KR20060101563A - 감염의 치료를 위한 감쇠된 미생물 - Google Patents
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Abstract
살모넬라 미생물은 Spi2 병원성 아일랜드내에 위치한 기구 유전자의 발현을 중단시키는 감쇠화 돌연변이 및 영양요구성 돌연변이를 갖는다. 따라서 미생물은 면역 반응을 유도하는 미생물의 효과를 유지하면서 미생물의 반응성을 예방하는 것을 돕는 이중 돌연변이를 갖는다.
살모넬라 미생물, 감쇠화 돌연변이, 영양요구성 돌연변이, 면역화
Description
본 발명은 세균성 또는 바이러스성 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물에 사용될 수 있는 감쇠된(attenuated) 미생물에 관한 것이다.
감쇠된 생(生) 미생물은 매우 효과적인 백신이라는 사실이 잘 입증되어 있다; 그러한 백신에 의해 유도된 면역 반응들은 비-복제 면역원에 의해 생성된 것들보다 종종 더 큰 규모이고 더 오래 지속된다. 이에 대한 설명 중 하나는 감쇠된 생 균주들은 숙주내에서 제한된 감염을 확립하고, 자연 감염의 초기 단계를 모사(mimic)한다는 것일 수 있다. 또한, 사멸된 조제물(preparation)과는 달리, 생 백신은 마크로파지(macrophage)같은 항원-제시 세포내에서 복제하는 능력과 연관될 수 있는 유력한 세포-중개(mediated) 반응을 유도할 수 있다.
동물 및 인간에게 살모넬라증(salmonellosis)의 예방을 위한 안전하고 효과적인 백신으로 감쇠된 살모넬라 생 백신을 사용하는 것은 오랜 역사를 갖는다. 사실, Swiss Serum Vaccine Institute에 의해 제조된 감쇠된 경구용 장티푸스 생 백신인 Ty21a(Vivotif)는 장티푸스 열병의 예방을 위한 매우 성공적인 백신임이 증명 되어 왔고, 미국 및 유럽을 포함한 많은 나라에서 인가되어 왔다.
그러나, 이 균주의 감쇠는 화학적 돌연변이 생성 기술을 이용하여 달성되었고, 균주의 감쇠에 대한 기초는 완전히 이해되지 않는다. 이 때문에, 투약(dose)의 수(현재는 4) 및 각 투약시 주어져야 하는 생 유기체의 수의 관점에서 백신은 이상적이지 않다.
살모넬라 병인론에 대한 늘어나는 지식과 연계된, 현대 분자 생물학 기술로 인하여 유기체들의 생체내 성장 및 생존을 위해 필수적인 여러 유전자들이 동정 (identification)되었다. 이것은 규정된 비-복귀성 돌연변이를 독성(virulence)에 관련된다고 알려진 선택된 유전자로 도입함에 의해 미래의 백신 균주가 "합리적으로" 감쇠될 수 있다는 개념을 이끌어 내는, 감쇠를 위한 새로운 유전자 표적을 제공해왔다. 이는 특히 면역원성, 및 이로 인하여 주어져야만 하는 투약의 수의 관점에서 개선된 백신의 발전을 촉진할 것이다.
살모넬라의 많은 감쇠된 균주가 현재 공지되어 있더라도, 인간에게 사용하기 위한 유력한 백신 후보로 적합한 것들을 거의 없다. 이는 부분적으로는 백신의 면역원성과 살모넬라 미생물이 반응하게 되는 가능성의 균형을 맞추기 위한 필요 때문일 것이다.
적합한 백신 후보를 야기하는 감쇠에 대한 적절한 표적의 선택은 수월하지 않고, 쉽게 예상될 수 없다는 것은 명백하다. 많은 인자들이 적절한 백신으로서 감쇠된 균주의 적합성에 영향을 주고, 적합한 균주를 동정하기 위한 많은 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 백신 후보로서 시험된 많은 감쇠된 균주들은 환자에서 백 신증(vaccinemia) 또는 농양을 초래한다.
따라서, 미생물 균주가 반응성 있는 형태로 복귀될 가능성이 적고, 그리고 제한된 부작용으로 우수한 안전성의 프로파일을 보이는 고도의 면역원성을 갖는 백신의 개발이 요구된다.
본 발명은 살모넬라 미생물내로 도입된 두 종류의 특정한 감쇠화 돌연변이가 고도의 면역원성을 갖고 미생물이 반응형으로 복귀될 위험이 낮은 백신을 생산할 수 있다는 발견에 기초한다. 생성되는 백신 균주는 우수한 부작용 프로파일을 보인다.
이를 기초로 본 발명은 Spi2 병원성 아일랜드내에 위치한 기구(apparatus) 유전자의 발현을 중단시키는 감쇠화 돌연변이 및 독립적인 영양요구성 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물을 제공한다.
발명의 요약
첫번째 돌연변이는 살모넬라 병원성 아일랜드(island) 2(Spi2)의 영역내에 포함된다; 두번째는 영양요구성(auxotrophic) 돌연변이 즉, 생합성 경로에서 요구되는 단백질을 코드화하는 유전자의 발현을 중단(disrupt)시키는 돌연변이이다.
본 발명의 첫번째 측면에 따르면, 살모넬라 미생물은 Spi2 병원성 아일랜드내에 위치한 기구(apparatus) 유전자의 발현을 중단시키는 감쇠화 돌연변이 및 독립적인 영양요구성 돌연변이를 갖는다. 바람직한 감쇠화 돌연변이는 기구 유전자 ssaV 내에 있고, 바람직한 영양요구성 돌연변이는 aroC 내에 있다.
이 미생물은 바람직하게는 추가로 하나 이상의 이종성 항원 또는 치료 단백질, 예를 들어 병원성 E. coli, Shigella, A형, B형, 또는 C형 간염, 단순 헤르페스 바이러스 및 인간 유두종 바이러스를 포함한다. 따라서, 이 미생물은 살모넬라를 제외한 감염에 대해 면역화하는 전달체로 작용할 수 있다.
살모넬라 미생물은 세균성 또는 바이러스성 감염의 치료, 예를 들어 장티푸스의 치료를 위한 정맥내 또는 경구 전달용 약제의 제조에 사용될 수 있다.
