図１に示される。χ３６２２において付加的に弱毒化する突然 変異、それは依然としてＣｒｐ’　（ｐｓＤＩ　１０゛）派生物χ３７３７にお いて発現しているか、か効果的に深い組織を定着さてる能力を非常に減少させる ことか明らかである。△７３７ｃ′）Ｃｄｔ−表現型はΔ立二！−上土突然変異 を存する旦　ヱイフィムリウムによる又は組み合わぜられたΔｃｒｐ及びΔｃｙ ａ突然変異（カーティス及びケリー、１９８７年）によるマウスのｐ。

０、接種に引き続いて観察されるとのような膜種の不在によっても又発現させら れる。菌株χ３７３７はχ３６２２よりも速く成長した。χ３６２２における付 加的弱毒化突然変異はａｒｐ突然変異かそうであるごとくには成長率を減少させ ない。

与えられる表現型に関する突然変異の分離及び分析に基づいて５Ｃｄｔ突然変異 てもあるΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−上皇又はΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓｃ＋）−１４突 然変異の含有か主局毒化サルモネラワクチン菌株の安全性を増強しなからその免 疫原性を減少させないてあろうことは明らかである。これは非宿主種、Ｓ、タイ フィムリウム及びＳ、エンテリテイディス等の侵入性サルモネラ種はかりてはな く、Ｓ、タイフィ、Ｓ、バラタイフィ　Ａ　（Ｓ、ショットムエ豚）、Ｓ、デュ ブリン（感染牛）、Ｓ、ガリナルム、及びＳ、プロて特に重要である可能性かあ る。

例４ 本例はｃＡＭＰ合成に影響を及はす遺伝子欠失突然変異の導入及び利用及びサル モ不うの毒性を深いＭｉ織の定着に影響を及はすことによって又制御する付近の 遺伝子及び表現型の安定性、完全無毒性及び高免疫原性に関する二つの遺伝子欠 失突然変異を用いた菌株の特徴によって無毒性細菌の構造を説明する。

細菌菌株。使用される衣！！及びネズミチフス菌菌株は表１．Ａ及びＢ、に記載 さねている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１て説明した如くである。

培地。細菌の通常培養、エニュメレーンヨン及び確認は例１にて説明した９口く である。

形質導入又びＴｎ　Ｉ　Ｏの損失に関するフサリフ酸選択。培地及び方法は例１ にて説明した如くである。

Δｃｙａ−１２及びΔ（ａ　ｒｐ−ｃｙｓＧ）−１０遺伝子欠失突然変異による Ｓ　タイフィムリウム菌株の構造。効験の見地ての最良ワクチン菌株は意味ある 定着能力及び侵入性を示す高毒性菌株の弱毒化によって得られるよってある。Ｓ Ｌ＋３４４　（χ３３３９）、ＵＫ−１（χ３７６１）及び７９８等のこれらの 高病原性Ｓ、タイフィムリウム野性壓菌株の選択の基準は例２にて説明した。

野性壓、毒性旦、タイフィムリウム菌株ＳＬ＋３４Ｃ７９８及びＵＫ−１は遺伝 的に下記の如くに、カーティス及びケリー（１９８７年）にて説明されているも のと同様な古典的遺伝的方法を使用して一時的変異された。手順は（テトラサイ クリン耐性を符号化する）トランスポゾンＴｎ上皇をΔｃｙａ−１２又はΔ〔ニ ー２一旦ｙｓＧ）−１０−突然変異の近くに載置し連鎖された形質をテトラサイ クリン耐性に関する選択及びマルトース負表現型に関するスフ１３４４　χ３３ ３９へ形質導入することによってＳ、タイツイムｌＪ’７ＡｓＬ　１３４４　（ 例１にて説明した如くに）において分離され特徴付けられたｃｒλ及び立ヱ且遺 伝子の動員遺伝子欠失よりなる。

Δ（ｃｒｐ−ｃｙｓｔ）　−１０に連鎖されたｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ工上 皇びΔｃｙａ−１２に連鎖されたｚｉｄ−６２：：Ｔｎ上連鎖されたトランスポ ゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−上皇及びｚｉｃ −１４３１：　：ＴｎｌＯ突然変異を含む旦、タイフィムリウム菌株χ３７１２ 上の高カ価細菌つィルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物及びΔｃｙａ−１２及びＬ上 皇二６２：：Ｔｎ上且突然変異を含む旦、タイフィムリウム菌株χ３７１１上の 他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたＰ２２ＨＴｉ ｎｔ溶解産物はそこで遺伝的形質を野性型宿主菌株χ３３３９，７９８及びχ３ ７６１へ形質導入するために使用された。

旦　タイツイム１功ムχ３７１２（Δ〔立二λ−ｃｙｓＧ：ｌ−土Ｏｚｈｃ−１ ４３１：：ＴｎｌＯ）上て増殖されたＰ２２ＨＴｉｎｔはＭａｌ−に関するスク リーニングを用いて毒性菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使用さ れた。ファージ−細菌感染混合は１００μ】サンプルか１２．５μｇテトラサイ クリン／ｍ１によって補足された１％マルトース（Ｒ１終濃度）を含むマツコン キー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、Ｍ＋）上に塗布される前に３７°Ｃで ２０分間インキュベートされた。３７°Ｃて略２６時間インキュヘートの後、テ トラサイクリン耐性Ｍａｌ−形質導入体は同じ培地上に採集され精製された。結 果的に得られた７９８派生物はχ３７Ｔ７と称されＵＫ−１派生物はχ３７７９ と称された。

菌株χ３７１２．　χ３７７７及びχ３７７９は全て遺伝子型Δ〔旦ｒｐ−ｃｙ ｓＧ）−±Ｏｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ工上皇表１゜Ｂ　）を存する。χ３７７ ７及びχ３７７９はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて成長 させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１．１０希釈され 、各々の１００４１はフサリフ酸含入（ＦＡ）培地（マロイ及びアン、１９８１ ）上に票布され、そのプレートは３７６Ｃで１ｇ３６時間インキュベートされた 。各菌株のフサリフ酸耐性コロニーは０．５ｍ１ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に 精製された。精製されたフサリフ酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁へ３７ °Ｃて成長させられＴｎｌｏ（テトラサイクリン５受性）の損失、完全なＬＰＳ の存在及び栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は双方か遺伝子ｃ ｙｓＧ）−ｔｏ）は元々例１にて説明した如くに分離された）Ｃｙａ−及びＣｒ ｐ−突然変異株の表現型は同じ（Ｍａ　Ｉ　−、Ｓｔ＋−、ｈイ１１−、他）で あるので、クローンされたａｒｐ”遺伝子をキャリーしアンピシリン耐性ｔ性（ ンユローダー及びトブロゴッッ、ｌ　バクチリオル　工互ユ　６１６−６２２　 （１９８６））を与える、核外遺伝子、ｐｓＤｌｌｏ、かΔｃｙａ突然変異の確 認を形質導入を介して導入されたときに可能とする染色体において一時的にΔｃ ｒｐ突然変異を補足するために使用された。χ３６２２．　χ３８７４及びχ３ ８０６のＬｍ汁成長培養はＳ　タイフィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ　 ２２　Ｔ　Ｈ＋　ｎ　ｔを用いて形質導入され、それは核外遺伝子ｐｓＤＩｉｏ を含む（表１）。選択はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンビ ンリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ” コ。

ニ一つ１採集されマツフンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピン リシ／ｍｌ上にｒＲ製され双方が遺伝子型△〔ニ一旦ｙｓＧ）−上皇　Δ（ｚｈ ｃ−１４３１：　：Ｔｎ上０）ｐｓＤｌｌｏ゛を育するχ３９０１（７９８）及 びχ３９４５　（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−上Ｏｐｓ Ｄｌｌｏ”を育するχ３７０６　（ＳＬＩ３４４）と称された。

菌株χ３７０６．　χ３９０】及びχ３９４５はＬ肉汁＋１００μｇアンピンリ ン／ｍｌにおいて成長させられ連鎖されたΔｃｙａ−質導入された。その形質導 入混合はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアシ・ヒリ！ノン／ｍ 　Ｉ　＋　Ｉ　２．　５μｇテトラサイクリン／ｒｎｌ上に載置された。アンピ ノリン耐性（ｐｓＤＩＩ０ドース＋１００μｇアンピンリン／ｍｌ＋＋２．５μ ｇテトラサイクリン／ｍｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集 され混濁に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関してチェ ックされた。結果的に得られた菌株は双方が遺伝子型育するχ３９０２（７９８ ）及びχ３９５６（ＵＫ−１）並びに遺伝子型Δ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−１０ｐ ｓＤ］１０°Δｃｙａ−＋２　ｚｉｄ−６２：：ＴｎｌＯを育するχ３７２２　 （ＳＬ＋３４４）と称された。χ３７２２．　χ３９０２及びχ３９５６の培養 はＬ肉汁＋１００μｇ了ンピシリン＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにお いて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１．ｌＯ希釈され、そして各培養の１００μ ｍサンプルかフザリク酸倉入培地上に塗布され３７°Ｃて略３６時間インキュベ ートされた。各菌株のフザリク酸耐性コロニーか採集されＦＡ培地上に精製され た。精製されたＦＡ耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴ ｎｌｏ（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ及び栄養素要求性に関 してチェックされた。ｐｓＤ１１０核外遺伝子はｐＳＤｌｌｏを消去するために 二つの過程を必要とする５Ｌ１３４４及びＵＫ−１派生物を除いてこのその結果 アンピシリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に失われた。最後の菌 株は双方か遺伝子型△Ｃｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−上皇　△（ｚｈｃ−１４３１：　 ：Ｔｎｌｏ）Δｃｙａ１２　Δ（ｚｉｄ−６２：：ＴｎｌＯ）を育するχ４０３ ８　（７９８）及びχ３９５８（ＵＫ−１）並びに遺伝子を二（表１、Ｂ、）。

−２突然変異による全ての遺伝子型及び表現梨形質は運動性を除いて完全に安定 である。機能的へん毛の合成及び運動性の表出か野性型ｃｙａ及びａｒｐ遺伝子 機能に依存しているとはいえ、ｃｆｓ（構成性へん毛合成）遺伝子における抑圧 遺伝子突然変異かへん毛合成及び運動性がｃｙａ及びａｒｐ遺伝子機能から独立 するように容易に選択され得る。旦、！イフィムリウムΔｃｙａ　Δｃｒｐ菌株 において、運動型突然変異株は菌株構成過程間ですでに選択された。べん毛抗原 への免疫は防護的てあり得るので全てのワクチン菌株の運動型突然変異株が選択 された。

Ｓ、タイフィムリウムグループＢＯ−抗原合成は抗血清を用いたスライド凝集（ ディフコ研究所、デトロイト、Ｍ＋）及びルリ了軟寒天オーバーレイ技術による Ｐ２２ＨＴｉｎｔ細菌ウィルス感受性によって確認された。

二つの突然変異株菌株の様々な炭素源上での砂糖の醗酵及び成長は表２に記載さ れた如くのΔｃｒｐ又はΔｃｙａ単独を用いた菌株に対して等しい。表現型は環 状ＡＭＰに関する要求及びカタボリック活性に関する環状ＡＭＰ受容タンパク質 の発行された報告書に基づくことが期待される如くのものであった。

フザリク酸耐性テトラサイクリン感受性派生物の選択に続（構成における核過程 において、テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株がテトラサイクリ ン感受性野性型親菌株に関して観察され得たより高頻度で回復され得たかに関す る研究がなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰 突然変異体／突然変異株は観察されなかった。

例５ 本例は無毒性細菌の構造を表現塁の安定性及び完全無毒性に関して二つの遺伝子 欠失突然変異を用いてｃＡＭＰ合成に影響を及はす遺伝子欠失突然変異及び利用 及び特徴付けによって説明する。

細菌菌株。使用される不ズミチフス菌及びＳ、タイフィ菌株は表１．８．及びＣ ９に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１て説明した９口くであ る。

培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くで ある。

形質導入及びＴｎｌＯの損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例１にて 説明した９口くである。

無毒性突然変異株の遺伝的安定性。遺伝的形質の安定性の決定に関Ｔる方法は例 １にて説明した如くである。

マウス。ｔｉｃＦＷ−１マウス（１ｓ−２０ｇ）（チャールズリハー、ライルミ シブトン、ＭＡ）か全ての感染実験に使用された。

動物は実験に使用される前にＩ−Ａ間隔離室に置かれる。実験マウスはワイヤフ ロアを用いたナルゲネフィルター力バードケージに置かれた。食料と水は不断で 与えられた。動物室は２２乃至２３°Ｃて１２時間照明で保持された。

動物感染性。Ｓ　タイフィ菌株の毒力は去勢豚の胃粘素を用いて腹腔内（ｉ、　 ｐ、　）接種に従って決定された。マウスにおける接種に関する細菌はＬ肉腫内 て３７０Ｃでスタンディングカルチャーとして夜通し成長させられた。その培養 は予め温められたし肉腫に１５０希釈され略０８乃至１．０のＯＤ、。。まで３ ７６Ｃて略４時間通気された。力価決定に関してベナッセイ寒天上にそしてＣｙ 　ａ／Ｃｒ　ｐ表現型を確かめるために１％マルトースを用いたマツコンキー寒 天上に適当な希釈溶液か置かれた。

アンファステットＣＦＷ−１マウスの腹腔内接種か２６ゲージ３／８′ニードル を使用して１５％去勢豚の胃粘素（ウィルソンロット　；０３４７ＡＯＯ１）に おいて懸濁されたＳ、タイフィの５００μｍを送出するために実行された。その 粘液懸濁はＳ、タイのフェリツクアンモニウムシトレート（シグマ、Ｓｔ　ロウ イス、ＭＯ）の付加によって準備された。野性壓親のＬＤ、。値及びΔＣｒｐ− ＋１　ΔＣｒ　ｐ　−１２派生物の毒性は１０日間の罹患率及び死亡率の記録の 後に決定された。

型）及びｌ５Ｐ２８２２　（Ｅｌｕ）菌株は下記の如くにカーティス及びケリー （＋９８７）によって説明されたものと同様の古典的遺伝的方法を用いて遺伝的 に一時的変異された。ｌ５Ｐ１Ｂ２０及びｌ５Ｐ２８２２は最近チリにおける腸 チフス流行の間に分離されＳ。

タイフィの標準実験室Ｔｙ２菌株より侵入的であるよってある。それらの弱毒化 １よよってＴ７２から派生されるものより効能かあるであろうワクチン菌株を生 成する可能性かある。その構成手順はΔＣＣ二叉はΔ旦二！突然変異の近くへの （テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンの載置によってＳ、タイ フィムリウムＳＬ］３４４において分離され特徴付けられた！−２及び且ヱ立遺 伝子の動員遺伝子欠失及びテトラサイクリン耐性に関する選択及びマルトース負 表現工に関するスクリーニングを用いたＰ２２ＨＴｉｎ±媒介形質導入を介した 高毒性旦、タイフィＴｙ２．ＩＳＰ＋８２０及びｌ５Ｐ２Ｂ２２菌株へ連鎖され た形質の形質導入よりなる。

