PT1183269E - Microrganismos atenuados para o tratamento de infecção - Google Patents
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Description
ΕΡ 1 183 269 /PT
DESCRIÇÃO "Microrganismos atenuados para o tratamento de infecção" Campo do Invento 0 presente invento refere-se a microrganismos atenuados que podem ser utilizados em composições de vacina para a prevenção ou tratamento de infecções bacterianas ou virais.
Antecedentes do Invento
Está bem estabelecido que os microrganismos vivos atenuados são vacinas altamente eficazes; as respostas imunitárias provocadas por tais vacinas são frequentemente de maior grandeza e maior duração que as produzidas por imunogénios não replicantes. Uma explicação para isto pode ser que as estirpes vivas atenuadas estabelecem infecções limitadas no hospedeiro e imitam os estádios iniciais da infecção natural. Adicionalmente, ao contrário das preparações mortas, as vacinas vivas são capazes de induzir potentes respostas mediadas por células que podem estar ligadas com a sua capacidade para se replicarem em células apresentadoras de antigénios, tais como os macrófagos. Há uma longa história de utilização de vacinas de Salmonella atenuadas como vacinas seguras e eficazes para a prevenção de salmonelose em animais e humanos. De facto, a vacina viva atenuada oral contra tifoide, Ty21a (Vivotif) , produzida pelo Swiss Serum Vaccine Institute, provou ser uma vacina com muito sucesso para a prevenção de febre tifoide e foi licenciada em muitos países incluindo os EUA e a Europa.
No entanto, a atenuação desta estirpe foi alcançada utilizando técnicas de mutagénese química e as bases da atenuação da estirpe não estão completamente compreendidas. Devido a isto, a vacina não é ideal em termos do número de doses (actualmente quatro) e do número de organismos vivos que têm de ser dados em cada dose.
As modernas técnicas da biologia molecular, em conjunto com o crescente conhecimento sobre a patogénese de Salmonella, 2
ΕΡ 1 183 269 /PT conduziram à identificação de vários genes que são essenciais para o crescimento in vivo e para a sobrevivência dos organismos. Isto proporcionou novos alvos génicos para atenuação, conduzindo ao conceito de que as futuras estirpes de vacina podem ser atenuadas "racionalmente" através da indução de mutações definidas não revertentes em genes seleccionados que se saiba estarem envolvidos na virulência. Isto facilitará o desenvolvimento de vacinas melhoradas, particularmente em termos da imunogenicidade e portanto do número de doses que tem de ser dado.
Embora sejam actualmente conhecidas muitas estirpes atenuadas de Salmonella, poucas se qualificaram como potenciais candidatos a vacinas para utilização em humanos. Isto pode ser devido em parte à necessidade de equilibrar a imunogenicidade da vacina com a possibilidade do microrganismo Salmonella se tornar reactivo. É claro que a selecção de alvos apropriados para atenuação que resultarão num candidato a vacina adequado não é directa e não pode ser facilmente prevista. Muitos factores podem influenciar a adequabilidade da estirpe atenuada como vacina apropriada, e está a ser efectuada muita investigação para identificar estirpes adequadas. Por exemplo, muitas estirpes atenuadas testadas como candidatos a vacinas conduziram a "vacinemia" ou a abcessos no paciente. É portanto desejável desenvolver uma vacina possuindo um elevado grau de imunogenicidade com reduzida possibilidade da estirpe do microrganismo reverter para uma forma reactiva e que exiba um bom perfil de segurança com efeitos secundários limitados.
Sumário do Invento 0 presente invento baseia-se na descoberta de que duas mutações atenuantes especificas introduzidas num microrganismo Salmonella podem produzir uma vacina produzindo um elevado grau de imunogenicidade e um baixo risco do microrganismo reverter para uma forma reactiva. As estirpes de vacina resultantes exibem um bom perfil de efeitos secundários. 3
ΕΡ 1 183 269 /PT A primeira mutação está contida dentro de uma região da ilha de patogenicidade de Salmonella dois (Spi2); a segunda é uma mutação auxotrófica, i.e. uma mutação para impedir a expressão de um gene que codifica uma proteína necessária numa via biossintética.
De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, um microrganismo Salmonella possui uma mutação atenuante que impede a expressão do gene ssaV situado dentro da ilha de patogenicidade Spi2 e uma mutação atenuante que impede a expressão do gene aroC. 0 microrganismo compreende ainda, de preferência, um ou mais antigénios heterólogos ou proteínas terapêuticas, por exemplo antigénios para E. coll patogénica, Shigella, Vírus da hepatite A, B ou C ou do Herpes Simples e o vírus do papiloma humano. Portanto, o microrganismo pode actuar como veículo de entrega para imunizar contra infecções diferentes das de Salmonella.
Os microrganismos Salmonella podem ser utilizados no fabrico de um medicamento para entrega intravenosa ou oral para o tratamento de uma infecção bacteriana ou virai, p. ex. para o tratamento da febre tifoide.
Os microrganismos Salmonella atenuados do presente invento formam vacinas que estimulam surpreendentemente a imunogenicidade das mucosas bem como a sistémica. Mais, os microrganismos não causam abcessos do baço num modelo animal, enquanto que mutantes com mutações únicas sim. Esta é uma vantagem particular dos duplos mutantes tal como aqui definidos.