본 발명의 감쇠된 살모넬라 미생물은 놀랍게도 점막의 면역뿐만 아니라 전신성(systemic) 면역을 자극하는 백신을 형성한다. 또한, 단일 돌연변이를 갖는 돌연변이체들이 비장 농양을 초래하는 반면, 상기 미생물은 동물 모델에서 비장 농양을 초래하지 않는다. 이것은 본 발명에서 정의된 이중(double) 돌연변이체의 특별한 장점이다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 미생물 및 백신 조성물은 공지된 기술로 제조될 수 있다.
특정 살모넬라 미생물의 선택 및 적절한 돌연변이의 선택은 과도한 실험 없이 당업자에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 미생물은 살모넬라 타이피뮤리움(Salmonella typhimurium)이다.
첫번째 돌연변이는 살모넬라 병원성 아일랜드 2의 영역에 위치된 기구 유전자내로 도입될 수 있고, 이 영역은 WO-A-9617951에 개시되어 있다.
살모넬라 병원성 아일랜드 2(Spi2)는 살모넬라 염색체에 위치한 두개의 전통 적인 병원성 아일랜드중 하나이다. Spi2는 Spi2 코드화된 독성-관련 단백질들(소위 작용인자 단백질)을 살모넬라 세균 외부 및 잠재적으로 직접 매크로파지같은 표적 숙주 세포로 운송하는데 연관된 유형 III 분비 계를 코드화하는 여러 유전자들을 포함한다. Spi2(기구 유전자)는 유형 III 계의 분비 기관을 코드화한다. Spi2는 세계에서 여러 다른 그룹에 의해 현재 입증된 관찰인, 마우스에서의 살모넬라의 병인론 및 독성에 절대적으로 필수적이다. S. typhimurium Spi2 돌연변이체는 경구, 정맥내 및 복막내 투여 경로에 의해 공격(challenge)된 마우스에서 매우 감쇠된다.
Spi2내에 위치한 기구 유전자들은 현재 잘 특징되어 진다; 예를 들어 Hensel et al, Molecular Microbiology (1997); 24(1): 155-167을 참조. 본 발명의 사용에 적합한 유전자들에는 ssaV , ssaJ , ssaK , ssaL , ssaM , ssaO , ssaP , ssaQ , ssaR , ssaS, ssaT , ssaU 및 ssaH 유전자들이 포함된다.
Spi2 영역내 돌연변이는 기능을 파괴하기 위하여 반드시 유전자내에 있어야 하는 것은 아니다. 예를 들어, 상류 조절 영역내의 돌연변이는 감쇠를 초래하며 역시 유전자 발현을 중단시킬 수 있다. 유전자간 영역내의 돌연변이는 또한 유전자 기능을 파괴하는데 충분할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 기구 유전자는 ssaV이다. 본 발명의 별개의 구현예에서, 돌연변이는 ssaJ 및 ssaK 사이의 유전자간 영역내에 놓여 있다.
두번째 돌연변이는 생합성 경로에 필수적인 유전자를 파괴하기 때문에 "영양요구성 돌연변이"라고 칭해진다. 생합성 경로는 살모넬라내에는 존재하지만 포유류내에는 존재하지 않는 것이다. 따라서, 돌연변이체들은 돌연변이의 효과를 우회하 기 위해 치료된 환자내에서 발견되는 신진대사 산물에 의존할 수 없다. 영양요구성 돌연변이에 대한 적합한 유전자들에는 어떠한 aro 유전자도 포함될 수 있는데, 예를 들어 aroA , aroC , aroD 및 aroE가 포함된다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 백신 조성물은 ssaV 및 aroC내의 감쇠화 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물을 포함한다.
돌연변이는 공지된 기술을 이용하여 미생물내로 도입될 수 있다. 바람직하게는, 돌연변이는 결실 돌연변이로, 여기서 유전자의 파괴는 핵산의 삭제에 의해 초래된다. 다른 방법으로, 돌연변이는 핵산의 삽입 또는 점 돌연변이에 의해 도입될 수 있다. 돌연변이를 특정한 영역으로 도입하는 방법은 당업자들에게 명백할 것이다.
두 돌연변이에 추가하여, 살모넬라 미생물은 또한 이종성 항원을 포함할 수 있다. 따라서 이 감쇠된 미생물은 다른 세균성 또는 바이러스성 감염에 대한 항원을 투여하기 위한 전달체로서 작용할 수 있다. 이런 방식에 사용하기에 적합한 항원은 당업자들에게 명백할 것이고 다음을 포함한다:
병원성 E.coli 항원 즉, ETEC
A형, B형 및 C형 간염 항원
라임(lime) 병 항원
비브리오 콜레라 항원
헬리코박터 항원
단순 헤르페스 바이러스 항원
인간 유두종 바이러스 항원
이 시스템은 또한 환자들, 예를 들어 간염에 감염된 환자들의 치료를 위한 치료 단백질(therapeutic protein), 예를 들어 사이토킨을 전달할 가능성을 갖는다. 백신 조성물을 이용한 이종성 항원 또는 치료 단백질의 전달을 위한 방법은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 미생물을 사용하여 제조된 백신들은 인간 환자의 감염의 치료 그리고 수의학적 감염의 치료에 적용된다.
이중 돌연변이는 안전한 백신 후보를 제공하기 위해 미생물을 감쇠하는 효과적인 수단을 제공한다.
백신 조성물들은 심지어 면역시스템이 손상된(immunocompromised) 환자에게도 효과적인 단백질을 제공하고, 중요하게는 비장 농양을 진전시킬 위험이 낮다. 비장 농양은 단일 돌연변이에 기초한 백신을 사용하여 확인되어 왔고, 따라서 본 조성물은 환자들에게 실질적인 이득을 제공할 수 있다.
백신 조성물을 제제화하기 위해서, 돌연변이체 미생물은 적합한 약학적으로 수용가능한 보조제, 희석제 또는 부형제를 포함한 조성물로 존재할 수 있다. 적합한 제제화는 당업자들에게 명백할 것이다. 제제화는 적합한 투여 수단을 위해 개발될 수 있다. 바람직한 투여는 경구 또는 정맥내 경로를 통한 것이고, 백신들은 감쇠된 생 살모넬라 미생물들이다. 제제화에서 존재하도록 요구되는 미생물의 수는 당업자에 의해 결정되고 최적화될 수 있다. 그러나, 일반적으로, 환자는 단일 투약 단위로 대략 107 - 1010 CFUs, 바람직하게는 약 108 - 109 CFUs로 투여될 수 있다.