ｍ：２に連鎖されたｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎユ及び且ヱ互に連鎖されたｚｉ ｄ−６２：　：ＴｎｌＯかこの目的のために使用された。

いずれの挿入も単独ではＳ、タイフィムリウムの毒性に影響を及はさｔい。

連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔＣｒｐ−１１及び ｚｈｃ−１４３１：　：ＴｎｌＯ突然変異を含むＳ。

解産物の最初の製造によって促進された。その結果得られたＰ２２ＨＴ　ｉ　ｎ 工溶解産物はそこで遺伝形質を宿主旦、タイフィ”ｌ”ｙ２゜ＩＳＰ＋８２０及 びｌ５Ｐ２８２２菌株へ形質導入するためにＩＯの感染多重によって感染させる ために使用された。

１８２０及び１ｓＰ２８２２菌株をテトラサイクリン耐性に形質導入するのに使 用された。ファージ−細菌感染混合は１００μＩサンプルか１２．５μｇテトラ サイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度）を含むマツコ ンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、Ｍｌ）上に塗布される前に３７°Ｃ で２０分間インキュベートされた。３７８Ｃで略２６時間インキュベートの後、 テトラサイクリン耐性Ｍａｌ−形質導入体は同じ培地上に採集されｒｉ製された 。結果的に得られたＴｙ２派生物はχ３８５３と称されＴＳＰ１８２０派生物は χ４２９８と称されｌ５Ｐ２８２２派生物はχ３８５２と称された。全てのこれ らの菌株は遺伝子梨Δｃｒｐ二土±　ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ工上皇表１． Ｃ，’）を育する。

菌株χ３８５２．　χ３８５３及びχ４２９８はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサ イクリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ ＢＳＧ）へ１：１０希釈され、各々の１００μｍはフサリフ酸含入（ＦＡ）培地 （マロイ及びアン、１９８１）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃで略３６ 時間インキュベートされた。各菌株のフサリフ酸耐性コロニーは０．５ｍ１ＢＳ Ｇへ採集されＦＡ培地上に精製された。精製されたフサリフ酸耐性コロニーはＬ 肉汁に採集され混濁へ３７°Ｃて成長させられＴｎ±旦（テトラサイクリン感受 性）の損失、完全なＬＰＳ及びｖ１抗原の存在及びシスティン及びトリプトファ ン（全てのその親菌株によって要求される二つのアミノ酸）に関する栄養素要求 性に関してチェックされた。新たな菌株は全てか遺伝子にΔＣｒλ−土土　Δ（ ＩＳＰ２８２２）、χ３８７８（Ｔ）’２）及びχ４２９９　（ＩｓＰ１８２０ ）と称された（表１．Ｃ，）。

Ｃｙａ−及びＣｒｐ−突然変異株の表現型は同じ（Ｍａｌ−，５ｔｌ−、Ｍｔｌ −、他）であるので、クローンされたａｒｐ”遺伝子をキャリーしアンピシリン 耐性（シュローダ−及びトブロゴッツ、導入を介して導入されたときに可能とす る染色体において一時的にそれは核外遺伝子ｐＳＤ１１Ｏを含む（表１．　８． 　）。選択はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍ ｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ”コロニーか 採集されマツコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００χ３８７９　（ＩＳＰ ２８２２）、χ３８８０（Ｔｙ２）及びχ４３００　（ＩＳＰ＋８２０）と称さ れた。

菌株χ３８７９．　χ３８８０及びχ４３００はＬ肉汁＋１００μ質導入された 。その形質導入混合はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシ リン／ｍｌ＋１２゜５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に載置された。アンピシリ ン耐性（ｐｓＤＩＩｏｌ−（Δｃｙａ）コロニーか採集されマンコンキー寒天＋ １％マルトース＋１００μｇアンビンリン／　ｍ　１＋　１２　、ｓμｇテトラ サイクリン／ｍｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁 に成長させられその菌株は完全なＬＰＳ、■１抗原及びシスティン及びトリプト ファンに関する栄養素要求性に関してチェノ５Ｐ１８２０）と称された。χ３９ ２１．　χ３９２２及びχ４３１６の培養はＬｍ汁＋Ｉ　ＯＯμｇ４ｇアンビン リンｌ’−，１２，５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に成長させられ 、ＢＳＧに１１０希釈され、そして各培養の１００μｍサンプルかフサリフ酸含 入培地上に塗布され３７’Ｃ７略３６時間インキュベートされた。各菌株のフサ リフ酸耐性コロニーか採集されＦＡ培地上に精製された。精製さｎたＦＡｉｔ性 ココニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されモしてＴｎｌＯ（テトラサイクリ ン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、■１抗原及びシスティン及びトリプトファン に関する栄養素要求性に関してチェックされた。ｐｓＤｌ］０核外遺伝子はその 結果アンピンリン感受性を得る過程の間たいてい菌株から自然に２）、χ３９２ ７（ＴΣ−２）及びχ４３２２　（ＩＳＰ＋８２０）と称された。Ｓ、タイフィ ｖ１抗原合成は坑血清を用いたＶｉへのスライド凝集（ディフコ研究所、デトロ イト、Ｍｌ）及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるＮ″ｉｌｌ細菌ウィルス 感受性によって確認された。ヘン毛の合成は機能的ｃ　ｙ　ａ及び旦ニー遺伝子 に依存する。しかし、ヘン毛かボテンンヤリーに重要な抗原であるので、ΔＣ３ ’　ａ　Δｃｒｐ　Ｓ、タイフィ菌株の運動型派生物は、ｃｆｓ変異の故に、運 動性寒天において選択された。χ３９２６及びχ３９２７は有ペン毛及び運動壓 として分離されたか菌株χ４３２３はχ４２２２のペン毛玉運動型派生物として 選択された。

表８には砂糖の醗酵及び様々な炭素源上での成長、ＬＰＳプロフィール、Ｖｉ抗 原及び平均世代時間に関して全ての突然変異株菌株の表現型特性及びそれらの親 か記載されている。表現型は環状ＡＭＰに関する要求及びカタボリック活性に関 する環状ＡＭＰ受容タンパク質の発行された報告書に基づくことか期待される如 くのものである。

無毒性突然変異株の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与されるへき菌株は それらの無毒性及びそれらの免疫原性属性に関する完全な安定性を有しなけれは ならない。Δｃｙａ　Δｃｒｐ　Ｓ。

タイフィ菌株の５０フオルト濃縮された培養及び様々な希釈（Ｉ８１０’、１０ ’、ｌｏｓ、ＩＯ’ＣＦＵ／プレート）か０５％のそれらの成長を支えるべきて ないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、又はラムノースを 含む（要求されるアミノ酸を用いて補足された）最小寒天培地上にプレートされ たとき、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。−双プレートの内 の１セツトが紫外線照射（５ジユ一ル／ｍ２／秒）され暗かりて３７’Ｃてイン キュベートされた。プレートの他のセットは照明を用いて３７°Ｃてインキュベ ートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は４８時間成長期間の後に検出され なかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株かその親菌株に関 して観察され得たよりも高頻度で回復され得たかどうかに関して研究かなされた 。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然 変異株は観察されなかった。

マウスに関する突然変異菌株の毒性。表９はマウスχ３９２６又はχ３９２７の 何れかの略５０倍ＬＤ、。供与量の感染にもかかわらずマウスは生存するという ことを示しているデータを含む。Ｓ　タこのモデルンステムにおいて旦、タイフ ィワクチン候補の毒性を最大限にする。

特表千６−５０１８４９　（２５） 例６ 本例はｃＡＭＰ合成に影響を及はす遺伝子欠失突然変異の導入及び利用による無 毒性最近及び深い組織の定着に影響を及ぼすことによってサルモ不うの毒性を制 御する付近の遺伝子の構造を示す。

細菌菌株。使用されるネズミチフス菌及びＳ、タイフィ菌株は表１．８．及びＣ に記載されている。これらの菌株の維持及び貯蔵は例１て説明した如くである。

培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した３口く である。

形質導入及びＴｎ工上皇損失に関するフザリク酸選択。培地及び方法は例Ｉにて 説明した如くである。

無毒性突状変異株の遺伝的安定性。遺伝的形質の安定性の決定に関する方法は例 １に説明した如くである。

Δｃｙａ−！２及びΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−１０突然変異によるＳ　タイフィ 菌株の構造。Ｓ、タイフィ菌株は人に関して高侵入性である。Δｃｙａ−１２及 びΔｃｒｐ−１１突然変異を用いた旦タイフィ菌株は無毒性に見えるか、免疫原 性を妥協することなく更に安全性を増強させることは付加的弱毒化突然変異を付 加することを考えることは慎重であると見えるであろう。Ｓ　タイフスムリウそ ねを使用することを正当化した。この突然変異は又膓道及びＧＡＬＴの定着の！ 味ある減少無く不ズミチフス菌による深い組織の定着を制御するｃｄｔｉ！伝子 を欠失させる。

野性型、毒性Ｔｙ２（Ｅｌ梨）、ｌ５Ｐ１８２０　（４６型）及びｌ５Ｐ２８２ ２　（Ｅｌ梨）＠株遺伝的に下記の如くに、カーティス及びケリー（１９８７年 ）にて説明されているものと同様な古典的遺伝的方法を使用して一時的変異され た。１ｓＰ１８２０及びｌ５Ｐ２８２２は最近チリにおける場チフス流行の間に 分離されＳ　夕（７４の標準実験室Ｔｙ２菌株より侵入的であるよってある。そ れらの弱毒化はよってＴＶ２から派生されるものより効能があるであろうワクチ ン菌株を生成する可能性がある。その構成手順はΔｃｙ且又はΔ−乞工」−突然 変異の近くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンの載置に よって（例１に説明さｎたな［１＜）耐性に関する選択及びマルトース負表現型 に関するスクリーニング連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導 入はΔ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−１且及びｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ工上皇７１ １上の他の溶解産物の最初の製造によって促進された。その給入するために使用 さｎた。

旦、夕／フィムリウムχ３７１２（Δ（ｃ　ｒ　ｐ　−ｃ　ｙ　ｓ　Ｇ）−±Ｔ ｙ２．１ｓＰ１８２０及びｌ５Ｐ１８２０＠株をテトラサイクリン耐性に形質導 入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｍサンプルか１２． ５μｇテトラサイクリン／ｍｌによって補足された１％マルトース（最終濃度） を含むマツコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、Ｍｌ）上に塗布される 前に３７゜Ｃて２０分間インキュベートされた。３７°Ｃて略２６時間インキュ ベートの後、テトラサイクリン耐性Ｍａｌ−形質導入体は同し培地上に採集され 精製された。結果的に得られたｌ５Ｐ２８２２派生物はχ３７９１と称され、７ ７２派生物はχ３７９２と称されＩＳＰ＋８２０派生物はχ４３２４と称された 。全てのこれらの菌株は遺伝子型Δ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−上Ｏｚｈｃ−１４３ １：：ＴｎｌＯ（表１．Ｃ，）を育しシスティン、トリプトファン及びアルギニ ン（表１Ｃ９）に関する栄養素要求性を有した。菌株χ３７９１、χ３７９２及 びχ４３２４はＬ肉汁＋１２．５μｇテトラサイタリン／ｍｌにおいて成長させ られた。各培養はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１−１０希釈さ れ、各々の１００μｍはフサリフ酸倉入（ＦＡ）培地（マロイ及びアン、１９８ １）上に塗布され、そのプレートは３７″′Ｃて略３６時間インキュベートされ た。各菌株のフザリク酸ｍ（性コロニーは０．５ｍｌ　ＢＳＧへ採集されＦＡ培 地上に精製された。精製されたフサリフ酸耐性コロニーはＬ肉汁に採集され混濁 へ３７°Ｃて成長させられＴｎｌＯ（テトラサイクリン感受性）の損失、完全な ＬＰＳ及びｖ１抗原の存在及びシスティン、アルギニン及びトリプトファンに関 する栄養素要求性に関してチェックされた。新たな菌株は全てか遺伝子型Δ０３ （Ｔｙ２）及びχ４３２５　（ＩＳＰ１８２０）と称された。

Ｃｙ　ａ−及びＣｒｐ−／Ｃｄじ突然変異株の表現梨は同じ（Ｍａｌ−＋　５ｔ ｙ−、ｈｌｔｌ−、他）であるのて、クローンされたｃｒ６））を与える、核外 遺伝子、ｐｓＤｌｌｏ、がΔｃｙａ突然変異の確認を形質導入を介して導入され たときに可能とする染色体において一時的にΔｃｒｐ突然変異を補足するために 使用された。χ３８０２、χ３８０３及びχ４３２５のＬ肉汁成長培養は旦、と 、）。選択はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピンリン／ｍ ｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピシリン耐性、Ｍａｌ”コロニーか 採集されマツコンキー寒天＋１％マルトース寒天＋１００μｇアンピシリン／ｍ ｌ上に精製され全てか遺伝子型Δ〔ｍ：ｐ−ｃｙｓＧ）−上皇　Δ（ｚｈｃ−］ 　４３１　：・菌株χ３８２４．　χ３８４５及びχ４３３１はＬ肉汁＋１００ μｇアンピシリン／ｍｌにおいて成長させられ各々は連鎖されたΔ１質導入され た。その形質導入混合はマツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピ シリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上に載置された。アンピシ リン耐性（ｐＳＤＩＩＯ゛）、テトラサイクリン耐性（ｚ　１ｄ−６２：　：Ｔ ｎ上０）、Ｍａｌ−（Δｃｙａ）コロニーか採集されマツコンキー寒天＋１％マ ルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍ ｌ上で精製された。精製されたコロニーはＬ肉汁に採集され混濁に成長させられ その菌株は完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシスティン及びトリプトファンに関する 栄養素要求性に関してチェックされた。結果的に得られた菌株は全てか遺伝子型 Δ（ｃｒｐ−ｃ二且且〕−上皇　Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ上０）　Ｉ） ＳＤＩ　１０゛Δｃｙａ−１２ｚｉｄ−６２：：Ｔｎ工上皇育しχ３９１９（Ｔ ｙ２）、χ３９２０　（ＩＳＰ２８２２）及びχ４３４０　（ＩＳＰｌ８２０） と称された。χ３９１９．　χ３９２０及びχ４３４０の培養はＬ肉汁＋１００ μｇアンピンリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌにおいて混濁に 成長させられ、ＢＳＣに１１０希釈され、そして各培養の１００μＩサンプルか フサリフ酸含入培地上に塗布され３７８Ｃて略３６時間インキュベートされた。

