MICROORGANISMOS ATENUADOS PARA EL TRATAMIENTO DE UNA INFECCIÓN DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se relaciona a los microorganismos atenuados que pueden ser usados en composiciones de vacupas para la prevención o tratamiento de infecciones bacterianas o virales . Está bien establecido que los microorganismos vivos atenuados son vacunas altamente efectivas; las respuestas inmunes producidas por tales vacunas son con frecuencia de mayor magnitud y de mayor duración que aquellas producidas por inmunogenes no replicantes. Una explicación para esto puede ser que las cepas atenuadas vivas establecen infecciones limitadas en el huésped y mimetizan las etapas tempranas de la infección natural. Además, distintas de las preparaciones vivas, las vacunas vivas son capaces de inducir respuestas potentes mediadas por células las cuales pueden ser conectadas con su capacidad para replicarse en las células que presentan el antígeno, tales como los macrófagos. Ha habido una gran historia del uso de las vacunas vivas de Salmonella como vacunas seguras y efectivas para la prevención de la salmonelosis en animales y humanos. En efecto, la vacuna tifoidea oral atenuada viva, Ty21a (Vivotif), fabricada por el Swiss Serum Vaccine Institute, ha probado ser una vacuna muy exitosa para la prevención de la fiebre tifoidea y se ha autorizado en muchos países incluyendo los Estados Unidos y Europa. Sin embargo, la atenuación de esta cepa se logra usando técnicas de mutagénesis químicas y la base de la atenuación de la cepa no está totalmente entendido. Debido a esto, la vacuna no es ideal en términos del número de dosis (actualmente cuatro) y el número de organismos vivos que se han dado en cada dosis. Las técnicas de biología molecular moderna, acopladas con el conocimiento incrementado de la patogénesis de Salmonella, ha llevado a la identificación de varios genes que son esenciales para el crecimiento in vivo y la sobrevivencia de los organismos. Esto ha proporcionado nuevos objetivos de genes para la atenuación, llevando al concepto que las cepas de vacunas futuras pueden ser atenuadas "racionalmente" al introducir mutaciones no revertidas definidas en los genes seleccionados conocidos para estar implicados en la virulencia. Esto facilitará el desarrollo de las vacunas mejoradas, particularmente en términos de inmunogenecidad y por lo tanto el número de dosis que tienen que ser dadas . Aunque son conocidas ahora muchas cepas atenuadas de la Salmonella, unas cuantas han sido calificadas como candidatas de vacunas potenciales para uso en humanos. Esto puede ser debido en parte a la necesidad para equilibrar la inmunogenecidad de la vacuna con la posibilidad de que llegue a ser reactivo el microorganismo de Salmonel la . Es claro que la selección de objetivos apropiados para la atenuación los cuales resultarán en un candidato de vacuna adecuado, es bastante sencillo y no puede ser fácilmente predicho. Muchos factores pueden influir la idoneidad de la cepa atenuada como una vacuna apropiada, y se está llevando a cabo mucha investigación para identificar las cepas adecuadas. Por ejemplo, muchas cepas atenuadas probadas como candidatas a vacuna llevan a la vacunosis o abscesos en el paciente. Es por lo tanto deseable desarrollar una vacuna que tiene un alto grado de inmunogenecidad con posibilidad reducida de la cepa del microorganismos que revierte a una forma reactiva y la cual exhibe un perfil de buena seguridad con efectos laterales limitados. La presente invención se basa en el descubrimiento de que dos mutaciones atenuantes específicas introducidas en un microorganismo de Salmonella pueden producir una vacuna que tiene un alto grado de inmunogenecidad y un bajo riesgo del microorganismo para revertir a una forma reactiva. Las cepas de la vacuna resultante exhiben un buen perfil de efecto lateral. La primera mutación está contenida dentro de una región de la isla dos de la patogenecidad de la Salmonel la
»»>-«Jl.Mja (Spi2); la segunda es una mutación auxotrófica, es decir, una mutación para alterar la expresión de un gen que codifica una proteína requerida en una trayectoria biosintética. De acuerdo a un primer aspecto de la invención, un microorganismo de Salmonel la tiene una mutación atenuante la cual altera la expresión de un gen aparato ubicado dentro de la isla de patogenecidad Spi2, y una mutación auxotrófica independiente. La mutación atenuante preferida está dentro del gen aparato ssaV, y la mutación auxotrófica preferida está dentro de aroC. El microorganismo preferentemente además comprende uno o más antígenos heterólogos o proteínas terapéuticas, por ejemplo los antígenos para la E. coli patogénica, Shi gel l a , hepatitis A, B o C, el virus del Herpes simple y el virus del papiloma humano. Por lo tanto, el microorganismo puede actuar como un vehículo de suministro para inmunizar contra las infecciones diferentes a la Salmonel la . Pueden ser usados los microorganismos de Salmonel la en la fabricación de un medicamento para el suministro intravenoso u oral para el tratamiento de una infección bacteriana o viral, por ejemplo, para el tratamiento de la tifoidea . Los microorganismos de Salmonel la atenuados de la presente invención forman vacunas las cuales estimulan sorpresivamente las mucosas así como también la inmunidad