하기의 실시예가 본 발명을 예시한다.
실시예
실시예 1
본 실시예는 ZH9로 명명된 인간 경구 장티푸스 백신으로 활성을 갖는 돌연변이 균주의 제조를 설명한다. 이 균주는 원래 장티푸스 환자로부터 단리된, 독성 S.typhi 균주 Ty2로부터 유도된다. 유도된 균주는 purA 및 aroA내에 한정된 돌연변이를 갖는다.
ZH9의 구조체를 위한 Ty2
S. typhi Ty2는 원래 1916년 장티푸스 열병에 걸린 개인으로부터 단리되었고, 모든 인가된 장티푸스 백신의 유도를 위해 사용되어 왔다. 이 균주는 콜린데일 (Colindale)에 있는 PHLS national culture collection으로부터 얻었다. NCTC 번호가 8385인 동결건조된 배양균(culture)으로 얻었다.
S. typhi Ty2로부터 S. typhi aroC 유전자의 클로닝
S. typhi Ty2는 스톡(stock)으로부터 회수되었고, Luria Bertani(LB) 브로스(broth)에서 밤새 성장시켰다. 세포들을 수확하고 전체 세포 DNA를 제조하였다. 제한 효소 Sau3A로 부분 절단하여 S. typhi Ty2 DNA의 단편들을 생성하고, 생성되는 단편들을 BamH1 분할된 pHC79에 결찰하여 E. coli HU835를 수용체로 사용하는 S.typhi Ty2 DNA의 코스미드 라이브러리를 생성하였다. S. typhi DNA로부터 DNA 코 드화 aroC를 단리하기 위해서 이 코스미드 라이브러리를, 하나의 돌연변이가 aroC 유전자에 있고 성장을 위한 방향족 화합물에 의존하는 E. coli AB2849를 형질도입하는데 사용하였다. 형질도입 혼합물을 방향족 화합물이 결핍된 최소 배지상에 플레이트하고, 37℃에서 인큐베이트하였다. 많은 수의 단리된 콜로니들을 관찰하고 밤새 인큐베이트하였다. 이 세균들은 아마 손상되지 않은 aroC 유전자 형태를 갖는 코스미드 클론에 의해 AB2849내에 aroC 돌연변이의 보충의 결과로서 생겨났을 것이다. 이 균주들 중의 하나에서 유래한 코스미드 DNA를 정제하였다. 이 코스미드에서 유래한 5.2kb HindIII 단편은 pUC18로 클론되어 AB2849 내에서 aroC의 결실을 보충할 수 있는 플라스미드 pTAC2를 부여하는데, 이것은 S. typhi aroC 유전자를 함유하는 것을 나타낸다.
클론된 S. typhi Ty2 aroC 유전자의 한정된 결실의 생성
한정된 600bp 결실을 PCR을 사용하여 클론된 aroC 유전자내에서 생성하였다. PCR에 사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 S. typhi aroC 유전자(Acc. M27715)의 발표된 DNA 서열을 사용하여 설계하였다. aroC 유전자에 대한 DNA 5'는 프라이머 SEQ ID NO. 3 및 SEQ ID NO. 1을 사용하여 pTAC2로부터 증폭하였다. SEQ ID NO. 3을 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 1을 aroC의 5' 영역으로 어닐링하였다. aroC 유전자에 대한 DNA 3'을 프라이머 SEQ ID NO. 4 및 SEQ ID NO. 2를 사용하여 증폭하였다. SEQ ID NO. 4를 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 2를 aroC의 3' 영역으로 어닐링 하였다. 생성되는 PCR 생성물은 클로닝을 촉진하기 위해 5' 말단으로 혼입되는 Xbal 부위를 가졌다. 단편들을 벡터 pUC18로 클론하였다. pMIAC23으 로 명명되는 최종 플라스미드 구조체는 4.8 kb HindIII 단편상에 aroC의 한정된 결실(위치 544 내지 1143)을 포함한다. 이 HindIII 단편은 pUC18의 HindIII 부위에 삽입된다. 단일 Xbal 부위는 aroC 결실의 부위에 존재한다.
aroC 돌연변이의 S. typhi Ty2 게놈으로의 도입
자기불활화(suicide) 플라스미드 pCVD442(Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310-4317)를 aroC 결실의 S. typhi Ty2의 게놈으로 도입을 위한 벡터로서 사용하였다. aroC 결실을 함유한 4.8kb HindIII 단편을 pMIAC23에서 단리시키고 Stratagene DNA 연마 키트를 사용하여 말단부를 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal으로 소화하여 선형화하고 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단 단편들로 결찰하였다. 요구되는 구조체를 단리하고 pYCVC21로 명명하였다.
pYCVC21을 표준 전기천공(electroporation) 프로토콜을 사용하여 S. typhi Ty2로 도입하였다. 플라스미드는 Ty2 게놈으로 통합할 수 있어서, 이어지는 게놈과 플라스미드 상의 상동성 영역간에 재조합이 엠피실린 내성을 형질전환체에 부여한다. 이 형질전환체들은 본래의 야생형 aroC 및 결실된 aroC 유전자 모두의 복사체를 포함했다. 이 균주들을 엠피실린의 부재하에서 성장시키는 것은, pCVD442 DNA 서열의 손실 및 야생형 복사체나 결실된 복사체 중의 하나인, aroC 유전자의 복사체를 야기한 두번째 재조합을 발생하게 하였다. 이 두번째 재조합을 겪은 S. typhi Ty2 세균은 5% 수크로스의 존재하에 성장할 수 있는 엠피실린 민감 유도체들(pCVD442는 발현시 수크로스 민감성 표현형을 야기하는 sacB 유전자를 지닌다)로 동정되었다. 결실된 aroC 유전자만을 보유했던 균주들은 초기에는 방향족 화합물의 보충의 부재하에 최소 배지 플레이트상에서 성장할 수 없는 균주들로 동정되었다. aroC 유전자형은 PCR 분석을 사용함에 의해 확인되었다. SEQ ID NO. 5 및 SEQ ID NO. 6을 갖는 프라이머들은 야생형 aroC에 대해서 994bp의 생성물을, 그리고 결실된 aroC 유전자에 대해서는 400bp의 생성물을 제공하였다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 및 DTY10으로 명명된 5가지의 개별 단리체에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 이 균주들을 장기간 보관을 위해 -70℃에서 Microbank 바이알내에 저장하였다. 균주 DTY8을 더 조작하기 위해 선택하였다.
