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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung und Isolierung von hitzestabilem Colienterotoxin. Gereinigtes hitzelabiles Colienterotoxin kann in Vakzinen zur aktiven Immunisierung und zur Herstellung eines Serums zum passiven Schutz gegen Coliinfektionen, sowie zur Immunoprophylaxe gegen Cholera verwendet werden.
Colienterotoxine werden seit langem für die Coliinfektionen verantwortlich gemacht, insbesondere im Hinblick auf die schweren Wasser- und Elektrolytverluste, die bei durch Colibakterien verursachten Diarrhoe-Erkrankungen auftreten. Die Fähigkeit, diese Colienterotoxine zu synthetisieren, ist nicht stammspezifisch, sondern sie wird durch ein übertragbares Plasmid beeinflusst, das von einem pathogenen E. Colistamm auf andere nicht pathogene Stämme übertragen werden kann, somit wird das Auftreten von neuen enteropathogenen Serotypen verständlich.
Coliinfektionen wurden bisher mit Colivakzinen oder mit Chemotherapeutika behandelt, insbesondere mit Antibiotika. Diese Colivakzine sind prinzipiell gegen bestimmte Serotypen von E. Coli, nicht aber gegen ihre Exotoxine, insbesondere Enterotoxine, wirksam. Sie vermitteln also nur eine antibakterielle, nicht aber eine antitoxische Schutzwirkung. Die plasmidkontrollierte Synthese erklärt auch das häufige Auftreten von Antibiotikaresistenz unter den enteropathogenen E. Coli-Stämmen, da R-Faktoren durch denselben Mechanismus übertragen werden wie Enterotoxinplasmide.
Die plasmidkontrollierte Synthese von zwei Formen des Colienterotoxins, nämlich des hitzelabi-
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zeigt wird, in der ebenfalls eine Anzahl gemeinsamer bekannter Eigenschaften zusammengestellt ist :
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<tb>
<tb> Eigenschaften <SEP> LT <SEP> ST
<tb> Hitzelabilität <SEP> (65'C, <SEP> 15 <SEP> min) <SEP> +
<tb> Säurelabilität <SEP> (PH <SEP> 6) <SEP> +
<tb> Antigenität <SEP> +
<tb> DialysierbarkeitHohes <SEP> Molekulargewicht <SEP> + <SEP> +
<tb> Wirksamkeit <SEP> im <SEP> KaninchenDarmschlingen-Modell <SEP> + <SEP> +
<tb> Wirksamkeit <SEP> im <SEP> SchweineDarmschlingen-Modell <SEP> + <SEP> +
<tb> Produktion, <SEP> gesteuert <SEP> durch
<tb> ein <SEP> Plasmid <SEP> + <SEP> +
<tb> Fähigkeit, <SEP> im <SEP> Schwein <SEP> Durchfälle <SEP> zu <SEP> induzieren <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb>
Versuche,
Colienterotoxin und dessen Bedeutung in Coliinfektionen weiter zu erforschen, scheiterten bisher an der Schwierigkeit, das Colienterotoxin mit genügendem Reinheitsgrad herzustellen.
Eine Voraussetzung zur Erreichung der erforderlichen Reinheit ist ein reproduzierbarer und genauer Test zur Lokalisierung und Bestimmung der Enterotoxinaktivität, z. B. nach der chromatographischen Trennung. Die bisher hiefür verwendeten Methoden, z. B. die oben erwähnten Darmschlingenmodelle, haben sich jedoch als unzulänglich erwiesen. Beispielsweise weisen die mit Hilfe dieser Methoden bestimmten Colienterotoxine eine grosse Verschiedenheit der Molekulargewichte auf. Diese bekannten Tests sind ferner zeitaufwendig und können nur für Untersuchungen im kleinen Umfang angewendet werden.
Ein genauerer und einfacherer Colienterotoxinaktivitätstest wird in der Erfindung angewendet und basiert auf der Tatsache, dass die Stimulation der Adenylatcyclaseaktivität in der Adenylat-
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cyclasepräparation des Katzenherzes, wie sie sich in der Akkumulation des cyclischen 3', 5'-Adeno- sinmonophosphats (cAMP) äussert, ein genaues Mass der Colienterotoxinaktivität und-konzentration darstellt.