sistemática. Además, los microorganismos no provocan abscesos de vasos en un modelo animal, mientras que si lo hacen los mutantes con mutaciones sencillas. Esto es una ventaja particular de las dobles mutaciones como se definen en la presente. Los microorganismos y composiciones de vacunas de la presente invención pueden ser preparados por técnicas conocidas . La elección del microorganismo de Salmonel la particular y la selección de la mutación apropiada, pueden ser hechos por la persona experta sin experimentación prolongada. Un microorganismo preferido es Salmonel la typhimuri um. Puede ser introducida una primera mutación en un gen aparato ubicado dentro de la región de la isla 2 de patogenicidad de la Salmonel la, esta región está descrita en la solicitud WO-A-9617951. La isla dos de patogencidad de la Samonella (Sp?2) es una de las dos islas de patogenicidad clásicas en el cromosoma de la Salmonella. Spi2 comprende varios genes que codifican un sistema de secreción del tipo III implicado en transportar Spi2 codificado por proteínas asociadas con la virulencia (también llamadas proteínas efectoras) fuera de la bacteria de la Salmonella y dirigidas potencialmente en las células huésped objetivo tales como macrófagos. Parte de la Spi2 (los genes aparatos) codifican el aparato de secreción del sistema tipo III. Spi2 es absolutamente esencial para la patogénesis y la virulencia de la Salmonel la en el ratón, una observación ahora documentada por varios grupos diferentes 5 alrededor del mundo. Las mutantes de S . typhimurium Spi2 son altamente atenuantes en ratones infectados por las rutas de administración oral, intravenosa e intraperitoneal Los genes aparatos ubicados dentro de Sppi2 están ahora bien caracterizados; véase por ejemplo Hensel et al, 10 Molecular Microbiology (1997); 24(1): 155-167. los genes adecuados para uso en la presente invención incluyen los genes ssaV, ssaJ, ssaK, sal, ssaM, ssaO, sep, ssaQ, ssaR, ssaS, ssaT, ssaU y ssaH La mutación en la región Spi2 no tiene que estar 15 necesariamente dentro de un gen para alterar la función. Por ejemplo, una mutación en una región regulatoria corriente arriba puede también alterar la expresión del gen, llevando a la atenuación. Las mutaciones en una región intergénica pueden ser también suficientes para alterar la función del 20 gen . En una modalidad preferida de la invención, el gen aparato es ssaV. En una modalidad preferida separada, la mutación está dentro de una región intergénica entre ssaJ y ssaK. 25 La segunda mutación es nombrada una "mutación
miflMJi.lHlM"-"'6''-'"- * -• •-'••, ¡i . .-.,->..-»^» auxotrófica" ya que altera un gen el cual es esencial en una trayectoria biosintética. La trayectoria biosintética es una presente en la Salmonel l a , pero no está presente en los mamíferos. Por lo tanto, las mutaciones no pueden depender de los metabolitos encontrados en el paciente tratado para solucionar el efecto de la mutación. Los genes adecuados para la mutación auxotrófica, incluyen cualquier gen aro, por ejemplo aroA, aroC, aroD y aroE. En una segunda modalidad preferida de la invención, la composición de la vacuna comprende un microorganismo de Salmonel la que tiene mutaciones atenuantes en ssaV y aroC. Las mutaciones pueden ser introducidas en el microorganismo usando cualquier técnica conocida. Preferentemente, la mutación es una mutación de eliminación, donde la alteración del gen es provocada por la escisión de los ácidos nucleicos. Alternativamente, las mutaciones pueden ser introducidas por la inserción de los ácidos nucleicos o por mutaciones de punto. Los métodos para introducir las mutaciones en las regiones específicas serán aparentes para la persona experta. Además de las dos mutaciones, el microorganismo de Salmonel la puede también comprender antígenos heterólogos. El microorganismo atenuado puede por lo tanto actuar como un vehículo de suministro para administrar antígenos contra otras infecciones bacterianas o virales. Los antígenos los cuales son adecuados para uso en esta forma serán aparentes para la persona experta e incluyen: Antígenos de E. coli patogénicos, es decir, ETEC Antígenos de la hepatitis A, B y C Antígenos de la enfermedad de Lime Antígenos de vi po cholera Antígenos de Helicobacter Antígenos del virus del herpes simple Antígenos del virus del papiloma humano El sistema también tiene el potencial para suministrar proteínas terapéuticas, por ejemplo, .as citosina, para el tratamiento de los pacientes, por ejemplo pacientes infectados con la hepatitis. Los métodos para el suministro de los antígenos heterólogos o proteínas terapéuticas que usan las composiciones de vacunas serán aparentes para una persona experta. Las vacunas hechas al usar los microorganismos de la invención tienen aplicación para el tratamiento de infecciones en pacientes humanos y en el tratamiento de infecciones veterinarias. La doble mutación proporciona un medio efectivo para atenuar el microorganismo para proporcionar un candidato de vacuna seguro. Las composiciones de vacunas proporcionan una protección efectiva incluso en pacientes inmunocomprometidos,
