EA004921B1 - Аттенуированный микроорганизм salmonella и способы его применения - Google Patents
Аттенуированный микроорганизм salmonella и способы его применения Download PDFInfo
- Publication number
- EA004921B1 EA004921B1 EA200101187A EA200101187A EA004921B1 EA 004921 B1 EA004921 B1 EA 004921B1 EA 200101187 A EA200101187 A EA 200101187A EA 200101187 A EA200101187 A EA 200101187A EA 004921 B1 EA004921 B1 EA 004921B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- microorganism
- gene
- mutation
- dna
- deletion
- Prior art date
Links
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims abstract description 48
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 title abstract 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title description 16
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 39
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 10
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 claims abstract description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 8
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims abstract description 5
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 abstract 1
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 abstract 1
- 101150032013 ssaV gene Proteins 0.000 abstract 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 46
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 46
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 31
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 25
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 13
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 13
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 13
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 12
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 12
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 6
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 6
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 101150044182 8 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 2
- 102100024390 Insulin gene enhancer protein ISL-2 Human genes 0.000 description 2
- 101710156777 Insulin gene enhancer protein ISL-2 Proteins 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 206010024652 Liver abscess Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 206010039438 Salmonella Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 101150026917 ago gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 150000001491 aromatic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 206010039447 salmonellosis Diseases 0.000 description 2
- 208000026426 spleen abscess Diseases 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 2
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 108010074051 C-Reactive Protein Proteins 0.000 description 1
- 102100032752 C-reactive protein Human genes 0.000 description 1
- 206010010904 Convulsion Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102220469221 S-adenosyl-L-methionine-dependent tRNA 4-demethylwyosine synthase TYW1B_E18A_mutation Human genes 0.000 description 1
- 108010069584 Type III Secretion Systems Proteins 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000001809 ammonium phosphatide Substances 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000036461 convulsion Effects 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- -1 for example Proteins 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003908 liver function Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 231100001079 no serious adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 231100000279 safety data Toxicity 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 201000005789 splenic abscess Diseases 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- QERYCTSHXKAMIS-UHFFFAOYSA-M thiophene-2-carboxylate Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CS1 QERYCTSHXKAMIS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 229960001266 typhoid vaccines Drugs 0.000 description 1
- 229940125575 vaccine candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/255—Salmonella (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K2035/11—Medicinal preparations comprising living procariotic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/42—Salmonella
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Микроорганизм Salmonella содержит аттенуирующую мутацию, которая нарушает экспрессию аппаратного гена, локализованного в островке патогенности Spi2, и аксотрофную мутацию. Таким образом, аттенуированный микроорганизм содержит двойную мутацию, что способствует предотвращению реактивации микроорганизма при сохранении эффективности микроорганизма в индукции иммунного ответа, и применяется для лечения бактериальной или вирусной инфекции.
Description
Область техники
Данное изобретение относится к аттенуированным (ослабленным) микроорганизмам, которые можно использовать в вакцинных композициях для предупреждения или лечения бактериальных или вирусных инфекций.
Предпосылки к созданию изобретения
Установлено, что живые ослабленные микроорганизмы являются высокоэффективными вакцинами; иммунные ответы, вызываемые такими вакцинами, часто являются более выраженными и более продолжительными, чем иммунные ответы, вызываемые нереплицирующимися иммуногенами. Одним из объяснений такого явления может служить то, что живые ослабленные штаммы вызывают у хозяина ограниченные инфекции и имитируют ранние стадии спонтанной инфекции. Кроме того, в отличие от убитых препаратов, живые вакцины способны вызывать сильные клеточно-опосредованные ответы, которые могут быть связаны с их способностью реплицироваться в антигенпредставляющих клетках, таких как макрофаги.
Известна длительная история применения аттенуированных вакцин 8а1топе11а как безопасных и эффективных вакцин для предупреждения сальмонелеза у животных и человека. Действительно, доказано, что живая аттенуированная противобрюшнотифозная вакцина для перорального применения, Ту21а (νίνοΙίΓ). которую производят в Швейцарском Институте сывороточных вакцин, является очень эффективной вакциной для предупреждения брюшного тифа и признана во многих странах, включая США и Европу.
Однако ослабления вирулентности указанного штамма достигали, используя способы химического мутагенеза, и сущность аттенуации штамма полностью не установлена. Поэтому вакцина не является идеальной с точки зрения количества доз (в настоящее время четыре) и количества живых организмов, которое следует вводить в каждой дозе.
Современные методы молекулярной биологии в сочетании с увеличивающимися знаниями о патогенности 8а1топе11а позволили идентифицировать несколько генов, которые являются существенными для роста и выживаемости организмов ίη νίνο. Это предоставляет новые гены-мишени для аттенюирования, приводя к общему представлению о том, что будущие вакцинные штаммы можно будет «рационально» ослаблять путем введения определенных необратимых мутаций в выбранные гены, о которых известно, что они вовлечены в вирулентность. Такой подход будет способствовать разработке улучшенных вакцин, в частности, с точки зрения иммуногенности, а поэтому - и количества доз, которые следует вводить.
Хотя в настоящее время известно множество ослабленных штаммов 8а1топе11а, только немногие из них квалифицируются как кандида ты на роль возможных вакцин для применения на человеке. Это отчасти может быть обусловлено необходимостью уравновешивания иммуногенности вакцины и возможности микроорганизма 8а1топе11а реактивироваться.
Ясно, что селекция подходящих мишеней для аттенюирования, в результате которой обнаруживается подходящий кандидат на роль вакцины, не является прямой и не может быть легко предсказана. Многие факторы могут оказывать влияние на пригодность аттенюированного штамма в качестве подходящей вакцины, и осуществляются многочисленные исследования для идентификации подходящих штаммов. Например, многие аттенюированные штаммы, испытанные в качестве вакцинных кандидатов, приводили к вакцинемии или абсцессам у пациентов.
Поэтому желательно разработать вакцину, которая имеет высокую степень иммуногенности и пониженную способность штамма микроорганизма к реактивации и которая также обладает надежным профилем безопасности и ограниченными побочными эффектами.
Краткое изложение изобретения
Данное изобретение основано на открытии, что две специфические аттенюирующие мутации, введенные в микроорганизм 8а1топе11а, дают возможность производить вакцину, характеризующуюся высокой степенью иммуногенности и низким риском реверсии микроорганизма в реактивную форму. Полученные вакцинные штаммы обладают приемлемым профилем побочных эффектов.
Первая мутация заключена в области островка два патогенности 8а1топе11а (8ρί2); вторая является ауксотрофной мутацией, то есть мутацией, которая нарушает экспрессию гена, который кодирует белок, необходимый в биосинтетическом пути.
В соответствии с первым аспектом изобретения микроорганизм 8а1топе11а имеет аттенюирующую мутацию, которая нарушает экспрессию аппаратного гена, локализованного в островке патогенности 8ρί2, и независимую ауксотрофную мутацию. Предпочтительная аттенюирующая мутация находится в аппаратном гене 55аV, а предпочтительная ауксотрофная мутация находится в агоС.
Кроме того, микроорганизм предпочтительно содержит один или более гетерологичных антигенов или терапевтических белков, например антигены патогенной Е. сой, 8Ыде11а. гепатитов А, В или С, вируса простого герпеса и вируса папилломы человека. Поэтому микроорганизм может действовать как доставочный носитель для иммунизации против инфекций, помимо 8а1топе11а.
Микроорганизм 8а1топе11а можно использовать в производстве лекарственных средств для внутривенного или перорального способов доставки для лечения бактериальной или вирус3 ной инфекции, например лечения брюшного тифа.
Аттенюированные микроорганизмы 8а1топе11а согласно данному изобретению составляют вакцины, которые неожиданно стимулируют иммунитет слизистых, а также системный иммунитет. Кроме того, микроорганизмы не вызывают, в отличие от мутантов с единственной мутацией, возникновение абсцессов селезенки на животной модели. Упомянутый факт представляет собой особое преимущество двойных мутаций, что отмечено в описании.
Подробное описание изобретения
Микроорганизмы и вакцинные композиции согласно данному изобретению можно получать с помощью известных способов.
Отбор определенного микроорганизма 8а1топе11а и выбор подходящей мутации может быть осуществлен специалистом без чрезмерного экспериментирования. Предпочтительным микроорганизмом является 8а1топе11а Ινρΐιίιηιιпит.