S. typhi aroC 돌연변이 DTY8로 ssaV 돌연변이의 도입
S. typhi의 ssaV 영역을 포함하는 7.5kb Pstl 단편들을 PCR을 사용하여 전체 DNA 제조물로부터 증폭하고 벡터 pCR2.1(invitrogen)내로 클로닝하였다. 사용된, SEQ ID NO. 7 및 SEQ ID NO. 8을 갖는 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머들을 S.typhimurium SPI2 서열로 설계하였다. 생성되는 플라스미드 구조체를 pTYSV21로 명명하였다.
ssaV 유전자의 결실을 갖는 플라스미드 구조체를 역배향 PCR을 사용하여 pTYSV21로부터 유도하였다. ssaV 개방 리딩 프레임의 5'(SEQ ID NO. 9) 및 3'(SEQ ID NO. 10)의 영역으로 한 프라이머들의 어닐링은 S. typhimurium SPi2 서열로 설계되었다. AVrll 제한 부위는 각 프라이머의 5' 영역으로 혼입되었고, Xbal 부위는 SEQ ID NO. 10내로 혼입되었다. Xbal 부위는 ssaV 돌연변이를 위한 태그(tag)로 작용하여, 제한 분석에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 생성되는 PCR 생성물은 Avrll로 소화시키고, 골격 플라스미드 분자는 뒤따르는 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. Avrll 점착성-말단에서 생성되는 단편들의 재순환은 요구되는 결실 구조체 pYDSV1을 제공했다. pYDSV1은 ssaV 개방 리딩 프레임내의 한정된 1894bp 결실을 갖는 5.5kb Pstl 단편을 함유한다.
자기불활화 플라스미드 pCVD442를 ssaV 결실을 S. typhi Ty2 aroC 돌연변이 DTY8의 게놈으로 도입하기 위하여 벡터로 사용하였다. ssaV 결실을 함유하는 5.5kb Pstl 단편은 pYDSV1로부터 단리되었고, 말단부는 Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal로 소화하여 선형화했고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단된 단편들에 결찰하였다. 요구되는 구조체를 단리하고 pYDSV214로 명명하였다.
pYDSV214를 전기천공을 사용하여 S. typhi DTY8 내로 도입하였다. 엠피실린-내성 형질전환체를 선택한 다음, 엠피실린의 부재하게 성장시켜서 pCVD442 DNA 서열의 손실 및 야생형 복사체나 결실된 복사체중의 하나인 ssaV의 복사체를 가능하게 하였다. 이 두번째 재조합을 겪은 균주들은 엠피실린-민감성, 수크로스-내성 콜로니로 동정되었다. 결실된 ssaV 유전자만을 보유한 균주들은 PCR 분석을 사용하여 동정하였다. SEQ ID NO. 11 및 SEQ ID NO. 12를 갖는 프라이머들은, 야생형 ssaV에 대해서는 2458bp 그리고 결실된 ssaV 유전자에 대해서는 591bp의 생성물을 제공했다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 5가지 개별 단리체들인 ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 및 ZH9 내에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 균주 ZH9가 CGMP 마스타 세포 은행의 제조를 위해 선택되었다.
실시예 2
본 실시예는 인간 위장염에 대해 백신 활성을 갖는 WT05로 명명된 S.typhimurium 돌연변이 균주의 제조를 설명한다. 균주는 공지된 인간 독성 S.typhimurium 균주 TML로부터 유도된다.
WT05의 구조체를 위한 TML
TML은 본래 위장염을 겪는 환자로부터 단리되었고, Birmingham대학에서 John Stevens 박사의 연구실에서 동정되었다. Wellcome Research Laboratories에서 동결건조되고, BRD 519로 배양균 번호가 할당되었다. 그 배양균을 Birmingham 대학에서 얻었다.
클론된 S. typhimurium ssaV 유전자의 한정된 결실의 생성
S. typhimurium LT2에서 단리된 7.5kb Pstl 단편을 pUC18의 Pstl 부위로 클로닝하여 플라스미드(plasmid 7-2, Shea et al; PNAS, 1996; 93: 2593-2597)를 생성하였다. ssaV를 이 단편의 중앙에 위치시켰다. ssaV ORF의 한정된 결실을 함유하는 플라스미드 구조체는 역배향 PCR을 사용하여 플라스미드 7-2로부터 유도하였다. ssaV 개방 리딩 프레임의 5'(SEQ ID NO. 13) 및 3'(SEQ ID NO. 14)의 영역에 프라이머들의 어닐링은 S. typhimurium Spi2 서열로 설계되었다. Avrll 제한 부위는 각 프라이머의 5' 영역으로 혼입되었고, Xbal 부위는 SEQ ID NO. 14내로 혼입되었다. Xbal 부위는 ssaV 돌연변이를 위한 태그로 작용하여 제한 분석에 의해 쉽게 검출될 수 있다. 생성되는 PCR 생성물은 Avrll로 소화시키고, 골격 플라스미드 분자는 뒤따르는 아가로스 겔 전기영동으로 정제하였다. Avrll 점착성-말단에서, 생성되는 단편들의 재순환은 요구되는 결실 구조체 pMDSV1을 제공했다. pMDSV1은 ssaV 개방 리딩 프레임내의 한정된 1894bp 결실을 갖는 5.5kb Pstl 단편을 함유하고, Avrll 및 Xbal 제한 부위는 결실 부위에 있다.