"*-*«» >k - •-'•"faA* y en forma importante ofrecen un bajo riesgo en desarrollar abscesos de vasos. Se han identificado los abscesos de vasos usando vacunas en base a una sola mutación, y por lo tanto las composiciones presentes pueden ofrecer un beneficio substancial a los pacientes. Para formular las composiciones de vacunas, los microorganismos con mutaciones pueden estar presentes en una composición junto con cualquier adyuvante, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las formulaciones adecuadas serán aparentes para la persona experta. Las formulaciones pueden ser desarrolladas para cualquier medio de administración adecuado. La administración preferida es vía las rutas orales o intravenosas y las vacunas son microorganismos de Salmonella atenuados vivos. El número de microorganismos que son requeridos para estar presentes en las formulaciones pueden ser determinados y optimizados por la persona experta. Sin embargo, en general, un paciente puede ser administrado aproximadamente con 10 -1010 UFC, preferente y aproximadamente 108-109 UFC en una sola unidad de dosis. Los siguientes Ejemplos ilustran la invención. Ejemplo 1 Este ejemplo describe la preparación de una cepa con mutación designada como ZH9 la cual tiene actividad como una vacuna tifoidea oral humana. La cepa se deriva de la cepa de S . Typhi virulenta Ty2, aislada originalmente a partir de un caso de tifoidea. La cepa derivada tiene una mutación definida dentro de purA y aroA. Ty2 para la construcción de ZH9 Se aisla originalmente la S . Typhi Ty2 a partir de un individuo con fiebre tifoidea en 1916 y se ha usado para la derivación de todas las vacunes de tifoidea autorizadas. Se obtiene la cepa a partir de la colección de cultivos nacional PHLS en Colindale. Esta se obtiene como un cultivo liofilizado, el número de NCTC que es 8385. Se recupera la 5. Typhi Ty2 a partir de una provisión y se hace crecer durante la noche en caldo de Luria Bertani (LB) . Se cosechan las células y se prepara el ADN celular entero. Se generan los fragmentos de ADN de S . Typh i Ty2 por escisión parcial con la enzima de restricción Sau3A y se ligan los fragmentos resultantes a BamHl escindido con pHC79 para generar una biblioteca de cósmidos de ADN de S . Typhi Ty2 usando E. coli HU835 como un receptor. Para aislar el ADN que codifica aroC a partir del ADN de 5. Typhi , se usa la biblioteca de cósmidos para transducir E . coli AB284b» la cual aloja una mutación en el gen aroC y es dependiente de los compuestos aromáticos para crecimiento. Se lleva a una placa la mezcla de transducción en un medio mínimo que carece de los compuestos aromáticos y se incuba a 37 °C. SE observa un número de colonias aisladas después de la incubación durante la noche. Estas bacterias tienen origen presumiblemente como una consecuencia de la complementación de la mutación de aroC en AB2849 por un clon de cósmido a partir del cual se aloja el gen intacto aroC. Se purifica el ADN del cósmido a partir de una de estas cepas. Se clona un fragmento HindIII de 5.2 kb a partir de este cósmido en pUCld para dar el plásmido pTAC2 el cual es capaz de complementar la eliminación de aroC en AB2849, lo cual demuestra que este contiene un gen aroC de 5 typhi . Generación de una eliminación definida de aroC de
S. typhi clonado Se crea una eliminación de 6000 pb definida dentro del gen aroC clonado usando PCR. Los cebadores de oligonucleótidos usados en la PCR se diseñan usando la secuencia de ADN publicada del gen aroC de S. typhi (Acceso M27715) . Se amplifica el 5' del ADN al gen aroC a partir de pTAC2 usando los cebadores SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 1 La SEQ ID NO. 3 templa al ADN del vector, la SEQ ID NO. 1 templa a la región 5' de aroC. El 3' de ADN al gen aroC se amplifica usando los cebadores SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 2. La SEQ ID NO. 4 templa al ADN vector, la SEQ ID NO. 2 templa a la región 3' de aroC. Los productos de la PCR resultantes tienen los sitios Xbal incorporados en los extremos 5 ' para facilitar la clonación. Se clonan los fragmentos en el vector pUCld. La construcción de plásmidos final designada pMIAC23 contiene una eliminación definida de aroC (posición 544 a 1143) en un fragmento de HindIII de 4.8 kb . Se inserta el fragmento de HindIII en el sitio HindIII de pUC18. Está presente un solo sitio Xbal en el sitio de la eliminación de aroC. Introducción de la mutación de aroC en el genoma de S. typhi Ty2 Se usa el plásmido suicida pCVD422 (Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310-4317) como un vector para introducir la eliminación aroC en el genoma de S . typhi Ty2. El fragmento de HindIII de 4.8 kb el cual contiene la eliminación aroC se aisla a partir de pMIAC23 y se hacen romos los extremos al usar el equipo de pulido de ADN de Stratagene. Se lineariliza el plásmido pCVD442 por digestión con Smal, se trata con fosfatasa alcalina y se liga a los fragmentos de extremos romos. Se aisla la construcción requerida y se denota como pYCVC21. Se introduce pYCVC21 en S. typhi Ty2 al usar un protocolo de electroporación estándar. El plásmido es capaz de integrarse al genoma de Ty2 después de la recombinación entre las regiones homologas en el plásmido y el genoma para dar las transformantes resistentes a la ampicilina. Estos transformantes contienen una copia de tanto el aroC del tipo silvestre original y el gen aro eliminado. Al hacer crecer estas cepas en la ausencia de ampicilina se permite que ocurra un segundo evento de recombinación el cual resulta en la