Первая мутация может быть введена в аппаратный ген, локализованный в области островка 2 патогенности 8а1топе11а, упомянутая область описана в международной заявке \УОА-9617951.
Островок 2 патогенности 8а1топе11а (8ρί2) является одним из двух классических островков патогенности, локализованных на хромосоме 8а1топе11а. 8ρί2 содержит несколько генов, которые кодируют систему секреции типа III, вовлеченную в транспортировку кодируемых белков 8ρί2, ассоциированных с вирулентностью (так называемых эффекторных белков), за пределы бактерии 8а1топе11а и, возможно, непосредственно в клетки-мишени хозяина, такие как макрофаги. Часть 8ρί2 (аппаратные гены) кодируют аппарат секреции системы III типа. 8ρί2 является безусловно существенным для патогенности и вирулентности 8а1топе11а у мышей - наблюдения, которые в настоящее время подтверждены несколькими различными группами из разных стран мира. Мутанты 8ρί2 8. Κρίιί шипит оказываются сильно аттенюированными у мышей, которых заражали, используя пероральный, внутривенный и внутрибрюшинный способы введения.
В настоящее время аппаратные гены, локализованные в 8ρί2, хорошо охарактеризованы; для примера см. Непке1 е! а1, Мо1еси1аг М1сгоЫо1оду (1997); 24(1): 155-167. Гены, подходящие для применения в данном изобретении, включают в себя гены ккаУ, кка1, ккаК, ккаЬ, ккаМ, ккаО, ккаР, ккаО. ккаК, кка8, ккаТ, ккаИ и ккаН.
Мутации в области 8ρί2 не обязательно должны быть в гене, чтобы нарушить функцию. Например, мутация в регуляторной области также может нарушать экспрессию гена, приводя к аттенуации. Мутации в межгенной области также могут быть достаточными, чтобы нарушить функцию гена.
В предпочтительном аспекте изобретения, аппаратным геном является ккаУ. В отдельном предпочтительном аспекте мутация локализована в межгенной области между кка1 и ккаК.
Вторая мутация названа ауксотрофной мутацией, так как она нарушает ген, который является существенным в биосинтетическом пути. Биосинтетический путь, имеющийся у 8а1топе11а, отсутствует у млекопитающих. Поэтому мутанты не могут зависеть от метаболитов, обнаруженных у леченых пациентов, чтобы расстроить эффект мутации. Подходящие гены для ауксотрофной мутации включают в себя любой ген аго, например, агоА, агоС, агоЭ и агоЕ.
В предпочтительном аспекте изобретения вакцинная композиция содержит микроорганизм 8а1топе11а, имеющий аттенюирующие мутации в ккаУ и агоС.
Мутации можно вводить в микроорганизм, используя любой известный способ. Предпочтительно, если мутация представляет собой делеционную мутацию, при которой нарушение гена вызывают вырезанием нуклеиновых кислот. Альтернативно, мутации можно вводить инсерцией нуклеиновых кислот или точечными мутациями. Способы введения мутаций в специфические области будут очевидны специалистам.
Кроме двух мутаций микроорганизм 8а1топе11а также может содержать гетерологические антигены. Поэтому аттенюированный микроорганизм может действовать как доставочный носитель для введения антигенов против других бактериальных или вирусных инфекций. Антигены, которые подходят для применения таким образом, будут очевидны специалистам и включают в себя:
Антигены патогенной Е. сой, то есть ЕТЕС
Антигены гепатитов А, В и С
Антигены болезни Лайма
Антигены холерного вибриона
Антигены НеБсоЬас!ег
Антигены вируса простого герпеса
Антигены вируса папилломы человека
В описанной системе также предусмотрена возможность доставки терапевтических белков, например цитокинов, для лечения пациентов, например пациентов, инфицированных гепатитом. Специалистам будут понятны способы доставки гетерологических антигенов или терапевтических белков с использованием вакцинных композиций.
Вакцины, созданные с использованием микроорганизмов согласно изобретению, находят применение для лечения инфекций человека и для лечения ветеринарных инфекций.
Двойная мутация обеспечивает эффективные способы снижения вирулентности микроорганизма, чтобы предоставить кандидата на роль безопасной вакцины.
Вакцинные композиции обеспечивают эффективную защиту даже у пациентов с ослаб5 ленным иммунитетом и, что важно, представляют низкий риск развития абсцессов селезенки. Абсцессы селезенки были идентифицированы при использовании вакцин на основе единственной мутации, и поэтому предлагаемые композиции могут представлять значительную пользу для пациентов.
Для приготовления вакцинных композиций мутантные микроорганизмы могут находиться в композиции вместе с любым подходящим фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем или наполнителем. Подходящие технологии приготовления будут очевидны специалистам в данной области. Композиции могут быть разработаны для любого подходящего способа введения. Предпочтительное введение представляет собой пероральный или внутривенный способы, а вакцины являются живыми аттенюированными микроорганизмами вида 8а1тоие11а. Количество микроорганизмов, которое должно присутствовать в композициях, может быть установлено и оптимизировано специалистом. Однако, в основном, пациенту можно вводить приблизительно 107 - 1010 КОЕ (колониеобразующих единиц), предпочтительно приблизительно 108 - 109 КОЕ в одной стандартной дозе.
Следующие примеры иллюстрируют изобретение.
Пример 1.
В примере описано получение мутантного штамма, обозначаемого ΖΗ9, который проявляет активность вакцины против брюшного тифа человека для перорального введения. Штамм получен из вирулентного штамма 8. 1урЫ Ту2, первоначально выделенного у пациента с брюшным тифом. Полученный штамм имеет определенную мутацию в ритА и агоА.
Ту2 для конструирования ΖΗ9
Впервые 8. 1урЫ Ту2 выделили у индивидуума с брюшным тифом в 1916 году и использовали для производства всех лицензированных брюшнотифозных вакцин. Штамм получали из Национальной коллекции культур РНЬ8 (лабораторная служба общественного здравоохранения) при Со1ш6а1е. Штаммы получали в виде лиофилизированной культуры, имеющей номер 8385 ИСТС (Национальная коллекция типовых культур микроорганизмов, Лондон, Великобритания).
Клонирование гена агоС 8. 1урЫ из 8. 1урЫ Ту2
8. 1урЫ Ту2 получали из запаса популяции и выращивали в течение ночи на питательной среде Луриа-Бертани (ЬВ; Ьшта Вейаш). Клетки собирали и получали всю клеточную ДНК. Фрагменты ДНК 8. 1у рЫ Ту2 получали частичным расщеплением ферментом рестрикции 8аи3А и полученные фрагменты лигировали с рНС7 9, расщепленным по ВатН1, чтобы образовать космидную библиотеку ДНК 8. 1урЫ Ту2, используя Е. сой НИ835 в качестве реципиента. Чтобы выделить ДНК, кодирующую агоС, из
ДНК 8. 1урЫ, использовали космидную библиотеку для трансдукции Е. сой АВ2849, которая включает мутацию в гене агоС и рост которой зависит от ароматических компонентов. Трансдуцирующую смесь помещали в минимальную среду, не содержащую ароматические соединения, и инкубировали при 37°С. После инкубации в течение ночи изучали ряд изолированных колоний. Описанные бактерии преимущественно возникали в результате комплементации мутации агоС в АВ2849 посредством коллекции космидного клона, содержащего интактный ген агоС. Очищали космидную ДНК из одного из упомянутых штаммов. Фрагмент ΗίηάΙΙΙ 5,2 т.н. из описанной космиды клонировали в рИС18, чтобы получить плазмиду рТАС2, которая способна дополнить делецию агоС в АВ2849, демонстрируя, что она содержит ген агоС 8. 1урЫ.