자기 불활화 플라스미드 pCVD442를 ssaV 결실을 S. typhimurium TML의 게놈으로 도입하기 위하여 벡터로 사용하였다. ssaV 결실을 함유하는 5.5kb Pstl 단편을 pMDSV1로부터 단리하였고, 말단부를 Klenow DNA 폴리머라제로 처리하여 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal로 소화하여 선형화했고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단화된 단편들에 결찰하였다. 요구되는 구조체를 단리하고 pMDSV22로 명명하였다.
pMDSV22를 접합을 이용하여 S. typhimurium TML로 도입하였다. 이 목적을 위해, 구조체를 E. coli 균주 S17-1 λpir로 형질전환시켰다. 표준 방법에 따라 접합을 수행하였다. 플라스미드와 게놈의 상동성 영역간의 재조합에 이어서, 플라스미드 pMDSV22는 TML 게놈으로 통합될 수 있어서 엠피실린 내성 접합 완료체(transconjugant)를 제공한다. mdsv-WT2로 명명된 접합 완료체를 더 조작하기 위해 선택하였다. 이 접합 완료체는 본래의 야생형 ssaV 및 결실된 ssaV 유전자 모두의 복사체를 함유한다. pCVD442 DNA 서열, 및 야생형 복사체나 결실된 복사체중의 하나인 ssaV 유전자의 복사체의 손실을 일으키는 두번째 재조합이 발생하도록 엠피실린 부재하에서 성장시켰다. 이 두번째 재조합을 겪었던 단리체들은 5% 수크로스의 존재하에 성장할 수 있는 엠피실린-민감성 유도체로 동정되었다(pCVD442는 발현시 수크로스 민감성 표현형을 야기하는 sacB 유전자를 지닌다). 결실된 ssaV 유전 자만을 보유했던 균주들은 PCR 분석을 사용하여 확인되었다. SEQ ID NO. 15 및 SEQ ID NO. 16을 갖는 프라이머들은 야생형 ssaV에 대해서 2485bp의 생성물을, 그리고 결실된 ssaV 유전자에 대해서는 591bp의 생성물을 제공하였다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 ZH20, ZH23, ZH25 및 ZH26인 4가지의 개별 단리체에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 이 균주들을 장기간 보관을 위해 -80℃에서 LB + 15% 글리세롤내에 저장하였다. 균주 ZH26이 추가 조작을 위하여 선택되었다.
S. typhimurium TML로부터 S. typhimurium aroC 유전자의 클로닝
게놈성 DNA를 S. typhimurium TML로부터 단리하고 HindIII로 절단하였다. 5 내지 6kb의 크기 범위의 HindIII 단편들을 정제하고 HindIII-절단된 pBluescript로 결찰하였다. 결찰 혼합물을 E. coli aroC 돌연변이체, AB2849를 형질전환하기 위해 사용하였고, S. typhimurium aroC 유전자를 함유한 클론들을 이 균주를 보충하는 그것들의 능력때문에 선택하였다. 하나의 클론, pDAC1의 분석은 그것이 5.2kb HindIII 단편을 함유하는 것을 입증하였다.
한정된 600bp 결실을 PCR을 사용하여 클론된 aroC 유전자내에서 생성하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 S. typhi aroC 유전자(Acc. M27715)의 발표된 DNA 서열을 사용하여 설계하였다. aroC 유전자에 대해 5' DNA는 SEQ ID NO. 19 및 SEQ ID NO. 17을 갖는 프라이머들을 사용하여 pDAC1으로부터 증폭하였다. SEQ ID NO. 19는 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 17은 aroC의 5' 영역으로 어닐링 하였다. aroC 유전자에 대해 3' DNA는 SEQ ID NO. 20 및 SEQ ID NO. 18을 갖는 프라이머들을 사용하여 증폭하였다. SEQ ID NO. 20은 벡터 DNA로 어닐링 하고, SEQ ID NO. 18은 aroC의 3' 영역으로 어닐링 하였다. 생성되는 PCR 생성물은 클로닝을 촉진하기 위해 5' 말단으로 혼입되는 Xbal 부위를 가졌다. 단편들을 벡터 pUC18로 클론하였다. 최종 플라스미드 구조체, pMIAC8은 4.8 kb HindIII 단편상에 aroC의 한정된 결실(Acc. M27715 위치 544 내지 1143)을 포함한다. HindIII 단편은 pUC18의 HindIII 부위에 삽입된다. 단일 Xbal 부위는 결실의 부위에 존재한다.
aroC 돌연변이의 S. typhimurium ssaV 돌연변이체 ZH26으로의 도입
자기불활화 플라스미드 pCVD442를 aroC 결실을 S. typhimurium TML의 게놈으로 도입하기 위한 벡터로 사용하였다. aroC 결실을 함유하는 4.8kb HindIII 단편을 pMIAC8로부터 단리하였고, 말단부는 Stratagene DNA 연마 키트(Part No. 200409)를 사용하여 둔단으로 만들었다. 플라스미드 pCVD442를 Smal로 소화하여 선형화했고, 알칼리성 포스파타제로 처리하고, 둔단-말단화된 단편들로 결찰하였다. 요구되는 구조체를 단리하고 pMCVC16으로 명명하였다. pMCVC16을 전기천공을 이용하여 S.typhimurium ZH26내로 도입하였다. 엠피실린-내성 형질전환체를 선택하고, 엠피실린의 부재하게 성장시켜서 pCVD442 DNA 서열 및 야생형 복사체나 결실된 복사체중의 하나인 aroC 유전자의 복사체의 결실을 허용하였다. 이 두번째 재조합을 겪은 균주들은 5% 수크로스 존재하에서 성장할 수 있는 엠피실린-민감성 유도체로 동정되었다. 결실된 aroC 유전자만을 보유했던 균주들은 초기에는 방향족 화합물의 보충의 부재하에 최소 배지 플레이트상에서 성장할 수 없는 균주들로 동정되었다. aroC 유전자형은 PCR 분석을 사용하여 확인되었다. SEQ ID NO. 21 및 SEQ ID NO. 22를 갖는 프라이머들은 야생형 aroC에 대해서 994bp의 생성물을, 그리고 결실된 aroC 유전자에 대해서는 400bp의 생성물을 제공하였다. 생성되는 PCR 생성물의 서열 분석은 WT05, WT09, WT10 및 WT12로 명명된 4가지의 개별 단리체에서 요구되는 결실의 존재를 확인하였다. 균주 WT05를 CGMP 마스타 세포 은행의 제조를 위해 선택하였다.