pérdida de las secuencias de ADN de pCVD442 y una copia del gen de aroC, tanto la copia del tipo silvestre o la copia eliminada. Las bacterias de S. typhy Ty2 las cuales tienen que sufrir este segundo evento de recombinación son identificadas como derivados sensibles a la ampicilina los cuales son capaces de crecer en la presencia de 5% de sacarosa (pCVD442 porta el gen sacB el cual cuando se expresa resulta en un fenotipo sensible a la sacarosa) . Las cepas que han retenido solamente el gen de aroC eliminado son inicialmente identificadas como las cepas que no son capaces de crecer en placas de medio mínimo en la ausencia de un complemento de compuestos aromáticos. Se confirma el genotipo aroC al usar el análisis de PCR. Los cebadores que tienen la SEQ ID NO. 5 y la SEQ Id NO. 6 dan un producto de 994 pb para el aroC del tipo silvestre y 400 pb para el gen aroC eliminado. El análisis de secuencia de los productos de PCR resultantes confirma la presencia de la eliminación requerida en 5 aislados individuales designados DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 y DTY10. Estas cepas se almacenan en viales Microbank en -70°C por almacenamiento a largo plazo. Se elige la cepa DTY8 para manipulación adicional . Introducción de una mutación ssaV en la mutante DTY8 de aroC de S. typhi Se amplifica un fragmento de Pstl de 7.5 kb que contiene la región ssaV de S . typh i a partir de una preparación de ADN total al usar PCR y se clona en el vector pCR2.1 (Invitrogen). Los cebadores de oligonucleótido de PCR empleados, que tienen la SEQ ID NO. 7 y la SEQ ID NO. 8, se diseñan a la secuencia de SP12 de S . typhimuri um. Se designa pTYSV21 a la construcción de plásmido resultante. Una construcción de plásmido que posee una eliminación del gen ssaV se deriva a partir de pTYSV21 al usar PCR de orientación inversa. Los cebadores que templan las regiones 5' (SEQ ID NO. 9) y 3' (SEQ ID NO. 10) de la estructura de lectura abierta ssaV se diseñan para la secuencia de S. typhimuri um Spi2. Se incorpora un sitio de restricción Avrli en la región 5' de cada cebador, se incorpora un sitio Xbal en la SEQ ID NO. 10. El sitio Xbal sirve como una etiqueta para la mutación ssaV de tal forma que ésta puede ser detectada fácilmente por análisis de restricción. Se somete el producto de PCR resultante a la digestión con Avrli y se purifican las moléculas de plásmido principales después de la electroforesis de gel de agarosa. La recircularización de los fragmentos resultantes en Jos extremos adhesivos Avrli dan la construcción pYDSVl de eliminación requerida. La pYDSVl contiene un fragmento Pstl de 5.5 kb con una eliminación de 1894 pb definida dentro de la estructura de lectura abierta ssaV. Se usa el plásmido suicida pCVD442 como un vector para introducir la eliminación ssaV en el genoma del mutante DTY8 de aroC de S . typhi Ty2. Se aisla el fragmento Pstl de 5.5. kb que contiene la eliminación ssaV a partir de pYDSVl y se hacen romos los extremos por tratamiento con ADN polimerasa de Klenow. Se lineariza el plasmid? pCVD44._ . ¡ digestión con Smal, se trata con fosfatasa alcalina y se liga a los fragmentos de extremos romos. Se aisla la c?nsliüiv ?,,n requerida y se denota como pYDSV214. Se introduce la pYDSV214 en S . typhi DTY8 al usarelectroporación. Se seleccionan los transforinantes resistentes a la ampicilina y después se hacen crecer en la ausencia de ampicilina para permitir la pérdida de secuencias de ADN de pCVD442 y una copia del gen ssaV, tanto la copia del tipo silvestre o la copia eliminada. Las cepas que han sufrido este segundo evento de recombinación son identificadas como colonias sensibles a la ampie íl ina, resistentes a la sacarosa. Se identifican las cepas que han retenido solamente el gen ssaV eliminado al usar el análisis de PCR. Los cebadores que tienen la SEQ ID NO. 11 y la SEQ ID NO. 12 dan un producto de 2485 pb para el ssaV del tipo silvestre y 591 pb para el gen ssaV eliminado. El análisis de secuencia de los productos de PCR resultantes confirma ia presencia de la eliminación requerida en 5 aislados individuales, ZH2, ZH4, ZH6, ZH7, y ZH9. Se elige la cepa ZH9 por la fabricación de un banco celular maestro CGMP.
Ejemplo 2 Este Ejemplo describe la preparación de una cepa mutante de 5. typhimurium designada WT05 la cual tiene la actividad de vacuna contra la gastroenteritis humana. Se deriva la cepa a partir de la cepa TML virulenta humana de 5. typhimuri um. TML para la construcción de T05 Se aisla originalmente la TML a partir de un paciente que sufre de gastroenteritis y se identifica en lc^ laboratorios del Dr . John Stevens en la Bi rm_ nqhnm University. Se liofiliza en Wellcome Research Laboratories y se le asigna un número de cultivo, BRD 519. Se obtiene el cultivo a partir de Birmingham University. Generación de una eliminación definida del gen ssaV de S . typhimurium Se genera un plásmido (plásmido 7-2, Shea et al; PNAS, 1996; 93: 2593-2597) por clonar un fragmento Pstl de 7.5 kb aislado a partir de S . typhimuri um LT2 en el sitio Pstl de pUCld . Se coloca ssaV centralmente en este fragmento. Se deriva una construcción de plásmido que contiene una eliminación definida del ORF de ssaV a partir del plásmido 7-2 al usar la PCR de orientación inversa. Los cebadores que templan a las regiones 5' (SEQ ID NO. 13) y 3' (SEQ Id