Образование определенной делеции клонированного 8. 1урЫ Ту2 агоС
Определенную делецию, 600 пар оснований, создавали в клонированном гене агоС, применяя РСК (полимеразно-цепьевая реакция). Использованные в РСК олигопептидные праймеры составляли, используя опубликованную последовательность ДНК гена 8. 1урЫ агоС (Асс.М27715). ДНК 5' в гене агоС амплифицировали из рТАС2, используя праймеры 8ЕО ΙΌ N0. 3 и 8Е0 ΙΌ N0. 1. 8Е0 ΙΌ N0. 3 отжигали на векторной ДНК, 8Е0 Ш N0. 1 отжигали на 5'-области агоС. 3'-конец ДНК в гене агоС амплифицировали, используя праймеры 8Е0 ΙΌ N0.4 и 8Е0 ΙΌ N0. 2. 8Е0 ΙΌ N0. 4 отжигали на векторной ДНК, 8Е0 Ш N0. 2 отжигали на 3'-области агоС. Полученные продукты РСК содержали ХЬа1-сайты, введенные в 5'-концы, чтобы способствовать клонированию. Фрагменты клонировали в векторную рИС18. Конечная плазмидная конструкция, обозначаемая рМ[АС23. содержала определенную делецию агоС (положение 544 до 1143) на фрагменте ΗίηάΙΙΙ 4,8 т.н.. Фрагмент ΗίηάΙΙΙ вставляли в ΗίηάΙΙΙ-сайт рИС18. Единственный ХЬа1-сайт присутствовал на участке агоС-делеции.
Введение мутации агоС в геном 8. 1урЫ Ту2
Суицидную плазмиду рСУЭ442 (□оопенЬегд & Карег, [пΓес(^оп ηηά ^тиШу, 1991; 59: 4310-4317) использовали в качестве вектора, чтобы ввести делецию агоС в геном 8. 1урЫ Ту2. Фрагмент ΗίηάΙΙΙ 4,8 т.н., содержащий делецию агоС, изолировали из рМ^С23, а концы затупляли, используя шлифующий набор ДНК 8йа1адеие. Плазмиду рСУО442 линеаризировали перевариванием посредством 8т.а1, обрабатывали щелочной фосфатазой и сшивали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию выделили и обозначили рУСУС21.
рУСУС21 вводили в 8. 1урЫ Ту2, используя стандартный протокол электропорации.
Плазмида была способна интегрироваться в геном Ту2 после рекомбинации между гомологичными областями плазмиды и генома, чтобы
Ί дать ампициллин-резистентные трансформанты. Полученные трансформанты содержали копию как исходного дикого типа агоС, так и делеционного гена агоС. Выращивая описанные штаммы в отсутствие ампициллина, учитывали второе рекомбинантное событие, которое приводило к потери последовательностей ДНК рСУО442 и одной копии гена агоС, или копии дикого типа, или делеционной копии. Бактерии 8. ΙνρΠί Ту2, которые подвергали второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллинчувствительные производные, которые способны расти в присутствии 5% сахарозы (рСУЭ442 содержит ген 5асВ, который при экспрессии давал в результате чувствительный к сахарозе фенотип). Штаммы, которые содержали только делеционный ген агоС, первоначально идентифицировали как штаммы, неспособные расти на чашках с минимальной средой в отсутствие добавок с ароматическими соединениями. Генотип агоС подтверждали, применяя анализ РСК. Праймеры, имеющие 8Ε^ ГО N0. 5 и 8Ε^ ГО N0 6, давали продукт из 994 пар оснований для дикого типа агоС и 400 пар оснований для делеционного гена агоС. Анализ последовательностей полученных продуктов РСК подтвердил присутствие требуемой делеции в 5 индивидуальных изолятах, обозначенных ΌΊΎ6, ΌΤΥ7, ΌΤΥ8, ΌΤΥ9 и ΌΤΥ10. Полученные штаммы хранили в ампулах микробанка при -70°С в течение длительного срока хранения. Штамм ΌΤΥ8 был отобран для дальнейших манипуляций.
Введение мутации 8§аУ в мутант ΌΤΥ8 8. 1ур1н агоС
Фрагмент Рь11 в 7,5 т.н., содержащий область 8§аУ 8. 1урЫ. амплифицировали из препарата тотальной ДНК, используя РСК, и клонировали в векторную рСК2.1 (1пуйгодеп). Используемые для РСК олигонуклеотидные праймеры, имеющие 8Ε^ ГО N0. 7 и 8Ε^ ГО N0. 8, отбирали по последовательности 8. (урЫтигшт 8Р12. Полученную плазмидную конструкцию обозначили рΤγ8ν21.
Плазмидную конструкцию, содержащую делецию гена 55аV, получали из рΤΥ8V21, используя РСК обратной ориентации. Праймеры, обожженные на 5'-(8Ε^ ГО N0. 9) и 3'-(8Ε^ ГО N0. 10) областях открытой рамки считывания 55ην. отбирали по последовательности 8. 1урЫтигшт 8р12. Сайт рестрикции АугП вводили в 5'-область каждого праймера, сайт ХЬа1 вводили в 8Ε^ ГО N0. 10. Сайт ХЬа1 служил в качестве метки для мутации 55а V, так, что он легко мог быть определен рестрикционнным анализом. Полученный продукт РСК подвергали перевариванию посредством АугП, а скелетные плазмидные ДНК очищали элетрофоретически на агарозном геле. Повторное кольцевание полученных фрагментов по липким концам АугП дало требуемую делецию рΥ^8V1. рΥ^8V1 содержал фрагмент Р5(1 в 5,5 т.н. с определенной делецией 1894 пар оснований в открытой рамке считывания 55аV.
Суицидальную плазмиду рС^Э442 использовали в качестве вектора для введения делеции 55аV в геном мутанта ΌΤΥ8 8. 1урЫ Ту2. Фрагмент Р511 в 5,5 т.н., содержащий делецию 55аV, изолировали из рΥ^8V1 и затупляли концы обработкой ДНК-полимеразой Кленова (К1епо\у). Плазмиду рС^442 линеаризировали перевариванием 8та1, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию изолировали и обозначили рΥ^8V214.
рΥ^8V214 вводили в 8. 1ур1н ΌΤΥ8, используя электропорацию. Выбирали ампициллин-резистентные трансформанты, а затем выращивали в отсутствие ампициллина с учетом потери последовательностей ДНК рС^442 и одной копии гена 55аV, или копии дикого типа, или делеционной копии. Штаммы, которые подвергали второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллин-чувствительные, сахарозорезистентные колонии. Штаммы, которые сохранили только делеционный ген 55аV, идентифицировали с помощью РСК-анализа. С праймерами, имеющими 8Ε^ ГО N0. 11 и 8Ε^ ГО N0.12, получили продукт из 2485 пар оснований для дикого типа и 591 пар оснований для делеционного гена 55аV. Анализ последовательностей полученных продуктов РСК подтвердил присутствие требуемой делеции в 5 индивидуальных изолятах, ΖΗ2, ΖΗ4, ΖΗ6, ΖΗ7 и ΖΗ9. Штамм ΖΗ9 был выбран для создания С6МР та5(ег клеточного банка.
Пример 2.
В примере описано получение мутантного штамма 8. (урЫтигшт, обозначенного ^Τ05, который проявляет вакцинную активность против гастроэнтерита человека. Штамм получен из известного человеческого вирулентного штамма ΤΜΓ 8. (урЫтигшт.
ΤΜΓ для конструкции ΧΥΤ05
ΤΜΓ впервые был выделен у пациента, страдавшего гастроэнтеритом, и идентифицирован в лабораториях Όγ ЛоПп 8(еуеп5 Бирмингенского Университета. Штамм лиофилизировали в \¥е11еоте Ке5еаге1 ЬаЬога!опе5 и ему был присвоен номер культуры ВКЭ 519. Культура получена из Бирмингенского Университета.
Получение определенной делеции клонированного гена 8. (урштигшт 55аV
Плазмиду (плазмида 7-2, 81еа е( а1.; РNΑ8, 1996; 93: 2593-2597) получали путем клонирования фрагмента Р511 7,5 т.н., выделенного из 8. (урЫтигшга ΓΤ2, в рИС18 на сайте Р5(1. 55аV помещали центрально на описанный фрагмент. Плазмидную конструкцию, содержащую определенную делецию открытой рамки считывания 55аV, получали из плазмиды 7-2, используя РСК обратной ориентации. Праймеры, обожженные на 5'-(8Ер ГО N0. 13) и 3'-(8Ер ГО N0. 14) об9 ластях открытой рамки считывания 55аУ. отбирали по последовательности 8. Ινρΐιί шипит 8ρί2. Сайт рестрикции ΆντΙΙ вводили в 5'область каждого праймера, и сайт ХЬа1 вводили в 8ЕС ΙΌ N0. 14. Сайт ХЬа1 служил в качестве метки для мутации 55аV так, что он легко мог быть определен рестрикционным анализом. Полученный продукт РСК подвергали перевариванию посредством ΆντΙΙ, и скелетные плазмидные ДНК очищали электрофоретически на агарозном геле. Повторное кольцевание полученных фрагментов по липким концам ΆντΙΙ дало требуемую делеционную конструкцию, обозначенную ρΜΌ8νΐ. ρΜΌ8νΐ содержала фрагмент Р5Й 5,5 т.н. с определенной делецией из 1894 пар оснований в открытой рамке считывания 55аV, ΆντΙΙ и рестрикционный сайт ХЬа! были локализованы на сайте делеции.