실시예 3
다음의 구조체를 동물 모델에서 이중 돌연변이체 백신을 시험하기 위해 제조하였다. 마우스를 감염시킨 균주, 단일 및 이중 돌연변이체를 갖는 S. typhimurium SL1344를 사용하였다.
S. typhimurium 12023s에서 유래한 ssaV::aph(비극성) 돌연변이를 단일 Spi2 돌연변이체를 생성하기 위해 SL1344로 P22 형질도입하였다.
aroC 결실/pCVD422 자기 불활화 벡터 pMCVC16을 S. typhimurium 균주 LB5010으로 전기천공으로 도입하여 부분이배체(merodiploid)를 얻었다. 그리고 나서, aroC 결실 부분이배체를 LB5010 부분이배체로부터 SL1344로 P22 형질도입하였다. 그리고 나서, SL1344 부분이배체를 수크로스 선택을 사용하여 분해하여 단일 aroC 돌연변이체를 생성하였다.
aroC 결실 부분이배체를 LB5010으로부터 SL1344 ssaV::aph로의 P22 형질도입하여 이중 돌연변이체를 생성하였다. 플라스미드 서열은 SL1344 ssaV::aph 배경에서 부분이배체로 분해되어 균주 3, aroC 결실 돌연변이를 이탈시켰다.
한정된 aroC/ssaV 살모넬라 돌연변이체에 대한 예비-임상 약물 동력학 연구
한정된 돌연변이를 aroC, ssaV 또는 두 돌연변이체의 조합내에 갖는 살모넬 라 돌연변이체(균주 SL 1344)는 유기체의 감쇠, 지속 및 야생형 균주에 의한 공격에 대한 면역화 능력을 평가하기 위해 BALB/C 마우스에서 광범위하게 평가되어 왔다.
실시예 4
정맥내 경로에 의해 면역화된 동물
예방 연구
10개의 BALB/C 마우스의 군을, LB 배양액에서 밤새 성장시키고 투여를 위해 식염수에서 재현탁시킨 SL1344 aroC, SL1344 ssaV 및 SL1344 aroC : ssaV의 105 및 106 미생물로 정맥내 면역화시켰다. 마우스들을 6주 후에 정맥내로 주입된 105 야생형 유기체로 공격시켰다. 정맥내로 주입된 이 야생형 균주의 10 유기체는 마우스를 죽이기에 충분하다.
단일 aroC 또는 ssaV 돌연변이체가 주입된 모든 마우스들은 어느 하나의 투약으로 공격 후 완전히 예방되었고, 질병의 징후를 보이지 않으면서 실험동안 건강하게 남아 있었다. 이중 돌연변이체에 대해서, 106개의 유기체로 면역화된 동물의 90%가 완전히 예방되었다. 마우스들 중 한마리가 공격 후 8일째에 죽었다. 더 낮은 투여량으로 면역화된 동물에서는, 단지 1마리의 마우스만이 공격에서 생존하였다.
이 실험은 살모넬라 ssaV 돌연변이체, 둘 중 하나만 이거나 또는 aroC 돌연변이체와 조합으로 된 면역화는 야생형 살모넬라 균주에 의한 공격에 대해 마우스를 면역시키는 것을 입증한다.
균주의 지속
마우스 군에 상기한 세가지 살모넬라 돌연변이체의 106 유기체를 주입하였다. 네마리의 마우스를 14일에 걸쳐 다른 시점에서 희생시키고, 간 및 비장내의 유기체의 계수를 시행하였다. 세 돌연변이체의 계수는 약 5 x 105의 유기체의 수일때인 10일까지 각 기관에서 유사하였다. 14일에, 단일 돌연변이체와 이중 돌연변이체 사이에서, 간 및 비장 모두에서 이중 돌연변이체 유기체의 수에서 대수만큼 더 작은, 차이를 보였다.
단일 돌연변이체와 aroC / ssaV 이중 돌연변이체 사이의 다른 중요한 차이는 이중 돌연변이체에 대해서 실험 중에 어느 시점에서도 간 농양이 존재하지 않았다는 것이다. 그러나, 단일 돌연변이체로 감염된 마우스들에는 10일 및 14일에 간 농양이 존재하였다. 이것은 중요한 발견이고 백신의 제조의 평가에 대해 돌연변이의 조합의 용도를 강력하게 뒷받침한다.
면역원성
상기한 바와 같이 면역화된 마우스 혈액을 채취하고, ELISA를 사용하여 전체 세포 살모넬라에 대하여 항체 역가를 측정하였다. 세가지 균주는 모두 살모넬라에 대하여 순환 IgG의 높은 역가를 유도하며, 높은 면역원성이 있음이 입증되었다.
실시예 5
경구에 의해 면역화된 동물
균주의 지속
세가지 살모넬라 돌연변이체 각각의 5 x 109 유기체로 경구 면역된 마우스 군을 주기적인 간격으로 희생시키고, 간 및 비장내에서의 그 유기체의 수를 계수하였다. 단일 aro 돌연변이체 및 단일 ssaV 돌연변이체에 대해서, 간 및 비장내의 수는 약 21일까지 각각 103 및 102이었다. 그 후에 수는 감소하였다. aroC:ssaV 이중 돌연변이체가 주입된 마우스들에 대해, 유기체는 경구 면역화 후에 간 및 비장에서 실질적으로 검출되지 않았다.
Salmonella typhimurium TML aroC / ssaV(WT05)로 백신화된 A-J 마우스의 경구 면역화 및 정맥내 공격
이 실험의 목적은 경구의 ityr 뮤린 백신화 및 정맥내 공격 모델에서 5 x 109 aroC / ssaV S. typhimurium TML 돌연변이체의 예방 효과를 확인하는 것이었다. 이 모델은 이들 동물들이 itys 배경보다 덜 민감하다는 점에서 살모넬라에 대한 인간 반응과 더 근접하게 유사하다.
0.2 ㎖ PBS 부피내의 5 x 109 S. typhimurium TML aroC / ssaV를 섭식(gavage) 관으로 10마리의 6-8주령 A-J 마우스에 접종하고 8주간 방치하였다. 두마리의 마우스를 이때에만 PBS를 주입하고, 대조구 동물로 이용하였다. 8주가 지난 후, 두 면역된 군을 107 야생형 S.typhimurium TML로 정맥내로 공격하였다. 접종 후 30일 동안 마우스를 관찰하였다.