Descrição do Invento
Os microrganismos e as composições de vacina do presente invento podem ser preparados através de técnicas conhecidas. A escolha do microrganismo Salmonella em particular e a selecção da mutação apropriada, podem ser feitas pelo perito na arte sem demasiada experimentação. Um microrganismo preferido é Salmonella typhimurium. 4
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Uma primeira mutação é introduzida no gene SSaV situado dentro da região da ilha de patogenicidade de Salmonella 2, sendo esta região divulgada em WO-A-9617951. A ilha de patogenicidade de Salmonella dois (Spi2) é uma de duas ilhas de patogenicidade clássicas situadas no cromossoma da Salmonella. A Spi2 compreende vários genes gue codificam um sistema de secreção de tipo III envolvido no transporte de proteínas associadas a virulência codificadas por Spi2 (designadas proteínas efectoras) para fora das bactérias Salmonella e potencialmente directamente para células hospedeiras alvo tais como macrófagos. Parte de Spi2 (os genes do aparelho) codifica o aparelho de secreção do sistema de tipo III. Spi2 é absolutamente essencial para a patogénese e virulência de Salmonella no ratinho, uma observação agora documentada por vários grupos diferentes em todo o mundo. Os mutantes de Spi2 de S. typhimurium são altamente atenuados em ratinhos provocados através das vias de administração oral, intravenosa e intraperitoneal.
Os genes do aparelho localizados dentro de Spi2 estão agora bem caracterizados; ver por exemplo Hensel et al., Molecular Microbiology 24(1): 155-167, 1997. A mutação no gene ssaV não tem necessariamente de estar dentro do gene para impedir a função. Por exemplo, uma mutação numa região reguladora a montante pode também impedir a expressão do gene, levando a atenuação. Mutações numa região intergénica podem também ser suficientes para impedir a função do gene. A segunda mutação é designada uma "mutação auxotrófica" uma vez gue destrói o gene aroC gue é essencial numa via biossintética. A via biossintética está presente em Salmonella, mas não está presente em mamíferos. Portanto, os mutantes não podem depender de metabolitos que se encontrem no paciente tratado para contornar o efeito da mutação.
As mutações podem ser introduzidas no microrganismo utilizando qualquer técnica conhecida. De preferência, a mutação é uma mutação de deleção, onde a ruptura do gene é causada pela excisão de ácidos nucleicos. Alternativamente, as 5 ΕΡ 1 183 269 /PT mutações podem ser introduzidas através da inserção de ácidos nucleicos ou de mutações pontuais. Os métodos para introdução das mutações nas regiões especificas serão aparentes para o perito na arte.
Para além das duas mutações, o microrganismo Salmonella pode também compreender antigénios heterólogos. 0 microrganismo atenuado pode portanto actuar como veículo de entrega para administração de antigénios contra outras infecções bacterianas ou virais. Os antigénios gue são adeguados para utilizar deste modo serão aparentes para o perito na arte e incluem:
Antigénios Antigénios Antigénios Antigénios Antigénios Antigénios Antigénios
de E. coli patogénica, i.e. ETEC
de hepatite A, B e C da doença de Lime de Vibrio cholera de Helicobacter do vírus de Herpes Simples do vírus do papiloma humano
Este sistema tem também o potencial para entregar proteínas terapêuticas, p. ex. citocinas, para o tratamento de pacientes, p. ex. pacientes infectados com hepatite. Os métodos para a entrega de antigénios heterólogos ou de proteínas terapêuticas utilizando as composições de vacina serão aparentes para o perito na arte.
As vacinas produzidas utilizando os microrganismos do presente invento têm aplicação no tratamento de infecções em pacientes humanos e no tratamento de infecções veterinárias. A dupla mutação proporciona um meio eficaz para atenuar o microrganismo para proporcionar um candidato a vacina seguro.
As composições de vacina proporcionam protecção eficaz mesmo em pacientes imunocomprometidos e, muito importante, oferecem um baixo risco no desenvolvimento de abcessos do baço. Os abcessos do baço foram identificados utilizando vacinas baseadas numa única mutação e portanto as presentes composições podem oferecer um benefício substancial aos pacientes. 6
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Para formular as composições de vacina, os microrganismos mutantes podem estar presentes numa composição juntamente com qualquer adjuvante, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. As formulações adequadas serão aparentes para o perito na arte. As formulações podem ser desenvolvidas para qualquer meio de administração adequado. A administração preferida é através da via oral ou intravenosa e as vacinas são microrganismos Salmonella vivos atenuados. 0 número de microrganismos que é necessário estar presente nas formulações pode ser determinado e optimizado pelo perito. No entanto, em geral, pode ser administrado a um paciente aproximadamente 107-1010 CFU, de preferência aproximadamente 108-109 CFU numa única unidade de dosagem.
Os seguintes Exemplos ilustram o presente invento.
Exemplo 1
Este Exemplo descreve a preparação de uma estirpe mutante designada ZH9 que possui actividade como vacina de febre tifoide oral humana. A estirpe é derivada da estirpe virulenta de S. typhi Ty2, originalmente isolada de um caso de febre tifoide. A estirpe derivada possui uma mutação definida dentro de purA e aroA.
Ty2 para a construção de ZH9 S. typhi Ty2 foi originalmente isolada a partir de um indivíduo com febre tifoide em 1916 e tem sido utilizada para a derivação de todas as vacinas de febre tifoide licenciadas. A estirpe foi obtida a partir da colecção nacional de culturas PHLS em Colindale. Foi obtida como uma cultura liofilizada, sendo o número NCTC 8385.
Clonagem do gene aroC de S. typhi a partir de S. typhi Ty2 S. typhi Ty2 foi recuperada a partir da reserva e posta a crescer de um dia para o outro em caldo de Luria Bertani (LB). As células foram colhidas e foi preparado ADN total de células inteiras. Os fragmentos de ADN de S. typhi Ty2 foram gerados através de clivagem parcial com a enzima de restrição Sau3A e os fragmentos resultantes foram ligados a pHC79 clivado com 7
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BamHI para gerar uma biblioteca cosmídica de ADN de S. typhi Ty2 utilizando E. coli HU835 como receptora. Para isolar o ADN codificando aroC a partir do ADN de S. typhi, a biblioteca cosmídica foi utilizada para transduzir E. coli AB2849 que ancora uma mutação no gene aroC e é dependente de compostos aromáticos para crescer. A mistura de transdução foi plaqueada em meio mínimo sem compostos aromáticos e incubada a 37°C. Várias colónias isoladas foram observadas após incubação de um dia para o outro. Estas bactérias surgiram presumivelmente em consequência de complementação da mutação de aroC em AB2849 por um clone cosmídico ancorando o gene aroC intacto. 0 ADN cosmídico de uma destas estirpes foi purificado. Um fragmento HindlII de 5,2 kb deste cosmídeo foi clonado em pUC18 para dar o plasmídeo pTAC2 que foi capaz de complementar a deleção de aroC em AB2849, demonstrando que contém o gene aroC de S. typhi.