Diese Methode zum Nachweis und/oder Bestimmung der Colienterotoxinaktivität beruht auf der
Inkubation einer Adenylatcyclasepräparation des Katzenherzes in Anwesenheit der auf Colientero- toxinaktivität zu prüfenden Substanz während einer bestimmten Zeit und Messung der Steigerung der Adenylatcyclaseaktivität des gebildeten Produktes im Vergleich zu einer Kontrollprobe.
Insbesondere kann die Inkubation, die in Anwesenheit eines Subtrates, dessen Umwandlung zum cyclischen 3', 5'-Adenosinmonophosphat durch Adenylatcyclase katalysiert wird, durchgeführt werden. Die Zunahme der Adenylatcyclaseaktivität wird durch Messung der Steigerung der Konzen- tration des cyclischen 3', 5'-Adenosinmonophosphats in dem gebildeten Produkt im Vergleich zu einer
Kontrollprobe bestimmt.
Die Herstellung der Adenylatcyclasepräparation des Katzenherzes kann aus dem myocardialen
Gewebe der Katze in an sich bekannter Weise erfolgen ; beispielsweise nach der Methode von Levey et al. [G. S. Levey and E. Epstein. Bioohem. Biophys. Res. Commun. 3. 990-995 (1968), und 38, 86-
92 (1970) ]. Die Präparation kann in Teilchenform oder in einer solubilisierten Form vorliegen.
Sie wird durch Behandlung des Gewebes mit einem nichtionischen Detergens, insbesondere mit Lubrol-
PX (= nichtionisches Detergens der Firma ICI, ein Octylphenylpolyäthylenglykoläther) nach der Me- thode von Levey (s. oben) und anschliessende Aufnahme in beispielsweise Zuckerpuffer hergestellt.
Im Falle der solubilisierten Präparationen ist es notwendig, die Adenylatcyclaseaktivität wieder herzustellen, die anscheinend durch das Detergens zerstört wird. Das kann durch Zugabe von Phos- phorlipiden, beispielsweise Phosphatidylserin, erreicht werden.
Die durch Adenylatcyclase katalysierte Umwandlung der Substrate zum cyclischen 3', 5'-Adeno- sinmonophosphat ist bekannt. Geeignete Substrate sind Adenosintriphosphat (ATP) oder vorzugsweise S'-Adenylimidodiphosphat (AMP-PNP). Die Inkubation kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden, z. B. wie in den oben angegebenen Levey-Referenzen. Das Reaktionsmedium enthält Magnesiumionen, z. B. in Form von Magnesiumchlorid, und andere Stoffe, die üblicherweise zur Umwandlung des ATP in das cAMP und im nachfolgenden Test des cAMP verwendet werden, z. B.
Rinderserumalbumin, Theophyllin und einen Puffer, z. B. Tris-HCl-Puffer, sowie das Substrat, z. B.
AMP-PNP, ein Enzym und die Testsubstanz oder die Kontrollprobe. Die Inkubation wird zweckmässigerweise durch Zugabe des Enzyms in Teilchenform oder solubilisierter Form, wie oben beschrieben, zu dem erhaltenen Reaktionsmedium eingeleitet und bei 370C während 3 bis 45 min, vorzugsweise 5 bis 30 min, durchgeführt.
Die Umwandlung kann in an sich bekannter Weise beendet werden, z. B. durch Zugabe von Trichloressigsäure, und Halten des Gemisches auf einer Temperatur von 4 C, z. B. während 10 oder mehr Minuten. Das cAMP kann aus dem gewonnenen Material in an sich bekannter Weise isoliert werden, z. B. Entfernung des Niederschlages durch Zentrifugation, wiederholte Extraktion des Überstandes mit Diäthyläther/Wasser und Eindampfen der wässerigen Phasen zur Trockne. Der Rückstand wird zweckmässigerweise in einem Puffer, z. B. Acetat-Puffer bei PH 4, aufgenommen. Aliquote Anteile davon werden in dem nachfolgenden cAMP-Test verwendet.
Vor dem Aufarbeiten des cAMP wird zweckmässigerweise eine bekannte Menge tritiertes cAMP zu dem Gemisch (oder wenigstens zu einer Probe davon) gegeben, um die Korrektur für die bei der Extraktion auftretenden Verluste durch Bestimmung der Menge des tritierten cAMP in dem isolierten Produkt zu ermitteln.
Das cAMP kann nach einer der vielen bekannten Methoden bestimmt werden, die bevorzugte Methode ist der Radioisotopenverdünnungstest, beschrieben von Gillman A. G., Proc. Nat. Acad. Sci. 67, 305-312 (1970), und modifiziert wie oben beschrieben. Dieses Testsystem ist im Handel erhältlich (Boehringer, Mannheim, BRD).