各菌株のフサリフ酸耐性コロニーか採集されＦＡ培地上に精製された。精製され たＦＡ耐性コロニーはＬ肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎｌＯ（テト ラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシスティン、アルギ ニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。ｐｓＤ １１０Ｍ外遺伝子はその結果アンピンリン感受性を得る過程の間たいてい菌株か ら自然に失われた。最後の苗株は全てか遺伝子型Δ（ｃｒｐ−ａｙｓＧ）−ＩＱ 　Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：ＴｎｌＯ）Δｃｙａ−１至　Δ（ｚｉｄ−６２： ：ＴｎｌＯ）（表ＩＣ０）を有しχ３９２４（Ｔｙ２）、　χ３９２５　（ＩＳ Ｐ２８２２）及びχ４３４５（ＩＳＰＩｇ２０）と称された。Ｓ　タイフィＶｉ 抗原合成は抗血清を用いたＶｌへのスライド凝集（ディフコ研究所、デトロイト 、Ｎ４１）によって及びルリア軟寒天オーバーレイ技術によるＶｉｌｌ細菌ウィ ルス感受性によって確認された。ペン毛の合成は機能的Ｃ）・ａ及びａｒｐ遺伝 子に依存する。しかし、ペン毛かポテンシャリーに重要な抗原であるので、二Ｃ ＞’　ａ　Δｃｒｐ　Ｓ、タイフィ菌株の運動型派生物は、ｃｆｓ　（構成性ヘ ン毛合成）遺伝子（ンルハーマン及びシモン、Ｊ、ハクテリオル　１２０：１１ ９６−１２０３　（＋９７４）における突然変異の故に、運動性寒天において選 択された。χ３９４０　（ｌｓＰ２８２２）、χ４０７２（Ｔｙ２）及びχ４３ ４６　（ＩＳＰｌ　８２０）は夫々χ３９２５．　χ３９２４及びχ４２４５の ペン毛正運動梨派生物として選択された。

Δ（ａｒｐ−ｃｙｓＧ）−１旦突然変異株菌株の砂糖の醗酵及び様々な炭素源上 での成長はΔｃｒｐ−ＩＩ突然変異株菌株に関して観察されものと同様であった 。表現梨は環状ＡＭＰに関する要求及びカタポリソク活性に関する環状ＡＭＰ受 容タンパク質の発行された轄告書に基づくことか期待される如くのものである。

無毒性突然変異株の遺伝的安定性。生ワクチンとして経口投与されるへき菌株は それらの無毒性属性に関する完全な安定性を有しなけれはならない。Δｃｙａ　 △ｃｒｐ　Ｓ、タイフィ菌株の５０フオルト濃縮された培養及び様々な希釈（略 １０’、１０’、１０’　、１０ｊＣＦＵ／プレート）か０．５％のそれらの成 長を支えるへきてないマルトース、メリビオース、キシロース、グリセロール、 又はラムノースを含む（要求されるアミノ酸を用いて補足された）最小寒天培地 上にプレートされたとき、復帰突然変異体及び突然変異株は検出されなかった。

−双プレートの内の１セツトが紫外線照射（５ジユ一ル／ｍ２／秒）され暗がり て３７’Ｃてインキュベートされた。プレートの他のセントは照明を用いて３７ °Ｃでインキュベートされた。復帰突然変異体及び突然変異株は４８時間成長期 間の後に検出されなかった。テトラサイクリン耐性復帰突然変異体／突然変異株 がその親菌株に関して観察され得たよりも高頻度で回復され得たかどうかに関し て又研究かなされた。全ての場合において、そのようなテトラサイクリン耐性復 帰突然変異体／突然変異株は観察されなかった。

例７ 本例は様々な感染症に対して免疫原性するための経口ワクチンとして使用するだ めの外来の抗原をイクスブレッシングする組み換え無毒性Ｓ　タイフィ菌株の構 造を説明する。

細菌菌株。使用される旦、三ユ、冬　タイツイムｌＪ”＋ム及び旦。

蔵は例ｊて説明した如くである。

培地。細菌の通常培養、エニュメレーション及び確認は例１にて説明した如くで ある。

形質導入及びＴｎｌＯの損失に関するフサリフ酸選択。培地及び方法は例１にて 説明した如くである。

ケリー（１９８７）及びナカザワ、ケリー及びカーティス（１９８７）によって 説明されたものと同様の古典的遺伝的方法を用いて遺伝的に一時的変異された。

Δｃｙａ−１２ΔＣｒｐ−１１突然変異を含むＸ３９２７及び菌株χ４３２３の 構造は例５に説明された。

Δ（ｃｒｐ−ｃｙｓＧ）−上皇突然変異を含む菌株χ４３４６の構造は例６て説 明された。無毒性サルモネラ菌株における組み換え核外遺伝子上のクローンされ た遺伝子の安定な維持及びハイレベルなイクスプレッションは平衡致死宿主ベク ター系の使用に依存する。

これに関し、アズパーティトβセミアルデヒドデヒドロゲナーゼを符号化するａ ｓｄ遺伝子の染色体突然変異は細菌細胞壁の硬い層の重要な成分てあり動物にお いて合成されないジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）に関する真正要求を課するため にΔｃｙａ　Δ−ニエ」−突然変異株へ導入される。染色体Δｌ且旦突然変異は そこて野性ｆｆ１ａｓｄ＝遺伝子をブロセッノングする核外遺伝子クローニング ベクターによって補足それる。核外遺伝子の損失の結果ＤＡＰ無し死及び細胞溶 解か生ずる。このような平衡宿主ベクター組み合わせは免疫化された動物宿主に おいて数週間安定でありサルモネラのみてはなくクローンされた遺伝子産物に対 しても強い免疫応答を引き出す。

ｃｖａ　Ｓ　タイフィ菌株への動員よりなる。これはΔａｓｄＡｌ突炊変異の近 くへの（テトラサイクリン耐性を符号化する）トランスポゾンＴｎ上皇の載置及 び連鎖された形質の旦、タイフィ　Ｔｙ２　Δｃｙａ−１２Δｃｒｐ−ＩＩ　菌 株χ３９２７．Ｓ、９＜フィ　ＩＰＳ］８２０　Δｃｙａ−１２Δｃｒｐ−１１ 菌株χ４３２３、及びＳ、タイフィ　Ｔｙ２　Δｃｙａ−＋２　Δ（ｃｒｐ−ｃ ｙｓＧ）−上皇　菌株χ４３４６へのＰ２２ＨＴｉｎ土形質導入を介したテトラ サイクリン耐性に関する選択及びジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）負表現型に関す るスクリーニングを用いた形質導入によって完成された。ΔａｓｄＡｌへ連鎖さ れたｚｈｆ−４：：ＴｎｌＯかこの目的のために使用された。

連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠損の形質導入は△ａｓｄＡｌ及びｚ ｈｆ−４：　：Ｔｎ　ｌ　Ｏ突然変異を含むＳ、タイフィ解産物はそこで１０の 多重感染における感染及び遺伝子形質を宿主旦　タイフィ　Ｔｙ２菌株χ３９２ ７．ｌ５Ｐ１８２０菌株χ４３２３及びＸ４３４６へ形質導入するために使用さ れた。

ファージ−細菌感染混合は１００μｍサンプルか５０μｇ　ＤＡＰ／ｍ１を含む ペナソセイ寒天（ディフッ研究所、デトロイト、Ｍ■）上に塗布される前に３７ °Ｃで略２０分闇インキュベートされ１２５μｇテトラサイクリン／ｍｌによっ て補足された。３７゜Ｃての略２６時間インキュベーションの後、形質導入体は 同じ培地に採集され精製された。５つのテトラサイクリン耐性コロニーのスクリ ーニングはＤＡＰ要求て又ある５つの形質導入体の内の略４を産する。結果とし て得られた７７２派生物はＸ４２９６と称され遺伝平型Δｃｒｐ−＋１　Δ（ｚ ｈｃ−１４３］　：　：ＴｎｌＯ）　△Δ　（ｚｉｄ−６２：　：ＴｎｌＯ）　 ΔａｓｄＡｌ　ｚｈｆ−４−６２：：ＴｎｌＯ）　ΔａｓｄＡＩ　ｚｈｆ−４： ：Ｔｎ上上皇得する。菌株χ４２９６．　Ｘ４４１６及びＸ４４３４はＬ肉汁＋ ５０ｕｇ　ＤＡＰ／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌ上で成長させら れゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）＋＝＋　１０希釈されフサリフ酸 倉入（ＦＡ）＋５０μｇ　ＤＡＰ　／ｍｌ培地（マロイ及びアン、１９８＋）上 に塗布されそのプレートは３７°Ｃて略３６時間インキュベートされた。フサリ フ酸耐性コロニーは０．５ｍｌ　ＢＳＧへ採集されＦＡ＋５０μｇ　ＤＡＰ　／ ｍ１培地上に精製された。精製されたフサリフ酸耐性コロニーはＬ閃汁＋５０ｕ ｂ　ＤＡＰ／ｍｌに採集され３７°Ｃて混濁に成長させられＴｎｌＯ（テトラサ イクリン感受性）の損失、完全ＬＰＳ及び〜７１抗原の存在及びンステイン、ト リプトファン、メチオニン、スレオニン及び最小培地上のＤＡＰに関する栄養素 要求性に関してチェックされた。新たな菌株はＸ４２９７（Ｔｙ２）と称され、 遺伝子ＹΔｃｒｐ−１１Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ上上皇　Δｃ　ｙ　ａ 　Ｉ　２　△Ｃｚｉｄ−６２：：丁ｎ１Ｏ）　Δａ　ｓ　ｄＡ　］Δ（ｚｈｆ− ４：　：ＴｎｌＯ）を有し４４４＋７　（ＩＳＰ１８２０）、遺伝平型Δ（ｃｒ ｐ−ｃｙｓＧ）−１０Δ（ｚｈｃ−１４３１：：ＴｎｉＯ）　Δｃｙａ−１２△ （ｚｉｄ−６２：　：Ｔｎ±旦〕　Δａｓｄ、Ａ］　（ｚｈｆ−４：　：Ｔｎ上 上皇を存し：χ４４３５、遺伝平型Δｃｒｐ−ＩＩ　Δ（ｚｈｃ−１４３１：　 ：Ｔｎ野性型親菌株のＡｓｄ−派生物かＣｒｐ’″Ｃｙａ”ハソクグラウント対 Ｃｒｐ−Ｃｙａ−ハフ・クグラウントによるイクスプレスされる組み換え１に原 の生産の比較の目的のために構成された。Ｔｙ２Δａ　ｓ　ｄ　、Ａ　Ｉ菌株か Ｐ２２ＨＴｉｎｔ　（Ｘ３５２０）を用いたＳタイフィＴ）・２菌株Ｘ３７６９ 及び旦　タイソイｌ５Ｐ１８２０菌株Δ３７４４の同時形質導入、テトラサイク リン耐性の選択及びノアミノピメリン酸負表現型に関するスクリーニングによっ て構成された。結果的に得られた７７２派生物はＸ４４５６と称されｌ５Ｐ４は Ｌ肉汁＋５０μｇ　ＤＡＰ／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍｌで成長 させられゼラチンを用いた緩衝生理食塩水（ＢＳＧ）へ１．１０希釈され１００ μｍサンプルはフサリフ酸含入＋５０ｕｇ　Ｄ、ＡＰ／ｍｌ培地（マロイ及びア ン、１９８１年）上に塗布されそのプレートは３７’Ｃて略３５時間インキュベ ートされた。

フサリフ＠耐性コロニーかＬ肉汁＋５０μｇ　ＤＡＰ／ｍｌに採集され３７’Ｃ て混濁に成長させられＴｎｌＯ（テトラサイクリン感受性）の損失、完全ＬＰＳ 及びＶｉ抗原の存在、及びンステイン、トリプトファン、メチオニン、スレオニ ン及び最小培地上のＤＡＰに関する栄養素要求性に関してチェックされた。新た な菌株はＸ４４５７　’（Ｔｙ　２）及びＸ４４５５と称され△ａｓｄＡ１　Δ （ｚｈ種（Ｌ　Ｌ）らい患者（サシノンユ、エラセル、ソール及びクラークーカ ーティス、インフエクト、イミュン、５８．１３２７−１３３６（＋９９０）） からのプールされた血清を用いてλｇｔｌｌ：：＼・１　ラブラニの遺伝学的ス クリーニングによって確認され。りつ−ンＬ１４は略１５８及びｌ　５３　ｋＤ ａの二つのタンパク質をスヘシファイし、双方はプールされたＬＬつ者の血清（ サノノンユ他、１９９０年）において非常に強く反応する。これらのタンパク質 は又血清か独立して試験（クラークーカーティス、ソール、サノソシュ、ホセノ カー、セラ、デカルバルホ及びエラセル、微生物学におけるレス、印刷中）され るとき２１のＬＬ患者の血清の内の１４における抗原を用いて反応する。

１、Ｏｋｂ　Ｍ　ラブラエ挿入ＤＮＡ破片か、アガロースゲル電気ネ動法による 消化破片の分離によって従われる、ＥｃｏＲＩを用いた組み換えファージＤＮＡ の消化によってλｇｔｌｌクローンＬ１４から除去された。Ｍ、ラブラエ破片は ゲルから精製されＡｓｄ°ベクターｐＹＡ２９２（ガラン、ナカザワ及びカーテ ィス、濫匡ロモータと関連するのと同しｔｒｃプロモータとｌ！！連する指向に お向する指向に２いてクローンされたｐＹ、Ａｌ０７８゜ｐＹＡ　ｌ　０７７の 託分的限定マｙブか図２に示されている。双方の組み換え核外遺伝子か大腸菌に 一１２菌抹χ６０６０及びＳ、タイフィムリウム菌株χ３７３０へ形質転換され その形質転換体によってスベンファイされたタンパク質かウェスタンブロッティ ングによって分析された。クローンＩ）ＹＡ］０７７は略３０ｋＤａの単一融合 タンパク賀モスベンファイし、それはプールされたＬＬ患者の血清において抗体 に強く反応する。クローンｐＹＡ１０７８は患者の血清を用いて反応するいかな るタンパク質をもスペシフアイしない。

細菌ウィルスＰ２２ＨＴｉｎｔ溶解産物かＳ、タイフィムリウムχ３７３０÷ｐ ＹＡ１０７７及びχ３７３０＋ｐＹＡ＋０７８上に４［された、これらの溶解産 物は旦、タイフィχ４２９７．　χ４４１７、χ４４３５．　χ４４５５及びχ ４４５７を形質導入するために使用された。３つのランダムに選ばれたｐＹＡ＋ ０７７を用いたχ４２９７の各形質導入体によって生産されたタンパク質のウェ スタンプロット分析は各形質導入体はプールされたＬＬ患者の血清を用いて反応 する３０ｋＤａのタンパク質をスベシファイしたかｐＹＡ１０７８をバーバーリ ングする３つの独立χ４２９７形質同流体は遺伝学的反応性タンパク質をスペン ファイしなかった（図３）。