Суицидную плазмиду ρθνθ442 использовали в качестве вектора для введения делеции 55аV в геном 8. ίуρЫти^^ит ТМЬ. Фрагмент Ρ51Ι 5,5 т.н., содержащий делецию 55аV выделяли из ρΜΌ8νΐ, и концы затупляли обработкой ДНКполимеразой Кленова. Плазмиду ρθνθ4 42 линеаризировали перевариванием 8та1, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию выделяли и обозначили ρΜΌ8ν22.
ρΜΌ8ν22 вводили в 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη ΤΜΕ, используя конъюгирование. С этой целью конструкцию трансформировали в штамм 817-1 λ ρίτ Е. сой. Конъюгирование проводили в соответствии со стандартными способами. Плазмида ρΜΌ8ν22 способна интегрироваться в геном ΤΜΕ после рекомбинации между гомологичными областями на плазмиде и геноме с образованием ампициллин-резистентных трансконъюгатов. Трансконъюгат, обозначенный тб5У-ХТ2, был выбран для дальнейших манипуляций. Полученный трансконъюгат содержал копию как исходного 55аV дикого типа, так и делеционный ген 55а ν. Трансконъюгат выращивали в отсутствие ампициллина с учетом осуществления второй рекомбинации, которая приводит к потере последовательностей ДНК ρί.’ν0442 и одной копии гена 55аV, или копии дикого типа, или делеционной копии. Изоляты, которые подвергали описанной второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллин-чувствительные производные, способные расти в присутствии 5% сахарозы (ρθνθ442 несет ген 55аН который, когда экспрессировался, приводил к сахарозо-чувствительному фенотипу). Штаммы, которые сохранили только делеционный ген 55аV, были идентифицированы с использованием РСК-анализа. С праймерами, имеющими 8ЕС Ш N0. 15 и 8ЕС ΙΌ N0. 16, получали продукт из 2485 пар оснований для дикого типа 55аV и 591 пары оснований для делеционного гена 55аV. Анализ последовательностей полученных продуктов РСК подтвердил присутствие требуемой делеции в 4 индивидуальных изолятах, ΖΗ20, ΖΗ23, ΖΗ25 и ΖΗ26. Полученные штаммы хранили в ЬВ плюс 15% глицерин при -80°С в течение длительного периода хранения. Штамм ΖΗ26 был выбран для дальнейших манипуляций.
Клонирование гена 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη агоС из 8.1νρ1ιίιηι.ιπι.ιιη ΤΜΕ
Геномную ДНК выделяли из 8.1νρ1ιίιηι.ιπι.ιιη ΤΜΓ и расщепляли с помощью ΗίηάΙΙΙ. Фрагменты ΗίηάΙΙΙ с величинами в диапазоне от 5 до 6 т.н. очищали и пришивали к ρΒ1ι.ΐ05^ίρΙ расщепленному по ΗίηάΙΙΙ-сайту. Лигирующую смесь использовали, чтобы трансформировать мутант Е.соН агоС, АВ2849, и клоны, содержащие ген 8. Ινρΐιίшипит агоС, отбирали по их способности дополнять описанный штамм. Анализ одного клона, ρΌΑΟ, показал, что клон содержит фрагмент ΗίηάΙΙΙ в 5,2 т.н.
Определенная делеция из 600 пар оснований была создана в клонированном гене агоС с использованием РСК. Олигонуклеотидные праймеры отбирали по опубликованной последовательности ДНК гена 8. ίуρЫ агоС (Асс. М27715). ДНК 5' в гене агоС амплифицировали из ρΌΑΟ, используя праймеры, имеющие 8ЕС ΙΌ N0. 19 и 8ЕС ΙΌ N0. 17. 8ЕС Ш N0. 19 отжигали на векторной ДНК, 8ЕС ΙΌ N0. 17 отжигали на 5'-области агоС. З'-конец ДНК в гене агоС амплифицировали, используя праймеры, имеющие 8ЕС ΙΌ N0. 20 и 8ЕС ΙΌ N0. 18. 8ЕС ΙΌ N0. 20 отжигали на векторной ДНК, 8ЕС ΙΌ N0. 18 отжигали на 3'-области агоС. Полученные продукты РСК содержали сайты ХЬаЕ введенные в 5'-концы, чтобы способствовать клонированию. Фрагменты клонировали в векторную ρυθ8. Конечная плазмидная конструкция ΡΜIΑС8 содержала определенную делецию агоС (Асс. М27715 положение 544 до 1143) на фрагменте ΗίηάΙΙΙ в 4,8 т.н. Фрагмент ΗίηάΙΙΙ вставляли в сайт ΗίηάΙΙΙ ρυί.Ί8. Единственный сайт ХЬа! присутствует на участке делеции.
Введение мутации агоС в мутант ΖΗ26
8. ίуρЫти^^ит 55аV
Суицидную плазмиду ρθνϋ442 использовали в качестве вектоρа, чтобы ввести делецию агоС в геном 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη ΤΜΕ. Фрагмент ΗίηάΙΙΙ в 4,8 т.н., содержащий делецию агоС, изолировали из рМ[АС8 и концы затупляли, используя шлифующий набор ДНК 8ΐπιΐ3βοηο (Рай №. 200409). Плазмиду ρθνθ442 линеаризировали путем переваривания посредством 8та!, обрабатывали щелочной фосфатазой и лигировали с фрагментами с затупленными концами. Требуемую конструкцию изолировали и обозначили ρΜ0ν016. ρΜ0ν016 вводили в 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη ΖΗ26 с использованием электропорации. Отбирали ампициллинрезистентные трансформанты и выращивали в отсутствие ампициллина с учетом потери последовательностей ДНК ρθνθ442 и одной копии гена агоС, или копии дикого типа или делеционной копии. Штаммы, которые подвергали описан11 ной второй рекомбинации, идентифицировали как ампициллин-чувствительные производные, которые способны расти в присутствии 5% сахарозы. Штаммы, которые сохранили только делеционнй ген агоС, первоначально идентифицировали как штаммы, которые не способны расти на чашках с минимальной средой в отсутствие добавки ароматических соединений. Генотип агоС подтвердили РСК. анализом. Праймеры, имеющие 8ЕЦ ΙΌ N0. 21 и 8Е0 ΙΌ N0. 22, дали продукт из 994 пар оснований для дикого типа агоС и 400 пар оснований для делеционного гена агоС. Анализ последовательностей полученных продуктов РСК подтвердил присутствие требуемой делеции в 4 индивидуальных изолятах, обозначенных \Т05, АГ09. \\'Т010 и \\'Т012. Штамм \Т05 был выбран для создания клеточного банка ССМР шайет.
Пример 3.
Следующую конструкцию получали для исследования вакцин с двойной мутацией на животной модели. Использовали штамм 8. 1урЫшитшт 8Ь 1344, имеющий единственную и двойную мутации, которым инфицировали мышей.
Мутация 88аУ::ар11 (неполярная) из 8. 1урЫтитшт 120238 была Р22-трансдуцирована в 8Ь 1344, чтобы получить мутант 8ρί2 с единственной мутацией.
Содержащую делецию агоС/суицидную векторную рСУЭ422 рМСУС16 электропорировали в штамм ЬВ5010 8. 1урЫтигшт, и получили меродиплоиды. Меродиплоид с делецией агоС был затем Р22-трансдуцирован из меродиплоида ЬВ5010 в 8Ь 1344. Меродиплоид 8Ь 1344 затем отделяли, используя селекцию сахарозой, чтобы получить мутант агоС с единственной мутацией.
Двойной мутант получали трансдукцией Р22 меродиплоида с делецией агоС из ЬВ5010 в 8Ь 1344 88аУ::арй. Плазмидные последовательности отделяли от меродиплоида, оставляя штамм 3 с делеционной мутацией агоС в генетической среде 8Ь 1344 88аУ::ар11.