모든 동물들이 야생형 공격에 대해 완전히 예방되었다(100% 생존, 10/10 동물들이 살아 있는). PBS 단독으로 주입하고 나서 야생형 S. typhimurium TML로 공격된 마우스는 공격 후 6일째에 죽었다.
ityr 배경에서 이중 S.typhimurium TML aroC / ssaV는 5 x 109의 경구 투약으로 주입된 마우스를 예방하는 것으로 보인다. ityr 마우스는 인간 살모넬라증의 더 우수한 모델이기 때문에, 감염에 대한 민감성이라는 점에서 이것은 인간 상황에 중요할 수도 있다.
마우스의 간 및 비장에서 이중 돌연변이체의 지속을 측정하기 위하여 또한 연구가 수행되었다. 이중 돌연변이체는 21일 부근까지 낮은 수준으로 지속되는 것이 발견되었다. 28일까지 돌연변이체 균주는 제거되었다.
실시예 6
인간 임상 시험
18명의 건강한 자원자를 공개 표시(label), 비-위약(placebo) 조절된 연구를 위해 모집하였다. 적절한 선별에 따라서, 3명의 각 자원자들은 107, 108 또는 109 CFUs의 S. typhi ZH9 또는 S. typhimurium WT05의 단일 경구 투약을 받았다. 상기한 바와 같이 제조된 미생물을 위산을 중화하기 위한 최종 부피가 100㎖인 2%(w/v) 중탄산 나트륨 용액내에 적절한 투약 농도로 재현탁하였다. 이 액체 현탁액을 경구로 자원자들에게 투여하였다. 그리고 나서, 자원자들을 72시간 동안 격리하고, 안전 및 면역성원을 위해 후-면역화했다.
자원자들은 반응유전자성(reactogenicity) 및 백신화와 관련된 다른 부작용에 대해서, 관찰, 물리적 진단 및 일지 카드의 완결에 의해 평가되었다. 추가로, 혈액, 대변 및 소변 배양물을 백신 균주의 백신증, 셰딩(shedding) 및 지속을 분석하기 위해 수집하였다. 표준 방법을 사용하여, 혈액내 C-반응성 단백질(CRP) 및 간 기능성 효소(ALT)의 수준, 총 백혈구 세포(WBC) 수 및 적혈구 침강 속도(ESR)를 측정하여 부가적인 안전성 데이타를 얻었다. 이 매개변수들을 7일까지 매일, 그리고 나서 28일까지 일주일 간격으로 채집한 혈액에 대해 측정하였다.
점막 및 전신성 면역 반응의 분석
혈액 및 타액 샘플들을 면역전 그리고 나서 면역후 7, 14, 21 및 28일에 수집하고, 타액 및 혈청을 ELISA에 의해 분석할 때까지 -70℃에서 동결시켰다. 말초 혈액 단핵 세포들을 수집하고 ELISPOT 기술을 사용하여 항체-분비 세포(ASCs)의 존재에 대해 분석하였다.
S. typhi ZH9 및 S. typhimurium WT05 모두가 모든 자원자들에게서 잘 내성화되었다. 각각 3 투약 수준에서 어떤 자원자에게서도 심각한 부작용은 관찰되지 않았고, 모든 점에서 조사된 모든 피접종자의 혈액 및 소변 배양액에서 음성으로 남아 있었다. 따라서, S. typhi ZH9 및 S. typhimurium WT05에 의한 면역화 모두는 백신증을 초래하지 않는다. 이 균주들 중의 하나가 주입된 자원자들 중 어느 누구에게도 설사나 지속적인 높은-등급의 열이 진행되지 않아, 백신 균주의 안전성을 추가로 나타내었다. 7일을 넘는 지속적인 배설이나 백신증이 S. typhi ZH9의 3 투약 군 또는 S. typhimurium WT05의 저-투여군(107) 중 어디에서도 관찰되지 않았다.
S.typhi ZH9에 의해 유도된 점막 및 전신성 면역 반응
S. typhi ZH9의 단일 저-투여(1 x 107 CFUs)에 의한 경구 면역화는 면역화 후 7일에 측정된 3명의 자원자 중 2명에게서 S.typhi-특이적 IgA-분비 ASCs의 초회항원자극(priming)을 야기하였다. 14일, 21일째에 뒤이은 시험은 IgA ASCs가 여전히 검출되지만 훨씬 낮은 수준이고, 28일까지는 사라지는 것을 보였다. 거의 모든 반응 피접종자에게서, ASCs의 수는 7일에 가장 높았다. 놀랍게도, 더 높은 투약(108 CFUs)의 S. typhi ZH9의 섭취는 3명의 자원자중 2명에게서 낮은 IgA ASC 반응을 야기하였다. 가장 높은 투약(1 x 109 CFUs)의 섭취는 3명의 자원자중 2명에게서 IgA ASCs를 초회항원자극하였다.
살모넬라-특이적 혈청 항체 반응
S.typhi ZH9의 단일 저-투여(1 x 107 CFUs)에 의한 경구 면역화는 7, 14, 21 및 28일에 조사했을 때, (피접종자의 2/3에게서 IgA-ASCs를 생성하였음에도 불구하고) S.typhi LPS-특이적 혈청 IgG를 유도하지 못했다. 유사하게, 단지 1/3만이 매우 낮은 수준의 편모-특이적 IgG를 생성하였다. 그러나, 108 CFUs의 섭취는 높은 수준의 LPS 및 편모-특이적 IgG를 지원자 3명 모두에게서 생성하는 결과를 야기하였다. 증가된 수준의 S.typhi LPS 특이적 및 편모-특이적 IgG는 면역 접종 후 겨우 7 일만에 검출되었고, 14일에 증가하고, 28일에 높게 유지되었다. 109 CFUs의 가장 높은 투약은 또한 피접종자 3명 중 2명에게서 LPS- 및 편모-특이적 IgG를 자극하여, 7일 및 14일째에 각각 검출될 수 있었다.