更に、ｐＹＡ１０７７からの遺伝学的反応性タンパク質のイクスプレッションは χ４４１７．　χ４４３５．　χ４４５５．及びχ４４５７において又示された 。図４はλｇｔｌｌ：Ｍ、ラブラエクローンＬＩ４及び旦　タイフィによって生 産されたタンパク質のウェスタンプロットを示し、旦、タイフィムリウム及びＥ 、三ｌ菌株かｐＹＡ２９２．ｐＹＡ１０７７及びｐＹＡＩ０７８をバーバーリン グしている。ニトロセルロースフィルター上のタンパク質は２１のらい種らい患 者からのプールされた血清を用いて反応させられた。正抗原抗体かサシッシュ、 エラセル、ソール及びクラークーカーティス（１９９０年）５８：１３２７によ って説明された技術によって検出された。更に個別には、第２の抗体はアルカリ フォスファターゼコンシュゲーテイド抗ポリスペシフィック抗体であり色素産生 の基質はニトロブルーテトラゾリウム及び５ブロモ４クロロ３インドリルリン酸 塩、ｐトルイジン塩であった。図のレーンは下記の通りである。（レーン１）分 子サイズ標識：　（レーン２）Ｉ）ＹＡ１０７７を用いｆ：Ｓ、　タイ’７４χ ４２９７　：　（Ｉｚ−ン３）　ｐＹＡＩ　０７７を用いた旦、タイ’：フイχ ４４１７＋（レー：／４）ｐＹＡ１０７７をχ４４５５：　（レーン１０）ｐＹ Ａ２９２を用いた旦　タイフィχ４４５７；　（レーンＩＩ）Ｉ）”１’Ａ２９ ２を用いたＳ、タイフィχ４４１７　＋　（レ−：／１２）　ｐＹＡ１０７７を 用いたＥ、コリ、￥６０９７、（レーン＋３）λｇｔｌｌ：：Ｍ、ラブラエクロ ーンＬＩ４からのタンパク質、（レーン］　４）ｐＹＡＩ　０７８を用いたＳ　 タイラクトノダーセを用いた融合タンパク質であるためサイズにおいてより大き い。

ｐＹＡ１０７７組み換えベクターを用いた旦、タイフィ菌株χ４２９７、χ４４ １７及びχ４４３５は腸チフス及びらい病に対して防護するために人を免疫価す る候補である。それらのワクチンの効験は防護免疫応答を引き出すてあろういく つかのＭ、　ラブラエ抗原につき−の′ｆｔ認及びそこで人免疫化試験において 使用され得たてあろうＳ　タイフィΔｃｙａΔｃｒｐΔＣｄｔΔａｓｄ菌株にお いてＡｓｄ−ベクターにおいてクローンされた遺伝子によってそれらをスペンフ ァイさせることに依存するであろう。

チンの安全性、免疫原性、及び効験を試験する過程を提供する。試験される菌株 は”ｒｙ２．］ＳＰ］８２０及びｌ５Ｐ２８２２のΔＣであるホランティアであ る。防護的ナランティアは研究前にスクリーンされる。スクリーニング過程は： １　医学的経歴 ２　物理的検査 ５　完全血球算定 ６　血液化学（ＢＵＮ、クレアチニン、空腹時血グルコース７　血清Ｎａ’、Ｃ ｌ−１Ｋ”、ＨＣＯ，−８、ＶＤＲＬ ９　Ｂ梨肝炎表面抗原 ］０．ＥＬＩＳＡによるＨＩＶ抗原 １１　妊娠テスト（女性） １２　肝機能テスト（ＳＰＧＴ） １３　心理学的検査及びインタビュー。

研究に参加するホランティアは一般的良好な健康を基準として選択され更に： １　胆看の病気、免疫不全、心臓血管の病気、呼吸器系統の病気、内分泌の病気 、肝炎、腎臓及び膀胱の病気の病歴を含む肝臓の病気、前立腺肥大、緑内障、消 化器系統の病気、細網内皮系の病気、神経弛緩の病気、入院を要する精神医学の 病気、薬物又はアルコール乱用の臨床的に実質的な経ｙか無く。

２、正規母集団に関して定義された限界内にある通常そして規則正しい揚習性を 持ち即ち　下剤又は下痢止め藁のしばしばの使用なしに少なくとも週に３回の便 通及び日に３回未満の便通かあり：３　アモキシリン又はシプロキサンンに対す るアレルギーか無４　ワクチン接種の前７日間に抗生物質治療の経歴か無く：５ 、陰性妊娠テスト（女性）を受１ブ：６　陰性ＨＩＶ抗体テストを受ける。

ホランティアは隔離病室に入室を許可され、そして情報提供され、立会われ、記 載された承諾か得られる。

研究設計。２２人のホランティアか研究される。基線血液及び腸液体標本か収集 される。その室での２日間の環境順化の後、空腹のホラシティ７つ１ランダムに Ｔｙ２．ｌ５Ｐ１８２０又はｌ５Ｐ２８２２のΔＣ＞’　ａΔｃｒｐ派生物のい ずれかの５ｘｌＯ’を含む重炭酸緩衝−経口供与量を用いて摂取することか許容 される。ホランティアは次の１５日間副作用に関して観察される（発熱、不快感 、悪寒、嘔吐、下痢）（腸チフスの通常のインキュベーション期間は８乃至１２ 日である）。連続した血液及び大便培養か１尋られる。更に温度の高さか１００ ．８°Ｆあるボランティアはだれても観察かなされる際に血液サンプルか採られ る：温度か１２時間このレベルに高められたままである場合、経口アモキシリン （各６時間毎に１゜０グラム）及び経ロシブロフロクサシン（１０日間、各１２ 時間毎に７５０ｍｇ）を用いた療法が開始される。十二指腸液培養が７゜１０及 び１３日での観察の期間に又得られる。

動物試験。アジュバントとしての豚胃粘素を用いた腹腔内接種によるマウスにお ける親菌株に関するＬ　Ｄ　ｓ。及び弱毒化された派生物か又決定された。

ワクチン接種物の準備。Ｓ、タイフィ候補ワクチン菌株の保存培養か、必要とな るまで一７０’Ｃて、１５％グリセロールによって補足され、トリプチケース大 豆肉汁培地（ＴＳＢ）において細胞懸濁として貯蔵された。各菌株の接種物を製 造するためにその懸濁は挑戦の三日前に解かされ羊赤血球寒天（ＴＳＡにおける ５％５ｒｂＣ）上に載置される。夜通しの３７°Ｃでのインキュベーションの後 、略２０乃至３０典梨的なコロニーか採集され塩類液において懸濁された。この せ濁はトリブチケース大豆肉汁培地上に接種され、適当に補足され、そしてその プレートは３７°Ｃて夜通しインキュベートされる。ボランティアに経口的にワ クチン接種するための準備において、これらのプレート上の成長は各プレート毎 に略３ｍｌ無菌通常塩類液を用いて収穫される。結果的に得られた懸濁は濁り分 析的に障準化される。要求されるサルモネラの濃縮を近似させるために塩類液に おいて希釈かなされた。ワクチン接種物は氷上の隔離室に移動させられた。顕微 鏡的検盃及びスライド凝集か使用前にＳ　タイフィ０及びＨ抗血清を用いて実行 された。レプリカ塗布プレート定ｌ培養か生存度及び接種物サイズの確認のため にワクチン接種の前後にその接種物から製造された。

ボランティアの接種。そのワクチンは経口経路によってＮａＨＣＯ２を用いて投 与される。ボランティアはワクチン接種前に９０分間ＮＰＯである。２グラムの ＮａＨＣ○コが５オンスの蒸留水において解かされる。ボランティアは４オンス の重炭酸イオン水を飲み、１分後ホランティアは残った１オンスの重炭酸イオン 水に懸濁されたワクチンを接種する。ボランティアは接種後９０分間食事と水を 採らない。

シスチンシー、及び説明の記録が採られる。各大便（又は大便か通過させられな い場合直腸綿棒）の標本か培養に関して収集された。

標本の体積か計測された。５点システムでグレード分けされた・グレードｌ−硬 い大便（通常） グレート２−柔らかい大便（通常） グレード３−濃い液体（異常） グレード４−不透明な水のような（異常）グレード５−米磨ぎ汁様（異常）。

静脈切開。抗体決定に関する血清かワクチン接種前及び８．２＋。

２８．６０．及び１８０日後に得られる。抗体スクリーニング細胞アッセイに関 するリンパ球分離に関するヘパリン止血は０．　４．７゜及び１０日に収集され た。０．２８，６０、及び１８０日に収集された単核細胞はサルモネラに対する リンパ球増殖性応答を査定し抗原を制御するために使用される。最後に０．２８ ．６０及び１８０日からの単核細胞は又、Ｓ、タイフィに対する抗体依存細胞毒 性アッセイ及び生体の制御において使用される。血液（５ｍｌ）が後ワクチン接 種観察期間の３．　４．　７．　８．　１０．　１２．及び１５日に培養に関し てワクチン生体の検出のために得られる。更なる血清の標本及び単核細胞か一次 ワクチン接種後１８０日に得られた。

空腸液吸引。経口ワクチン接種前及び放出の直ぐ前（１５日）。

ボランティアは局所ＳＩｇＡ抗体の測定のために腸液を収集するために口から１ ３０ｃｍの距離へポリ塩化ビニル腸チューブをのみ下す。］　Ｏｍｇのメトクロ プラミドかチューブの摂取の後にその胃から幽門を通して小腸への通過を促進す るために傾向的に与えられる。

チューブの空腹への載置は距離（１３０ｃｍ）、吸引された液体の色（黄色−緑 ）、及びｐＨ（６）によって証明される。略ｌｏｏｍ１の空腸液体か各挿管毎に 取り去られる。

ゼラチンストリングカプセル。各ワクチン菌株を用いた腸定着率の決定のため、 ゼラチンストリングカプセル（エンテロテスト）かホラ：／ティアによって入院 の期間に３回摂取された。

ボランティアはＡＭ６時からＮＰＯである。水の飲み下しは口及び喉を湿らすた めになされた。引き出されたストリングの位置を用いたカプセルはナイロンスト リングのループを保持しながら水で飲み下される。その線は顔に向かって確保さ れ、決められた場所で４時間置かれる。ボランティアは任意に水を飲むことを許 されるか、他の食料又は飲物を採ることは許されない。４時間後その線は引き抜 かれ、胆汁で染められた粘液で浸された末端部が切り取らｎ無菌ベト９皿に載置 され、それは確認のためにラベルか付けられる。そのストリングはそこで微生物 に関して大便標本を用い場合と同じ方法で培養される。

扁桃培養。扁桃リンパ組織のワクチン接種後の可能な侵入を検出するために連続 的な扁桃培養か３．　４．　７．　８．　１０　１２及び１５日に得られる。

細菌学的分析。大便、直腸綿棒、及び接種されたゼラチンカプセルからの胆汁に 染められた十二指腸ストリングの末端１５ｃｍかセしナイトＦ豊富肉汁に接種さ れる。扁桃綿棒かＧＮ肉汁に接種される。夜通しの３７°Ｃてのインキュベーシ ョンの後、副次培養か、双方共ワクチン菌株の栄養素要求性に関して適当に補足 されたＳＳ（サルモネラーンゲラ）寒天培地及びＸＬＤ寒天寒天上地上られた。

疑わしいコロニーか補足されたトリプルシュガーアイアンスラント及び旦　タイ フィＶｉを用いた凝集によってなされる確認に移動させられる。これらの隔離集 団は（例えは核外遺伝子の存在に関する又はクローン遺伝子に関する特異遺伝子 プローブを用いたササンブロソティングに関する）更なる分析のためにグリタロ ールにおいて一７０°Ｃて保管される。

血液培養（５ｍｌ）は補足されたプレインハートインフュージョン肉汁の５０ｍ １に接種される。

免疫学的分析。血清及び空腹液標本はレビン他、（１９８７年）、Ｈｌ及びＶｉ 抗原に対するＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＧ抗体に関して試験される。Ｈ抗体は又 抗原Ｓ　バージニア（Ｓ、バージニアは旦、タイフイと同一のペン毛抗原を分担 する）を使用してライダルチューブ凝集によって測定される。

周辺血液単核細胞か収集されサルモネラ抗原に対する特異な応答の研究に関して 分割される。これらは下記のものを含む。

１、抗体分泌細胞：旦、タイフィＯ，Ｖｉ又はＨ抗原に対するＩｇＧ、ＩｇＡ又 はＩｇＭ抗体を分泌するトラフィッキングリンパ球はカンテーレ他の方法によっ て測定される。

２、複製リンパ球　周辺血液単核細胞は抗原駆動リンパ球複製を検圧するために 、上述のレビン他によって説明された如くに、ヒーのしビン他で説明された如く の抗体依存細胞様細胞毒性アッセイにおいて測定される。

１多１週間以内で終わるであろうといことか予測される。排出か７又はそれ以上 の日数続いた場合、排出を続けているボランティアはツブ０フロクサシン（各１ ２時間毎に　７５０ｍｇ）供与量か与えられる。≧２連続日数間の陰性培養か放 出のために要求される。

株のマウスに於けるＬＤ、。は（去勢豚胃粘素を用いた腹腔内注射を使用して） １．８ｘｌＯ’である。

引き続く過程は本質的に前述の例８にて説明したちのてあった。

ボランティアの二つの同齢集口か異なる供与量のワクチンか与えられた研究に使 用された。その１１の研究において、１７人のボランティアか二重盲検法にてラ ンダマイズされた。６人のボランティアティアか二重盲検法にてランダマイズさ れた。６人のボランティア研究）又は２４日間（第２の研究）隔離室で厳密に監 視された。生存兆候か観察期間中各６時間毎に測定された。各ボランティアから の全ての大便はプラスチック容器に収集され、検査され、５屯スケールでグレー ト分けされ、そして大便かゆるい場合には体積か測定された。ボランティアは医 師によって毎日インタビューされ症候について尋ねられた。発熱は口腔の温度≧ ３８２°Ｃとして定義された。下痢は４８時間以内の２又はそれ以上のゆるい大 便が合計して少なくとも２００　ｍ　ｌの体積あるか又は−回のゆるい大便≧３ ００ｍ１であるとして定義された。抗生物質療法が発熱又は陽性血液培養を発す るボランティアに与えられた。

ワクチンを準備するために一７０°Ｃて１５％グリセロールを用いたトリブチケ ース大豆肉汁上で維持されてきたχ３９２７の貯蔵培養か解かされ補足されたア ロ寒天上で成長させられた。３７°Ｃてインキュベートされた後、２０乃至３０ のワクチン菌株の典型的なコロニーかアロ寒天から採集され、塩類液において懸 濁され、そして再びアロ寒天上に接種された。３７６Ｃで夜通しインキュベート された後、その細菌は食塩加リン酸緩衝液（ＰＢＳ）の３ｍｌを用いて収穫され 細菌の濃度か濁り分析的に標準化された。その懸濁の希釈かミリメーター毎の生 存可能な生体の所望の濃度を達成するためにＰＢＳにおいてなされた。接種物の 同一性は顕微鏡的検査によって及びＳ、タイフィ○、Ｈ１及びＶｊ抗血清を用い たサイト凝集によって確認された。複製塗布プレート定量培養か生存可能性及び 接種物のサイズのＷａ認のためにワクチン接種の前後にその接種物より作られた 。

ワクチン菌株はソディウムバイカーポ不一トを用いて経口経路によって投与され た。ソディウムバイカーポ不−）（２ｇｍ）は１５０ｍ１の蒸留水において解か されボランティアは胃酸を中和するために１２０ｍ１飲んだ。−分後、パイカー ボネート溶液の残りの３０ｍ１に懸濁されているワクチンを飲んだ。ボランティ アはワクチン接種の前後の９０分間飲まず食わずであった。