NO. 14) de la estructura de lectura abierta ssaV se diseñan para la secuencia S . typhimuri um Sp2. Se incorpora un sitio de restricción Avrli en la región 5' de cada cebador y se incorpora un sitio Xbal en la SEQ ID NO. 14. El sitio Xbal sirve como una etiqueta para la mutación ssaV de tal forma que esta puede ser detectada fácilmente por análisis de restricción. Se somete el producto de PCR resultante a digestión con Avrli y se purifican las moléculas del plásm-du principal después de la electroforesis de gel de agarosa. La recircularización de los fragmentos resultantes tu 1 ^ extremos adhesivos Avrli da la construcción de eliminación requerida designada pMDSVl . pMDSVl contiene un fragmento Pstl de 5.5 kb con una eliminación de 1894 pb definida dentro de la estructura de lectura abierta ssaV, un sitio de restricción Avrli y Xbal está en el sitio de la eliminación. Se usa el plásmido suicida pCVD442 como un vector para introducir la eliminación ssaV en el genoma de TML de S. typhimuri um. El fragmento Pstl de 5.5. kb que contiene la eliminación de ssaV se aisla a partir de pMDSVl y se hacen romos los extremos por tratamiento con ADN polimerasa de Klenow. Se lineariliza el plásmido pCVD442 por digestión con Smal, se trata con fosfatasa alcalina y se liga a los fragmentos de extremos romos. Se aisla la construcción requerida y se denota como pMDSV22. Se introduce pMDSV22 en TML de 5. typh imuri um usando la conjugación. Se transforma para este extremo la construcción en la cepa de E. coli S17-1 ? pir. Se realiza la conjugación de acuerdo a los procedimientos estándar. El plásmido pMDSV22 es capaz de integrarse en el genoma de TML después de la recombinación entre las regiones homologas en el plásmido y el genoma para dar los transconjug d ? resistentes a ampicilina. Se elige un transconjugado designado mdsv-WT2 para manipulaciones adicionales. Este transconjugado contiene una copia de tanto el gen ssaV del tipo silvestre original y el gen ssaV eliminado. Este se hace crecer en la ausencia de ampicilina para permite que ocurra un segundo evento de recombinación el cual puede resultar en la pérdida de las secuencias de ADN de pCVD442 y una copia del gen de ssaV, tanto la copia del tipo silvestre o la copia eliminada. Se identifican los aislados los cuales han sufrido este segundo evento de recombinación como derivados sensibles a la ampicilina los cuales son capaces de crecer en la presencia de sacarosa al 5% (pCVD442 porta el gen sacB el cual cuando se expresa resulta en un fenotipo sensible a sacarosa) . Se identifican las cepas que han retenido solamente el gen ssaV eliminado al usar el análisis de PCR. Los cebadores que tienen la SEQ Id NO. 15 y la Seq Id No. 16 dan un producto de 2485 pb para el gen ssaV del tipo silvestre y 591 pb para el gen ssaV eliminado. El análisi de secuencia de los productos de PCR resultantes confirma la presencia de la eliminación requerida en 4 aislados individuales, ZH20, ZH23, ZH25, y ZH26. Se almacenan estas cepas en Lb más glicerol al 15% en 80 °C por almacenamiento a largo plazo. Se elige la cepa ZH26 para manipulación adicional . Clonación del gen de aroC de S. typhimuri?m a 5 partir de TML de S. typhimurium Se aisla el ADN genómico a partir de TML de S. typhimuri um y se escinde con HindIII. Se purifican los fragmentos de HindIII en el intervalo de tamaño de 5 a 6 kb y se ligan a pBluescript escindida con HindIII. Se usa la
10 mezcla de ligación para transformar una mutante de aroC de E . coli , AB2849, y los clones que contienen el gen aroC de 5. typhimuri um se seleccionan por virtud de su capacidad para complementar esta cepa. El análisis de un clon, pDACl, demuestra que éste contiene un fragmento HindIII de 5.2 kb .
15 Se crea una eliminación de 600 pb definida dentro del gen aroC clonado por usar la PCR. Se designan los cebadores de oligonucleótidos al usar la secuencia de ADN publicada del gen aroC de S . typhi (Acceso M27715) . Se amplifica el 5' del ADN al gen aroC a partir de pDACl al
20 vector de ADN, la SEQ ID NO. 17 templa a la región 5' de aroC. Se amplifica el 3' del ADN del gen aroC usando los cebadores que tienen la SEQ Id NO. 20 y la SEQ ID NO. 18. La SEQ ID NO. 20 templa al vector de ADN, la SEQ ID NO. 18 templa a la región 3' de aroC . Los productos de PCP
25 resultantes tienen sitios Xbal incorporados en los extremos
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5' para facilitar la clonación. Se clonan los fragmentos en el vector pUCl8. La construcción de plásmido final pMIACd contiene una eliminación definida de aroC (acceso M2771^ posición 544 a 1143) en un fragmento HindIII de 4.8 kb . Se inserta el fragmento HindIII en el sitio HindIII de pUC18. Un solo sitio Xbal está presente en el sitio de la eliminación. Introducción de la mutación aroC en la mutante ZH26 de ssaV de S. Typhimurium Se usa el plásmido pCVD442 como el vector para introducir la eliminación aroC en el genoma de TML de S. typhimurium. El fragmento HindIII de 4.8 kb que contiene la eliminación aroC se aisla a partir de pMIACS y se hacen i los extremos al usar el equipo de pulido de ADN de Stratagene (Parte No. 200409) . Se lineariliza el plásmido pCVD442 por digestión con Smal, se trata con fosfatasa alcalina y se liga a los fragmentos de extremos romos. Se aisla la construcción requerida y se denota como