Предклинические фармакодинамические исследования на определенных мутантах агоС/88аУ 8а1топе11а
Проведено обширное исследование мутантов 8а1топе11а (штамм 8Ь 1344), содержащих определенные мутации либо в агоС, 88аУ, либо комбинацию обеих, на мышах ВАЬВ/С, чтобы оценить аттенуацию, персистенцию организмов и возможность иммунизации против заражения штаммом дикого типа.
Пример 4. Животные, иммунизированные внутривенным способом.
Исследования защиты
Группу из десяти мышей ВАЬВ/С иммунизировали внутривенно дозой 105 и 106 организмов 8Ь 1344 агоС, 8Ь 1344 88аУ и 8Ь 1444 агоС:88аУ, выращенных в течение ночи в питательной среде ЬВ и повторно суспендированных в физиологическом растворе для введения.
Мышей заражали через 6 недель внутривенным введением 105 организмов дикого типа. Десяти организмов из названного штамма дикого типа оказалось достаточно, чтобы убить мышей.
Все мыши, получившие мутанты с единственной мутацией агоС или 88аУ, были надежно защищены после заражения каждой дозой и оставались здоровыми на протяжении всего эксперимента, не проявляя никаких признаков заболевания. Что касается двойных мутантов, 90% животных, которые получили иммунизацию 106 организмов, были надежно защищены. Одно из животных погибло на 8 день после заражения. Что касается животных, которые были иммунизированы более низкой дозой, то лишь 1 из мышей осталась в живых после заражения.
Эксперименты показали, что иммунизация мутантами 88аУ 8а1топе11а, либо индивидуально, либо в комбинации с мутацией агоС, позволяет добиться выработки иммунитета у мышей против заражения штаммом 8а1топе11а дикого типа.
Персистенция штаммов
Группам мышей вводили дозу 106 организмов трех мутантов 8а1топе11а, описанных выше. Четырех мышей умерщвляли в различные периоды времени вплоть до 14 дня и проводили подсчет организмов в печени и селезенке. Количества всех трех мутантов сравнивали вплоть до 10 дня, когда количество составило приблизительно 5 х 105 организмов в каждом органе. На 14 день были выявлены различия между мутантами с единственной и двойной мутациями, при этом в логарифмической зависимости уменьшалось количество организмов с двойной мутацией как в печени, так и в селезенке.
Другое важное различие между мутантами с единственной мутацией и двойным мутантом агоС/88аУ заключается в том, что не было обнаружено никаких абсцессов печени ни в один из периодов времени в процессе эксперимента у двойных мутантов. Однако у мышей, инфицированных мутантом с единственной мутацией, были обнаружены абсцессы печени на 10 и 14 дни. Представленные данные важны и серьезно указывают на целесообразность применения описанной комбинации мутаций для оценки препаратов вакцин.
Иммуногенность
У мышей, иммунизированных, как описано выше, брали кровь и определяли титры антител против целой клетки 8а1топе11а, используя ЕЫ8А (твердофазный иммуноферментный анализ). Показано, что все три штамма являются высоко иммуногенными, с высокими титрами циркулирующего 1дС против 8а1топе11а.
Пример 5. Животные, иммунизированные пероральным способом.
Персистенция штаммов
Группы мышей, иммунизированных перорально 5 х 105 организмов каждого из трех мутантов 8а1топе11а, умерщвляли через определенные интервалы и оценивали количество ор13 ганизмов в печени и селезенке. Что касается мутанта с единственной мутацией аго и с единственной мутацией ккаУ, их количества в печени и селезенке составляли, соответственно, 103 и 102 приблизительно вплоть до 21 дня. Затем количество организмов снижалось. Что касается мышей, получивших двойные мутанты агоС:ккаУ, после пероральной иммунизации организмы достоверно не определялись ни в печени, ни в селезенке.
Иммунизация пероральным способом и внутривенное заражение мышей Л-1, вакцинированных 8а1топе11а (урЫтигшт ТМЬ агоС/ккаУ (№ТО5)
Цель описываемого эксперимента заключалась в выяснении протективной эффективности 5 х 109 мутантов агоС/ккаУ 8. (урЫтигшт ТМЬ при пероральной вакцинации мыши Иуг и на внутривенно зараженной модели. Упомянутая модель в большей степени напоминает ответную реакцию человека на 8а1топе11а тем, что названные животные являются менее чувствительными, чем йук-фенотип.
мышей Л-1 в возрасте 6-8 недель вакцинировали перорально через желудочный зонд 5х109 8. (урЫтигшт ТМЬ агоС/ккаУ в объеме 0,2 мл РВ8 и оставляли на 8 недель. Двум мышам вводили только РВ8 в те же периоды времени и они служили в качестве контрольных животных. Через 8 недель две иммунизированные группы заражали внутривенно 107 8. 1ур1итипит ТМЬ дикого типа. За мышами наблюдали в течение 30 дней после заражения.
Все животные оказались надежно защищенными против заражения диким типом (100% выживание, живые 10/10 животных). Мыши, получившие только РВ8 и затем зараженные диким типом 8. 1ур1итипит ТМЬ, погибли на 6 день после заражения.
Оказалось, что у Пу'-фенотипа двойной 8. (урЫтипит ТМЬ агоС/ккаУ защищает мышей, получивших пероральную дозу 5х109 Описанный факт может быть важным в случае человека, так как мыши Нуг являются лучшей моделью сальмонелеза человека с точки зрения чувствительности к инфекции.
Также были проведены исследования с целью выяснения персистентности двойных мутантов в печени и селезенке мышей. Обнаружено, что двойные мутанты сохраняются при низких уровнях около 21 дня. К 28 дню происходило удаление мутантной линии.
Пример 6. Клиническое испытание на человеке.
здоровых волонтеров было привлечено для обширного исследования без контроля плацебо. После соответствующего скрининга каждый из 3 волонтеров получал однократную пероральную дозу или 107, 108 или 109 КОЕ 8. (урЫ ΖΗ9 или 8. (урЫтипит \УТО5. Микроорганизмы, приготовленные, как описано выше, повторно суспендировали до соответствующих концентраций доз в конечном объеме 100 мл 2% (мас./об.) раствора двууглекислого натрия, чтобы нейтролизовать желудочную кислоту. Полученную жидкую суспензию вводили волонтерам перорально. Затем волонтеров изолировали в течение 72 ч, тщательно наблюдая за ними после иммунизации в отношении безопасности и иммуногенности.
У волонтеров оценивали реактогенность и другие неблагоприятные явления, связанные с вакцинацией, посредством наблюдения, врачебного осмотра и составления диарейных карт, кроме того, собирали культуры крови, испражнений и мочи, чтобы исследовать вакцинемию, потерю и устойчивость вакцинных штаммов. Дополнительные данные относительно безопасности были получены в результате измерения уровней С-реактивного белка (СВР) и ферментов функции печени (ЛЬТ) в крови, общего количества белых клеток крови (^ВС) и скорости оседания эритроцитов (Е8В), используя стандартные способы. Перечисленные параметры измеряли в крови, которую брали ежедневно до 7 дня, и потом - с еженедельными интервалами до 28 дня.
Анализ ответных реакций слизистых и системного иммунного ответа
Образцы крови и слюны собирали до иммунизации и потом -на 7, 14, 21 и 28 день после иммунизации. Слюну и сыворотку замораживали при -70°С до исследования, проводимого методом ЕЬ18А. Мононуклеарные клетки периферической крови собирали и исследовали присутствие в них клеток, секретирующих антитела (А8Ск), применяя способ ЕЬ18РОТ (иммуноферментный спот-анализ).
Как 8. 1ур1и ΖΗ9, так и 8. (урЫтипит \УТО5 хорошо переносились всеми волонтерами. Никаких серьезных неблагоприятных явлений ни у кого из волонтеров не наблюдали ни на одном из 3 уровней доз, а культуры крови и мочи оставались негативными у всех вакцинированных во всех временных точках исследования. Таким образом, иммунизация как 8. 1ур1и ΖΗ9, так и 8. (урЫтигшт \УТО5 не приводила к вакцинемии. Ни у кого из волонтеров не обнаруживали ни вызванной штаммами диареи, ни устойчивой интенсивной лихорадки, что указывает на безопасность вакцинных штаммов. Ни устойчивой экскреции, ни вакцинемии после 7 дня ни у одного из волонтеров 3 дозовых групп 8. 1ур1и ΖΗ9, а также группы низкой дозы (107) 8. (урЫтигшт \УТО5 не наблюдали.