ボランティアによって通過させられた各大便（及び大便か通過させられなかった 場合には直腸綿棒）かワクチン菌株のために毎日培養された。大便は０．１％Ｐ ＡＢＡ及び０．　１％ＰＨＢによって補足されたグラム陰性肉汁（ＢＢＬ、　コ ツキースピル、ＭＤ）へ及び補足を用いてＳ−８寒天上に直接接種された。３７ °Ｃでの夜通しのインキュベーションの後、Ｉｇの大便が連続的に塩類液におい て１０フオルト希釈され各希釈は上記の如くに補足されたＳ−３寒天上に載置さ れた。疑わしいコロニーかトリプルソユガーアイアンア１抗血清を用いた凝集に よって確認された。

ワクチン接種の後７，１０．及び１３日に絶食しているボランティアは胆汁に染 められた十二指腸液のサンプルを収集するためにストリングデバイスを含むゼラ チンカプセルを飲み下した。４時間後、そのストリングは除去され末端１５ｃｍ の色とｐＨか記録された。十二指腸液はストリングの端から絞られ上記の如く培 養された。

ワクチン生体の培養のための血液はワクチン接種の４．　５．　７゜８、＋０． １２及び１５日後に及び発熱か発生した場合には再び系統的に収集された。血液 の５ｍｌか補足されたアロ肉汁の５０ｍ１に接種された。

更に、扁桃培養かそのワクチン菌株の検出のために］、２．　４．５、　７．　 ８．　ＩＱ、１２及び１５日に得られた。扁桃に当てられた綿棒は補足を用いた グラム陰性肉汁に２４時間及びそこで補足されたサルモ不う−ンゲラ塞天に接種 された。

免疫か九滴応答を決定するために、下記の過程か続げらｎた。血清サンプルかワ クチン接種のに前及び７．２１．２８及び６０日後に得られた。空腸液か例８に て説明した如くに、ワクチン接種の前及び１４日後に収集された。その液体の合 計のＩｇＡ含有量はＥＬＩＳＡによって測定され各標本は１００当たり２０ｍｇ のＩｇＡを含むように２２化された。Ｓ　タイフイリボ多糖（ＬＰＳ）、Ｈ。

及び■ｌ抗原か血清及び空腸において測定された。

ＬＰＳ　Ｏ抗原に対するＩｇＡ抗体かＥＬＩＳＡによって検出された。１１００ 希釈において試験された前及び後ワクチン接種血清間のネット光学濃度≧０２０ における上昇は意味のある上昇と考えられた。各マイクロタイタープレートと共 に使用された圧制圓血清はハイレヘルのＬＰＳ　Ｏ抗体を含み、Ｔ　’Ｊ　２１ 　ａワクチンによる免疫化の後に強いＩｇＧ　ＬＰＳ　Ｏ抗体応答を育した健康 な１２人のチリ人からの血清のプールを表示した。ＬＰＳ　○抗原に対するＩｇ Ａ抗体か血清の１−２５希釈から開始した２フオルト希釈を使用して測定された 。ＩｇＡ力価は４フすルド上昇か前及び後ワクチン接種過程に発生した場合意味 かあると考えられた。

Ｓ　タイフィＬＰＳ　Ｏ抗原に対する腸分泌１ｇＡ抗体か又ＥＬＩＳＡによって 測定された。４フオルト上昇は意味かあると考えられた。

Ｈ抗体を測定するために、Ｈ−ｄベン毛抗原か旦、タイフイ菌株５４１Ｔｙから 準備された。Ｈ−ｄ抗体に関する血清及び空腸液かＥＬＩＳＡによって測定され た。力価における４フすルド上昇は意味があると考えられた。

使用して実行された。

Ｖｉ抗原かＥＬＩＳＡによって血清及び空腸液において測定され、４フオルト上 昇が意味かあると考えられた。

ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＭ抗体を旦、タイフィＯ，Ｈ，又１１Ｖｌ抗原に対し て分泌するガノトデライブド、トラフィッキング抗体分泌細胞かフオレスト他（ （１９８８年）、ランセット１：８１）の方法の変更によってＥＬＩＳＡ及びＥ ＬＩＳＰＯＴアッセイの双方を使用して測定された。ヘパリン止血かワクチン接 種の前及び７及び１０日後に引き抜かれた。簡単に、フィコ−グラディエンド（ オルガノンテクニ力、デュルハム、ＮＣ）によって分離された周辺血リンパ球か 抗原塗布プレートに付加された。ＥＬＩＳＡにおいて、リンパ球によって分泌さ れた抗体の結束か結束された抗１ｇＡフンシュゲートを用いた基質の反応によっ て生産された光学濃度における変化によって測定された。ＬＰＳ、Ｈ，及びＶｉ 抗原に対するに対する意味のある応答かこれらの研究において参加しているボラ ンティアから取られた免疫化前及び４日細胞から生成されたＯＤ、プラス３３． Ｄ　にお１ブる差異を使用して決定された。ＥＬＩｓＰＯＴアッセイにおいて、 個々のリンパ球によって分泌された特ｎ’；　Ｉ　ｇ　Ａか各ウェルへのアガロ ースオーバーレイの付加及び結束された抗人１ｇＡコンジュゲートを用いた基質 の反応によって生産された色付きスポットの計数によって検出された。ワクチン 接種後のウェル毎に≧４スポットの検出は正反応として定義されコニの数はワク チン接種前に計数されたスポットの平均数プラス２ＳＤ　に基づいている。

その結果得られたものは下記の通りである。

ワクチン接種後のボランティアの臨床的兆候は二重盲検法において評価された。

菌株χ３９２７を受けた１２人のボランティアの内の一人か発熱した。このボラ ンティアはワクチン接種後２２日に最高温度４０．１’Ｃまて熱か上がった。こ のボランティアは４乃至１３日に深刻な急激な腹痛、不快感、食欲不振、頭痛、 及び嘔吐にみまわれたか、彼の発熱は２２日までには始まらなかった。彼の兆候 はそこでめまい、筋肉及び身体痛、便秘、不眠症、及び茶色の痰を生産するせき を含んだ。このグループの他のボランティアの一人は入院患者監視期間に不快感 、急激な腹痛、頭痛、及び吐き気にみまわれた。

細菌学的研究は５ＸＩＯ’を受けた６人のボランティア中の一人及びχ３９２７ の５ｘｌＯ’　ｃｆｕを受けた６人のボランティア中の一人か陽性血培養を有す ることを示した。これらは１５日及び８及び１２日に夫々発生した。これらのボ ランティアの何れもどのような兆候も育していなかった。χ３９２７を受けた１ ２人のボランティアの内の一人は１日の大便において検出されたワクチン生体の 一コロニーを有した。これらのボランティアはだれも陽性扁桃又は十二指腸スト リング培養を有しなかった。ボランティアの血及び大便から回復されたχ３９２ ７隔離集団は全てΔｃｙａΔｃｒｐ突然変異の存在に関連する予測される表現型 を保有した。

免疫学的研究はχ３９２７を受けた１２ワクチン中の６（５０Ｈ抗原又はｖｉに 対する抗体は１２人のボランティアの何れにも検出されなかった。１２人のボラ ンティア中の一人のみか空腸液におけるＬＰＳに対する分泌１ｇＡを発現した。

Ｈ抗体に対する分１．　ＩｇＡ抗体応答かたった一人のボランティアに発生しワ クチン接種後分泌抗ｖ１抗体を持つボランティアは一人もいなかった。１２人の ボランティア中の５人がＥＬＩＳＡ又はＥＬＩＳＡＳＰＯＴアッセイによって検 出されたＬＰＳに対するＩｇＡを分泌する画壇細胞を発現された。環状Ａ　Ｍ　 Ｐ　Ｋ１１節経路における遺伝子欠失によって与えられる弱毒化の度合いは突然 変異株及び親菌株を用いたボランティアの同時挑戦無しには厳密には測定され得 なかった。しかし、野性型菌株の同様な供与量か与えられたボランティアを用い た歴史的経験に基づくと、その遺伝子欠失かＳ、タイフィの弱毒化を与えるよっ てある。野性壓Ｓ、タイフィ菌株Ｔｙ２か重炭酸イオン無しに１ｘ１０７の供与 量で６人のボランティアに与えられたとき、８３％か（〉３６時間１０３°Ｆの 温度として定義される）腸チフス又は（〉５日間の低グレード発熱、意味のある 血清学的応答、陽性血培養又は旦、タイフィの排泄として定義される）感染を発 現した。対照的に、Ｔｙ２から派生されたχ３９２７ワクチンを重炭酸イオンを 用いて（重炭酸イオン無しの余程高い供与量と同等）１０４又は１０’　ｃｆｕ 供与量て受けたここで報告された１２人のボランティア中、たった−人のボラン ティアか発熱を発生したった二人のボランティアか陽性血培養を発生した。その 上、熱病にみまわれたボランティアは、発熱時に付加的に収集された血培養であ るにもかかわらず彼らの血液においてワクチン細菌か検出されなかった。発熱は ワクチンによる腸の感染によって刺激されたシトキネスの放出に対する応答にお いて発生したよってある。

例１０ 本例はΔｃｄ工突然変異を含むΔｃｒｐ−１０Δｃｙａ１２Ｓ　タイフィ構造物 の構造及び特徴を説明する。我々はＳ、タイ染病４６型隔離集団）へΔｃｙａΔ ｃｒｐ突然変異を導入した。Δｃ　ｙ　ａ　−１２及びΔｃｒｐ−１１突然変異 による前者の菌株は既に例９に説明したクロくに人ホランティアにおいて評価さ れた。５ＸＩＯ”ｃｆｕを受けた６人のボランティアの内の一人及び５ｘ１０５ ｃｆｕのΔｃｒｐ−１０Δｃｙａ−１２Ｓ、タイフィ菌株、χ３９２７、を受け た６人のボランティアの内の一人か陽性血培養を存した。これらは夫々１５日及 び８及び１２日に発生した。しかし、これらのボランティアはだれもとのような 兆候も示さなかった。更に、必ずしも全ての免疫化された個体がＳ、タイフィ抗 原に対する高力価抗体応答を発現しなかった。免疫化されたこれらの大多数にお ける防護的免疫の誘発に関するより高い経口供与量を許容するであろう更なる弱 毒する突然変異か所望される。我々は減少させられた毒性を結果的に生しよって より高い供与量を許容するはずであるΔｃｒｐ−１０Δｃｙａ−１２Ｓ　タイフ ィ菌株へ導入された更なる遺伝子欠損を確認した。この欠損は深い組織の定着（ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｅｅｐ　工１ｓｓｕｒｅ）に関してｙａΔ ｃｙａ突然変異のみによる菌株の場合よりも人の血清においてより生存できない 。それらはよってよりたやすく取り除かれるはずてあり血中にワクチンを存する 状態を誘発てきないよってある。

菌株構造。野性型、毒性Ｓ、タイフィＴｙ２　（Ｅ２塁）及びＩｓＰ＋８２０（ ４６’！り菌株かカーティス及びケリー（（１９８７年）、インフエクト、イミ ュン、５５　：　：３０３５−３０４３）で説明され、例１に説明した方法と同 様の方法による古典的遺伝学を使用して遺伝的に一時的変異された。アデニし一 トシクラーセ及び環状、へＭＰ受容タンパク質か損なわれた不ズミチフス菌遺伝 子欠失突然変異株は無毒性であり免疫原性である。インフェクト、イミュン　５ ５：：３０３５−３０４３．　（１）。その手順はトランスボを促進することよ りなる。よって我々は夫々Δｃｒｐ−１０に連鎖間する選択及びマルトース負表 現壓に関するスクリーニングを用いてＰ２２ＨＴｉｎｔを用いて連鎖された形質 を高毒性Ｓ　タイフィＴＶ２及びｒｓＰＩ８２０菌株へ同時形質導入した。

連鎖されたトランスポゾンを用いた遺伝子欠失の形質導入はΔＣｒｐ−１０ｚｈ ｃ−１４３１：　：ＴｎｌＯ突然変異を含むＳ、９にフィムリウム菌株χ３７１ ２上へ高力価細菌ウィルスＰ２２ＨＴ±ユニ溶解産物を及びΔｃｙａ−＋２　ｚ ｉｄ−６２：：Ｔｎ上上皇然変異を含む旦　タイフィムリウム菌株χ３７１１上 へ別の溶解産物を最初に製造することによって促進された。結果的に得られたＰ ２２ＨＴｉｎ工溶解産物はそこで遺伝的形質を宿主旦、タイフィＴｙ２　（χ３ ７６９）及びｌ５Ｐ１８２０　（χ３７４４）菌株へｌ。

の多重感染で感染させ形質導入するのに使用された。

導入するのに使用された。ファージ−細菌感染混合は１００μｍサンプルか１２ ．５μｇテトラサイクリン／ｍ＋によって補足された１０６マルトース（最終濃 度）を含むマツコンキー寒天（ディフコ研究所、デトロイト、ＭＩ）上に塗布さ れる前に３７°Ｃて２０分間インキュベートされた。３７°Ｃて略３６時間イン キュベートの後、形質導入体は同し培地上に採集され精製された。結果的に得ら れたＴｙ２派生物はｌ３７９２と称されｌ５Ｐ１８２０派生物はｌ４３２４と称 された。双方の菌株は遺伝子型ΔＣｒｙ）−１０ｚｈｃ−１４３１：：ＴｎｌＯ を育する。菌株χ３７９２及びｌ４３２４はルリア肉汁’＋１２．５μｇテトラ サイクリン／ｍｌにおいて成長させられ各々はゼラチンを用いた緩衝生理食塩水 （ＢＳＧ）へ１゜１０希釈された。（Ｉルリア肉汁はリッター当たり１０ｇのＮ ａＣ１を含み他方レノソクス肉汁はリッター当たり５ｇのＮａＣｌを含む。高容 量オスモル濃度培地において成長させられたサルモネラ細胞は組織培養細胞に侵 入する増加された能力を示す（ガラン及びカーティス、インフェクト　イミュン 　（１９９０）５８　：ｌ８７９−１８８５；侵入のために要求されるサルモネ ラ遺伝子のイクスブレソションはＤＮＡスーパーコイリングにおける変化によっ て調整される）。よって、ルリア肉汁における増加されたＮａＣ］レベルはワク チン菌株の最適可動性を確実にする。）各々の菌株の１００μｍのサンプルはフ ザリク酸倉入（ＦＡ）培地（マロン及びアン（１，９８１年）、Ｊ　バクトリア ル、１４５：１１１０−１１１２）上に塗布され、そのプレートは３７°Ｃて略 ３６時間インキュベートされた。各菌株のフサリフ酸耐性コロニーは０．５ｍ１ ＢＳＧへ採集されＦＡ培地上に線条接種によって精製された。精製されたフサリ フ酸耐性コロニーはルリア肉汁に採集され混濁へ３７゜Ｃて成長させられＴｎｌ Ｏ（テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシスティン 、アルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた 。新たな菌株はｌ３８０３（Ｔｙ２）及びｌ４３２５　（ＩＳＰ１８２０）と称 され、それらは遺伝子型Δ−乞工」−一旦　Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ　 ｌ　Ｏ）を存する。