Criação de uma deleção definida do aroC clonado de S. typhi Ty2
Foi criada uma deleção definida de 600 pb dentro do gene aroC clonado utilizando PCR. Os iniciadores oligonucleotídicos utilizados na PCR foram desenhados utilizando a sequência de ADN publicada do gene aroC de S. typhi (Ac. M27715) . O ADN a 5' do gene aroC foi amplificado a partir de pTAC2 utilizando os iniciadores SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO:l. SEQ ID NO:3 liga-se ao ADN do vector, SEQ ID NO:l liga-se à região 5' de aroC. O ADN a 3' do gene aroC foi amplificado utilizando os iniciadores SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:2. SEQ ID NO:4 liga-se ao ADN do vector, SEQ ID NO: 2 liga-se à região 3' de aroC. Os produtos de PCR resultantes tinham locais Xba I incorporados nas extremidades 5' para facilitar a clonagem. Os fragmentos foram clonados no vector pUC18. A construção plasmídica final designada pMIAC23 contém uma deleção definida de aroC (posição 544 a 1143) num fragmento HindlII de 4,8 kb. O fragmento HindlII é inserido no local HindlII de pUC18. Um único local XbaI está presente no local da deleção de aroC.
Introdução da mutação de aroC no genoma de S. typhi Ty2
O plasmídeo suicida pCVD442 (Donnenberg & Kaper, Infection and Immunity 59: 4310-4317, 1991) foi utilizado como vector para introduzir a deleção de aroC no genoma de S. typhi Ty2. O fragmento HindlII de 4,8 kb contendo a deleção de aroC 8 ΕΡ 1 183 269 /PT foi isolado de pMIAC23 e as extremidades foram tornadas lisas através da utilização do estojo de polimento de ADN de Stratagene. 0 plasmídeo pCVD442 foi linearizado através de digestão com Smal, tratado com fosfatase alcalina e ligado aos fragmentos com extremidades lisas. A construção necessária foi isolada e denominada pYCVC21. 0 pYCVC21 foi introduzido em S. typhi Ty2 através da utilização de um protocolo de electroporação padrão. 0 plasmídeo foi capaz de se integrar no genoma de Ty2 após recombinação entre as regiões homólogas do plasmídeo e do genoma para dar transformantes resistentes à ampicilina. Estes transformantes continham uma cópia tanto do gene original de tipo selvagem aroC como de aroC com a deleção. 0 crescimento destas estirpes na ausência de ampicilina permitiu a ocorrência de um segundo acontecimento de recombinação que resultou na perda das sequências de ADN de pCVD442 e de uma cópia do gene aroC, da cópia de tipo selvagem ou da cópia com a deleção. As bactérias S. typhi Ty2 que sofreram este segundo acontecimento de recombinação foram identificadas como derivados sensíveis à ampicilina que eram capazes de crescer na presença de sacarose a 5% (pCVD442 transporta o gene sacB que quando expresso resulta num fenótipo sensível à sacarose). As estirpes que mantiveram apenas o gene aroC com a deleção foram inicialmente identificadas como estirpes que eram incapazes de crescer em placas de meio mínimo na ausência de um suplemento de compostos aromáticos. 0 genótipo aroC foi confirmado através da utilização de análise de PCR. Os iniciadores possuindo SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6 deram um produto de 994 pb para o gene aroC de tipo selvagem e 400 pb para o aroC com a deleção. A análise das sequências dos produtos de PCR resultantes confirmou a presença da deleção requerida em 5 isolados individuais designados DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 e DTY10. Estas estirpes foram armazenadas em frascos Microbank a -70°C para armazenamento a longo prazo. A estirpe DTY8 foi escolhida para posterior manipulação.
Introdução de uma mutação ssaV no mutante de aroC de S. typhi DTY8
Um fragmento PstI de 7,5 kb contendo a região ssaV de S. typhi foi amplificado a partir de uma preparação de ADN total através da utilização de PCR e clonado no vector pCR2.1 (Invitrogen). Os iniciadores oligonucleotídicos de PCR empregues, possuindo SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:8, foram 9
ΕΡ 1 183 269 /PT desenhados para a sequência de SP12 de S. typhimurium. A construção plasmídica resultante foi designada pTYSV21.
Uma construção plasmídica possuindo uma deleção do gene ssaV foi derivada de pTYSV21 através da utilização de PCR de orientação inversa. Os iniciadores que se ligam às regiões 5' (SEQ ID NO:9) e 3' (SEQ ID NO:10) do enquadramento de leitura aberto de ssaV foram desenhados para a sequência de Spi2 de S. typhimurium. Foi incorporado um local de restrição Avrll na região 5' de cada iniciador, foi incorporado um local Xfoal em SEQ ID NO:10. O local Xfoal serve como etiqueta para a mutação ssaV uma vez que pode ser facilmente detectado através de análise de restrição. O produto de PCR resultante foi sujeito a digestão com Avrll e as moléculas da estrutura do plasmídeo purificadas após electroforese em gel de agarose. A recircularização dos fragmentos resultantes nas extremidades coesivas de Avrll deu a requerida construção de deleção pYDSVl. pYDSVl contém um fragmento PstI de 5,5 kb com uma deleção definida de 1894 pb dentro do enquadramento de leitura aberto de ssaV. 0 plasmídeo suicida pCVD442 foi utilizado como vector para introduzir a deleção de ssaV no genoma do mutante de aroC de S. typhi Ty2 DTY8. O fragmento PstI de 5,5 kb contendo a deleção de ssaV foi isolado de pYDSVl e as extremidades tornadas lisas através de tratamento com a ADN-polimerase Klenow. 0 plasmídeo pCVD442 foi linearizado através de digestão com Smal, tratado com fosfatase alcalina e ligado aos fragmentos de extremidades lisas. A construção requerida foi isolada e denominada pYDSV214.
