PL203551B1 - Mikroorganizm Salmonella, kompozycja szczepionki zawieraj aca mikroorganizm Salmonella i zastosowanie mikroorganizmu Salmonella - Google Patents

Description

Opis wynalazku Przedmiotem wynalazku jest mikroorganizm Salmonella, kompozycja szczepionki zawieraj aca mikroorganizm Salmonella i zastosowanie mikroorganizmu Salmonella do wytwarzania leku. Mikroor- ganizm Salmonella mo zna stosowa c w szczepionkach do profilaktyki lub leczenia infekcji bakteryjnych lub wirusowych. Dobrze wiadomo, ze zywe atenuowane mikroorganizmy s a wysoce skutecznymi szczepionka- mi; odpowiedzi immunologiczne wywo lane przez takie szczepionki s a cz esto silniejsze i trwaj a d lu zej, ni z te wywo lane przez nie ulegaj ace replikacji immunogeny. Jednym z wyja snie n tego zjawiska mo ze by c to, ze zywe atenuowane szczepy powoduj a powstawanie stanu ograniczonych infekcji w organi- zmie gospodarza i na sladuj a wczesne stadia infekcji naturalnej. Ponadto, w przeciwie nstwie do prepa- ratów zawieraj acych zabite drobnoustroje, szczepionki zawieraj ace atenuowane drobnoustroje s a zdolne do wywo lywania silnych odpowiedzi z udzia lem komórek, co mo ze by c zwi azane z ich zdolno- sci a do replikacji w komórkach prezentuj acych antygeny, takich jak makrofagi. Stosowanie szczepionek zawieraj acych zywe atenuowane Salmonella, jako bezpiecznych i sku- tecznych szczepionek do zapobiegania salmonellozie u zwierz at i ludzi ma d lug a histori e. Istotnie, zywa atenuowana, doustna szczepionka przeciw durowi brzusznemu, Ty21a (Vivotif), produkowana przez Swiss Serum Vaccine Institute, okaza la si e bardzo udan a szczepionk a do zapobiegania durowi brzusznemu i uzyska la licencj e w wielu krajach, w tym w Stanach Zjednoczonych Ameryki i Europie. Jednak ze atenuacj e tego szczepu uzyskano stosuj ac techniki chemicznej mutagenezy, a podsta- wa atenuacji szczepu nie jest w pe lni zrozumia la. Zatem szczepionka nie jest idealna pod wzgl edem liczby dawek (obecnie cztery) i liczby zywych organizmów, które musz a by c podane w ka zdej dawce. Wspó lczesne techniki biologii molekularnej, w po laczeniu z coraz to wi eksz a wiedz a na temat patogenezy Salmonella, doprowadzi ly do identyfikacji kilku genów, które maj a zasadnicze znaczenie dla wzrostu i prze zywania organizmów in vivo. Zapewni lo to nowe geny docelowe do atenuacji, co prowadzi do pogl adu, ze szczepy przysz lych szczepionek mo zna b edzie „racjonalnie" atenuowa c przez wprowadzanie okre slonych, nie ulegaj acych rewersji, mutacji do wybranych genów, o których wiadomo, ze s a zwi azane ze zjadliwo sci a. U latwi to opracowywanie ulepszonych szczepionek, szczególnie pod wzgl edem immunogenno sci, a zatem i pod wzgl edem liczby dawek, które musz a by c podawane. Chocia z obecnie znanych jest wiele atenuowanych szczepów Salmonella, tylko kilka zakwalifi- kowano jako potencjalnych kandydatów do szczepionek do stosowania u ludzi. Czesciowo mo ze to by c spowodowane potrzeb a równowagi pomi edzy immunogenno scia szczepionki, a mo zliwo sci a mi- kroorganizmu Salmonella do stawania si e reaktywnym. Jest jasne, ze wybór odpowiednich celów do atenuacji, co pozwoli uzyska c odpowiedniego kandydata do szczepionki, nie jest prosty i nie mo zna go latwo przewidzie c. Na przydatno sc atenu- owanego szczepu jako odpowiedniej szczepionki mo ze wp lywa c wiele czynników i prowadzi si e wiele bada n majacych na celu zidentyfikowanie odpowiedniego szczepu. Przyk ladowo, wiele atenuowanych szczepów testowanych jako kandydaci do szczepionek prowadzi lo do bakteriemii poszczepiennej lub ro-pieni u pacjenta. Zatem pozadane jest opracowanie szczepionki o wysokim stopniu immunogenno sci, przy obni- zonej mo zliwo sci szczepu mikroorganizmu do rewersji do formy reaktywnej, oraz wykazuj acej dobry profil bezpiecze nstwa z ograniczonymi dzia laniami ubocznymi. Wynalazek opiera si e na odkryciu, ze dwie specyficzne mutacje atenuuj ace wprowadzone do mikroorganizmu Salmonella mog a doprowadzi c do szczepionki o wysokim stopniu immunogenno sci, przy ma lym ryzyku rewersji mikroorganizmu do formy reaktywnej. Otrzymane szczepy szczepionek wykazuj a dobry profil dzia la n ubocznych. Pierwsza mutacja znajduje si e w regionie wyspy drugiej patogenno sci Salmonella (Spi2); druga mutacja jest mutacj a auksotroficzn a, to jest mutacj a znosz ac a ekspresj e genu, który koduje bia lko wymagane w szlaku biosyntetycznym. Zatem wynalazek dotyczy mikroorganizmu Salmonella majacego mutacj e atenuuj ac a, która znosi ekspresj e genu ssaV i mutacj e atenuuj ac a, która znosi ekspresj e genu aroC. Korzystnie mikroorganizm wed lug wynalazku zawiera ponadto antygen heterologiczny lub bia l- ko terapeutyczne. Korzystniej mikroorganizm wed lug wynalazku zawiera antygen, który stanowi antygen wirusa zapalenia w atroby typu A, B lub C.PL 203 551 B1 3 Najkorzystniej mikroorganizm wed lug wynalazku stanowi Salmonella typhi Ty2. Ponadto wynalazek dotyczy okre slonego powy zej mikroorganizmu Salmonella do stosowania jako lek. Ponadto wynalazek dotyczy kompozycji szczepionki zawieraj acej mikroorganizm oraz adiuwant i fizjologicznie dopuszczalny rozcie nczalnik, która cechuje si e tym, ze jako mikroorganizm zawiera okre slony powy zej mikroorganizm Salmonella. Korzystnie kompozycja wed lug wynalazku zawiera 10 7 -10 10 jednostek tworz acych kolonie (CFU) w pojedynczej jednostce dawkowanej, korzystniej 10 8 -10 9 jednostek tworz acych kolonie (CFU). Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania okre slonego powy zej mikroorganizmu Salmonella do wytwarzania leku do podawania do zylnego do leczenia ogólnoustrojowych infekcji bakteryjnych. Korzystniej w odniesieniu do powy zszego rozwi azania stosuje si e mikroorganizm Salmonella do wytwarzania leku do leczenia duru brzusznego. Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania okre slonego powy zej mikroorganizmu Salmonella do wytwarzania leku do podawania doustnego do leczenia ogólnoustrojowych infekcji bakteryjnych. Korzystniej w odniesieniu do powy zszego rozwi azania stosuje si e mikroorganizm Salmonella do wytwarzania leku do leczenia duru brzusznego. Jak podano powy zej, mikroorganizm mo ze zawiera c ponadto jeden lub wi eksz a liczb e antyge- nów heterologicznych lub bia lek terapeutycznych, np. antygeny patogenne E. coli, Shigella, wirusa opryszczki i wirusa brodawczaka ludzkiego. Tak wi ec mikroorganizm mo ze dzia la c jako no snik za- pewniaj acy immunizacj e przeciw infekcjom innym, ni z Salmonella. Atenuowane mikroorganizmy Salmonella wed lug wynalazku tworz a szczepionki, które nieocze- kiwanie stymuluj a zarówno odpornosc b lon sluzowych, jak i odporno sc ogólnoustrojow a. Ponadto mikroorganizmy nie powoduj a ropni sledziony w modelu zwierz ecym, w przeciwie nstwie do mutantów z jedn a mutacj a. Stanowi to konkretn a zalet e podwójnych mutantów zdefiniowanych w opisie. Mikroorganizmy i szczepionki wed lug wynalazku mo zna wytwarza c znanymi sposobami. Wyboru okre slonego mikroorganizmu Salmonella i odpowiedniej mutacji mo ze dokona c facho- wiec, bez zb ednych do swiadcze n. Korzystnym mikroorganizmem jest Salmonella typhimurium. Pierwsz a mutacje wprowadza si e do genu ssaV zlokalizowanego w regionie wyspy 2 patogen- no sci Salmonella; region ten ujawniono w WO-A-9617951. Wyspa druga patogenno sci (Spi2) jest jedn a z dwóch klasycznych wysp patogenno sci zlokali- zowanych w chromosomie Salmonella. Spi2 zawiera kilka genów, które koduj a uk lad wydzielania typu III, bior acy udzia l w transportowaniu kodowanych przez Spi2 bia lek zwi azanych ze zjadliwo scia (tak zwanych bia lek efektorowych) na zewn atrz bakterii Salmonella i potencjalnie bezpo srednio do docelowych komórek gospodarza, takich jak makrofagi. Czes c Spi2 (geny aparatu) koduje aparat uk ladu wydzielania uk ladu typu III. Spi2 odgrywa bezwzgl ednie zasadnicz a rol e w patogenezie i zja- dliwo sci Salmonella u myszy, co stanowi obserwacj e udokumentowan a obecnie przez kilka ró znych grup na ca lym swiecie. Mutanty Spi2 S. typhimurium s a w znacz aco atenuowane u myszy, które pro- wokowano przez podawanie doustne, do zylne i sródotrzewnowe. Geny aparatu po lo zone w obr ebie Spi2 s a obecnie dobrze scharakteryzowane; patrz np. Hensel i inni, Molecular Microbiology (1997); 24 (1): 155-167. Mutacja w genie ssaV nie musi wyst epowa c koniecznie w obr ebie tego genu, aby znosi c jego funkcj e. Tak np. mutacja przed regionem regulatorowym mo ze równie z znie sc ekspresj e genu, prowa- dz ac do atenuacji. Mutacje w regionie mi edzygenowym mog a równie z by c wystarczaj ace do zniesie- nia dzia lania genu. Druga mutacja jest okre slana „mutacj a auksotroficzn a", poniewa z niszczy ona gen aroC, który odgrywa zasadnicz a rol e w szlaku biosyntetycznym. Szlakiem biosyntetycznym jest szlak wyst epuj acy u Salmonella, ale nie wyst epuj acy u ssaków. Tak wi ec mutanty nie mog a polega c na metabolitach wyst epuj acych u leczonego pacjenta dla obej scia efektu mutacji. Mutacje mo zna wprowadza c do mikroorganizmu stosuj ac jak akolwiek znan a technik e. Korzyst- nie mutacj a jest mutacja polegaj aca na delecji, gdzie zniszczenie genu jest spowodowane wyci eciem kwasów nukleinowych. Alternatywnie mutacje mo zna wprowadza c przez insercj e kwasów nukleino- wych lub mutacje punktowe. Metody wprowadzania mutacji do okre slonych regionów b ed a oczywiste dla fachowca. Jak podano powy zej, poza dwiema mutacjami, mikroorganizm Salmonella mo ze równie z zawie- ra c antygeny heterologiczne. Atenuowany mikroorganizm mo ze dzi eki temu dzia la c jako no snik do podawania antygenów przeciw innym infekcjom bakteryjnym lub wirusowym. Antygeny, które s a od- powiednie do stosowania w ten sposób, b ed a oczywiste dla fachowca i obejmuj a:PL 203 551 B1 4 antygeny patogenne E. coli, to jest ETEC antygeny wirusa zapalenia w atroby typu A, B i C antygeny choroby z Lime antygeny przecinkowca cholery antygeny Helicobacter antygeny wirusa opryszczki antygeny wirusa brodawczaka ludzkiego. Uk lad ten ma równie z zdolnosc dostarczania bia lek terapeutycznych, np. cytokin, do leczenia pacjentów, np. pacjentów zainfekowanych wirusem zapalenia w atroby. Metody dostarczania antygenów heterologicznych lub bia lek terapeutycznych z u zyciem szczepionek b ed a oczywiste dla fachowca. Szczepionki wytworzone z u zyciem mikroorganizmów wed lug wynalazku znajduj a zastosowanie w leczeniu infekcji u ludzi oraz w leczeniu infekcji weterynaryjnych. Podwójna mutacja zapewnia skuteczny sposób atenuacji mikroorganizmu dla zapewnienia kan- dydata na bezpieczn a szczepionk e. Kompozycje szczepionki zapewniaj a skuteczn a ochron e nawet pacjentom z os labionym uk la- dem immunologicznym, i co wa zne, stwarzaj a ma le ryzyko powstawania ropni sledziony. Ropnie sle- dziony stwierdzano w przypadku u zycia szczepionek opartych na pojedynczej mutacji i dlatego szcze- pionki wed lug wynalazku mog a by c wielce korzystne dla pacjentów. Przy formu lowaniu kompozycji szczepionek, zmutowane mikroorganizmy mog a by c obecne w kompozycji razem z dowolnym odpowiednim farmaceutycznie dopuszczalnym adiuwantem, roz- cie nczalnikiem lub zaróbk a. Odpowiednie preparaty b ed a oczywiste dla fachowców. Preparaty mo zna opracowywa c dla dowolnych odpowiednich sposobów podawania. Korzystne podawanie odbywa si e drog a doustn a lub do zyln a, a szczepionkami s a zywe atenuowane mikroorganizmy Salmonella. Liczb e mikroorganizmów, która powinna byc obecna w preparatach mo ze okre sli c i zoptymalizowa c facho- wiec. Jednak ze ogólnie pacjent mo ze otrzymywa c w przybli zeniu 10 7 -10 10 CFU, korzystnie 10 8 -10 9 CFU w pojedynczej jednostce dawkowanej. Wynalazek ilustruj a poni zsze przyk lady. P r z y k l a d 1 W przyk ladzie tym opisano wytwarzanie zmutowanego szczepu oznaczonego ZH9, który wyka- zuje aktywno sc jako ludzka doustna szczepionka przeciw durowi brzusznemu. Szczep pochodzi od zjadliwego szczepu Ty2S. typhi, pierwotnie wyizolowanego z przypadku duru brzusznego. Pochodny szczep