결론
본 연구는 새로운 경구 장티푸스 백신 균주의 구성 성분으로서, ssaV 돌연변이의 유용성을 입증하였다. aro 돌연변이만을 단독으로 갖는 S. typhi 균주는 주입된 투약에서 백신증을 초래해왔다. 따라서 ssaV 돌연변이는 이 초기 제제화를 사용하여 백신증을 근절하여 aro 돌연변이만에 대한 부가적인 수준의 안정성을 제공한다.
잘 내성화된다고 증명되었을 뿐만 아니라, ZH9는 주입된 3가지 모두의 투약 수준에서 또한 면역원성이라고 입증되었다. 혈청 항체를 자극하는 것에 관련하여, 중간(108 CFUs) 및 가장 높은(109 CFUs) 투약은 S. typhi LPS 및 편모 특이적-혈청 IgG를 유도하는 108 CFUs 주입된 3/3 백신 및 109 CFUs 주입된 2/3 백신으로, 매우 면역원성이 있다고 입증되었다. 일반적으로 경구 백신 접종에 의하여 혈청 항체를 유도하는 것이 어렵기 때문에, 이 반응들은 매우 고무적이다.
S. typhi-특이적 혈청 항체 반응을 생성할 뿐만 아니라, ZH9는 또한 장 점막에서 면역 자극의 지표인 IgA ASCs를 초회항원자극하였다. 5/9 자원자 전체가 투약량-의존적으로 보이지 않는 S. typhi LPS-특이적 IgA-분비 세포(ASC) 반응을 유도하였다.
WT05는 또한 잘 내성화되고 어떤 백신증도 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 어떤 설사 또는 위장염의 증상이 어떤 자원자들에게서도 검출되지 않았다. 마우스에 주입된 S. typhimurium내의 단순 aro 또는 SPI2 돌연변이를 갖는 돌연변이체 TML 균주를 사용하여 얻어진 이전 데이타는 이중 aroC / ssaV 돌연변이체가 예를 들어, 인간에게서 설사, 경련같은 일부 국소 장내 효과를 초래할 수도 있다는 것을 제시하였다. 이런 증상이 없는 것은 aro 및 SPI2 돌연변이의 조합의 유용성을 추가로 뒷받침한다.
실시예 7
이종성 항원 운반체
외래 항원을 발현하고 전달하는 ssaV : aroC 이중 돌연변이체의 유용성을 입증하기 위해, WT05를 E. coli 열-불안정성 장관독(enterotoxin) B 소단위(LT-B)의 유전자를 발현하는 플라스미드(pBRDO26)로 형질전환하였다.
BALB/C 마우스(n=10/군)를 pBRD026을 발현하는 109 CFUs(PBS내에 200㎖) WT05 또는 WT05 벡터 균주(대조구)로 0일 및 28일에 경구 면역화하였다. 비교를 위해(그리고 양성 대조구로서), 한 군의 마우스들(n=5)을 0일 및 28일에 10㎍의 정제된 LT(Sigma)로 경구 면역화하였다. 음성 대조구 마우스들(n=5)을 0일 및 28일에 200㎕ PBS로 경구 면역화하였다. 마우스들은 21, 28, 35일에 꼬리 정맥에서 그리고 42일에 심장 천자(puncture)에 의해 채혈하였고 그리고 혈청 및 장 세척(42일에만)을 모집하고 -20℃에서 보관하였다.
WT05/LT-B로 면역화된 마우스 중 하나를 제외하고 모두 단일 경구 투약 후 28일에 LT-특이적 IgG(3,000-50,000의 역가)를 유도하였다. WT05 또는 PBS로 경구 면역화된 대조구 마우스는 모두 LT-특이적 IgG를 유도하지 않았다. 정제된 LT의 단일 투약에 의한 경구 면역화는 LT-특이적 항체의 더 높은 역가를 유도했다(6,000 -> 50,000). LT-B-특이적 혈청 IgG의 이소타입을 조사했을때, pBRD026을 발현하는 WT05 균주는 거의 광범위하게 LT-특이적 IgG2a를 유도하여 TH1-타입의 면역 반응의 성향을 보이는 것이 확인되었다. 반대로, 정제된 LT(Sigma)로 면역화된 마우스는 거의 광범위하게 LT-특이적 IgG1을 유도하여 TH2-타입 반응을 보였다. 따라서, aroC/ssaV 균주 내에서 LT-B를 발현하는 것은 완전한 면역 변조(modulation)를 촉진한다. TH1-타입 반응이 보호적인 병원성 유기체에서 유래한 항원이 발현될 때, Salmonella aroC / ssaV 균주에 의해 생성된 TH1-성향의 반응은 중요하게 될 것이다.
본 발명은 ssaJ, ssaK 또는 ssaH 유전자의 발현을 중단시키는 감쇠화 돌연변이 및 aroC 유전자의 발현을 중단시키는 영양요구성 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물로서, 세균성 또는 바이러스성 감염의 예방 또는 치료를 위한 백신 조성물에 사용될 수 있는 감쇠된 미생물을 제공하는 효과를 가진다.
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Claims (11)
- ssaJ, ssaK 또는 ssaH 유전자의 발현을 중단시키는 감쇠화 돌연변이 및 aroC 유전자의 발현을 중단시키는 영양요구성 돌연변이를 갖는 살모넬라 미생물.
- 제 1항에 있어서, 상기 미생물은 이종성 항원 또는 치료 단백질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 2항에 있어서, 상기 항원은 A형, B형, 또는 C형 간염 항원인 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 살모넬라 타이피 Ty2(Salmonella typhi Ty2 )인 것을 특징으로 하는 미생물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미생물은 치료용인 미생물.
- 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 따른 미생물, 보조제 및 생리학적으로 수용가능한 희석제를 포함하는 백신 조성물.
- 제 6항에 있어서, 단일 투약 단위에 107-1010 CFUs를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제 7항에 있어서, 단일 투약 단위에 108-109 CFUs을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제 1항에 따른 미생물을 포함하는, 전신성 세균 감염의 치료를 위한 정맥내 투여용 약제.
- 제 1항에 따른 미생물을 포함하는, 전신성 세균 감염의 치료를 위한 경구용 약제.
- 제 9항 또는 제 10항에 있어서, 장티푸스의 치료를 위한 약제.
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