Слизистые и системные иммунные ответные реакции, выявленные с помощью
8. 1ур1и ΖΗ9
Пероральная иммунизация однократной низкой дозой (1х107 КОЕ) 8. 1ур1и ΖΗ9 приводила к появлению 8. 1ур1и-специфических 1дАсекретирующих А8С у 2 из 3 волонтеров, определяемых на 7 день после иммунизации. Последующее тестирование на 14 и 21 дни показало, что 1дА-А8С еще определялись, но в значительно меньшей степени, и исчезали к 28 дню. Почти у всех отвечающих вакцинированных количество А8С было более высоким на 7 день. Неожиданно прием внутрь более высокой дозы (108 КОЕ) 8. 1урЫ приводил к низкому ответу 1дА-Л8С только у одного из трех волонтеров. Прием внутрь наиболее высокой дозы (1 х 109 КОЕ) индуцировал 1дА-А8С у 2 из 3 волонтеров.
Ответ 8а1топе11а-специфических сывороточных антител
При пероральной иммунизации однократной низкой дозой (1х107 КОЕ) 8. 1урЫ ΖΗ9 не удалось выявить 8. 1урЫ-ЕР8-специфический сывороточный 1дО (несмотря на образование 1дЛ-Л8С.’5 у 2/3 вакцинированных), когда исследовали на 7, 14, 21 и 28 дни. Аналогично, только 1/3 продуцировала очень низкие уровни флагелла-специфического 1дО. Однако прием внутрь 108 КОЕ приводил к продукции высоких уровней как ЬР8, так и флагелла-специфических 1дО у всех 3 волонтеров. Увеличенные уровни 8. 1урЫ-ЬР8-специфического и флагелласпецифического 1дО определяли уже на 7 день после вакцинации, они возрастали к 14 дню и сохранялись высокими на 28 день. Наиболее высокая доза 109 КОЕ также стимулировала ЬР8- и флагелла-специфический 1дО у 2 из 3 вакцинированных, что обнаруживали на 7 и 14 дни, соответственно.
Выводы
Представленное исследование продемонстрировало преимущество мутации 55аУ в качестве компонента нового брюшнотифозного вакцинного штамма для перорального введения. Штамм 8. 1урЫ, содержащий только агомутации, будет вызывать вакцинемию при вводимых дозах. Поэтому мутация 55а У обеспечивает дополнительный уровень безопасности единственной мутации аго посредством устранения вакцинемии при использовании описанного ранее состава.
Что касается обеспечения хорошей толерантности, также было продемонстрировано, что ΖΗ9 оказался иммуногенным при всех трех введенных уровнях доз. Относительно стимулирования сывороточных антител доказано, что промежуточные (108 КОЕ) и наивысшие (109 КОЕ) дозы оказались высокоиммуногенными, в случае введения 108 КОЕ 3/3 вакцин и в случае введения 10 9 КОЕ 2/3 продемонстрировали высокие титры как 8. 1урЫ ЬР8, так и флагелласпецифического 1дО. Описанные ответные реакции являются очень обнадеживающими, так как при пероральной вакцинации вообще трудно выявить сывороточные антитела.
Что касается возникновения ответных реакций 8. 1урЫ-специфических сывороточных антител, ΖΗ9 также инициировал 1дА Л8С5, что указывает на иммунную стимуляцию в слизистой кишечника. Всего у 5/9 волонтеров выявили ответ 8. 1урЫ ЬР8-специфических 1дАсекретирующих клеток (А8С), который, как оказалось, не является дозозависимым.
Оказалось, что АТО5 также хорошо переносится и не обнаружено никакой вакцинемии. Интересно, что никакой диареи или симптомов гастроэнтерита ни у кого из волонтеров не наблюдали. Предварительные данные, полученные с использованием мутантного штамма ТМЬ с единственной аго- или 8р12-мутациями в 8. 1урЫтитшт, введенными мышам, позволили предположить, что двойной мутант агоС/55аУ может вызывать некоторые местные кишечные проявления, например диарею, судороги у человека. Отсутствие названных проявлений дополнительно подтверждает преимущество комбинации мутаций агоС и 8р12.
Пример 7. Гетерологические антигенные носители.
Чтобы продемонстрировать преимущество двойных мутантных штаммов 55аУ:агоС для экспрессии и доставки чужеродных антигенов, АТО5 трансформировали плазмидой (рВРОО26), экспрессирующей ген субъединицы В термостабильного энтеротоксина Е.соН (ЬТВ).
Мышей ВАЬВ/С (п = 10/группу) иммунизировали пероральным введением на 0 и 28 дни 109 КОЕ (200 мл в РВ8) АТО5, экспрессирующего рВРЭО26, или посредством векторного штамма АТО5 (контроль). Для сравнения (и в качестве положительного контроля) группу мышей (п = 5) иммунизировали перорально на 0 и 28 дни 10 мкг очищенного ЬТ (8щта). Негативных контрольных мышей (п = 5) иммунизировали перорально на 0 и 28 день 200 мкл РВ8. У мышей брали кровь из хвостовой вены на 21, 28, 35 дни и при пункции сердца на 42 день, а также собирали сыворотку и кишечную жидкость (только на 42 день) и хранили при -20°С.
У всех мышей, кроме одной, иммунизированных АТО5/ЬТ-В, выявили ЬТ-специфический 1дО (титры 3000 - 50000) на 28 день после однократной пероральной дозы. Ни у одной из контрольных мышей, иммунизированных перорально АТО5 или РВ8, не выявили ЬТспецифический 1дО. При пероральной иммунизации однократной дозой очищенного ЬТ были обнаружены более высокие титры ЬТспецифических антител (титры 6000 -> 50000). При исследовании изотипа ЬТ-Вспецифического 1дО было установлено, что штамм АТО5. экспрессирующий рВРЭО26, вырабатывал почти исключительно ЬТспецифический 1дО2а, что указывает на смещение в направлении иммунного ответа ТН1-типа. В отличие от этого, мыши, иммунизированные очищенным ЬТ (8щта), продуцировали почти исключительно ЬТ-специфический 1дС 1, что указывает на ответную реакцию ТН2-типа. Следовательно, экспрессия ЬТ-В в штамме агоС/55аУ облегчает фундаментальную иммун17 номодуляцию. ΤΗ 1-смещение ответных реакций, генерируемых штаммом 8а1топе11а атоС/ккаУ, имеют особое значение, когда экспрессируются антигены патогенных организмов, у которых ответные реакции типа ТН1 являются защитными.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <11С> М1сгозс1ег.се Ыт1тес1 <12С> Аттенюированные микроорганизмы для лечения инфекции <130> КЕРО6128ИО <· 40>
< 1 4 1>
<150 9910812.8 <151> 1999-05-10 <160 22 <170> Патент ίη Уег. 2.1 <210> 1 <211> 36 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <4С0> 1 аатсадЛсса даааСаоСдд гдссддЬсдс сасдсс 36 <210 2 <211> 36 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <4С0> 2 аассадксДа даадсддаса асасаггдОд дсдсаС 36 <210 3 <211> 23 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 3 сссадгсасс асдтсдЛааа асд 23 <210>
<210 23 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <2 2 0>
<223> Описание синтетической .последовательности: олигонуклеотид <400 4 адсдаагаас аатОсасас адд 23 <210> 5 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 5 сддсдааоса сасдддсгдд с 21 <2ГО б <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 6 ддсдсадсад дгдабссаДс а 21 <210 7 <211> 35 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400 дссасСааса сдаоаасддС Сдсдгдаааа ссасд 35 <210 8 <211> 32 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 8 сдсаааддсс ссДдсадаас сдадссадда дс 32 <211> 61.