ma zdefiniowane mutacje w obr ebie purA i aroA. Ty2 do konstruowania ZH9 S. typhi Ty2 wyizolowano pierwotnie od osobnika choruj acego na dur brzuszny w 1916 roku i stosowano do otrzymywania wszystkich licencjonowanych szczepionek przeciw durowi brzusznemu. Szczep otrzymano z narodowej kolekcji kultur PHLS w Colindale. Otrzymano go jako zliofilizowan a hodowl e, o numerze NCTC 8385. Klonowanie genu aroC S. typhi z S. typhi Ty2 S. typhi Ty2 odzyskano z kultury podstawowej i hodowano przez noc w bulionie Luria Bertani (LB). Komórki zebrano i przygotowano ca ly komórkowy DNA. Fragmenty DNA S. typhi Ty2 utworzono przez cz esciowe strawienie enzymem restrykcyjnym Sau3A i otrzymane fragmenty zligowano z pHC79 strawionym BamH1, dla utworzenia kosmidowej biblioteki DNA S. typhi Ty2, jako biorc e sto- suj ac E. coli HU835. Dla wyizolowania DNA koduj acego aroC z DNA S. typhi, bibliotek e kosmidow a zastosowano do transdukcji E. coli AB2849, która zawiera mutacj e w genie aroC i do wzrostu wymaga zwi azków aromatycznych. Mieszanin e transdukcyjn a wysiano na pod lo ze minimalne pozbawione zwi azków aromatycznych i inkubowano w temperaturze 37°C. Po inkubacji przez noc obserwowano szereg izolowanych kolonii. Bakterie te wyros ly przypuszczalnie dzi eki komplementacji mutacji aroC w AB2849 przez kosmidowy klon zawieraj acy nienaruszon a posta c genu aroC. Z jednego z tych szczepów oczyszczono kosmidowy DNA. Fragment Hindlll o d lugo sci 5,2 kb z tego kosmidu sklo- nowano w pUC18 i otrzymano plazmid pTAC2, który by l zdolny do komplementacji delecji aroC w AB2 849, co wskazuje, ze zawiera on gen aroC S. typhi. Tworzenie zdefiniowanej delecji sklonowanego aroC S. typhi Ty2 Stosuj ac PCR, w obr ebie genu aroC utworzono zdefiniowan a delecj e o d lugo sci 600 bp. Starte- ry oligonukleotydowe zastosowane w PCR zaprojektowano wykorzystuj ac opublikowan a sekwencj e DNA genu aroC S. typhi (numer dost epu M27715). DNA po stronie 5' wobec genu aroC zamplifikowa- no z pTAC2 stosuj ac startery o sekwencjach SEQ ID NO. 3 i SEQ ID NO. 1. SEQ ID NO. 3 wiaze si ePL 203 551 B1 5 z DNA wektora, a SEQ ID NO. 1 wi aze si e z 5'-ko ncowym regionem aroC. DNA po stronie 3' wobec genu aroC zamplifikowano stosuj ac startery o sekwencjach SEQ ID NO. 4 i SEQ ID NO. 2. SEQ ID NO. 4 wi aze si e z DNA wektora, a SEQ ID NO. 2 wi aze si e z 3'-ko ncowym regionem aroC. Otrzymane produkty PCR mia ly miejsca Xbal wprowadzone na ko ncach 5' dla u latwienia klonowania. Fragmenty sklonowano w wektorze pUC18. Ko ncowy konstrukt plazmidowy, oznaczony pMIAC23, zawiera l zdefiniowan a dele- cj e aroC (pozycje od 544 do 1143) we fragmencie Hindlll o d lugo sci 4,8 kb. Fragment Hindlll wstawiono w miejscu Hindlll pUC18. W miejscu delecji aroC obecne jest pojedyncze miejsce Xbal. Wprowadzanie mutacji aroC do genomu S. typhi Ty2 Do wprowadzenia delecji aroC do genomu S. typhi Ty2 zastosowano „samobójczy" plazmid pCVD442 (Donnenberg i Kaper, Infection and Immunity, 1991; 59: 4310-4317). Fragment Hindlll o d lugo sci 4,8 kb, zawieraj acy aroC z delecj a, wyizolowano z pMIAC23 i jego ko nce przeprowadzono w t epe ko nce stosuj ac Stratagene DNA Polishing Kit. Plazmid pCVD442 przeprowadzono w posta c liniow a przez strawienie Smal, potraktowano alkaliczn a fosfataz a i zligowano z fragmentami o t epych ko ncach. Pozadany produkt wyizolowano i oznaczono jako pYCVC21. pYCVC21 wprowadzono do S. typhi Ty2 stosuj ac standardowy protokó l elektroporacji. Plazmid by l zdolny do integracji z genomem Ty2, b ed acej wynikiem rekombinacji pomi edzy homologicznymi regionami plazmidu i genomu, daj ac transformanty oporne na ampicylin e. Transformanty te zawiera ly kopie zarówno oryginalnego aroC typu dzikiego, jak i genu aroC z delecj a. Hodowanie tych szczepów w nieobecno sci ampicyliny umo zliwi lo zaj scie drugiego zdarzenia rekombinacji, w wyniku czego na- st api la utrata sekwencji DNA pCVD442 i jednej kopii genu aroC - albo kopii typu dzikiego, albo kopii z delecj a. Bakterie S. typhi Ty2, które przesz ly to zdarzenie drugiej rekombinacji, zidentyfikowano jako pochodne wra zliwe na ampicylin e, które s a zdolne do wzrostu w obecno sci 5% sacharozy (pCVD442 zawiera gen sacB, który, je sli ulega ekspresji, daje fenotyp wra zliwy na sacharoz e). Szczepy, które zachowa ly tylko gen aroC z delecj a, zidentyfikowano najpierw jako szczepy, które nie s a zdolne do wzrostu na p lytkach z pod lozem minimalnym przy braku dodatku zwi azków aromatycznych. Genotyp aroC potwierdzono stosuj ac analiz e metod a PCR. Startery zawieraj ace SEQ ID NO. 5 i SEQ ID NO. 6 dawa ly produkt o d lugo sci 994 bp w przypadku aroC typu dzikiego, a o d lugo sci 400 bp w przypadku genu aroC z delecj a. Analiza sekwencji otrzymanych produktów PCR potwierdzi la obecno sc wymaga- nej delecji w 5 pojedynczych izolatach, oznaczonych jako DTY6, DTY7, DTY8, DTY9 i DTY10. Przy d lugotrwa lym przechowywaniu, szczepy te przechowywano w fiolkach Microbank w temperaturze - 70°C. Do dalszych minipulacji wybrano szczep DTY8. Wprowadzanie mutacji ssaV do mutanta aroC, S. typhi DTY8 Fragment Pstl o d lugo sci 7,5 kb, zawieraj acy region ssaV S. typhi, zamplifikowano z preparatu ca lkowitego DNA stosuj ac PCR i sklonowano w wektorze pCR2.1 (Invitrogen). Zastosowane w PCR startery oligonukleotydowe, maj ace SEQ ID NO. 7 i SEQ ID NO. 8, zaprojektowano wobec sekwencji SPI2 S. typhimurium. Otrzymany konstrukt plazmidowy oznaczono jako pTYSV21. Konstrukt plazmidowy maj acy delecj e genu ssaV otrzymano z pTYSV21, z zastosowaniem PCR w odwrotnej orientacji. Startery przy laczone do regionów 5'-ko ncowego (SEQ ID NO. 9) i 3'-ko n- cowego (SEQ ID NO. 10) otwartej ramki odczytu ssaV zaprojektowano wobec sekwencji Spi2 S. ty- phimurium. Do regionu 5'-ko ncowego ka zdego startera wprowadzono miejsce restrykcyjne AvrII, a do SEQ ID NO. 10 wprowadzono miejsce Xbal. Miejsce Xbal s luzy jako znacznik mutacji ssaV, tak ze latwo mo zna j a wykrywa c przez analiz e restrykcyjn a. Otrzymany produkt