pMCVCl6. Se introduce el pMCVClß en ZH26 de S . typhimuri um al usar la electroporación. Se seleccionan las transformantes resistentes a ampicilina y se permite que crezcan en la ausencia de ampicilina para permitir la pérdida de las secuencias de ADN de pCVD442 y una copia del gen de aroC, tanto la copia del tipo silvestre o la copia eliminada. Las cepas que han sufrido este segundo evento de recombinación son identificadas como derivados sensibles a ampicilina que son capaces de crecer en la presencia de sacarosa al 5%. Las cepas que han retenido solamente el gen aroC eliminado se identifican inicialmente como las cepas que no son capaces de crecer en placas de medio mínimo en la ausencia de un complemento de compuestos aromáticos. Se confirma el genotipo de aroC al usai el análisis de PCR. Los cebadores que tienen la SEQ ID NO. 21 y la SEQ ID NO. 22 dan un producto de 994 pb para el aroC del tipo silvestre y 400 bp para el gen aroC eliminado. El análisis de secuencia de los productos PCR resultantes confirma la presencia de la eliminación requerida en 4 aislados individuales designados WT05, WT09, WT10 y WT12. Se elige la cepa WT05 para la fabricación de un banco de células maestras CGMP. Ejemplo 3 Se prepara la siguiente construcción para probar las vacunas con mutaciones dobles en un modelo animal . Se usa SL 1344 de S . typhimuri um, una cepa que infecta ratones, con mutaciones sencillas y doblas presentes. Una mutación ssaV::aph (no polar) a partir de 5. typhimuri um 12023s es P22 transducido a SL1344 para dar el mutante Spi2 solo. Se electropora la eliminación de aroC/vector suicida pMCVC16 de pCVD422 en la cepa LB5010 de 5. typhimurium y se obtienen los merodiploides. El mer0dipl04.de de eliminación aroC es entonces transducido P22 a partir del
- -merodiploide LB5010 a SL 1344. Se resuelve entonces eL merodiploide SL 1344 usando la selección de sacarosa para dar el mutante aroC solo. Se genera la mutación doble por transduccióii T 22 del merodiploide de eliminación de aroC a partir de LB5010 en ssaV::aph de SL1344. Se resuelven las secuencias de plásmidos a partir del merodiploide que deja la cepa 3, la mutación de la eliminación aroC en el antecedente ssaV::aph de SL1344. Estudios farmacodinámicos preclínicos en mutantes de Salmonella aroC/ssaV Se han evaluado extensivamente los mutantes de la Salmonella (cepa SL1344) que alojan las mutaciones definidas en tanto aroC, ssaV o una combinación de ambas mutaciones °n ratones BALB/C para evaluar la atenuación, la persistencia de los organismos y la capacidad para inmunizar contra retos con la cepa del tipo silvestre. Ejemplo 4 Animales inmunizados por la ruta intravenosa Estudios de protección Se inmunizan los grupos de diez ratones BALB/C i.v. con 105 y 106 organismos de SL1344 aroC, SL1344 ssaV y SL1344 aroC: se hace crecer ssaV durante la noche en caldo de LB y se vuelve a suspender en solución salina para administración. Se les realiza un reto a los ratones seis semanas más tarde con 105 organismos del tipo silvestre dados intravenosamente.
Diez organismos de esta cepa del tipo silvestre dados intravenosamente son suficientes para matar ratones. Todos los ratones a los que se les dan los mutantes aroC y ssaV sencillos son protegidos sólidamente después del reto con cualquier dosis y permanecen bien en todo el experimento, sin exhibir algún signo de enfermedad. Para Las mutaciones dobles 90% de los animales son protegidos sólidamente los cuales reciben la inmunización con 10 organismos. Uno de los animales muere 8 días después ^] reto. Para los animales gue se inmunizan con dosis bajas, solamente uno de los ratones sobrevive al reto. Este experimento demuestra que la inmunización con mutantes de ssaV de Salmonel la , tanto solos, o en combinación con una mutación de aroC inmunizará ratones contra retos con la cepa de Salmonella del tipo silvestre. Persistencia de las cepas Se les da a los grupos de ratones 10 organismos de las tres mutantes de Salmonel la descritas anteriormente. Se sacrifican cuatro ratones en diferentes puntos de tiempo hasta el día 14 y se realiza la enumeración de los organismos en hígados y vasos. Las cuentas de todas las tres mutantes se comparan hasta el día 10 cuando las cuentas son aproximadamente 5 X 105 organismos en cada órgano. Se demuestra en el día 14 una diferencia entre las mutaciones sencillas y las mutaciones dobles, hay una pérdida logarítmica en los números de los organismos con mutaciones dobles en tanto hígado y vasos. La otra diferencia importante entre la mutación sencilla y la mutación doble aroC/ssaV es que no hay abscesos
5 de hígado presentes en cualquier momento durante el experimento para las mutaciones dobles. Sin embargo, Los ratones i fectados con las mutaciones sencillas no tienen abscesos en el hígado presentes en el dia 1U y 14. Esto es un descubrimiento importante y soporta fuertemente el uso de
10 esta combinación de mutaciones para la evaluación de la preparación de las vacunas. Inmunogenecidad Los ratones inmunizados como anteriormente son sangrados y se determinan los títulos del anticuerpo contra 15 la Salmonel la celular completa usando un ELISA. Se demuestra que todas las tres cepas son altamente inmunogénicas, las cuales producen tres títulos de IgG circulante contra La Salmonella . Ejemplo 5 20 Animales inmunizados por la ruta oral Persistencia de cepas Se sacrifican grupos de ratones inmunizados oralmente con 5X109 organismos de cada una de las tres inmunizaciones de Salmonel l a en intervalos periódicos y se