<212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <2 2 0 >
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 9 сассдссссс аддассагаО ссгдссдасс сдсдсаСаса сСдадссасо дОдсдсссг: 60 д 61 <210 10 <211> 63 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 10 ддсаддассо аддсСадСсЛ адасОДаРас аадДддОада аадОаОдас сОадсдаад 60 адд 63 <210> 11 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
Описание синтетической последовательности:
00:
аатагдССсо ддсддсаадд <210:
:212:
ДНК
Синтетическая последовательность
220:
Описание синтетической последовательности:
олигонуклеотид олигонуклеотид
ДНК
Синтетическая последовательность :23>
Списание синтетической последовательности:
:4С <210> 14 <210 63 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Списание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400 14 ддсаддасс! аддсДадЕсД адаеслагас аадсддоада ааддакддас слгадсдаад 60 адд 63 <210> 15 <211> 2С <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400 15 аасаЕдсссд адсддсаадд 20 <210> 16 <211> 20 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 16 аГссссасда ссссадсааа 20 <210 17 <210 36 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Списание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 17 аатсадг.сГа даааСасддд Сдссдддссд сасдсс 36 <210 13 <211> 36 <212> ДЕК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 13 аассаддсРа саадгдддса асасаССдЕд дсдсаС 36 <210> 19 <211> 23 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <4С0> 19 сссадтсасд асдЮдТааа асд 23 <210 20 <211> 23 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400 20 адсддадаас ааССГсасас адд 23 <210 21 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220 <223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400> 21 сддсдаадса сасддасДдд с 21 <210 22 <211> 21 <212> ДНК <213> Синтетическая последовательность <220>
<223> Описание синтетической последовательности: олигонуклеотид <400 22 ддсдсадсад дбдаТссаСс а 21
Claims (11)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Микроорганизм 8а1тоие11а, имеющий аттенуирующую мутацию, которая нарушает экспрессию гена 55аV, и мутацию, которая нарушает экспрессию гена агоС.
- 2. Микроорганизм по п.1, который дополнительно содержит гетерологичный антиген или терапевтический белок.
- 3. Микроорганизм по п.2, в котором антиген является антигеном гепатита А, В или С.
- 4. Микроорганизм по любому из пп.1-3, который представляет собой 8а1тоие11а 1урЫ Ту2.
- 5. Применение микроорганизма по любому из пп.1-4 в терапии бактериальной или вирусной инфекции.
- 6. Вакцинная композиция, содержащая микроорганизм по любому из пп.1-4, а также адъювант и физиологически приемлемый разбавитель.
- 7. Композиция по п.6, которая содержит от 107 до 1010 КОЕ микроорганизма в однократной стандартной дозе.
- 8. Композиция по п.7, которая содержит 108-109 КОЕ микроорганизма.
- 9. Применение микроорганизма по любому из пп.1-4 в производстве лекарственного средства для внутривенного введения для лечения системной бактериальной инфекции.
- 10. Применение микроорганизма по любому из пп.1-4 в производстве перорального лекарственного средства для лечения системной бактериальной инфекции.
- 11. Применение по п.9 или 10 для лечения брюшного тифа.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9910812.8A GB9910812D0 (en) | 1999-05-10 | 1999-05-10 | Vaccine composition |
| PCT/GB2000/001749 WO2000068261A2 (en) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | Attenuated microorganisms for the treatment of infection |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200101187A1 EA200101187A1 (ru) | 2002-04-25 |
| EA004921B1 true EA004921B1 (ru) | 2004-10-28 |
Family
ID=10853168
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200101187A EA004921B1 (ru) | 1999-05-10 | 2000-05-09 | Аттенуированный микроорганизм salmonella и способы его применения |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6756042B1 (ru) |
| EP (2) | EP1702927B1 (ru) |
| JP (1) | JP4583607B2 (ru) |
| KR (2) | KR100811319B1 (ru) |
| CN (1) | CN1177863C (ru) |
| AP (1) | AP1470A (ru) |
| AT (2) | ATE346090T1 (ru) |
| AU (1) | AU763898B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0010418B8 (ru) |
| CA (1) | CA2372553C (ru) |
| CY (1) | CY1107656T1 (ru) |
| CZ (1) | CZ301926B6 (ru) |
| DE (2) | DE60031974T2 (ru) |
| DK (1) | DK1183269T3 (ru) |
| EA (1) | EA004921B1 (ru) |
| ES (1) | ES2277591T3 (ru) |
| GB (1) | GB9910812D0 (ru) |
| HU (1) | HUP0201117A3 (ru) |
| IL (3) | IL146255A0 (ru) |
| MA (1) | MA25411A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA01011477A (ru) |
| NO (1) | NO329520B1 (ru) |
| NZ (1) | NZ539260A (ru) |
| OA (1) | OA11940A (ru) |
| PT (1) | PT1183269E (ru) |
| TR (1) | TR200702949T2 (ru) |
| WO (1) | WO2000068261A2 (ru) |
| ZA (1) | ZA200108912B (ru) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2178101T3 (es) * | 1994-12-09 | 2002-12-16 | Imp College Innovations Ltd | Genes de virulencia en la region vgc2 de salmonella. |
| EP1970449B1 (en) * | 1998-09-04 | 2010-11-03 | Emergent Product Development UK Limited | Attenuated salmonella SPI2 mutants as antigen carriers |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| GB0105924D0 (en) * | 2001-03-09 | 2001-04-25 | Microscience Ltd | Promoter |
| US7449178B2 (en) * | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
| US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
| WO2008153772A2 (en) * | 2007-05-25 | 2008-12-18 | Emergent Product Development Gaithersburg Inc. | Chlamydia vaccine comprising htra polypeptides |
| WO2009158240A1 (en) * | 2008-06-16 | 2009-12-30 | Emergent Product Development Uk Limited | Salmonella vectored vaccines against chlamydia and methods of use |
| US20120020996A1 (en) | 2008-08-06 | 2012-01-26 | Jonathan Lewis Telfer | Vaccines against clostridium difficile and methods of use |
| WO2010048322A1 (en) * | 2008-10-21 | 2010-04-29 | Emergent Product Development United Kingdom | Use of e. coli surface antigen 3 sequences for the export of heterologous antigens |
| US8481052B2 (en) | 2011-05-17 | 2013-07-09 | Cj Cheiljedang Corporation | Avirulent Salmonella gallinarum variants and pharmaceutical composition using the same |
| CA2926984A1 (en) * | 2013-10-11 | 2015-04-16 | Servicio Galego de Saude (Sergas) | Live attenuated vaccines |
| US9616114B1 (en) | 2014-09-18 | 2017-04-11 | David Gordon Bermudes | Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
| US11541105B2 (en) | 2018-06-01 | 2023-01-03 | The Research Foundation For The State University Of New York | Compositions and methods for disrupting biofilm formation and maintenance |
| US11471497B1 (en) | 2019-03-13 | 2022-10-18 | David Gordon Bermudes | Copper chelation therapeutics |
| US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
| EP3922255A1 (en) | 2020-06-10 | 2021-12-15 | Prokarium Limited | Cancer therapy |
| EP4124342A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-01 | Prokarium Limited | Cancer therapy with live attenuated bacteria |
| AU2022404718A1 (en) | 2021-12-09 | 2024-05-30 | Prokarium Limited | Combination cancer therapy |
| WO2024061748A1 (en) | 2022-09-21 | 2024-03-28 | Prokarium Limited | Salmonella strain with chromosomally integrated landing pad |
| GB202215134D0 (en) | 2022-10-13 | 2022-11-30 | Prokarium Ltd | Composition |
Family Cites Families (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4440859A (en) | 1977-05-27 | 1984-04-03 | The Regents Of The University Of California | Method for producing recombinant bacterial plasmids containing the coding sequences of higher organisms |
| US4704362A (en) | 1977-11-08 | 1987-11-03 | Genentech, Inc. | Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression |
| YU44186B (en) | 1978-12-22 | 1990-04-30 | Biogen Nv | Process for obtaining recombinant dnk molecules |
| US4530901A (en) | 1980-01-08 | 1985-07-23 | Biogen N.V. | Recombinant DNA molecules and their use in producing human interferon-like polypeptides |
| US4837151A (en) | 1980-05-19 | 1989-06-06 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University, Stanford University | Live vaccines comprising two mutations and foreign antigen |
| US4550081A (en) | 1980-05-19 | 1985-10-29 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Jr. University | Non-reverting salmonella |
| US5210035A (en) | 1980-05-19 | 1993-05-11 | Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University | Non-reventing live vaccines |