PCR poddano trawieniu AvrII i cz asteczki szkieletu plazmidu oczyszczono wykonuj ac elektroforez e w zelu agarozowym. Po ponow- nym przeprowadzeniu w posta c kolist a otrzymanych fragmentów przy lepkich ko ncach AvrII otrzyma- no po zadany konstrukt delecyjny, pYDSV1. pYDSV1 zawiera fragment Pstl o d lugo sci 5,5 kb ze zdefi- niowan a delecj a o d lugo sci 1894 bp w obr ebie otwartej ramki odczytu ssaV. Do wprowadzenia delecji ssaV do genomu mutanta aroC S. typhi Ty2 DTY8 zastosowano „sa- mobójczy" plazmid pCVD442. Fragment Pstl o d lugo sci 5,5 kb, zawieraj acy delecj e ssaV, wyizolowa- no z pYDSVl i jego ko nce przeprowadzono w t epe ko nce stosuj ac polimeraz e DNA Klenowa. Plazmid pCVD442 przeprowadzono w posta c liniow a przez strawienie Smal, potraktowano alkaliczn a fosfataz a i zligowano z fragmentami o t epych ko ncach. Pozadany produkt wyizolowano i oznaczono pYDSV214. pYDSV214 wprowadzono do S. typhi DTY8 stosuj ac elektroporacj e. Wyselekcjonowano trans- formanty oporne na ampicylin e, a nast epnie hodowano je w nieobecno sci ampicyliny, co umo zliwi lo utrat e sekwencji DNA pCVD442 i jednej kopii genu ssaV -albo kopii typu dzikiego, albo kopii z delecj a. Szczepy, które przesz ly to zdarzenie drugiej rekombinacji, zidentyfikowano jako kolonie wra zliwe na ampicylin e, oporne na sacharoz e. Szczepy, które zachowa ly tylko gen ssaV z delecj a, zidentyfikowa-PL 203 551 B1 6 no stosuj ac analiz e metod a PCR. Startery o SEQ ID NO. 11 i SEQ ID NO. 12 da ly produkt o d lugo sci 2485 bp w przypadku ssaV typu dzikiego i o d lugo sci 591 bp w przypadku genu ssaV z delecj a. Anali- za sekwencji otrzymanych produktów PCR potwierdzi la obecno sc wymaganej delecji w 5 pojedyn- czych izolatach, ZH2, ZH4, ZH6, ZH7 i ZH9. Szczep ZH9 wybrano do utworzenia banku CGMP komó- rek macierzystych. P r z y k l a d 2 W przyk ladzie tym opisano wytwarzanie szczepu mutanta S. typhimurium, oznaczonego WT05, który wykazuje aktywno sc szczepionki przeciw zapaleniu zo ladka i jelit u ludzi. Szczep ten pochodzi od znanego ludzkiego zjadliwego szczepu S. typhimurium TML. TML do konstruowania WT05 TML wyizolowano pierwotnie od pacjenta cierpi acego na zapalenie zo ladka i jelit i zidentyfikowano w laboratorium dr Johna Stevensa z Birmingham University. Zliofilizowano go w Wellcome Research Laboratories i oznaczono numerem kultury BRD 519. Kultur e otrzymano z Birmingham University. Tworzenie zdefiniowanej delecji sklonowanego genu ssaV S. typhimurium Plazmid (plazmid 7-2, Shea i inni, PNAS, 1996; 93: 2593-2597) utworzono przez sklonowanie fragmentu Pstl o d lugo sci 7,5 kb, wyizolowanego z S. typhimurium LT2, w miejscu Pstl pUC18. We fragmencie tym, ssaV jest po lo zony centralnie. Konstrukt plazmidowy zawieraj acy zdefiniowan a dele- cje ORF ssaV otrzymano z plazmidu 7-2, z zastosowaniem PCR w odwrotnej orientacji. Startery wi a- zace si e z regionami 5'-ko ncowym (SEQ ID NO. 13) i 3'-ko ncowym (SEQ ID NO. 14) otwartej ramki odczytu ssaV zaprojektowano wobec sekwencji Spi2 S. typhimurium. Do regionu 5'-ko ncowego ka z- dego startera wprowadzono miejsce restrykcyjne AvrII, a do SEQ ID NO. 14 wprowadzono miejsce Xbal. Miejsce Xbal s luzy jako znacznik mutacji ssaV, tak ze mo zna j a latwo wykrywa c przez analiz e restrykcyjn a. Otrzymany produkt PCR poddano trawieniu AvrII i cz asteczki szkieletu plazmidowego oczyszczono wykonuj ac elektroforez e w zelu agarozowym. Po ponownym przeprowadzeniu w posta c kolist a otrzymanych fragmentów przy lepkich ko ncach AvrII otrzymano po zadany konstrukt delecyjny, oznaczony pMDSV1. pMDSV1 zawiera fragment Pstl o d lugo sci 5,5 kb ze zdefiniowan a delecj a o d lugo sci 1894 bp w obr ebie otwartej ramki odczytu ssaV, w miejscu delecji znajduj a si e miejsca restrykcyjne Avrl i Xbal. Do wprowadzenia delecji ssaV do genomu S. typhimurium TML zastosowano „samobójczy" plazmid pCVD442. Fragment Pstl o d lugo sci 5,5 kb, zawieraj acy delecj e ssaV, wyizolowano z pMD- SV1 i jego ko nce przeprowadzono w t epe ko nce stosuj ac polimeraz e DNA Klenowa. Plazmid pCVD442 przeprowadzono w posta c liniow a przez strawienie Smal, potraktowano alkaliczn a fosfataz a i zligowano z fragmentami o t epych ko ncach. Pozadany produkt wyizolowano i oznaczono pMDSV22. pMDSV22 wprowadzono do S. typhimurium TML stosuj ac koniugacj e. W tym celu konstruktem stransformowano szczep S17-1 ? pir E. coli. Koniugacj e przeprowadzono zgodnie ze standardowymi procedurami. Plazmid pMDSV22 by l zdolny do integracji do genomu TML, b ed acej wynikiem rekombi- nacji pomi edzy regionami homologicznymi plazmidu i genomu, daj ac oporne na ampicylin e transko- niuganty. Do dalszych manipulacji wybrano transkoniugant oznaczony mdsv-WT2. Ten transkoniugant zawiera l kopie zarówno oryginalnego ssaV typu dzikiego, jak i genu ssaV z delecj a. Hodowano go w nieobecno sci ampicyliny dla umo zliwienia zaj scia drugiego zdarzenia rekombinacji, wynikiem które- go mog la by c utrata sekwencji DNA pCVD442 i jednej kopii genu ssaV - albo kopii typu dzikiego, albo kopii z delecj a. Izolaty, które przesz ly to zdarzenie drugiej rekombinacji, zidentyfikowano jako pochod- ne klony wra zliwe na ampicylin e, które s a zdolne do wzrostu w obecno sci 5% sacharozy (pCVD442 zawiera gen sacB, który je sli ulega ekspresji, daje fenotyp wra zliwy na sacharoz e). Szczepy, które zachowa ly tylko gen ssaV z delecj a, zidentyfikowano stosuj ac analiz e metod a PCR. Startery o SEQ ID NO. 15 i SEQ ID NO. 16 da ly produkt o d lugo sci 2485 bp w przypadku ssaV typu dzikiego i o d lugo sci 591 bp w przypadku genu ssaV z delecj a. Analiza sekwencji otrzymanych produktów PCR potwierdzi- la obecno sc wymaganej delecji w 4 pojedynczych izolatach, oznaczonych ZH20, ZH23, ZH25 i ZH26. Przy d lugoterminowym przechowywaniu, szczepy te przechowywano w pod lo zu LB z 15% gliceryny w temperaturze -80°C. Do dalszych manipulacji wybrano szczep ZH26. Klonowanie genu aroC S. typhimurium z S. typhimurium TML Genomowy DNA wyizolowano z