O pYDSV214 foi introduzido em S. typhi DTY8 através da utilização de electroporação. Os transformantes resistentes à ampicilina foram seleccionados e depois postos a crescer na ausência de ampicilina para permitir a perda das sequências de ADN de pCVD442 e de uma cópia do gene ssaVr a cópia de tipo selvagem ou a cópia com a deleção. As estirpes que foram sujeitas a este segundo acontecimento de recombinação foram identificadas como colónias sensíveis a ampicilina, resistentes a sacarose. As estirpes que mantiveram apenas o gene ssaV com a deleção foram identificadas através da utilização de análise de PCR. Os iniciadores possuindo SEQ ID 10
ΕΡ 1 183 269 /PT NO:11 e SEQ ID NO:12 deram um produto de 2485 pb para o ssaV de tipo selvagem e de 591 pb para o gene ssaV com a deleção. A análise das sequências dos produtos de PCR resultantes confirmou a presença da deleção requerida em 5 isolados individuais ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 e ZH9. A estirpe ZH9 foi escolhida para o fabrico de um banco de células principal CGMP.
Exemplo 2
Este Exemplo descreve a preparação de uma estirpe mutante de S. typhimurium designada WT05 que possui actividade de vacina contra gastroenterite humana. A estirpe é derivada da estirpe de S. typhimurium virulenta humana conhecida TML. TML para a construção de WT05 TML foi originalmente isolada a partir de um paciente sofrendo de gastroenterite e foi identificada nos laboratórios do Dr. John Stevens em Birmingham University. Foi liofilizada em Wellcome Research Laboratories e foi-lhe atribuído o número de cultura, BRD 519. A cultura foi obtida em Birmingham
University.
Criação de uma deleção definida do gene ssaV de S. typhimurium clonado
Um plasmídeo (plasmídeo 7-2, Shea et al., PNAS 93: 2593-2597, 1996) foi criado através da clonagem de um fragmento
PstI de 7,5 kb isolado a partir de S. typhimurium LT2 no local PstI de pUC18. ssaV posiciona-se centralmente neste fragmento. Uma construção plasmídica contendo uma deleção definida do ORF de ssaV foi derivada do plasmídeo 7-2 através da utilização de PCR de orientação inversa. Os iniciadores que se ligam às regiões 5' (SEQ ID NO:13) e 3' (SEQ ID NO:14) do enquadramento de leitura aberto de ssaV foram desenhados para a sequência de Spi2 de S. typhimurium. Foi incorporado um local de restrição Avrll na região 5' de cada iniciador e foi incorporado um local Xbal em SEQ ID NO: 14. O local Xba 1 serve como etiqueta para a mutação de ssaV uma vez que pode ser facilmente detectado através de análise de restrição. 0 produto de PCR resultante foi sujeito a digestão com Avrll e as moléculas da 11
ΕΡ 1 183 269 /PT estrutura do plasmídeo purificadas após electroforese em gel de agarose. A recircularização dos fragmentos resultantes nas extremidades coesivas de Avrll deu a requerida construção de deleção pMDSVl. pMDSVl contém um fragmento PstI de 5,5 kb com uma deleção definida de 1894 pb dentro do enquadramento de leitura aberto de ssaV, um Avrll e um XbaI estão no local da deleção. 0 plasmídeo suicida pCVD442 foi utilizado como vector para introduzir a deleção de ssaV no genoma de S. typhimurium TML. 0 fragmento PstI de 5,5 kb contendo a deleção de ssaV foi isolado a partir de pMDSVl e as extremidades tornadas lisas através de tratamento com a ADN-polimerase Klenow. 0 plasmídeo pCVD442 foi linearizado através de digestão com SmaI, tratado com fosfatase alcalina e ligado aos fragmentos de extremidades lisas. A construção requerida foi isolada e denominada PMDSV22. 0 pMDSV22 foi introduzido em S. typhimurium TML utilizando conjugação. Para este fim a construção foi transformada na estirpe S17-1 λ pir de E. coli. A conjugação foi efectuada de acordo com procedimentos padrão. 0 plasmídeo pMDSV22 foi capaz de se integrar no genoma de TML após recombinação entre as regiões homólogas do plasmídeo e do genoma para dar transconjugantes resistentes à ampicilina. Foi escolhido um transconjugante designado mdsv-WT2 para posteriores manipulações. Este transconjugante contém uma cópia tanto do gene ssaV original de tipo selvagem como do ssaV com a deleção. Foi posto a crescer na ausência de ampicilina para permitir a ocorrência de um segundo acontecimento de recombinação que resultaria na perda das sequências de ADN de pCVD442 e de uma cópia do gene ssaV, da cópia de tipo selvagem ou da cópia com a deleção. Os isolados que sofreram este segundo acontecimento de recombinação foram identificadas como derivados sensíveis à ampicilina que foram capazes de crescer na presença de sacarose a 5% (pCVD442 transporta o gene sacB que quando expresso resulta num fenótipo sensível à sacarose). As estirpes que mantiveram apenas o gene ssaV com a deleção foram identificadas através da utilização de análise de PCR. Os iniciadores possuindo SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 16 deram um produto de 2485 pb para o gene ssaV de tipo selvagem e 591 pb para o gene ssaV com a 12 ΕΡ 1 183 269 /PT deleção. A análise das sequências dos produtos de PCR resultantes confirmou a presença da deleção requerida em 4 isolados individuais, ZH20, ZH23, ZH25 e ZH26. Estas estirpes foram armazenadas em LB mais glicerol a 15% a -80°C para armazenamento a longo prazo. A estirpe ZH26 foi escolhida para posterior manipulação.