25 enumeran los números de organismos en hígados y vasos. Para
Mi^ímsu ti a? m la mutación sencilla aroC y la mutación sencilla ssaV las cuentas en hígados y vasos son 103 y 10 respectivamente hasta aproximadamente el día 21. Después de este se reducen los números. Para los ratones que reciben las mutaciones dobles aroC:ssaV, los organismos son virtualmente no detectables en los hígados y vasos después de la inmunización oral. Inmunización oral y reto intravenoso de ratones A-J vacunados con TML de Salmonella Typhimurium aroC/ssaV (WT05) El propósito de este experimento es determinar la eficacia protectora de 5X109 de mutantes de TML de S. typhimuri um aroC/ssaV en una vacunación de murino ity oral y el modelo de reto intravenoso. Este modelo se asemeja cercanamente a la respuesta humana a Salmonel l a ya que estos animales son menos susceptibles que un antecedente ity5. Se inoculan 5X109 aroC/ssaV de TML de S . typh imuri um en un volumen de 0.2 ml de PBS oralmente or t uno de gavage en 10 ratones A-J de 6-d semanas de edad y se dejan 8 semanas. Después de que han transcurrido 8 semanas se retan los dos grupos inmunizados intravenosamente con 10 TML do 5. typhimuri um del tipo silvestre. Se observan los ratones por 30 días post reto. Todos los animales se protegen sólidamente contra el reto del tipo silvestre (100% de sobrevivencia, 10/10 animales vivos) . Se les da a los ratones PBS solo y después se les hace un reto con TML de S . typh imuri um del tipo silvestre y se sacrifican en el día 6 post reto. En un antecedente ityr el aroC/ssaV de TML de 5. typhimuri um doble parece proteger ratones que se les da una dosis oral de 5 x 109. Esto puede ser importante para la situación humana ya que los ratones ?ty' son un mejor modelo de salmonelosis humana, en términos de susceptibilidad a la infección . Se realizan también estudios para evaluar la persistencia de las mutaciones dobles en los Luyad?s y „c?, de los ratones. Se descubrió que las mutaciones dobles persisten en niveles bajos alrededor del día 21. Por el día 28, la cepa mutante ha sido limpiada. Ejemplo 6 Prueba clínica humana Se reclutan 18 voluntarios saludables para un estudio no controlado con placebo, de etiqueta abierta Después del tamizado apropiado, cada uno de los 3 voluntarios reciben una dosis oral sencilla de tanto 10'7, lü8 o 10* UFi de ZH9 de S . typhi o WT05 de S . typhímuri um . Se preparan los microorganismos como anteriormente y se vuelven a suspender en las concentraciones de dosificación apropiadas t- n un volumen final de 100 ml de solución de bicarbonato de sodio al 2% (p/v) para neutralizar el ácido gástrico. Se administra oralmente esta suspensión liquida a los voluntarios. Se aislan entonces los voluntarios por 72 horas, y después se siguen hasta la post inmunización para seguridad e inmunogenecidad . Se evalúan los voluntarios para reac togenicidad otros eventos adversos asociados con la vacunación por 5 observación, examinación física y por la completación de las tarjetas diarias. Además, se recolectan los cultivos sanguíneos, de heces y orina para ensayo para vacunosis, sangrado y persistencia de las cepas de vacunas. Adicionalmente se obtienen los datos de seguridad por medir
10 los niveles de proteína C reactiva (CRP) y enzimas de la función del hígado (ALT) en sangre, cuentas celulares de glóbulos blancos totales y proporciones de sedimentación de eritrocitos (ESR) usando los procedimientos estándar. Se miden estos parámetros en la sangre tomada diariamente hasta
15 el día 7 y después en intervalos semanales hasta el día 28, Análisis de las respuestas de las mucosas e inmunes sistémicas Se recolectan las muestras de sangre y saliva antes a la inmunización y después en los días 7, 14, 21 y 28
20 después de la inmunización. Se congelan la saliva y el suero a -70°C hasta el análisis por ELISA. Se recolectan las células mononucleares sanguíneas periféricas y se ensayan para la presencia de células secretoras de anticuerpos (ASC) usando la técnica de ELISPOT. 25 Tanto ZH9 de S . typhi y WT05 de S . typh imuri um son
láßHíaÉriuaMÉaM bien toleradas en todos los voluntarios. No se notan eventos adversos serios en cualquiera de los voluntarios en cada uno de los tres niveles de dosis y los cultivos de sangre orina permanecen negativos en todas las vacunas en todos los puntos 5 de tiempo examinados. De esta forma, la inmunización con tanto ZH9 de S . typhi y WT05 de S . typhimuri um no resultan en vacunosis. Ninguno de los voluntarios que se les da cualquiera de las cepas desarrolla diarreas o fiebre de ul grado persistente, lo cual indica además de la seguridad de
10 las cepas de vacunas. No se observa excreción persistente ni vacunosis más allá del día 7 en ninguno de los 3 grupos de dosis de ZH9 de S . typhi o en bajas dosis de WT05 de S . typhimuri um (10 ) . Respuestas de mucosas e inmunes sistemáticas
15 producidas por ZH9 de S. typhi La inmunización oral con una sola dosis baja (1X10 UCF) de ZH9 de S . typhi resulta en la imprimación de ASC que secreta IgA específico a 5. typhi en 2 de tres voluntarios detectados 7 días después de la inmunización. Las pruebas