S. typhimurium TML i strawiono Hindlll. Fragmenty Hindlll o wielko sci w zakresie od 5 do 6 kb oczyszczono i zligowano ze strawionym Hindlll pBluescript. Mie- szanin e ligacyjn a zastosowano do transformacji mutanta aroC E. coli, AB2849, i klony zawieraj ace gen aroC S. typhimurium wyselekcjonowano na podstawie ich zdolno sci do komplementacji tego szczepu. Analiza jednego klonu, pDAC1, wykaza la, ze zawiera on fragment Hindlll o d lugo sci 5,2 kb.PL 203 551 B1 7 Zdefiniowan a delecj e o d lugo sci 600 bp w obr ebie sklonowanego genu aroC utworzono stosu- jac PCR. Startery oligonukleotydowe stosowane w PCR zaprojektowano wykorzystuj ac opublikowan a sekwencj e DNA genu aroC S. typhi (numer dost epu M27715). DNA po stronie 5' genu aroC zamplifi- kowano z pDAC1 stosuj ac startery o sekwencji SEQ ID NO. 19 i SEQ ID NO. 17. SEQ ID NO. 19 wi a- ze si e z DNA wektora, a SEQ ID NO. 17 wi aze si e z 5'-ko ncowym regionem aroC. DNA po stronie 3' genu aroC zamplifikowano stosuj ac startery o sekwencji SEQ ID NO. 20 i SEQ ID NO. 18. SEQ ID NO. 20 wiaze si e z DNA wektora, a SEQ ID NO. 18 wi aze si e z 3'-ko ncowym regionem aroC. Otrzy- mane produkty PCR mia ly miejsca Xbal wprowadzone na ko ncach 5' dla u latwienia klonowania. Fragmenty sklonowano w wektorze pUC18. Ko ncowy konstrukt plazmidowy pMIAC8 zawiera l zdefi- niowan a delecj e aroC (pozycje 544 do 1143 w szczepie o numerze dost epu M27715) we fragmencie Hindlll o d lugo sci 4,8 kb. Fragment Hindlll wstawiono w miejscu Hindlll pUC18. W miejscu delecji obecne jest pojedyncze miejsce Xbal. Wprowadzanie mutacji aroC do mutanta ssaV S. typhimurium ZH26 Do wprowadzenia delecji aroC do genomu S. typhimurium TML zastosowano jako wektor „sa- mobójczy" plazmid pCVD442. Fragment Hindlll o d lugo sci 4,8 kb, zawieraj acy aroC z delecj a, wyizo- lowano z pMIAC8 i jego ko nce przeprowadzono w t epe ko nce stosuj ac Stratagene DNA Polishing Kit (numer 200409). Plazmid pCVD442 przeprowadzono w posta c liniow a przez strawienie Smal, potrak- towano alkaliczn a fosfataz a i zligowano z fragmentami o t epych ko ncach. Po zadany produkt wyizolo- wano i oznaczono pMCVC16. pMCVC16 wprowadzono do S. typhimurium ZH26 stosuj ac elektropora- cje. Wyselekcjonowano transformanty oporne na ampicylin e i umo zliwiono ich wzrost w nieobecno sci ampicyliny dla umo zliwienia utraty sekwencji DNA pCVD442 i jednej kopii genu aroC - albo kopii typu dzikiego, albo kopii z delecj a. Szczepy, które przesz ly to zdarzenie drugiej rekombinacji zidentyfiko- wano jako wra zliwe na ampicylin e klony pochodne, które s a zdolne do wzrostu w obecno sci 5% sa- charozy. Szczepy, które zachowa ly tylko gen aroC z delecj a, zidentyfikowano najpierw jako szczepy, które nie s a zdolne do wzrostu na p lytkach z pod lo zem minimalnym bez dodania zwi azków aroma- tycznych. Genotyp aroC potwierdzono stosuj ac analiz e metod a PCR. Startery maj ace SEQ ID NO. 21 i SEQ ID NO. 22 da ly produkt o d lugo sci 994 bp w przypadku aroC typu dzikiego i o d lugo sci 400 bp w przypadku genu aroC z delecj a. Analiza sekwencji otrzymanych produktów PCR potwierdzi la obec- nosc wymaganej delecji w 4 pojedynczych izolatach, oznaczonych WT05, WT09, WY10 i WT12. Szczep WT05 wybrano do utworzenia banku CGMP komórek macierzystych. P r z y k l a d 3 Poni zszy konstrukt wytworzono w celu testowania szczepionek z podwójnym mutantem w mo- delu zwierz ecym. Zastosowano S. typhimurium SL 1344, szczep, który zaka za myszy, posiadaj acy pojedyncz a lub podwójn a mutacj e. Mutacj e ssaV::aph (niepolarna) z S. typhimurium 12023s poddano trandukcji z P22 do SL 1344 i otrzymano pojedynczego mutanta Spi2. „Samobójczy" wektor pMCVC16, zawieraj acy aroC z delecj a/pCVD422 przeniesiono przez elek- troporacj e do szczepu LB5010 S. typhimurium i otrzymano merodiploidy. Merodiploid o aroC z delecj a nast epnie poddano transdukcji P22 z merodiploidu LB5010 do SL 1344. Merodiploid SL1344 nast ep- nie poddano selekcji sacharoz a i otrzymano pojedynczy mutant aroC. Podwójnego mutanta utworzono przez transdukcj e P22 merodiploidu o aroC z delecj a z LB5010 do SL 1344 ssaV::aph. Sekwencje plazmidowe wyselekcjonowano z merodiploidu i otrzymano szczep 3, mutant o aroC z delecj a w genetycznym tle SL 1344 ssaV::aph. Prekliniczne badania farmakodynamiczne na zdefiniowanych mutantach Salmonella aroC/ssaV Mutanty Salmonella (szczep SL 1344) zawierajace zdefiniowane mutacje w aroC, w ssaV, lub kombinacj e tych mutacji, poddano obszernym badaniom na myszach BALB/C w celu oszacowania atenuacji, trwa losci organizmów i zdolno sci do immunizacji przez porównanie z prowokacj a szczepem typu dzikiego. P r z y k l a d 4 Zwierz eta immunizowane drog a do zyln a Badania ochrony Grupy licz ace 10 myszy BALB/C immunizowano do zylnie stosuj ac 10 5 i 10 6 organizmów SL 1344 aroC, SL 1344 ssaV i SL 1344 aroC: ssaV, namno zonych w ci agu nocy w bulionie LB i ponownie zawieszonych w soli fizjologicznej do podawania. Myszy prowokowano w 6 tygodni pó zniej organi- zmami typu dzikiego, w liczbie 10 5 , podawanymi do zylnie. Dziesi ec organizmów tego szczepu typu dzikiego, podanych do zylnie, wystarcza do zabicia myszy.PL 203 551 B1 8 Wszystkie myszy, które otrzyma ly pojedyncze mutanty aroC lub ssaV, by ly dobrze chronione po infekcji ka zd a z dawek i by ly w dobrym stanie podczas do swiadczenia, nie wykazuj ac zadnych obja- wów choroby. W przypadku podwójnych mutantów, 90% zwierz at, które otrzyma ly immunizacj e w dawce 10 6 organizmów, by lo dobrze chronionych. Jedno ze zwierz at pad lo 8 dnia po prowokacji. W przypadku zwierz at, które immunizowano ni zsz a dawk a, tylko 1 mysz prze zy la prowokacj e. Do swiadczenie to wykazuje, ze immunizacja mutantami ssaV Salmonella, albo samymi, albo w po- laczeniu z mutacj a aroC, b edzie uodparnia c myszy przeciw infekcji szczepem Salmonella typu dzikiego. Trwa lo sc szczepów Grupy myszy otrzyma ly 10 6 organizmów trzech opisanych powy zej mutantów Salmonella. Czte- ry myszy zabito w ró znych punktach