Clonagem do gene aroC de S. typhimurium a partir de S. typhimurium TML ADN genómico foi isolado de S. typhimurium TML e clivado com HindIII. Os fragmentos HindiII no intervalo de tamanho de 5 a 6 kb foram purificados e ligados a pBluescript clivado com HindIII. A mistura de ligação foi utilizada para transformar um mutante de aroC de E. coli, AB2849, e os clones contendo o gene aroC de S. typhimurium foram seleccionados em virtude da sua capacidade para complementar esta estirpe. A análise de um clone, pDACl, demonstrou que continha um fragmento HindIII de 5,2 kb.
Foi criada uma deleção definida de 600 pb dentro do gene aroC clonado através da utilização de PCR. Os iniciadores oligonucleotidicos foram desenhados utilizando a sequência de ADN publicada do gene aroC de S. typhi (Ac. M27715) . O ADN a 5' do gene aroC foi amplificado a partir de pDACl utilizando iniciadores possuindo SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO:19 liga-se ao ADN do vector, SEQ ID NO:17 liga-se à região 5' de aroC. O ADN a 3' do gene aroC foi amplificado utilizando iniciadores possuindo SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO:20 liga-se ao ADN do vector, SEQ ID NO:18 liga-se à região 3' de aroC. Os produtos de PCR resultantes tinham locais Xfoal incorporados nas extremidades 5' para facilitar a clonagem. Os fragmentos foram clonados no vector pUC18. A construção plasmidica final pMIAC8 contém uma deleção definida de aroC (Ac. M27715 da posição 544 a 1143) num fragmento HindIII de 4,8 kb. O fragmento HindIII é inserido no local HindIII de pUC18. Um único local Xfoal está presente no local da deleção. 13
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Introdução da mutação de aroC no mutante de ssaV de S. typhimurium ZH26 0 plasmídeo suicida pCVD442 foi utilizado como vector para introduzir a deleção de aroC no genoma de S. typhimurium TML. 0 fragmento HindiII de 4,8 kb contendo a deleção de aroC foi isolado de pMIAC8 e as extremidades tornadas lisas através da utilização do estojo de polimento de ADN de Stratagene (Parte N° 200409). O plasmídeo pCVD442 foi linearizado através de digestão com SmaI, tratado com fosfatase alcalina e ligado aos fragmentos com extremidades lisas. A construção requerida foi isolada e denominada pMCVClô. pMCVClô foi introduzido em S. typhimurium ZH26 através da utilização de electroporação. Os transformantes resistentes à ampicilina foram seleccionados e deixados a crescer na ausência de ampicilina para permitir a perda das sequências de ADN de pCVD442 e de uma cópia do gene aroC, a cópia de tipo selvagem ou a cópia da deleção. As estirpes que foram sujeitas a este segundo acontecimento de recombinação foram identificadas como derivados sensíveis a ampicilina, que foram capazes de crescer na presença de sacarose a 5%. As estirpes que mantiveram apenas o gene aroC com a deleção foram inicialmente identificadas como estirpes que eram incapazes de crescer em placas de meio mínimo na ausência de um suplemento de compostos aromáticos. O genótipo aroC foi confirmado através da utilização de análise de PCR. Os iniciadores possuindo SEQ ID NO:21 e SEQ ID NO:22 deram um produto de 994 pb para o gene aroC de tipo selvagem e 400 pb para o aroC com a deleção. A análise das sequências dos produtos de PCR resultantes confirmou a presença da deleção requerida em 4 isolados individuais designados WT05, WT09, WT10 e WT12. A estirpe WT05 foi escolhida para o fabrico de um banco de células principal CGMP.
Exemplo 3 A seguinte construção foi preparada para testar as vacinas de duplos mutantes num modelo animal. S. typhimurium SL1344, a estirpe que infecta ratinhos, foi utilizada, com mutações simples e duplas presentes. 14
ΕΡ 1 183 269 /PT
Uma mutação ssaV::aph (não-polar) de S. typhimurium 12023s foi transduzida por P22 para SL1344 para dar o mutante simples de Spi2. 0 vector suicida pMCVC16 da deleção aroC/pCVD422 foi sujeito a electroporação para a estirpe LB5010 de S. typhimurium e obtiveram-se merodiplóides. 0 merodiplóide da deleção de aroC foi então transduzido por P22 do merodiplóide LB5010 para SL1344. 0 merodiplóide SL1344 foi então resolvido utilizando selecção de sacarose para dar o mutante simples de aroC. 0 duplo mutante foi gerado através de transdução por P22 do merodiplóide da deleção de aroC de LB5010 para o SL1344 ssaV: :aph. As sequências plasmídicas foram resolvidas a partir do merodiplóide que sai da estirpe 3, do mutante de deleção de aroC no fundo de SL1344 ssaV::aph.
Estudos farmacodinâmicos pré-clínicos em mutantes de Salmonella aroC/ssaV definidos
Os mutantes de Salmonella (estirpe SL1344) ancorando mutações definidas em aroC, ssaV ou numa combinação de ambas as mutações foram avaliados extensivamente em ratinhos BALB/C para avaliar a atenuação e a persistência dos organismos e a capacidade para imunizar contra provocação com a estirpe de tipo selvagem.
Exemplo 4
Animais imunizados através da via intravenosa Estudos de protecção
Grupos de dez ratinhos BALB/C foram imunizados i.v. com 105 e 106 organismos de SL1344 aroC, SL1344 ssaV e SL1344 aroC: ssaV criados de um dia para o outro em caldo LB e ressuspensos em solução salina para administração. Os ratinhos foram provocados 6 semanas depois com 105 organismos de tipo selvagem dados intravenosamente. Dez organismos desta estirpe de tipo selvagem dados intravenosamente são suficientes para matar ratinhos. 15
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Todos os ratinhos aos quais foram dados os mutantes simples aroC ou ssaV ficaram solidamente protegidos após provocação com ambas as doses e permaneceram bem ao longo da experiência, não exibindo sinais de doença. Para o duplo mutante, 90% dos animais que receberam a imunização com 106 organismos ficaram solidamente protegidos. Um dos animais morreu 8 dias após a provocação. Para os animais que foram imunizados com uma dose mais baixa, apenas 1 dos ratinhos sobreviveu à provocação.