Dieser Test ermöglicht die Abtrennung der Anteile, aus denen das Enterotoxin isoliert werden
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lich ist, können weitere Trennungen der aktiven Fraktionen vorgenommen werden, zweckmässigerweise nachdem diese gesammelt wurden. Die aktiven Fraktionen werden sodann erneut identifiziert.
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das die biologische Eigenschaft dieser Stoffe zur spezifischen und reversiblen Bindung von Liganden verwertet. Eine Lösung des zu reinigenden Stoffes wird über eine Säule, die mit unlöslichem Polymeren oder Gel, an das ein spezifischer Inhibitor oder ein anderer Ligand kovalent gebunden ist, beschickt ist, geleitet.
Die Proteine, die keine nennenswerte Affinität zu den Liganden besitzen, werden ohne Verzögerung die Säule passieren, während diejenigen, die eine Affinität zu den Liganden haben, im Verhältnis zu ihrer Affinität verzögert die Säule passieren werden. Das spezifisch absorbierte Protein kann dann durch Änderung der Lösungsmittelzusammensetzung, die zur Dissoziation führt, eluiert werden.
Die erfindungsgemässe Trennung kann in einer für die Affinitätschromatographietrennung bekannten Weise durchgeführt werden, beispielsweise wie beschrieben von Cuatrecasas et al. [ Methods of Enzymology XXII, 345 (1971)]. Erfindungsgemäss werden als geeignete Affinitätsliganden amphipatische Substanzen wie Phospholipide oder Glycolipide mit freien Carboxylgruppen, vorzugsweise Ganglioside, verwendet. Diese Liganden können an einen unlöslichen Träger, zweckmässigerweise ein Agarosederivat, wie es durch Anbringung eines Aminocopolymeren, z. B. Poly-L-lysyl-DL-alanin an durch Cyanbromid aktivierte Agarose in bekannter Weise hergestellt werden kann [z. B. Cuatrecasas, P., J. Biol. Chem. 245,3059 (1970), und Sica V., Nature (London), New Biology 244, 36 (1973)] oder Albuminagarose gebunden sein.
Der Ligand kann an den Träger in bekannter Weise gebunden sein. Im Falle der Ganglioside, z. B. wird die Carboxylgruppe der terminalen Sialinsäure an die Aminogruppe der oben beschriebenen Agarosederivate in Anwesenheit eines wasserlöslichen
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zweckmässigerweise in einem Lösungsmittel oder in einem Lösungsmittelgemisch, z. B. einem cyclischen Äther, beispielsweise Dioxan oder einem Wasser/Dioxan-Gemisch, durchgeführt.
Als weitere Ligandenträgersysteme sind Fettsäure-Aminoalkylaminoagarose-Komplexe geeignet.
Diese können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, beispielsweise wie in der oben genannten ersten Cuatrecasas-Referenz. Zur Bildung der Aminoalkylaminoagarose-Derivate eignen sich als Alkylendiamine unter anderem Hexandiamin, Decandiamin und Äthylendiamin. Als Fettsäure ist unter anderem die Palmitinsäure geeignet.
Die oben beschriebenen Affinitätsharze werden zweckmässigerweise in eine Affinitätssäule gebracht, das zu Beginn konzentrierte lyophilisierte sterile Zellfiltrat wird vorzugsweise in einem Puffer aufgenommen, beispielsweise einem Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer (PH 7, 4), in die Säule gebracht und entwickelt, zweckmässigerweise unter Kühlung bei 4 C. Die Elution des Colienterotoxins kann beispielsweise mit Natriumdodecylsulfat durchgeführt werden. Die nachfolgende Entfernung des Natriumdodecylsulfats und die notwendige Renaturierung des eluierten Colienterotoxins kann in an sich bekannter Weise durchgeführt werden (z. B. Weber K., J. Biol. Chem. 246,4504 [1971]).
Für die erfindungsgemässe Herstellung des Colienterotoxins können beliebige enteropathogene E. Coli-Stämme oder nichtpathogene, durch Plasmidübertragung pathogen gewordene Stämme verwendet werden. Zu den bevorzugten Stämmen gehören unter anderem schweinepathogene E. Coli-Stämme P 263, Serotype 08 : K87, K88ab : HI9 : P 155, Serotype 0149 : K91, 88a, c ; und P 307, Serotype 08 : K87, K88ab ; humanpathogene Stämme H 10407, Serotype 078K : ? und H 19, Serotype 026 : K60 : H11 ; sowie ein Ent+ E. Coli K 12 Stamm, der das Ent-Plasmid vom humanpathogenen Stamm H 19 übertragen erhalten hat.
Mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens wird das Colienterotoxin mit einer Reinheit von mindestens 99% erhalten.
Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren erhaltene, bisher unbekannte hitzelabile (LT) Colienterotoxin besitzt ein Molekulargewicht von 102000 : 3000.
E. Coli-Stämme sind als Erreger von Durchfallerkrankungen bei Mensch und Tieren, insbesondere bei Jungtieren, wie Ferkel, Lämmer und Kälber, bekannt. Coliinfektionen werden insbesondere für die Säuglingsenteritis, für die meisten Formen der Reisekrankheit und für die akute Diarrhoe verantwortlich gemacht. Bei den Haustieren, insbesondere bei den Jungtieren, gehören die Coli-
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infektionen zu den wichtigsten Krankheiten. Die Coliinfektionen des Schweines treten hauptsächlich im Zusammenhang mit Störungen von seiten des Intestinaltraktes, vor allem bei neugeborenen Ferkeln und bei Absatzferkeln auf. Es kommt dabei zu einer massenhaften Vermehrung bestimmter Serotypen hämolysierender Colibakterien.
Das gereinigte hitzelabile Colienterotoxin eignet sich zum Schutz gegen Coliinfektionen, wie
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und Schweinedarmschlingentest (W. Burrows, G. H. Musteikis,[1965]), im Fettzellenlipasetest (P. Cuatrecasas, Biochem. 12,3567 [1973]) und im Adenylatcyclasestimulierungstest zum Ausdruck kommt.
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Tatsache zu entnehmen ist, dass eine nahe serologische Verwandtschaft oder Kreuzimmunität zwischen dem hitzelabilen Colienterotoxin und dem bereits in reiner Form hergestellten und durch physikalisch chemische Daten umfassend charakterisierten Choleraenterotoxin besteht.
Das erfindungsgemäss isolierte und gereinigte hitzelabile Colienterotoxin kann in Vakzinen zum aktiven Schutz und zur Herstellung von Sera zum passiven Schutz gegen Coliinfektionen sowie zur Immunprophylaxe gegen Cholera verwendet werden. In diesem Zusammenhang wurde gefunden, dass die Enterotoxine verschiedener E. Coli-Stämme immunologisch identisch oder so nahe verwandt sind, dass eine Kreuzimmunität besteht, was eine Voraussetzung für einige immunologische Anwendungen ist, z. B. für die passive Herstellung der Antisera, die in verschiedenen Tierspezies erhalten werden.
Für einige Zwecke, insbesondere für die orale Verbreichung und für die Herstellung eines
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liegt, d. i. einer Präparation, welche die Enterotoxinantigenität behält, aber dessen Toxizität ver- ringert oder beseitigt ist. Solche Toxoide können in an sich bekannter Weise hergestellt werden (z. B. R. S. Rappaport, Inf. Imm. 9, 304 [1974]). Beispielsweise können übliche Vernetzungsmittel, wie Formaldehyd oder vorzugsweise Glutaraldehyd, eingesetzt werden, wobei darauf zu achten ist, dass bei der Behandlung die immunogenen Eigenschaften erhalten bleiben. Beispielsweise kann man das gereinigte hitzelabile Colienterotoxin mit Formaldehyd bei erhöhter Temperatur, z. B. bei 35 bis 40 C, über eine längere Zeitspanne, z.
B. 2 bis 6 Wochen, oder mit Glutaraldehyd bei Raumtem- peratur bis 40 C und einer Glutaraldehydkonzentration von 0, 001 bis 0, 5 M inkubieren.
Das erfindungsgemäss isolierte und gereinigte Colienterotoxin kann in einer Vakzine, die eine immunologisch wirksame Menge des gereinigten hitzelabilen Colienterotoxins oder sein stabiles Toxoid enthält, verwendet werden.
Ein zur passiven Immunisierung verwendbares Serum enthält Antikörper, deren Bildung durch Verabreichung eines gereinigten hitzelabilen Colienterotoxins oder seines stabilen Toxoids hervorgerufen wird.