czasowych do 14 dnia i okre slano liczb e organizmów w w atro- bach i sledzionach. Liczby wszystkich trzech mutantów by ly porównywalne do dnia 10, kiedy ich liczba wynosila w przybli zeniu 5 x 10 5 organizmów w ka zdym z narz adów. W dniu 14 pojawi ly si e ró znice pomi edzy pojedynczymi mutantami, a podwójnymi mutantami; zarówno w w atrobie, jak i sledzionie liczba organizmów z podwójn a mutacj a by la mniejsza o rz ad wielko sci. Inn a wa zn a ró znic e mi edzy pojedynczym mutantem, a podwójnym mutantem aroC/ssaV stano- wi to, ze w przypadku podwójnych mutantów podczas trwania do swiadczenia nie wyst epowa ly zadne ropnie w atroby. Natomiast myszy zainfekowane pojedynczymi mutantami mia ly ropnie w atroby w dniu 10 i 14. Jest to wa zne stwierdzenie i silnie popiera stosowanie tej kombinacji mutacji do oceny prepa- ratów szczepionek. Immunogennosc Od myszy immunizowanych w opisany powy zej sposób pobierano krew i okre slano miana przeciw- cia l skierowanych przeciw ca lym komórkom Salmonella, stosuj ac ELISA. Wszystkie trzy szczepy okaza ly si e wysoce immunogenne, wywo luj ac wysokie miana IgG skierowanych przeciw Salmonella w kr azeniu. P r z y k l a d 5 Zwierz eta immunizowane drog a doustn a Trwa lo sc szczepów Grupy myszy immunizowane doustnie ka zdym z trzech mutantów Salmonella w liczbie 5 x 10 9 zabijano w periodycznych odst epach czasu i okre slano liczb e organizmów w w atrobach i sledzionach. W przypadku pojedynczego mutanta aro i pojedynczego mutanta ssaV liczby bakterii w w atrobach i sledzionach wynosi ly, odpowiednio, 10 3 i 10 2 do oko lo dnia 21. Pó zniej liczby te zmniejsza ly si e. W przypadku myszy, które otrzyma ly podwójne mutanty aroC::ssaV, po doustnej immunizacji organi- zmy praktycznie nie by ly wykrywalne w w atrobach i sledzionach. Doustna immunizacja i do zylne prowokowanie myszy A-J szczepionych Salmonella typhimu- rium TML aroC/ssaV (WT05) Celem tego do swiadczenia by lo sprawdzenie skuteczno sci ochronnej mutantów aroC/ssaV S. typhimurium TML w liczbie 5 x 10 9 w modelu doustnego szczepienia myszy ity r i infekcji do zylnej. Ten model bardziej przypomina ludzk a odpowied z na Salmonella, pod tym wzgl edem, ze zwierz eta te s a mniej wra zliwe ni z z t lem genetycznym ity s . 10 myszy A-J w wieku 6-8 tygodni zaszczepiono doustnie, poprzez zg lebnik, S. typhimurium TML aroC/ssaV w liczbie 5 x 10 9 , podawanej w PBS o obj eto sci 0,2 ml, i pozostawiono na 8 tygodni. Dwie myszy otrzyma ly w tym samym czasie tylko PBS i s luzy ly jako zwierz eta kontrolne. Po 8 tygo- dniach, dwie immunizowane grupy zainfekowano do zylnie S. typhimurium TML typu dzikiego w liczbie 10 7 . Myszy obserwowano 30 dni po infekcji. Wszystkie zwierz eta by ly dobrze chronione przed infekcj a szczepem typu dzikiego (100% prze- zywalno sci, 10/10 zwierz at prze zy lo). Myszy, którym podano sam PBS, a nast epnie prowokowano S. typhimurium TML typu dzikiego, pad ly 6 dnia po prowokacji. Przy tle genetycznym ity r podwójne mutanty aroC/ssaV S. typhimurium TML wydaj a si e chroni c myszy otrzymuj ace doustn a dawk e wynosz ac a 5 x 10 9 . Mo ze to by c wa zne w odniesieniu do ludzi, po- niewa z myszy ity r s a lepszym modelem salmonellozy cz lowieka pod wzgl edem podatno sci na infekcj e. Przeprowadzono równie z badania dla oceny trwa lo sci podwójnych mutantów w w atrobach i sle- dzionach myszy. Stwierdzono, ze podwójne mutanty zachowuj a si e na niskich poziomach do oko lo 21 dnia. Do dnia 28 zmutowany szczep zosta l usuni ety. P r z y k l a d 6 Próba kliniczna na ludziach Zwerbowano 18 zdrowych ochotników do otwartych bada n znaczonych, nie kontrolowanych placebo. Po odpowiednim przegl adzie, ka zdy z 3 ochotników otrzyma l pojedyncz a doustn a dawk e 10 7 ,PL 203 551 B1 9 10 8 lub 10 9 CFU S. typhi ZH9 lub S. typhimurium WT05. Mikroorganizmy przygotowane w opisany powy zej sposób, ponownie zawieszono do uzyskania odpowiedniego stezenia dawki w ko ncowej ob- jeto sci 100 ml 2% (wag./obj.) roztworu wodorow eglanu sodu dla zoboj etnienia kwasu zoladkowego. Te ciek la zawiesin e podawano ochotnikom doustnie. Nast epnie ochotników odizolowano na 72 godzi- ny, a nast epnie kontrolowano po immunizacji pod wzgl edem bezpiecze nstwa i immunogenno sci. Ochotników oceniano pod wzgl edem reaktogenno sci i innych szkodliwych zjawisk zwi azanych ze szczepieniem, poprzez obserwacj e, badania lekarskie i wype lnianie dzienników. Ponadto pobiera- no próbki krwi, stolca i moczu do hodowli w celu okre slania bakteriemii poszczepiennej, wydalania oraz trwa lo sci szczepów szczepionek. Dodatkowe dane dotycz ace bezpiecze nstwa otrzymano przez pomiar poziomów bia lka reaktywnego C (CRP) i enzymów w atrobowych (ALT) we krwi, ca lkowitej liczby bia lych krwinek (WBC) i szybko sci sedymentacji erytrocytów (ERS), z zastosowaniem standar- dowych procedur. Te parametry mierzono we krwi pobieranej codziennie do 7 dnia, a nast epnie z przerwami tygodniowymi do 28 dnia. Analiza odpowiedzi immunologicznych b lon sluzowych i ogólnoustrojowych Próbki krwi i sliny pobierano przed immunizacj a, a nast epnie w dniach 7, 14, 21 i 28 po immuni- zacji. Slin e i surowic e zamra zano w temperaturze -70°C do analizy metod a ELISA. Zbierano jednoj a- drzaste komórki krwi obwodowej i oznaczano pod k atem obecno sci komórek wydzielaj acych przeciw- cia la (ASC), stosuj ac technik e ELISPOT. Zarówno S. typhi ZH9, jak i S. typhimurium WT05, by ly dobrze tolerowane przez wszystkich ochotników. Nie stwierdzono zadnych powa znych reakcji szkodliwych u zadnego z ochotników przy wszystkich 3 poziomach dawek, hodowle krwi i moczu pozostawa ly ujemne dla wszystkich szczepio- nek we wszystkich sprawdzanych punktach czasowych. Zatem immunizacj a zarówno S. typhi ZH9, jak i S. typhimurium WT05, nie spowodowa la bakteriemii poszczepiennych. U zadnego z ochotników otrzymuj acych którykolwiek ze szczepów nie wyst api la biegunka lub utrzymuj aca si e wysoka gor acz- ka, co dodatkowo wskazuje na bezpiecze nstwo szczepów