Esta experiência demonstra que a imunização com mutantes ssaV de Salmonella, sozinhos ou em combinação com uma mutação aroC imunizarão ratinhos contra provocação com a estirpe de Salmonella de tipo selvagem.
Persistência das Estirpes
Foi dado a grupos de ratinhos 106 organismos dos três mutantes de Salmonella descritos acima. Quatro ratinhos foram sacrificados em diferentes momentos até ao dia 14 e foi efectuada a contagem dos organismos no fígado e no baço. As contagens de todos os três mutantes foram comparáveis até ao dia 10 quando as contagens eram de aproximadamente 5χ105 organismos em cada órgão. No dia 14 ficou demonstrada uma diferença entre os mutantes simples e os duplos mutantes, havendo uma perda logarítmica no número de organismos duplos mutantes tanto no fígado como no baço. A outra diferença importante entre o mutante simples e o duplo mutante aroC/ssaV é que não havia abcessos do fígado presentes a nenhum momento durante a experiência para os duplos mutantes. No entanto, os ratinhos infectados com os mutantes simples tinham de facto abcessos do fígado presentes ao dia 10 e 14. Esta é uma importante descoberta que apoia fortemente a utilização desta combinação de mutações para avaliação da preparação de vacinas.
Imunogenicidade
Ratinhos imunizados tal como acima foram sangrados e foram determinados os títulos de anticorpo contra células inteiras de Salmonella utilizando um ELISA. Demonstrou-se que 16
ΕΡ 1 183 269 /PT todas as três estirpes eram altamente imunogénicas, provocando elevados títulos de IgG em circulação contra Salmonella.
Exemplo 5
Animais imunizados através da via oral Persistência das Estirpes
Grupos de ratinhos imunizados oralmente com 5χ109 organismos de cada um dos três mutantes de Salmonella foram sacrificados a intervalos periódicos e foi contado o número de organismos nos fígados e baços. Para o mutante simples aroC e o mutante simples ssaV as contagens nos fígados e baços foram de 103 e 102, respectivamente, até cerca do dia 21. A partir daí o número reduziu. Para os ratinhos que receberam os duplos mutantes aroC:ssaV, os organismos foram virtualmente indetectáveis nos fígados e baços após imunização oral.
Imunização oral e provocação intravenosa de ratinhos A-J vacinados com Salmonella typhimurium TML aroC/ssaV (WT05) . 0 objectivo desta experiência foi o de avaliar a eficácia de 5xl09 mutantes aroC/ssaV de S. typhimurium TML num modelo de vacinação oral de murídeo ityr e de provocação intravenosa. Este modelo assemelha-se mais à resposta humana a Salmonella por estes animais serem menos susceptíveis que um fundo itys.
Inocularam-se oralmente 10 ratinhos A-J de 6-8 semanas de idade com 5xl09 S. typhimurium TML aroC/ssaV num volume de 0,2 ml de PBS através de uma sonda esofágica e deixou-se passar 8 semanas. A dois ratinhos foi dado apenas PBS desta vez e serviram como animais de controlo. Após terem passado as 8 semanas os dois grupos imunizados foram provocados intravenosamente com 107 S. typhimurium TML de tipo selvagem. Os ratinhos foram observados durante 30 dias após a provocação.
Todos os animais foram solidamente protegidos contra a provocação de tipo selvagem (100% de sobrevivência, 10/10 animais vivos). Os ratinhos aos quais foi dado apenas 17
ΕΡ 1 183 269 /PT PBS e que foram depois provocados com S. typhimurium TML de tipo selvagem morreram no dia 6 após a provocação.
Num fundo ityr o duplo S. typhimurium TML aroC/ssaV parece proteger os ratinhos aos quais foi dada uma dose oral de 5χ109. Isto pode ser importante para a situação humana uma vez que os ratinhos ityr são um melhor modelo de salmonelose humana, em termos de susceptibilidade à infecção.
Foram também realizados estudos para avaliar a persistência dos duplos mutantes nos fígados e baços dos ratinhos. Verificou-se que os duplos mutantes persistem a baixos níveis até cerca do dia 21. Pelo dia 28, a estirpe mutante tinha sido eliminada.
Exemplo 6
Ensaio clínico humano
Foram recrutados 18 voluntários saudáveis para um estudo efectuado em aberto, não controlado com placebo. Após uma pesquisa apropriada, cada um dos 3 voluntários recebeu uma dose oral única de ΙΟ7, 108 ou 109 CFU de S. typhi ZH9 ou S. typhimurium WT05. Os microrganismos preparados tal como acima foram ressuspensos até às concentrações de dosagem apropriadas num volume final de 100 ml de solução de bicarbonato de sódio a 2% (p/v) para neutralizar o ácido gástrico. Esta suspensão líquida foi administrada oralmente aos voluntários. Os voluntários foram então isolados durante 72 horas e depois seguidos pós-imunização quanto à segurança e à imunogenicidade.
Os voluntários foram avaliados quanto à reactogenicidade e outros acontecimentos adversos associados a vacinação através de observação, exame físico e através do preenchimento de fichas diárias. Adicionalmente, foram recolhidas culturas de sangue, fezes e urina para ensaiar quanto a "vacinemia", derrame e persistência das estirpes de vacina. Dados adicionais da segurança foram obtidos através da medição dos níveis da proteína C reactiva (CRP) e das enzimas da função hepática (ALT) no sangue, contagem dos glóbulos brancos totais (GB) e velocidades de sedimentação dos eritrócitos (VSE) utilizando procedimentos padrão. Estes parâmetros foram 18 ΕΡ 1 183 269 /PT medidos no sangue tomado diariamente até ao dia 7 e depois a intervalos semanais até ao dia 28.