20 subsecuentes en los días 14 y 21 muestran que ASC de IGA son todavía detectables pero en niveles mucho menores y han desaparecido por el día 28. En casi todas las respuestas a las vacunas, todos los números de ASC son más altos en el dia 7. Sorpresivamente, la ingestión de una dosis superior (10
25 UFC) de ZH9 de S typhi resulta en una respuesta ASC de Ta
jnwum baja en solamente una de las tres vacunas. La ingestión de la dosis más alta (1 XlO9 UFC) imprimen ASC de IgA en 2 d^ . voluntarios . Respuesta del anticuerpo sérico específico a Salmonella La inmunización oral con una sola dosis baja ?J,?¡) UFC) de ZH9 de S . typhi falla para producir el IgG sérico específicao a LPS de S . typhi (a pesar de generar ASC de IgA en 2/3 vacunas) cuando se examinan en los días 7, 14, 21 v 28. Similarmente solamente 1/3 produce niveles muy bajos de IgG específico a flagell a . Sin embargo, la ingestión de 10 UFC resulta en la producción de altos niveles de tanto LPS y IgG específico a fl agell a en todos los tres voluntarios. Se detectan niveles incrementados de LPS de S. typhi específicos y flagella específicos inicialmente en los / días despu s de la vacunación, incrementándose en el día 14 y permaneciendo altos en el día 28. La dosis más alta de 10 UFC también estimula IgG específico a LPS y fl a gel l a en ? de 3 vacunas, detectable en los días 7 y 14 respectivamente. Conclusiones Este estudio demuestra la utilidad de la mutación ssaV, como un componente de cualquier cepa de vacuna tiofoidea oral nueva. Una cepa de S . typhi que aloja las mutaciones aro solas pueden haber provocado vacunosis en las dosis dadas. La mutación ssaV por lo tanto proporciona un nivel adicional de seguridad para la mutación aro sola por abolir la vacunosis usando esta formulación temprana. Así como también se prueba que es bien tolerada, se demuestra también que ZH9 es inmunogénica en todos los tres niveles de dosis dados. Con respecto a estimular el anticuerpo sérico, la dosis intermediaria (10l< UFC) y la más alta (109 UFC) prueban que son altamente inmunogénicas, con 3/3 vacunas dadas con 108 UFC y 2/3 dadas con lü'J UFC las cuales producen altos títulos de tanto LPS de S . typhi y JgG sérico específico a flagella . Estas respuestas son muy alentadoras ya que es generalmente difícil producir el anticuerpo sérico por vacunación oral. Así como se generan las respuestas de anticuerpos séricos específicos a S. typhi, ZH9 también imprime A c de IgA, indicativo de la estimulación inmune en la mucosa intestinal. Un total de 5/9 voluntarios producen una respuesta celular secretora de IgA (ASC) específico a LPS de S . typhi la cual no parece ser dependiente a la dosis. WT05 también es bien tolerada y no se detecta vacunosis. En forma interesante, no se detectan diarreas o síntomas de gastroenteritis en ninguno de los voluntarios. Los datos previos obtenidos al usar la cepa TML mutante con mutaciones aro o SPI2 sencillas en S. typhimurium dados a los ratones sugieren que una mutación aroC/ssaV doble puede provocar algunos efectos intestinales locales por ejemplo, la diarrea, retorcijones en los humanos. La ausencia de estos eventos además soporta la utilidad de la combinación de las mutaciones aro y SPI2. Ejemplo 7 Portadores de antígenos heterólogos Para demostrar la utilidad de las cepas con mutaciones dobles ssaV/aroC para expresar y suministrar antígenos extraños, se transforma la WT05 con un plásmido (pBRD026) el cual expresa el gen para la subunidad de enterotoxina B lábil al calor de E. col i (LT-B) . Se inmunizan oralmente ratones BALB/C (n=10/grupo) en los días 0 y 28 con 109 UFC (200 ml ) en PBS) WT05 que expresa pBRD026, o con la cepa del vector WT05 (control) . Para comparación (y como un control positivo) se inmuniza un grupo de ratones (n=5) oralmente en los días 0 y 28 con 10 µg de LT purificado (Sigma) . Se inmunizan ratones de control negativos (n=5) oralmente en los días 0 y 28 con 200 µl de PBS. Se sangran los ratones a partir de la vena de la cola en los días 21, 28 y 35 y por una punción cardiaca en el dia 42 y se recolectan el suero y el lavado intestinal (dia 42 solamente) y se almacenan a -20°C. Todos a excepción de uno de los ratones inmunizados con WT05/LT-B producen IgG específico a LT (títulos de 3,000-50,000) en el día 28 después de una sola dosis oral. Ninguno de los ratones de control inmunizados oralmente con WT05 o PBS producen IgG específico a LT . La inmunización oral con una sola dosis de LT purificado produce títulos superiores de anticuerpo específico a LT (títulos de 6, 000->50, 000 ) . Cuandc el isotipo del IgG sérico específico a LT-B se examina, se encuentra que la cepa WT05 que expresa pBRD026 produce casi exclusivamente IgG2a específico a LT, lo cual indica una desviación hacia una respuesta inmune del tipo THl. En contraste, los ratones inmunizados con LT purificado (Sigma) producen casi exclusivamente IgGl especifico a LT, lo cual indica una respuesta del tipo TH2. Por lo tanto, el expresar la LT-B dentro de la cepa aroC/ssaV facilita la modulación inmune profunda. Las respuestas desviadas de THl generadas por la cepa aroC/ssaV de Salmonella serán importantes, cuando se expresen los antígenos a partir de los organismos patogénicos para los cuales son protectoras las re puestas del tipo THl.
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