szczepionek. Nie obserwowano ani trwa le- go wydalania, ani bekteriemii poszczepiennej po dniu 7 ani w 3 grupach dawek S. typhi ZH9, ani w grupie otrzymuj acej nisk a dawk e (10 7 ) S. typhimurium WT05. Odpowiedzi immunologiczne b lon sluzowych i ogólnoustrojowe wywo lywane przez S. typhi ZH9 Doustna immunizacja pojedyncz a nisk a dawk a (1 x 10 7 CFU) S. typhi ZH9 spowodowa la pobu- dzenie ASC wydzielaj acych IgA specyficzne wobec S. typhi u 2 z 3 ochotników, wykryte 7 dnia po immunizacji. Nast epne badania w dniach 14 i 21 wykaza ly, ze ASC IgA by ly jeszcze wykrywalne, ale na du zo ni zszych poziomach i zanik ly do dnia 28. U prawie wszystkich biorców szczepionek, liczby ACS by ly najwy zsze 7 dnia. Niespodziewanie, przyj ecie doustnie wy zszej dawki (10 8 CFU) S. typhi ZH9 spowodowa lo nisk a odpowied z ACS IgA tylko w przypadku jednego z trzech biorców szczepio- nek. Przyj ecie doustnie najwy zszej dawki (1 x 10 9 CFU) pobudzi lo ASC IgA u 2 z 3 ochotników. Odpowied z specyficznych wobec Salmonella przeciwcia l surowicy Doustna immunizacj a pojedyncz a nisk a dawk a (1 x 10 7 CFU) S. typhi ZH9 nie wywo la la specy- ficznych wobec LPS S. typhi IgG w surowicy (pomimo powstawania ACS IgA u 2/3 biorców szcze- pionki), badanych w dniach 7, 14, 21 i 28. Podobnie, tylko w 1/3 przypadków powsta ly bardzo niskie poziomy IgG specyficznych wobec rz esek. Natomiast doustnie przyj ecie 108 CFU spowodowa lo wy- tworzenie wysokich poziomów IgG, zarówno specyficznych wobec LPS, jak i rz esek, u wszystkich 3 ochotników. Podwy zszone poziomy IgG specyficznych wobec LPS i rz esek S. typhi wykryto ju z 7 dnia po szczepieniu, by ly one jeszcze wy zsze w dniu 14 i utrzymywa ly si e na wysokim poziomie w dniu 28. Najwy zsza dawka, 10 9 CFU, równie z stymulowa la IgG specyficzne wobec LPS i rz esek u 2 spo sród 3 biorców szczepionek, wykrywalne w dniach, odpowiednio, 7 i 14. Wnioski Badania te wykaza ly u zytecznosc mutacji ssaV, jako sk ladnika ka zdego nowego szczepu doustnej szczepionki przeciw durowi brzusznemu. Szczep S. typhi zawieraj acy tylko mutacje aro mo ze w podawanych dawkach powodowa c bakteriemie poszczepienne. Zatem mutacja ssaV zapewnia dodatkowy poziom bezpiecze nstwa w stosunku do samej mutacji aro, znosz ac bakterie poszczepien- ne przy stosowaniu tej pierwszej postaci. Tak jak potwierdzono, ze ZH9 jest dobrze tolerowany, wykazano równie z, ze jest on immuno- genny przy wszystkich trzech poziomach podawanych dawek. W odniesieniu do stymulacji przeciwcia l surowicy, srednie (10 8 CFU) i najwy zsze (10 9 CFU) dawki okaza ly si e wysoce immunogenne; 3/3 szczepionki podane w liczbie 10 8 CFU i 2/3 podane w liczbie 10 9 CFU wywo laly wysokie miana specy-PL 203 551 B1 10 ficznych zarówno wobec LPS, jak i rz esek, IgG surowicy. Odpowiedzi te s a bardzo zach ecaj ace, po- niewa z generalnie bardzo trudno jest wywo la c przeciwcia la w surowicy przez szczepienie doustne. Równie dobrze jak wywo luje odpowiedzi specyficznych wobec S. typhi przeciwcia l surowicy, ZH9 pobudza równie z ASC IgA, co jest wska znikiem stymulacji immunologicznej sluzówki jelita. U 5/9 ochotników stwierdzono wywo lanie odpowiedzi komórek wydzielaj acych IgA (ASC) specyficznej wo- bec LPS S. typhi, która okaza la si e nie by c zale zna od dawki. WT05 by l równie z dobrze tolerowany i nie wykryto zadnych bekteriemii poszczepiennych. Co in- teresuj ace, u zadnego z ochotników nie wykryto biegunki lub objawów zapalenia zo ladka i jelit. Wcze- sniejsze dane, otrzymane w przypadku podawania myszom mutanta szczepu TML z pojedyncz a mu- tacj a aro lub SPI2 u S. typhimurium, sugerowa ly, ze podwójny mutant aroC/ssaV mo ze powodowa c u ludzi miejscowe reakcje jelitowe, np. biegunk e, skurcze. Brak tych reakcji jeszcze bardziej podkre sla u zytecznosc kombinacji mutacji aro i SPI2. P r z y k l a d 7 No sniki antygenów heterologicznych W celu wykazania u zyteczno sci szczepów podwójnego mutanta ssaV::aroC do ekspresji i do- starczania obcych antygenów, WT05 stransformowano plazmidem (pBRDO26), z którego zachodzi ekspresja genu podjednostki B termowra zliwej enterotoksyny E. coli (LT-B). Myszy BALB/C (n = 10/grup e) immunizowano w dniach 0 i 28 doustnie WT05, w którym zacho- dzi ekspresja pBRD026, lub szczepem WT05 z wektorem (kontrola), w liczbie 10 9 CFU (200 ml w PBS). Dla porównania (i jako kontrol e dodatni a), grup e myszy (n=5) immunizowano doustnie, w dniach 0 i 28, 10 µg oczyszczonej LT (Sigma). Myszy stanowi ace kontrol e ujemn a (n = 5) immuni- zowano, w dniach 0 i 28, 200 µl PBS. Myszom pobierano krew, w dniach 21, 28 i 35 z zy ly ogonowej, a w dniu 42 przez nak lucie serca i zbierano surowice oraz p lukanki jelitowe (tylko dzie n 42) i przecho- wywano w temperaturze -20°C. U wszystkich, poza jedn a, myszy immunizowanych WT05/LT-B, powsta ly IgG specyficzne wo- bec LT (miana 3000-50000) w dniu 28 po pojedynczej dawce doustnej. U zadnej z myszy kontrolnych, immunizowanych doustnie WT05 lub PBS, nie powsta ly IgG specyficzne wobec LT. Doustna immuni- zacja pojedyncz a dawk a oczyszczonej LT wywo lala wy zsze miana przeciwcia l specyficznych wobec LT (miana 6000 ?50000). Gdy sprawdzono izotypy specyficznych wobec LT-B IgG surowicy, stwier- dzono, ze szczep WT05, w którym zachodzi ekspresja pBRD026, wywo luje prawie wy lacznie IgG2a specyficzn a wobec LT, co wskazuje na tendencj e do odpowiedzi immunologicznej typu TH1. Nato- miast u myszy immunizowanych oczyszczon a LT (Sigma), powstawa ly prawie wylacznie specyficzne wobec LT IgG1, co wskazuje na odpowied z typu TH2. Zatem ekspresja LT-B w szczepie aroC/ssaV u latwia znacz ac a immunomodulacj e. Odpowiedzi o tendencji w kierunku TH1, wywo lywane przez szczep aroC/ssaV Salmonella, b ed a wa zne, je sli b edzie zachodzi c ekspresja antygenów organizmów patogennych, w przypadku których odpowiedzi typu TH-1 b ed a stanowi c ochron e.PL 203 551 B1 11PL 203 551 B1 12PL 203 551 B1 13PL 203 551 B1 14PL 203 551 B1 15PL 203 551 B1 16PL 203 551 B1 17 PL PL PL