| US4766075A (en) | 1982-07-14 | 1988-08-23 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator |
| US4582800A (en) | 1982-07-12 | 1986-04-15 | Hoffmann-La Roche Inc. | Novel vectors and method for controlling interferon expression |
| US4757006A (en) | 1983-10-28 | 1988-07-12 | Genetics Institute, Inc. | Human factor VIII:C gene and recombinant methods for production |
| US4677063A (en) | 1985-05-02 | 1987-06-30 | Cetus Corporation | Human tumor necrosis factor |
| US5643579A (en) * | 1984-11-01 | 1997-07-01 | American Home Products Corporation | Oral vaccines |
| US4810648A (en) | 1986-01-08 | 1989-03-07 | Rhone Poulenc Agrochimie | Haloarylnitrile degrading gene, its use, and cells containing the gene |
| US5397697A (en) | 1989-01-10 | 1995-03-14 | Ciba-Geigy Corporation | Identification of plant-responsive genes of bacteria |
| FR2664614B1 (fr) | 1990-07-11 | 1992-10-16 | Pasteur Institut | Sequences nucleiques issues du genome de salmonella typhi, et leurs utilisations notamment pour le diagnostic in vitro de la presence de bacteries du genre salmonella dans les produits alimentaires. |
| SE9101433D0 (sv) | 1991-05-13 | 1991-05-13 | Marianne Hansson | Recombinant dna sequence and its use |
| AU2509592A (en) | 1991-08-22 | 1993-03-16 | Washington University | Polynucleotide probes for salmonella |
| AU2778992A (en) | 1991-10-07 | 1993-05-03 | Idaho Research Foundation Inc., The | Genetic construct for selection of homologous recombinants on a single selective medium |
| EP0613500A1 (en) | 1991-11-15 | 1994-09-07 | The Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| US5356797A (en) | 1991-11-15 | 1994-10-18 | Board Of Regents, The University Of Texas | Membrane expression of heterologous genes |
| CA2148829A1 (en) | 1992-11-06 | 1994-05-26 | Keum Hwa Choi | Avirulent live vaccine and method for immunizing animals against p. multocida pasteurellosis |
| WO1994026933A1 (en) | 1993-05-13 | 1994-11-24 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Genetic footprinting: insertional mutagenesis and genetic selection |
| WO1996011708A1 (en) | 1994-10-18 | 1996-04-25 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Membrane expression of heterologous genes |
| ES2178101T3 (es) | 1994-12-09 | 2002-12-16 | Imp College Innovations Ltd | Genes de virulencia en la region vgc2 de salmonella. |
| US5700683A (en) | 1995-02-17 | 1997-12-23 | Pathogenesis Corporation | Virulence-attenuating genetic deletions deleted from mycobacterium BCG |
| WO1997014800A1 (en) | 1995-10-16 | 1997-04-24 | Smithkline Beecham Plc | Novel saliva binding protein |
| EP0939761A4 (en) | 1995-11-14 | 2002-07-31 | Gen Hospital Corp | SALMONELLA SECRETIED PROTEINS AND USE THEREOF |
| US6030624A (en) | 1996-08-16 | 2000-02-29 | Uab Research Foundation | Mucosal immunogens for novel vaccines |
| GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
| AU722326B2 (en) | 1997-02-14 | 2000-07-27 | Merck & Co., Inc. | Polynucleotide vaccine formulations |
| US6455323B1 (en) | 1997-07-03 | 2002-09-24 | Pharmacia & Upjohn Company | Anti-bacterial methods and materials |
| GB9804809D0 (en) | 1998-03-06 | 1998-04-29 | Wallis Timothy S | Attenuated salmonella:materials and methods relating thereto |
| US6585975B1 (en) | 1998-04-30 | 2003-07-01 | Acambis, Inc. | Use of Salmonella vectors for vaccination against helicobacter infection |
| EP1970449B1 (en) | 1998-09-04 | 2010-11-03 | Emergent Product Development UK Limited | Attenuated salmonella SPI2 mutants as antigen carriers |
| EP1129196B1 (en) | 1998-11-09 | 2008-01-09 | Microscience Limited | Virulence genes and proteins, and their use |
| GB9910812D0 (en) * | 1999-05-10 | 1999-07-07 | Microscience Ltd | Vaccine composition |
| WO2001032697A2 (en) | 1999-11-05 | 2001-05-10 | L'unite De Recherche En Biologie Moleculaire (Urbm) Des Facultes Universitaires Notre Dame De La Paix (Fundp) | Virulence genes and proteins from brucella melitensis, and their use |
| JP3414342B2 (ja) * | 1999-11-25 | 2003-06-09 | 日本電気株式会社 | 集積回路チップの実装構造および実装方法 |
| EP1905834A3 (en) | 1999-12-23 | 2008-07-23 | Vmax Limited | Virulence Genes, Proteins, and their Use |
| GB0011108D0 (en) | 2000-05-08 | 2000-06-28 | Microscience Ltd | Virulence gene and protein and their use |
| GB0127657D0 (en) | 2001-11-19 | 2002-01-09 | Microscience Ltd | Virulence genes and proteins and their use |
| US7449178B2 (en) | 2002-04-05 | 2008-11-11 | Merial Limited | Attenuated gram negative bacteria |
-
1999
- 1999-05-10 GB GBGB9910812.8A patent/GB9910812D0/en not_active Ceased
-
2000
- 2000-05-09 HU HU0201117A patent/HUP0201117A3/hu not_active Application Discontinuation
- 2000-05-09 ES ES00927538T patent/ES2277591T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 IL IL14625500A patent/IL146255A0/xx active IP Right Grant
- 2000-05-09 KR KR1020067018279A patent/KR100811319B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 AT AT00927538T patent/ATE346090T1/de active
- 2000-05-09 CA CA2372553A patent/CA2372553C/en not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 CZ CZ20014030A patent/CZ301926B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 NZ NZ539260A patent/NZ539260A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 CN CNB00808419XA patent/CN1177863C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 EA EA200101187A patent/EA004921B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 MX MXPA01011477A patent/MXPA01011477A/es active IP Right Grant
- 2000-05-09 TR TR2007/02949T patent/TR200702949T2/xx unknown
- 2000-05-09 AP APAP/P/2001/002317A patent/AP1470A/en active
- 2000-05-09 WO PCT/GB2000/001749 patent/WO2000068261A2/en active Application Filing
- 2000-05-09 BR BRPI0010418A patent/BRPI0010418B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 KR KR1020017014154A patent/KR100680391B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 AU AU45932/00A patent/AU763898B2/en not_active Ceased
- 2000-05-09 DE DE60031974T patent/DE60031974T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 US US09/569,601 patent/US6756042B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 JP JP2000616235A patent/JP4583607B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2000-05-09 EP EP06012488A patent/EP1702927B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 OA OA1200100295A patent/OA11940A/en unknown
- 2000-05-09 EP EP00927538A patent/EP1183269B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 DE DE60043868T patent/DE60043868D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-09 DK DK00927538T patent/DK1183269T3/da active
- 2000-05-09 AT AT06012488T patent/ATE457998T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-05-09 PT PT00927538T patent/PT1183269E/pt unknown
-
2001
- 2001-10-29 ZA ZA200108912A patent/ZA200108912B/xx unknown
- 2001-10-31 IL IL146255A patent/IL146255A/en not_active IP Right Cessation
- 2001-11-08 NO NO20015464A patent/NO329520B1/no not_active IP Right Cessation
- 2001-11-09 MA MA26404A patent/MA25411A1/fr unknown
-
2004
- 2004-04-08 US US10/822,053 patent/US7211264B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-12-21 CY CY20061101836T patent/CY1107656T1/el unknown
-
2007
- 2007-02-01 US US11/701,214 patent/US7887816B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-10-29 IL IL186993A patent/IL186993A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7887816B2 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| KR20010024650A (ko) | ＲｐｏＳ 양성 표현형을 가진 면역원성 약독화 박테리아를포함하는 재조합 백신 | |
| CN114107228B (zh) | 缺失十二个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用 | |
| CN114015660B (zh) | 缺失十个基因的减毒非洲猪瘟病毒株的构建及其作为疫苗的应用 | |
| CN111867622A (zh) | 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 | |
| KR20040101258A (ko) | 세균성 포자 | |
| US7541447B2 (en) | Process for the preparation of an improved Brucella strain plasmid to develop the strain and the vaccine comprising the said strain | |
| CA2320489A1 (en) | Live vaccine for human immunodeficiency virus | |
| US20030059442A1 (en) | Attenuated microorganisms for the treatment of infection | |
| Vasconcellos et al. | Vaccine Against Entheropathogenic E. coli: A Systematic Review | |
| JP4881733B2 (ja) | アルドラーゼ陰性弱毒細菌生ワクチン | |
| PL203551B1 (pl) | Mikroorganizm Salmonella, kompozycja szczepionki zawieraj aca mikroorganizm Salmonella i zastosowanie mikroorganizmu Salmonella |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): RU |