Ｃｙａ”及びＣｒｐ−／Ｃｄｔ−突然変異株の表現覆は同じ（Ｍａｌ−，５ｔｌ −、Ｍｔｌ−、池）であるので、クローンされた野性型ｃｒｐ”遺伝子をそのプ ロモーターを用いてキャリーする（ンユローダー及びドブロゴマツ（＋９８６） 、Ｊ、バクチリオル１６７：６１６−６２２Ｌ核外遺伝子、ｐｓＤｌｌｏ、が染 色体において（よってその菌株を野性型表現型に回復させる）一時的にΔＣｒｐ 突然変異を補足しΔｃｙａ突然変異を用いた菌株の確認を形質導入後に可能とす るために使用された。ｌ３８０３及びｌ４３２５のルリア肉汁培養はＳ、タイフ ィムリウムχ３６７０上に増殖されたＰ２２ＴＨｉｎｔを用いて形質導入され、 それは核外遺伝子ｐｓＤ１１０を含む。選択はマツコンキー寒天＋１％マルトー ス＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ上でなされた。２６時間後、各菌株のアンピ シリン耐性、Ｍａビコロニーか採集されマツコンキー寒天＋１％マルトース寒天 上に精製されｌ３８２４（Ｔｙ２）及びｌ４３３１　（ＩＳＰ１８２０）と称さ れそれらは遺伝子型Δｃｒｐ−１０−Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎ上０）ｐ ｓＤｌ　ｌ　Ｏ”を有する。

菌株χ３８２４及びｌ４３３１はＬ肉汁＋１００μｇアンピシリン／ｍｌにおい て成長させられ各々はΔｃｙａ−１２及び連鎖されマルトース負、テトラサイク リン耐性、アンピシリン耐性表現型に関する選択はマツコンキー寒天＋１９６マ ルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン／ｍ ｌ上でなされた。アンピシリン耐性（１）ＳＤＩＩＯ″″）、テトラサイクリン 耐性（ｚｉｄ−６２：　：Ｔｎ±０）、Ｍａｌ−（Δｃｙａ）’：Ｊロニーはマ ツコンキー寒天＋１％マルトース＋１００μｇアンピシリン／ｍ１＋１２．５μ ｇテトラサイクリン／ｍｌ上に採集され精製された。

精製されたコロニーはルリア肉汁に採集され混濁へ成長させられその菌株は完全 なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシスティン、アルギニン及びトリプトファンに関する栄 養素要求性に関してチェックされた。正しい表現塑の隔離集団はχ３９１９　（ Ｔｙ２）及びｌ４３４０　（ＩＳＰ　＋　８２０）と称され、それらは遺伝子型 Δｌ−２−上旦　Δ（ｚｈｃ−１４３１：：Ｔｎ±０）Ｉ）ＳＤＩＩＯ”Δｃｙ ａ−＋２ｚｉｄ−６２：　：Ｔｎｌｏ−を育する。ｌ３９１９及びｌ４３４０の 培養はＬ肉汁＋１００μｇアンビンリン／ｍｌ＋１２．５μｇテトラサイクリン ／ｍｌにおいて混濁に成長させられ、ＢＳＧに１１０希釈され、そして各培養の １００μｍサンプルかフザリク酸含入培地上に塗布され３７°Ｃて略３６時間イ ンキュベートされた。

各菌株のフサリフ酸耐性コロニーが採集されＦＡ培地上に精製された。精製され たＦＡ耐性コロニーはルリア肉汁に採集され、混濁に成長されそしてＴｎ工上皇 テトラサイクリン感受性）の損失、完全なＬＰＳ、Ｖｉ抗原及びシスティン、ア ルギニン及びトリプトファンに関する栄養素要求性に関してチェックされた。ｐ ｓＤ１１０核外遺伝子はアンピシリンの不在における菌株の成長の間自然に失わ れた。アンビンリン感受性及び咳外遺伝子無しの最後の菌株はｌ３９２４　（Ｔ ｙ２）及びｌ４３４５　（ＩＳＰＩ８２０）と称されそれらは遺伝子型Δｃｒｐ −１０Δ（ｚｈｃ−１４３１：　：Ｔｎｌ旦〕Δｃｙａ−＋２　Δ（ｚｉｄ−６ ２：：Ｔｎ上上皇を有する。

ヘン毛の運動性の表示を用いた合成は機能的旦ヱ旦及びニー２遺伝子に部分的に 依存しペン毛か重要な抗原であるので、我々はペン毛６の派生物を選択した。ｌ ４０７３はｌ３９２４のペン毛玉派生物として選択されｌ４３２６はｌ４３４５ のペン毛玉派生物として選択された。図１０は野性型親菌株及びそれらのΔｃｙ ａΔｃｒｐ派生物か記載されている。

菌株χ４０７３及びｌ４３４６は下記の表現型特徴によって容易にそれらの野性 梨親と区別され得る　炭素源マルトース、マンニトール、ツルピント、メルビオ ース及びキシロースを醗酵又は成長させる能力か無いこと、Ｈ，Ｓを生産する能 力が兼いこと、増加させられた世代時間、及び意味のある程度に増加させられた マウスＬ［）ｓｏ値。

表１０ 細菌菌株 χ３７６９．旦、タイフイ　Ｔｙ２ Ｔｙｐｅ　Ｅｌ、野生型、■ビ。

Ｌ、バロン、ウオルターリード陸軍研究所、ワシントン、ＤＣｌからＴｙ２とし て受け取った。

χ４０７３　旦　タイフイ　Ｔｙ２ ｘ　３７６９のΔｃｒｐ−１０（ｚｈｃ−１４３１：：ＴｎｌＯ）Δｃｙａ　− １２△Ｃｚ　１ｄ−６２：：ＴｎｌＯ）　；　Ｃｒｐ−Ｃｄｔ−Ｃｙａ−Ａｒｇ −派生物。

χ３７４４　旦、タイフイ　ｌ５Ｐ１８２０Ｔｙｐｅ　４６．野生型、Ｖｉ’。

Ｎイ　レビン、ワクチン開発センター、ボルチモア、ＭＤからｌ５Ｐ１８２０と して受け取った。１９８３年にチリ人宿主より分離した。

χ４３４６　旦、タイフイ　］５Ｐ１８２０’Ｘ　３７４４のΔｃｒｐ−１０Δ （ｚｈｃ−１４３１：：ＴｎｌＯ）Δｃ　ｙ　ａ　二１２χ３７４４．　χ３７ ６９．　χ４０７３．及びχ４３４６に関する成長条件 各菌株の細胞は寒天培地から２ｍｌルリ了肉汁に採集された。培養は３７８Ｃて 略１４時間静止培養としてインキュベートされた。

その培養か視覚的に混濁（ＯＤ６゜。≧０．５）のとき、白金耳量の各培養かい くつかの表現型特性を実証するために表１１に記載された培地上の分離された培 養に関して線条接種させられた。培養は又ファージ、抗生物質罹病性、野性ｆｆ １ＬＰｓを生産する能力、栄養素要求性、運動性、コリシンを生産する能力が無 いこと、核外遺伝子ＤＮＡの不在、平均世代時間、及び抗血清によるＳ、タイフ ィ（図１１参照）のＯ，Ｈ，及びＶｉ抗原を確認するための凝集に関して試験さ れた。全ての菌株の表現型特性かそれらの野性型親よりも意味かある程度遅く成 長するΔ旦ヱ！Δニー２菌株χ４３４６及びχ４０７３を用いて予測された如く であった。

表１１ 表現型 最小寒天“＋ ０．５％メルビオース　＋　＋　− ”アタッチされた最小培地処方せん。

表　１１（前頁に続く） 表現型 トリプルシュガーアイアン培地−Ｈ，Ｓ　＋　＋−生産物 アルカリスラント＝　Ｌａｃ−Ｌａｃ−Ｌａｃ−Ｌａｃ−Ｇｌｕ”　Ｇｌｕ”　 Ｇｌｕ’　Ｇｌｕ”細菌ウィルス感受性０ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　（銀染色剤）　コンブ、コンブ、コンブ　コンブ。

°ファージ感受性は形質導入による軟寒天オーバーレイ技術によってアッセイさ れた。　Ｓ＝感受性、Ｒ＝耐性４１．０％カゼイン、０．　５％ＮａＣ］、０． 　５％ディフコ寒天及び５０μｇ／ｍｇトリフニニールーテトラゾレウム　クロ ライドを含む培地へスタンディング−オーバーナイト　ルリア肉汁培養の白金耳 量を刺すことによって決定された運動性、３７°Ｃでのインキュベーション及び ２４及び４８時間で記録された運動性。

表　１１　（前頁より続く） 表現型 ＭＧＴ・　２６．６　３６．５　２４．３　３４．５核外遺伝子内容　無　無　 無　無 栄養素要求性　Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｔ ｒｐ− Ａｒｇ”″　Ａｒｇ″″　Ａｒｇ″″　Ａｒｇ”ＭＩＣ’ テトラサイクリン　４　４　＜２　４ ストレプトマイシン　６４　６４　１６　８アンビンリン　＜２　＜２　＜２　 ＜２ゲンタミシン　＜２　＜２　＜２　＜２クロラムフエニコール　４　４　４ 　４ネオマイシン　く２　く２　く２　く２リフエンピシン　８　１６　８　ｇ ナリジクス酸　＜２　４　＜２　４ スペクチノマイシン　３２　３２　３２　１６カナマイシン　＜２　＜２　＜２ 　＜２゛平均代時間（分）２３７°Ｃて通気（１５０ｒｐｍニューブルンスウィ ックブラットフォーム　シェーカー）を用いたルリア肉汁において決定された。

１抗生物質の最小抑制濃度（μｇ／ｍｌ）は各菌株の抗生物質の定義された濃度 を含む寒天上へのスタンディングオーバーナイト培養の線状接種によって決定さ れた。

表　＋＋（前頁から続く） 表現型 次のものに対するディフコ抗血清を用いた凝集：べん毛抗原Ｈ：１　＋　＋　十 −４− べん毛抗原Ｈ・２　＋　＋　十−４− グループＤファクター９　＋＋　十十 グループＤファクター１２　＋　＋　＋　＋グループＤ（０−１，９，１２）　 ＋　＋　＋＋ルイ了肉汁において成長させられ、ゼラチンを用いた緩衝生理食塩 水（ＢＳＧ）において希釈され、そして分離されたコロニー形成単位（ｃｆｕ） を達成するために１０４５マルトースを含むマツコンキー寒天上に載置された。

与えられた菌株の全てのコロニーはサイズ及び色において均一に見える。ΔＣｙ ａ　ＣｒＪ）菌株のそれらの野性型親に比較して遅い成長率によって、マツコン キー寒天上の成長はχ４０７３及びχ４３４６のコロニーか容易に目視てきる前 に３７°Ｃて略３７＋　時間かかる。

釈（１３１０’、ＩＯ’、ｌｏ’、１０’　ｃｆｕ／プレート）かそれらの成長 を保持すべきてない０５％マルトース、メリビオース、キンロース、グリセロー ル、又はラムノースの何れかを含む（２２ｐｇＬ了ルギニン／ｍｌ、２２ｇｇＬ システィン及び２０ｇｇＬトリプトファン／ｍｌにしよって補足された）最小寒 天培地上にプレートされた。１対のプレートの内の１セツトは紫外線照射（５ジ ユ一ル／ｍ２／秒）され暗かりて３７９Ｃでインキュベートされた。他の１セク トは証明を用いて３７°Ｃてインキュベートされた。復帰突然変異体及び／又は 突然変異株は４８時間の成長期間の農に検出さねらかうた。

菌株の貯蔵 各菌株は１％ペプトン−５０６グリ七ロール懸濁において維持され一７０°Ｃで 貯蔵された。

動物実験に関する接種物の準備 下記はマウスの腹腔内の（ｉ、ｐ、　）接種に関する各ワクチン菌株とその親の 成長及び懸濁に関する標準化されたプロトコルである。

雌ＣＦＷマウス（１８乃至２０ｇ）（チ↑−ルズリバー、ウィルミノブト／、Ｎ ・ｉＡ）か野性型旦　タイフィのＬ　Ｄ　ｓ。値及びΔｃｒｐ−１０Δｃｙａ− １２派生物の毒性の決定のために使用された。静止夜通し培養（３７°Ｃ）か予 め温められたルリア肉汁に１，２０希釈されＯＤ、、、≦０．０８に達するまで ３７６Ｃ（＋５Ｏｒｐｍ）で通気された。野性型及びΔｃｒｐ−１０Δｃｙａ− １２Ｓ、タイフィ細胞か１５％（重さ／体積）去勢豚胃粘素（アメリカン研究所 、オマハ、ＮＢ）において懸濁された。その１５％粘素懸濁はｐＨ７への中性化 、１５ｐ、ｓ、ｉて１２１°Ｆで１０分間のオートクレーピングによって準備さ れ、新鮮に準備された無菌第２鉄アンモニウムントレート／ｍ１　（シゲラ、Ｓ ｔ、ロウイス、ＭＯ）の３μｇか適当に希釈されたＳ　タイフィ細胞の付加に先 立ち付加された。

その細胞懸濁はそこで５００μｍ体積において２３ゲージニードルを使用してＣ ＦＷマウスに１．ｐ、投与された。野性塁親及びΔＣｒｐ−１０Δ（ｙａ−１２ 派生物のＬＤｉｏが７２時間の死亡率データの記録の後に決定された。野性型親 に関するＳ、タイフィ突然変異株の毒性に関する結果に関して表１２を参照され たし。

表　１２　１ＳＰ１８２０及び”ｒｙ２　ｓ、　タイフイ野生型及びΔｃｒｐ　 −ＩＩ補乳類細胞培養粘着性及び侵入性アッセイ異味は、３７°Ｃて、夫々２時 間及び４時間を通してＣＨＯ細胞の単層に粘着及び／又は侵入する野性型親菌株 に比較して減少された能力を示している。

プルの平均時ＳＤである。

通常人の血清における突然変異株の野性型親に比較した成長及び残ＥＳを用いて 平衡化された各ｍ１の血清に付加された。補体媒介された溶菌活動性か１０分間 ６０°Ｃての血清の不活性化及び６０分特に、Ｘ３７４４　（ＩＳＰ１８２０． 野性型）、Ｘ３７６９（Ｔ）・２．野性型）、Ｘ４０７３（Ｔｙ２　Δｃｙａ− １２Δ〔且二ｐ−ｃｙｓＧ）−１０）、Ｘ４３４６　（ＩＳＰ１８２９　Δ−訟 」−及びｌ５ＰＩ８２０菌株χ３７６９及びＸ３７４４の夫々を用いて吸収され 、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳを用いて緩衝されそしてアッセイ示し同し菌株は熱不活 性化された血清にお（ブる成長の際にネット成長によって実証された如く負の別 画として作用した。