Claims (12)

1. Zastrze zenia patentowe 1. Mikroorganizm Salmonella maj acy mutacj e atenuuj ac a, która znosi ekspresj e genu ssaV i mutacj e atenuuj ac a, która znosi ekspresj e genu aroC.

2. Mikroorganizm wed lug zastrz. 1, który zawiera ponadto antygen heterologiczny lub bia lko terapeutyczne.

3. Mikroorganizm wed lug zastrz. 2, w którym antygen stanowi antygen wirusa zapalenia w a- troby typu A, B lub C.

4. Mikroorganizm wed lug zastrz. 1 albo 2, albo 3, który stanowi Salmonella typhi Ty2.

5. Mikroorganizm okre slony w zastrz. 1-4 do stosowania jako lek.

6. Kompozycja szczepionki zawieraj aca mikroorganizm oraz adiuwant i fizjologicznie dopusz- czalny rozcie nczalnik, znamienna tym, ze jako mikroorganizm zawiera mikroorganizm Salmonella okre slony w zastrz. 1-4.

7. Kompozycja wed lug zastrz. 6, znamienna tym, ze zawiera 10 7 -10 10 jednostek tworz acych kolonie w pojedynczej jednostce dawkowanej.

8. Kompozycja wed lug zastrz. 7, znamienna tym, ze zawiera 10 8 -10 9 jednostek tworz acych kolonie.

9. Zastosowanie mikroorganizmu okre slonego w zastrz. 1-4, do wytwarzania leku do podawa- nia do zylnego do leczenia ogólnoustrojowych infekcji bakteryjnych.

10. Zastosowanie wed lug zastrz. 9, do wytwarzania leku do leczenia duru brzusznego.

11. Zastosowanie mikroorganizmu okre slonego w zastrz. 1-4, do wytwarzania leku do podawa- nia doustnego do leczenia ogólnoustrojowych infekcji bakteryjnych.

12. Zastosowanie wed lug zastrz. 11 do wytwarzania leku do leczenia duru brzusznego.PL 203 551 B1 18 Departament Wydawnictw UP RP Cena 4,00 z l. PL PL PL