Für die Anwendung in Vakzinen wird die Dosis des gereinigten hitzelabilen Colienterotoxins oder seines Toxoids selbstverständlich variieren in Abhängigkeit von der Verwendungsart, vom Wirt und von der gewünschten Behandlung. Im allgemeinen erhält man zufriedenstellende Resultate mit Dosen von 0, 015 bis 10 pg/kg Tierkörpergewicht. Bei grösseren Säugetieren beträgt die zu verabreichende Dosis etwa 1 pg bis 1 mg und zur oralen Verabreichung geeignete Formen enthalten etwa 100 pg bis 1 mg des stabilen Toxoids. Das Toxin oder Toxoid ist zweckmässigerweise gefriergetrocknet.
Die Menge des zur passiven Immunisierung zu verabreichenden Serums wird selbstverständlich äquivalent zur wirksamen oben angegebenen Dosis des Toxins und Toxoids sein und wird selbstverständlich von dem Antikörpergehalt des Serums abhängen. Die Bestimmung der Antikörper erfolgt durch Messung der Serummenge, die nötig ist, eine entsprechende Toxinmenge zu neutralisieren, wobei die Restaktivität mit Hilfe des oben erwähnten Darmschlingentests, des Adenylatcyclasestimulierungstests, des passiven Hämagglutinationmikrotests (S. V. Boyden, J. Exp. Med. 93,107 [1951], und A. B. Stavitsky, J. Immunol. 72,368 [1954]) und des Bentonitflokkulationsmikrotests (H. C. Goodman, J. Bozicevich, Immunochemical Methods 43 [1964]) bestimmt wird.
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Die Vakzine können in an sich bekannter Weise zusammengesetzt sein, z. B. mit oder ohne Hilfsstoffe. Werden Hilfsstoffe verwendet, so sind als solche unter anderem Aluminiumhydroxyd oder-phosphat oder"Alhydrogel"und Wasser-in-Öl-Emulsionen, wie eine Wasser-in-Öl-Emulsion von Antigen in Erdnussöl, die mit Mannitmonooleat emulgiert und mit Aluminiumstearat stabilisiesrt ist (Adjuvans), und für Tieranwendung Freund's Adjuvans geeignet.
Die Vakzine und Sera können in an sich bekannter Weise zum Schutz gegen Coliinfektionen und Cholera verwendet werden. Beispielsweise kann der Schutz von Säuglingen und Erwachsenen gegen die durch E. Coli-Stämme hervorgerufene Diarrhoe für die Säuglinge durch maternale Vakzination gekoppelt mit einem Vakzinprogramm für die Säuglinge vor Beendigung des passiven Schutzes, oder allgemein durch aktive Immunisierung mit Toxoid, erreicht werden.
Der Schutz von Tieren gegen Coliinfektionen ist vor allem bei Jungtieren wichtig. Da die neugeborenen Tiere Antikörper nur in den ersten Stunden bzw. Tagen nach der Geburt mit dem Kolostrum der Mutter aufnehmen können, ist es zu ihrem Schutz wichtig, dass dieses Kolostrum einen hohen Gehalt an spezifischem Antikörper hat. Dies kann durch eine wiederholte Immunisierung der Mutter mit dem Colienterotoxin erreicht werden. Gerade innerhalb der ersten Lebenswochen wird dieser Schutz durch maternale Antikörper benötigt, da in dieser Zeit Infektionen der Jungtiere
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Eine weitere Möglichkeit des Schutzes von Jungtieren ist die Verabreichung spezifischer heterologer Antikörper, z. B. in Form eines Serums, das aus mit Colienterotoxin immunisierten Tieren gewonnen werden kann.
Die Erfindung wird an Hand eines Beispiels näher erläutert, wobei die Beschreibung der Herstellung des (vorgereinigten) eingesetzten Kulturfiltrats in lyophilisierter Form vorangestellt ist.
Herstellung des eingesetzten Colienterotoxins (Rohprodukt) : a) Medium
Als Medium kann ein"trypticase soy broth"-Medium verwendet werden. Das Pepton-Wasser-
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che wie oben beschrieben ist, wobei jedoch das Pepton vor seiner Verwendung einer Ultrafiltration durch Diaflo PM-10 Membranen (Amicon) unterworfen wird. Eine 30% ige (Masse/Vol.) Lösung eines "trypticase soy broth"-Mediums wird ultrafiltriert, der Rückstand verworfen und das Filtrat weiter- verwendet. Es ist vorteilhaft, diese relativ kleinen Peptonmoleküle an Stelle des rohen Produkts zu verwenden, da dadurch die spätere Abtrennung des Anteils unveränderten Mediums von den bakteriellen Produkten in den Rohkulturen von E. coli erleichtert wird. b) Herstellung des rohen zellfreien Kulturfiltrats
Der gefriergetrocknete E.