Análise das respostas imunitárias das mucosas e sistémica
Foram recolhidas amostras de sangue e saliva antes da imunização e depois nos dias 7, 14, 21 e 28 após a imunização. A saliva e o soro foram congelados a -70°C até à análise através de ELISA. Foram recolhidas células mononucleares do sangue periférico que foram ensaiadas guanto à presença de células secretoras de anticorpos (ASC) utilizando a técnica ELISPOT.
Tanto S. typhi ZH9 como S. typhimurium WT05 foram bem toleradas em todos os voluntários. Não se observaram acontecimentos adversos graves em nenhum dos voluntários em nenhum dos 3 níveis de dose e as culturas de sangue e urina permaneceram negativas em todos os vacinados em todos os momentos examinados. Assim, a imunização tanto com S. typhi ZH9 como com S. typhimurium WT05 não resulta em "vacinemias". Nenhum dos voluntários a quem foi dada uma das estirpes desenvolveu diarreia ou febre alta persistente, indicando também a segurança das estirpes de vacina. Não se observou excreção persistente nem "vacinemia" para além do dia 7 em nenhum dos 3 grupos de dose de S. typhi ZH9 ou na dose baixa (107) de S. typhimurium WT05.
Respostas imunitárias das mucosas e sistémica provocadas por S. typhi ZH9 A imunização oral com uma única dose baixa (lxlO7 CFU) de S. typhi ZH9 resultou na iniciação de ASC secretoras de IgA específica de S. typhi em 2 do 3 voluntários detectada 7 dias após a imunização. Testes subsequente nos dias 14 e 21 mostraram que as ASC de IgA eram ainda detectáveis mas a níveis muitos inferiores e que tinham desaparecido ao dia 28. Em quase todos os vacinados que responderam, o número de ASC foi maior no dia 7. Surpreendentemente, a ingestão de uma dose maior (108 CFU) de S. typhi ZH9 resultou numa resposta de ASC de IgA baixa em apenas um dos três vacinados. A ingestão da maior dose (lxlO9 CFU) iniciou ASC de IgA em 2 de 3 voluntários. 19
ΕΡ 1 183 269 /PT
Resposta de anticorpos séricos específicos de Salmonella A imunização oral com uma única dose baixa (lxlO7 CFU) de S. typhi ZH9 não conseguiu provocar IgG sérica específica de LPS de S. typhi (apesar de gerar ASC de IgA em 2/3 vacinados) quando examinada nos dias 7, 14, 21 e 28. De forma semelhante apenas 1/3 produziu níveis muito baixos de IgG específica de flagelos. No entanto, a ingestão de 108 CFU resultou na produção de níveis elevados de IgG específica tanto de LPS como de flagelos nos 3 voluntários. Níveis maiores de IgG específica de LPS e específica de flagelos de S. typhi foram detectados logo 7 dias após a vacinação, subindo no dia 14 e permanecendo elevados no dia 28. A maior dose de 109 CFU estimulou também IgG específica de LPS e de flagelos em 2 dos 3 vacinados, detectável nos dias 7 e 14, respectivamente.
Conclusões
Este estudo demonstrou a utilidade da mutação ssaV, como componente de qualquer nova estirpe de vacina da febre tifoide oral. Uma estirpe de S. typhi ancorando mutações apenas aro teria causado "vacinemias" às doses dadas. A mutação ssaV proporciona portanto um nível adicional de segurança à mutação aro sozinha abolindo as "vacinemias" de quando se utiliza esta formulação inicial.
Para além de ser bem tolerada, demonstrou-se que ZH9 era também imunogénica a todos os três níveis de dose dados. Em relação à estimulação de anticorpos séricos, a dose intermédia (108 CFU) e a maior (109 CFU) provaram ser altamente imunogénicas, com 3/3 vacinados com 108 CFU e 2/3 com 109 CFU a provocarem elevados títulos de IgG sérica específica tanto de LPS como de flagelos de S. typhi. Estas respostas são muito encorajadoras uma vez que é geralmente difícil provocar anticorpos séricos através de vacinação oral.
Para além de gerar respostas de anticorpos séricos específicas S. typhi, ZH9 também iniciou ACS de IgA, indicativo da estimulação imunitária na mucosa intestinal. Um total de 5/9 voluntários provocou uma resposta de células secretoras (ASC) de IgA específica de LPS de S. typhi que parece não ser dependente da dose. 20
ΕΡ 1 183 269 /PT WT05 foi também bem tolerada e não se detectaram "vacinemias". Interessantemente, não foram detectadas diarreias ou sintomas de gastroenterite em nenhum dos voluntários. Os dados anteriores obtidos utilizando a estirpe mutante TML com mutações simples aro ou SPI2 em S. typhimurium dada a ratinhos sugeriu gue um duplo mutante aroC/ssaV pudesse causar alguns efeitos locais intestinais p. ex. diarreia e cãibras em humanos. A ausência destes acontecimentos apoia ainda a utilidade da combinação das mutações aro e SP12.
Exemplo 7
Transportadores de antigénios heterólogos
Para demonstrar a utilidade das estirpes duplo mutantes ssaV: aroC para expressar e entregar antigénios estranhos, WT05 foi transformado com um plasmídeo (pBRD026) gue expressa o gene para a subunidade β da enterotoxina termo-instável de E. COli (LT-B).
Ratinhos BALB/C (n=10/grupo) foram imunizados oralmente nos dias 0 e 28 com 109 CFU (200 ml em PBS) de WT05 expressando pBRD026, ou com a estirpe vector WT05 (controlo). Para comparação (e como controlo positivo) um grupo de ratinhos (n=5) foi imunizado oralmente nos dias 0 e 28 com 10 pg de LT purificado (Sigma). Os ratinhos de controlo negativo (n=5) foram imunizados oralmente nos dias 0 e 28 com 200 μΐ de PBS. Os ratinhos foram sangrados a partir da veia caudal nos dias 21, 28 e 35 e através de punção cardíaca no dia 42 e os soros e uma lavagem intestinal (apenas no dia 42) foram recolhidos e armazenados a -20°C.