図５は３７°Ｃて２４時間を通した各菌株のネット成長及び／又は残存を示す。

菌株の寄託 下記に記載された材料は、米国Ｙ培養収集（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、１２３０１　バークローンドラ イブ、ロックビレ、メリーラント、をもちいた、ブタベスト条約の条件の下の寄 託に関する。示されているアクセノソヨン番号は成功した生存度試験の後に割り 当てられ、必要料金か支払わられた。該培養へのアクセスは本特許出願か３７Ｃ ＦＲ］、］４及び３５　ＵＳＣＩ２２の下でそれに与えられるへきである長官に よって決定されるものへ未決定の間可能であろう。公衆に対する該培養の取得可 能性に関する全ての制限は本出願に基づいた特許の許可に関して取り消されるこ と無いように除去されるであろう。更に、指名された寄託は寄託の期日から３０ 年間、又は最後の寄託要求から５年間、又は米国特許の実施可能期間の内の長い 期間維持される。万一培養か生存不可能となったり又は不注意に破壊され又は、 核外遺伝子含有菌株かその核外遺伝子を失った場合、それは同じ分類の種類の生 存可能な培養によって取り替えられる。ここで述へられる寄託された材料は便宜 を意図しており、本発明をこの二こての説明の＠屯で実行することを要求されず 、そして更に、こわらの材料は引用によって合体される。

ｌ５Ｐ２８２２　１９９０年１１月２日　５５１１４ＩＳＰ１８２０　１９９０ 年１１月２日　５５１１６χ４０７３　１９９１年１１月６日　５５２４８（χ ４０７３は置換培養） 商業的利用 ここで提供される菌株は直接及び間接（こ、旦　タイフイ（二よって引き起こさ れる病気を防止する、ワクチンを含む免疫原性成分、及びそれによってに対する 抗体か交叉反応する他の腸の細菌の生産１こ適する。これらの菌株は又細菌細胞 において組み換え遺伝子上で符号化されるイクスブレソンヨン産物の生産のｊこ めのギヤ１ノア微生物として有用である。更に、増給された安全性を用１飄で使 用されン辱るその菌株は、旦　タイフイに対する、及び無毒性旦　タイフイ（こ おいてイクスプレスさｎる抗原に対する単一クローン及び多クローンの双方の抗 体の生産のために有用である。

ｎ−〇七９０つ○］ ロー　０−　ユ の　の　の ＣＯり　マ　の　へ　−０ １山／ｎヨ０斗糞ヅ０Ｌ５ｃｒ１じ替ヱσＴ工ＧＵ罠三　５ 国際調査報告 １＋１Ｍ＋１８Ｉ＋１１＋１１１＾””””’”＝ＦＣＴ／ｌＪｓ９１１０８３ ７６−ＩＩＩｅｍａＩＩＩ−Ａ１１８１１１６Ｍ−ρＣＴ／ＬＩＳ９＋１０８３ ７６Ｔｈｉｓ　ａｐＤｌｌｃａｔ＋ａｎ　ｃｏｎｔａ＋ｎｓ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌ ａｍｔｎｇ　＋ｎｖｅｎｔｌｏｎｓ　ｏｒ　ｇｒｏｕρｓｏｔｉｎｖｅｎｔｉｏ ｎ％　−ｈ＋ｅｈ　ａｒｅ　ｎｏｔ　ｓｏ　ｌｉｎｋｅｄ　ｓｏ　ａｓ　ｔｏ　 ｆｏｒｍ　ａ　ｓｉｎｇｌｅ　ｒロｖｅｎ煤{ｖｅ ｅｌｌｎｃ費ｐｔ．　Ｉｎ　ｏｒｄｅｒ　ｆｏｒ　ａｌｌ　＋ｎｖｅｎｔｌｏｎ ｓ　ｔｏ　ｂｅ　ｅ＊ａｓｔｎ曹ｄ，　ｔｈｅ　ａｐｐｒｏ垂秩{ａｔｅ ａｄｄｉｔｉｏｎａｌａｍａｓＩｎａＮｏロｆｅｅｓ＠ｕｓｔｂｅｐａｉｄ．Ｔ ｈｅＧｒｏｕｐｉｎｇｓｏｒ＋ｎｖｅｎｔｉｏｎＬＣｌａｉｍｓｌ−Ｊｄｒａｗ ｎｔｏａｎａｖ＋ｒｕｌｅｎｔｓｔｒａｉｎｏｆ＄１ＬＬ！ｊｖ１！』一Ｌ遥． ｔｊツ１ｂ」２＋ｍｌｔｈ　ａ　＠ｕｔＡｔｌｏｌ’ｌ　Ｉｎ　ｔｈｅ　ａｄｅ ｎｙｌａｔｅ　ＣＹＣ１ａ％ｍ　ｌ【ｘ１−　ｌｉｏｎ菅，　ｌｌｌ＊ｕｎO９ ｅｎｌｅ ｃｏｓｐｏｓ＋ｔ＋ｏｒ＋ｓ，ａｎｄａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｓｔｉｍｕｌａｔｉ ｎｇｔｈｅ＋＋＋ａｕｎｅｓｙｓｔｅｍｗｉｔｈａｎａｖ＋ｒｕｌｅｎｔ　ｓｔ ｒａｉｎ　ｏｆ　５１」」１９Ｄｊ−ＬＬ−，１ｔｕＩＬｗｉｔｈ　ａ　ｍｕｔ ａｔｉｏｎ　Ｉｎ　ｔｈ曽　ａｄ■獅凾撃Sｔｅ ｅｙｅｌａｓｅｔ【ｘ１ノｇ譬ｎｅａｒｅｆｏｒｅｗａｓｐｌ＊，ｃｌａｓｓｉ ｆｉｅｄｉｎＣｌ曇ｓｓ４２４，ｓｕｂｃｌａｓｓ’＋３ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　 ４３５，　ｉｕｂｅｌａｓｓ　２５２．ａ．ＩＬＣｌａｉｓｓ９−１６，ｄｒａ ｗｎｔｏａｎａｖｉｒｕｌｅｎｔｓｔｒａｉｎｏｆ５』ＬＬ−ｊｕｌ！」一Ｌ圭 ．’２ＳｉしＬｗｉｔｈａ＠ｕｔａｔ＋ｏｎｒｎｔｈｅｅｙｃｌｉｅＧＩＭ９ｒ ｅｃｅｐｔｏｒ＋仁エコ１１ｇｅｘ＋ｉｍｓｕｎｏｇｅｎ＋ｅｅｏｓｐａｓ＋ｔ ＋ｏｎｓ，ａｎｄａ＠ｅｔｈｏｄｆｏｒｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｔｈｅ＋ｓｓｕ ｎｅｓｙｓｔｗｓｗ＋ｔｈａｎ畠ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　５』 ＬＬ二Ｓ■ｌ！』一Ｌ最．ＩＢｌｊ　ｗｔｔｈ　ａ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　ｌロ　 ｔｈｅ　ｃ凾モ撃奄メ@ＱＩＱｐ ｒｅｃｅｐｔｏｒ　＋ＣｊｌＪＬＩ　Ｑｅｎｅ　ａｒｅ　ｆｏｒ　ｅｘａｓｐｌ ｅ，　ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ｉｎ　Ｃｌａｓｓ　４２４，@％ｕｂｃｒａ％％ ９３ａｎｄＣｌａｓ−４３５，ｓｕｂｃｌａｓｓ２５２．Ｊ１．”’　Ｃｌａｉ ｍｓ　１７−２４，　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｎ　ａｖｉｒｕｌｅｎｔ　％ｔｒａ ｔｎ　ｏｆ　聾』ＬＬ色Ｓり１！」二Ｌタ，Pｔ可ＩＬ ｗｌｔｈ　ａ　ｓｕｔａｔ＋ｏｎ　ｌｎ　ｔｈｅ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｅｙｅ ｌａｉｅ　（【！１１　ｇｅｎｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｌｌ’戟@ｔｈｅ ｅｙｃｌｉｃＱｌ＋ｌｐｒｅｃｅｐｔｏｒ＋ム１ｇｏｎｅ，＋ｓｓｕｎｏｇｅｎ ｉｃｃａ會ｐｏｓｘｔｉａｎｓ，ａｎｄａｍｅｔｈｏｄｆｏｒ％ｔ＋ｓｕｌａｔ ＋ｎｇｔｈｅ＋ａｓｕｎｅｓｙｓｔｅ＋＋ｗｉｔｈａｎａｖ＋ｒｕＬｅｎｔｓｔ ｒａｔｎｏｆ５』ＬＬ！ｊｖユ！」黷k貞， １！−ＩＬ’ｌｔ”　晶　Ｉｌｕｔ畠ｔｉａｎ　ｉロ　ｔｈｔ　ａｄｅｎｙｌａ ｔｅ　ｅｙｅｌａｓｅ　ｆにｔ色１　ｇｏｎｅ　ａｍ　ｔｈ■@＋ｎ　ｔｈｅ ｃｙｃｌｉｅＱｌｅｒｅｃｅｐｔｏｒ＋ｇコ１１ｇｅｎｅａｒｅｆｏｒ●ｘａｓ ｐｌｅ，ｅｌａｓｓｉｆＬ替ｄｉｎＣｌａｓｓ４２４，ｓｕｂｃｌａｓｓ　９３ 　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　４３５，ｓｕｂｅｌａｓｓ　２５２．ａ．ｂａｅｔ＠ｒ ＋ａ　ｔｏ　ｅｆｆｅｅｔ＋ｖｅｌｙ　ｃｏｌｏｎｉｚｅ　ｄｅｅｐ　ｔｉｓｓ ｕｅ　＋αｌ９ｅｎＮ，　ｌｍ的ｎＱ９＠ｎｌ■ ｅｅ＋＋ｐｏ％ｉｔｉｏｎ％，蟲ｎｄａ＠＠ｔｈｏｄＦｏｒｓｔｉ＠ｕｌａｔｉ ｎｇｔｈｅ＋−ｍｕｎｅｓｙｓｔｅｓｗ＋ｔｈａｎａｖ＋ｒ＋ａｌｅｎｔ％ｔｒ ａｉｎ　ｏｆ　７　ｗｔｔｈ　ａｎ　ａｖ＋ｒｕｌｅｎｔ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ 　７ｗ＋ｔｈａｓｕｔａｔ＋ｏｎ＋ｎｔｈ＠ｇｅｎｅｗｈｉｃｈｄｌｓ＋ｎｔｓ ｈｅｓｔｈｅｃａｐａｅ＋ｔｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｔｏｅｆｆｅｃｔｉ ｖｅｌｙｃｏｌｏｎｉｚｅｄｅｅｐＨｓｓｕｅ＋（Ｊｌｌａｒｅｆｏｒｅｘａｍ ｐｌｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ　ＩｎＣｌａｓ＠４２４，　ｉｕｂｅｌａｓｓ　 ９３　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　４３５．　ｓｕｂｅｌ龜ｓｓ　２５２．＝D リ・　Ｃｌａｉｍ　３３，　ｄｒａｗｎ　ｔ＠　ａｎ　ｉ＠ａｕｌ’ｌｏ％ｎｌ ｃ　Ｃｏ＠ｐｌｌｌｌｌｔｌｏｎ　ｏｆ　ａｒ＋　ａｖｉｒ浮撃■秩{ｔ ％ｔｒ１１１１′Ｉ　ロｆ　５ｊＬｌｊり９ｖリＬ１」一―．ｗｉｔｈ　ａ　ｓ ｕｔａｔｉａｎ　ｒｎ　ｔｈｅ　ｇｏｎｅ　ｗｈｉＣｈ　ｄ奄高普{ｔｓｈｅｓ 　ｔｈｅ ｅａｐａｅ＋ｔｙｏｆｔｈｅｂａｅｔｅｒｔａｔｏｒｆｆｅｅｔｉｖｅｌｙｃｏ ｌｏｎｒｘ譬ｄｅｅｐｔロｓｕｅ＋９区１１ａｎｄａｓｕｔａｌ＋ｏｎ　＋ｎ　 ｔｈｅ　ｅｙｅｌｉｅ　ＡＭＧＩ　ｒｅｅｅｐｔｏｒ　＋虹旦ｌ　ｇｅｎｅ　ｉ ｓ　ｆａｒ　＊＋＋ａｓｐｌｅ，ｅｌａｓｓ＋ｆ＋ｅｄ　ｕ＋　Ｃｌａｓｓ　４ ２４，　ｓｕｂｅｌａｓｓ　９３　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　４３５，　ｓｕｂｅｌ ａｓｓ　２５Q．ａ＋ リＩＨＣｌａｉ＠３４，ｄｒａｗｎｔｏａｎｉｓｓｕｎｏｇｅｎｘｅｅｏｗｐｏ ｓｉｔ＋ｏｎｏｆａｎａｖｔｒｕｌｅｎｔ％ｔｒａｔｎｏｆ７ｗｉｔｈａｍｕｔ ａｔｉｏｎ＋ｎｔｈｅｇｅｎｅｗｈｉｅｈｄ＋ｓｉｒ＋＋ｓｈｅｓｔｍｅａｐａ ｅ＋ｔｙｏｆｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｔｏｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｃａｌｏｎｔ ｚｅｄｅｅｐｔｉｓｓｕｅ＋９区１１ａｎｄａ●ｕｔａｔ＋ｏｎｌＩ′Ｉｔｈｅ ａｄｅｒ＋ｙｌａｔｅｅｙｃｌａｓｅｔ【！糺ｌｇｏｎｅｉｓｆｏｒｅｘａ一ｐ ｌｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｅ■ ＋ｎ　Ｃｌａ＠ｓ　４２４，　ｓｕｂｅｌａｓｓ　ワ３　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　 ４３５，　ｓｕｂｅｌａｓｓ　２５２．８．リ”　Ｃ１ａ＋ｓａ　３５，　３７ ，　ａｎｄ　３８　ｄｒａｗｎ　ｔｏ　ａｎ　＋ｓ＠ｕｎｏｇ＠ｒ＋＋ｅ　ｅａ ｓｐｏｓ山ｏｎ　ｏｆＪｎａＶｌｒｕｌｔｎｔ％ｔｒａ１ｎａｆＷｗｌｔｈａ” ｕ＊ａｔＩｌｌｎ１ｎｔｈｅＱｅ’ｔ−ｈｌＣｈ鈎ｔａｔｉａｒ＋ｉｎｔｈｅａ ｄ＊ｎｙｌａｔ＊ｅｙｅｌａｓ＠（；コ乙−．ｌｇｅｌ’ｌｅ畠ｒｅｆロｒｅｘ ａｍｐｌｅ，ｅｌａｓｓｉｆ撃■■ ＩＦＩ　Ｃｌａｓｓ　４２４，　ｓｕｂｃｌａｓｓ　９３　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ 　４Ｗ，　ｓｕｂｅｌａｓｓ　２５２．ａ．リ”’−ＣＩｌｌｌ＠３！，ｄｒａ ｗｎｔｏｉｓｏｌａｔｅｄｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ旦貞１１ ｊばソＬＬＬｉａｒｅｆｏｒｅ賀ａｍｏｌｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｉｎＣｌａ ｓｓ為２４，ｓｕｂｅｌａｓｓ９３ａｎｄＣｌａｓｓ４３５，φ”　Ｃｌａｓｓ 　ｈ＠，　ｄｒａｗ　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏｒ　ｕｓ＋＋ｖｇ　ａｎ　ａ ｖ＋ｒｕｌｅｒ＋ｔ　ｓｔｒａｒｎ　ｏｆ＠．　ｕ夏１ｗｉｔｈ　ａ　ｓｕｔａ ｔｉａｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　θ１ｇｅｎｅ　ａｒｅ　ｆｏｒ　ｅ＋＋ａ＋＋＋＋ｌ ｅ，　Ｃｌａｓｓｉｆ奄■п@ｒｎ Ｃｌａｓｓ　４２４，　ｓｕｂｅｌａ％ｉ　９３　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　４３５ ，　ｓｕｂｃｌａｓｓ　２５２、８・Ｘφ　ＣＩａＩｍ　４１，　ｄｒａｗｒ＋ 　ｔｏ　蟲　−ｅｔｈｏｄ　ｏｆ　ｕ＠ｉｎｇ　ａｎ　蟲ｖｉｒｕｌｅｎｔ　ｓ ｔｒａｉｎ　ｏｆｕ．　覧コ』Ｊツ』１ｗ＋ｔｈ　ａ　ｌｌＬＩｔｌｌｔｌａｒ ｌ　ｌガ　ｔＭ　【ｎ鼠ｇｅｎｅ　ａｒｔ　ｆａｒ　●糞蟲−Ｇｌｌ●，　ｃ撃 ≠唐唐浮撃■п@ｉｎ Ｃｌａ％ｓ４２４，ｓｕｂｅｌａｓｓ９３ａｎｄＣｌａｓｓ４３５，ｓｕｂｅｌ ａｓｓ２５２．Ｌ緊／：９１二菩：６，。工：饗肋ｕ３厄ＩＩ　ｆｌａｓｔ　ｓ ｈ＊ｅｔｌＶｌ．　ＣＥＩＩＴＩＩＩＩＮ　ＯＢＳＥＲｕＡＴＩＯＮ！ｉ　０Ｎ 　ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＧＩＴＩＯＮＩＬ　９９１）ＬＩＣＲＴＩＯＮｘＩ−Ｃ ｌａｉｍ４２，ｄｒａｗｎｔｏａｍｅｔｈｏｄｏｆｕｓ＋ｎｇａｎａｖ＋ｒｕｌ ｅｎｔｓｔｒａｉｎｏｆｉ．―ｗ＋ｔｈａｍｕｔａｔｌｏｎ＋ｎｔｈｅ【虜１． ｇｅｎｅａｒｅｆロｒｅｘａｍｐｌｅ，ｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ＋ｎＣｌａｓｓ　 ４２４，　ｓｕｂｅｌａｓｓ　９３　ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　４３５，　％ｕｂｅ ｌａｓｉ　２５２．８．”ｌＩ−Ｃｌａ＋ｓ４３，ｄｒａｗｎｔｏａｓｅｔｈｏ ｄｏｆｕｓ＋ｎｇａｎａｖｉｒｕｌｅｎｔｓｔｒａｉｎｏｆｉ．　−ｈｗ＋ｔｈ 　ａ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｉｎ　ｔＭ　ムａｎｄ　Ｑ　ｇｅｎｅ　ａｒｅ　ｆｏ ｒ　ｅｘａｍｐｌｅ，ｃｌａｓ％＋ｆ＋＊ｄ　＋＋′ＩＣｌａ＠ｓ　４２４，　 ｓｕｂｃｌａｓｓ　９３ａｎｄ　Ｃｌａｓｓ　４３５，　ｓｕｂｅｌａｓｓ　２ ５Q．Ｌ Ｘ＋ＩＩ．　Ｃｌａｓｓ　４４，　ｄｒａｗｒ＋　ｔｏ　ａ　ｍｅｔｈｏｄ　ｏ ｆ　ｕｓ＋ｒ＋ｇ　ａｎ　ａｖ＋ｒｕｌｅｒ＋ｔ　ｓｔｒａ奄氏@ｏｆ ’Ｌ．（）コ２り」Ｌ”””””””””’ｇΣ：ｐ，Ｇｊｊ、ａｎｄ９ＳｕＬ ｇｅｎｅｓａｒｅｆｏｒｅｘａｍｐｌｅ，ＣＩａ％％Ｉｆ１ｅｄ　Ｉｎ　Ｃｌａ ｓｓ　４２４１　ｓｕｂｃｌａｓｓ　９３　ａｎｄＣｌａｓｓ　４３５，　％ｕ ｂＣ＋ａ％％　２５２D１１． フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５１０１ ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：０１） ８９３１−４Ｂ Ｉ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. １．個体の免疫化に関する免疫原性組成であって、生理的に許容され得る賦形剤 において、ｃｙａ遺伝子における突然変異よりなるチフス菌（Ｓ．タイフィ）の 無毒性派生物よりなる免疫原性組成。
2. ２．特許請求の範囲第１項記載の免疫原性組成てあって、該無毒性派生物は、該 個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を、該脊椎動物におい て該病原に対する免疫応答を誘発することがてきる抗原を生産するために、イク スプレッシングすることができる免疫原性組成。
3. ３．特許請求の範囲第１項記載のワクチンを該個体に投与することよりなり、Ｓ ．タイフィの免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
4. ４．特許請求の範囲第２項記載のワクチンを該個体に投与することよりなり、病 原の免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
5. ５．ｃｙａ遺伝子における突然変異よりなる分離された無毒性Ｓ．タイフィ菌株 。
6. ６．特許請求の範囲第５項に記載のＳ．タイフィの分離された無毒性菌株てあっ て、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を、該脊椎動物 において該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を生産するために 、イクスブレッシンクすることができるＳ．タイフィの分離された無毒性菌株。
7. ７．特許請求の範囲第６項記載の菌株であって、該Ｓ．タイフィは、平衡致死宿 主ベクター系を構成するために致死突然変異を補足するベクター遺伝子によって 平衡され、致死である染色体突然変異を含む菌株。
8. ８．特許請求の範囲第７項記載の菌株であって、該菌株の細胞は； ａ）ベーターアスパーテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｅｔａ−ａｓ ｐａｒｔａｔｅ　ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ ａｓｄ）を符号化する機能する自生染色体遺伝子を欠き； ｂ）染色体ａｓｄ突然変異を補足するが組み換えによる欠損染色体遺伝子の置換 えをなし得ない機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子を現に有 し； ｃ）機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子及び免疫原性抗原の 間の物理的連鎖を有し、機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子 の損失が機能的Ａｓｄの欠乏がその細胞を溶解させる環境にその細胞があるとき にその細胞を溶解させる、菌株。
9. ９．ｃｒｐ遺伝子における突然変異よりなるＳ．タイフィの無毒性派生物よりな る個体を免疫化する免疫原性組成。
10. １０．特許請求の範囲第９項記載の個体を免疫化する免疫原性組成であって、該 無毒性派生物は、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を 、該脊椎動物において該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を生 産するために、イクスプレッシングすることができる免疫原性組成。
11. １１．特許請求の範囲第９項記載の免疫原性組成を該個体に投与することよりな り、Ｓ．タイフィの免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
12. １２．特許請求の範囲第１０項記載の免疫原性組成を該個体に投与することより なり、病原の免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
13. １３．ｃｒｐ遺伝子における突然変異よりなるＳ．タイフィの分離された無毒性 菌株。
14. １４．特許請求の範囲第１３項に記載のＳ．タイフィの分離された無毒性菌株で あって、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を、該脊椎 動物において該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を生産するた めに、イクスプレッシンクすることがてきるＳ．タイフィの分離された無毒性菌 株。
15. １５．特許請求の範囲第１４項記載の菌株てあって、該Ｓ．タイフィは、平衡致 死宿主ベクター系を構成するために致死突然変異を補足するベクター遺伝子によ って平衡され、致死である染色体突然変異を含む菌株。
16. １６．特許請求の範囲第１５項記載の菌株てあって、該菌株の細胞は； ａ）ベーターアスパーテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｅｔａ−ａｓ ｐａｒｔａｔｅ　ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ ａｓｄ）を符号化する機能する自生染色体遺伝子を欠き； ｂ）染色体ａｓｄ突然変異を補足するが組み換えによる欠損染色体遺伝子の置換 えを成し得ない機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子を現に有 し； ｃ）機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子及び免疫原性抗原の 間の物理的連鎖を有し、機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子 の損失が機能的Ａｓｄの欠乏がその細胞を溶解させる環境にその細胞があるとき にその細胞を溶解させる、菌株。
17. １７．Ｓ．タイフィの無毒性派生物よりなる個体を免疫化する免疫原性組成であ って、該派生物はＣｙａ遺伝子における突然変異及びｃｒｐ遺伝子における突然 変異よりなる免疫原性組成。
18. １８．特許請求の範囲第１７項記載の免疫原性組成であって、該無毒性派生物は 、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を、該脊椎動物に おいて該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を生産するために、 イクスプレッシングすることができる免疫原性組成。
19. １９．特許請求の範囲第１７項記載の免疫原性組成を該個体に投与することより なり、Ｓ．タイフィの免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
20. ２０．特許請求の範囲第１８項記載の免疫原性組成を該個体に投与することより なり、病原の免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
21. ２１．ｃｙａ遺伝子及びｃｒｐ遺伝子における突然変異よりなるＳ．タイフィの 分離された無毒性菌株。
22. ２２．特許請求の範囲第２１項に記載のＳ．タイフィの分離された無毒性菌株て あって、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を、該脊椎 動物において該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を生産するた めに、イクスプレッシングすることがてきるＳ．タイフィの分離された蕪毒性菌 株。
23. ２３．特許請求の範囲第２２項記載の菌株であって、該Ｓ．タイフィは、平衡致 死宿主ベクター系を構成するために致死突然変異を補足するベクター遺伝子によ って平衡され、致死である染色体突然変異を含む菌株。
24. ２４．特許請求の範囲第２３項記載の菌株であって、該菌株の細胞は； ａ）ベーターアスパーテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｅｔａ−ａｓ ｐａｒｔａｔｅ　ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ ａｓｄ）を符号化する機能する自生染色体遺伝子を欠き； ｂ）染色体ａｓｄ突然変異を補足するが組み換えによる欠損染色体遺伝子の置換 えを成し得ない機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子を現に有 し； ｃ）機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子及び免疫原性抗原の 間の物理的連鎖を有し、機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子 の損失が機能的Ａｓｄの欠乏がその細胞を溶解させる環境にその細胞があるとき にその細胞を溶解させる、菌株。
25. ２５．ｃｄｔ遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの無毒性派生物よりな る個体を免疫化する免疫原性組成。
26. ２６．特許請求の範囲第２５項記載の個体を免疫化する免疫原性組成であって、 該無毒性派生物は、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子 を、該脊椎動物において該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を 生産するために、イクスプレッシングすることができる免疫原性組成。
27. ２７．特許請求の範囲第２５項記載の免疫原性組成を個体に投与することよりな り、サルモネラの免疫原性抗原に応答するために該個体の免疫系を刺激する方法 。
28. ２８．特許請求の範囲第２６項記載の免疫原性組成を該個体に投与することより なり、病原の免疫原性抗原に応答するために免疫系を刺激する方法。
29. ２９．ｃｄｔ遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの分離された無毒性菌 株。
30. ３０．特許請求の範囲第２９項に記載のサルモネラの分離された無毒性菌株であ って、該個体に対して病原性の因子から派生された組み換え遺伝子を、該脊椎動 物において該病原に対する免疫応答を誘発することができる抗原を生産するため に、イクスプレッシングすることができるサルモネラの分離された無毒性菌株。
31. ３１．特許請求の範囲第３０項記載の菌株であって、該サルモネラは、平衡致死 宿主ベクター系を構成するために致死突然変異を補足するベクター遺伝子によっ て平衡され、致死である染色体突然変異よりなる菌株。
32. ３２．特許請求の範囲第３０項記載の菌株であって、該菌株の細胞は； ａ）ベーターアスパーテートセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ｂｅｔａ−ａｓ ｐａｒｔａｔｅ　ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）（ ａｓｄ）を符号化する機能する自生染色体遺伝子を欠き； ｂ）染色体ａｓｄ突然変異を補足するが組み換えによる欠損染色体遺伝子の置換 えを成し得ない機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子を現に有 し； ｃ）機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子及び免疫原性抗原の 間の物理的連鎖を有し、機能的Ａｓｄポリペプチドを符号化する組み換え遺伝子 の損失が機能的Ａｓｄの欠乏がその細胞を溶解させる環境にその細胞があるとき にその細胞を溶解させる、菌株。
33. ３３．特許請求の範囲第２５項記載の免疫原性組成であって、該無毒性派生物は ｃｒｐ遺伝子を有する免疫原性組成。
34. ３４．特許請求の範囲第２５項記載の免疫原性組成であって、該無毒性派生物は ｃｙａ遺伝子における突然変異を有する。
35. ３５．特許請求の範囲第３３項記載の免疫原性組成であって、該無毒性派生物は ｃｙａ遺伝子における突然変異を又有する。
36. ３６．特許請求の範囲第２９項記載のサルモネラの分離された無毒性菌株てあっ て、ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子から選択された遺伝子における突然変異よりなるサ ルモネラの分離された無毒性菌株。
37. ３７．特許請求の範囲第２９項記載のサルモネラの分離された無毒性菌株であっ て、ｃｙａ及びｃｒｐ遺伝子における突然変異よりなるサルモネラの分離された 無毒性菌株。
38. ３８．特許請求の範囲第３７項記載の菌株及び製薬的に許容され得る賦形剤より なる免疫原性組成。
39. ３９．ｘ３９５８，ｘ４３２３，ｘ３９２６，ｘ３９２７，ｘ４２９７，ｘ４３ ４６，ｘ３９４０、ｘ４０７３，ｘ４４１７，ｘ４４３５，及びその派生物菌株 のグループから選択された分離された菌株。
40. ４０．ｃｙａ遺伝子における突然変異よりなる無毒性Ｓ．タイフィの菌株を利用 する方法であって、生理的に許容し得る賦形剤における該菌株の懸濁によって免 疫原性組成を調整することよりなる方法。
41. ４１．ｃｒｐ遺伝子における突然変異よりなる無毒性Ｓ．タイフィの菌株を利用 する方法であって、生理的に許容し得る賦形剤における該菌株の懸濁によって免 疫原性組成を調整することよりなる方法。
42. ４２．ｃｄｔ遺伝子における突然変異よりなる無毒性サルモネラの菌株を利用す る方法であって、生理的に許容し得る賦形剤における該菌株の懸濁によって免疫 原性組成を調整することよりなる方法。
43. ４３．特許請求の範囲第４１項記載の方法であって、該菌株は更にＣｙａ遺伝子 における突然変異よりなる方法。
44. ４４．特許請求の範囲第４３項記載の方法であって、該菌株は更にｃｄｔ遺伝子 における突然変異よりなる方法。 ４５ｃｄｔ突然変異株てあるＳ．タイフィの分離された菌株。