Todos excepto um dos ratinhos imunizados com WT05/LT-B provocaram IgG específica de LT (títulos de 3000-50000) no dia 28 após uma única dose oral. Nenhum dos ratinhos de controlo imunizados oralmente com WT05 ou PBS provocaram IgG específica de LT. A imunização oral com uma única dose de LT purificada provocou títulos maiores de anticorpo específico de LT (títulos de 6000->50000). Quando o isotipo da IgG sérica específica de LT-B foi examinado, verificou-se que a estirpe WT05 expressando pBRD026 provocou quase exclusivamente IgG2a específica de LT, indicando uma tendência para uma resposta imunitária de tipo TH1. Em contraste, os ratinhos imunizados com LT purificada (Sigma) provocaram quase exclusivamente IgGl 21 ΕΡ 1 183 269 /PT específica de LT, indicando uma resposta de tipo TH2. Por isso, a expressão de LT-B dentro da estirpe aroC/ssaV facilita uma profunda modulação imunitária. As respostas tendentes para TH1 geradas pela estirpe aroC/ssaV de Salmonella serão importantes, quando os antigénios de organismos patogénicos para os quais as respostas de tipo TH1 são protectoras, forem expressos. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Microscience Limited <120> Microorganismos Atenuados para o Tratamento de Infecção
<130> REP06128WO <140> <141> <150> 9910812.8 <151> 1999-05-10 <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.1
<210 > 1 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 1 aatcagtcta gaaatactgg tgccggtcgt cacgcc 36
<210> 2 <211> 36 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 2 aatcagtcta gaagtgggca acacattgtg gcgcat 36
<210> 3 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial
22 ΕΡ 1 183 269 /PT <2 2 Ο > <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 3 cccagtcacg acgttgtaaa acg 23 <210> 4 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 4 agcggataac aatttcacac agg 23 <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 5 cggcgaatca cacgggctgg c 21 <210> 6 <211> 21 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 6 ggcgcagcag gtgatccatc a 21 <210> 7 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial <400> 7 gccactaaca cgataacggt tgcgtgaaaa ccacg <210> 8 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial
Oligonucleótido
Oligonucleótido
Oligonucleótido
Oligonucleótido
Oligonucleótido 35
ΕΡ 1 183 269 /PT 23 <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 8 tgtaaagtcc tctgcagaac cgagccagga gc 32 <210 > <211 > <212> <213> 9 61 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 9 caccgtccct aggaccatat cctgccgacc cgcgcataca ctgagccact gttgcgccct 60 q 61 <210 > <211> <212> <213> 10 63 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 10 ggcaggacct aggctagtct agacttatac aagtggtaga aagtattgac cttagcgaag 60 agg 63 <210> <211 > <212> <213> 11 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 11 aatatgttct ggcggcaagg 20 <210 > <211 > <212> <213> 12 20 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 12 atccccacga cttcagcaag 20 <210 > <211> <212> <213> 13 61 ADN Sequência Artificial 24
ΕΡ 1 183 269 /PT <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 13 caccgtccct aggaccatat cctgccgacc cgcgcataca ctgagccact gttgcgccct 60 g 61 <210 > <211> <212> <213> 14 63 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 14 ggcaggacct aggctagtct agacttatac aagtggtaga aagtattgac cttagcgaag 60 agg 63 <210 > <211 > <212> <213> 15 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 15 aatatgttct ggcggcaagg 20 <210> <211 > <212> <213> 16 20 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 16 atccccacga cttcagcaag 20 <210> <211 > <212> <213> 17 36 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 17 aatcagtcta gaaatactgg tgccggtcgt cacgcc 36
ΕΡ 1 183 269 /PT 25 <210> <211 > <212> <213> 18 36 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 18 aatcagtcta gaagtgggca acacattgtg gcgcat 36 <210 > <211 > <212> <213> 19 23 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 19 cccagtcacg acgttgtaaa acg 23 <210 > <211> <212> <213> 20 23 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 20 agcggataac aatttcacac agg 23 <210> <211 > <212> <213> 21 21 ADN Sequência Artificial <220> <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 21 cggcgaatca cacgggctgg c 21 <210 > <211 > <212> <213> 22 21 ADN Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Descrição da Sequência Artificial: Oligonucleótido <400> 22 ggcgcagcag gtgatccatc a 21
Lisboa
Claims (11)
- ΕΡ 1 183 269/ΡΤ 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Microrganismo Salmonella possuindo uma mutação atenuante que impede a expressão do gene ssaV e uma mutação atenuante que impede a expressão do gene aroC.
- 2. Microrganismo de acordo com a reivindicação 1, em que o microrganismo compreende ainda um antigénio heterólogo ou uma proteína terapêutica.
- 3. Microrganismo de acordo com a reivindicação 2, em que o antigénio é um antigénio de hepatite A, B ou C.
- 4. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o microrganismo é Salmonella typhl Ty2.
- 5. Microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para utilização em terapia.
- 6. Composição de vacina compreendendo um microrganismo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, e um adjuvante e um diluente fisiologicamente aceitável.
- 7. Composição de acordo com a reivindicação 6, compreendendo 107-1010 CFU numa única unidade de dosagem.
- 8. Composição de acordo com a reivindicação 7, compreendendo 108-109 CFU.
- 9. Utilização de um microrganismo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no fabrico de um medicamento para administração intravenosa para o tratamento de infecção bacteriana sistémica.
- 10. Utilização de um microrganismo tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no fabrico de um medicamento para entrega oral para o tratamento de infecção bacteriana sistémica. ΕΡ 1 183 269/ΡΤ 2/2
- 11. Utilização de acordo com a reivindicação 9 ou a reivindicação 10, para o tratamento de febre tifoide. Lisboa,
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