Coli-Stamm P 263, Serotype 08 : K87, K88ab : H19 wird in Wasser aufgenommen, auf Blutagarplatten ausgestrichen und 12 h bei 37 C kultiviert. Dann werden mit einer Platinschleife Zellen aus der Oberfläche in einen 1 1 Erlenmeyerkolben übertragen, der 200 ml des oben beschriebenen Mediums (nicht modifizierten oder modifizierten"trypticase soy broth") enthält und der sich auf einem rotierenden Schüttelapparat befindet. Die Bakterien werden 4 h bei 37 C kultiviert. Dann wird damit eine 2 1 Kultur beimpft, die ihrerseits nach Erreichen der Mitte der logarithmischen Phase als Impfflüssigkeit für einen 20 1 Fermenter, in dem das Medium mit 500 Umdr/min gerührt und mit 10 l/min Luft belüftet wird, verwendet wird.
Um ein Schäumen der Lösung zu verhindern, wird 1 ml eines 2,5%gen Antischaummittels Glanapon 2000, GrossBussetti, Wien, Österreich, (Masse/Vol.) zugesetzt. Es wird 9 h bei 37 C inkubiert. Dann werden die Zellen durch Zentrifugation in einer gekühlten Ultrazentrifuge bei 4 C geerntet. Die überstehende Flüssigkeit wird durch ein 0, 45 p Membranfilter filtriert und das Filtrat auf Sterilität geprüft (durch Bestreichen einer Blutagarplatte). Das sterile Filtrat wird durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz (z. B. AG-501-X8) entsalzt, lyophilisiert und bei-20 bis-70 C für die weitere Verwendung gelagert.
Analog wie oben beschrieben können auch andere E. Coli-Stämme verwendet werden, wie z. B. die schweinepathogenen E. Coli-Stämme P155, Serotype 0149 : K91 : 88a, c und P307, Serotype 08 : K87
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volumen von 40 ml zugesetzt. Nach 15 h bei Zimmertemperatur wird das Gel mit 500 ml Dioxan, 500 ml 90% (V/V) Methanol und letztlich mit 6 M Guanidin. HCl gewaschen.
B) Kupplung des Gangliosid-N-Hydroxysuccinimidesters
200 mg Gangliosid, z. B. wie unter A) beschrieben, werden mit 2, 5 mg N-Hydroxysuccinimid und 2, 5 mg Dicyclohexylcarbodiimid 30 min bei 15 C in 10 ml Dioxan umgesetzt. Die Lösung wird hierauf zu 20 ml Albuminagarose, suspendiert zu einem Endvolumen von 40 ml in Dioxan, gegeben.
Nach 15 h Schütteln bei 4 C wird das Gel mit 500 ml 90% (V/V) Methanol und mit 250 ml 6 M Guanidin. HCl gewaschen.
C) Verwendung von gemischten Anhydriden der Ganglioside
100 pl 0, 1 M N-Methylmorpholin in Tetrahydrofuran werden zu einer Lösung von 20 mg Gan-
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oben unter A) beschrieben gewaschen.
Analog den Beispielen A), B) und C) können Gele unter Verwendung eines Copolymeren des Poly-L-lysyl-DL-alanins und einer durch Cyanbromid aktivierten Agarose an Stelle von Albuminagarose hergestellt werden.
D) Präparierung eines Fettsäure-Agarosederivat-Komplexes
Aminoäthylamino-, Aminohexylamino-und Aminodecylamino-Agarosederivate können entsprechend der Methode nach Cuatrecasas und Anfinsen (Methods in Enzymol. 22/345 [1971]) durch Aktivierung von Sepharose 4 B mit 200 mg CNBr/ml abgesetztes Harz bei PH 11 bis 11,5 und Rühren bei PH 10 und 3 C über 15 h mit dem entsprechenden Diamin hergestellt werden. Das molare Verhältnis Hexandiamin oder Decandiamin zu CNBr ist 1, das von Äthylendiamin zu CNBr 5. Die Aminoalkylamino-Agarosepräparationen werden 5 Tage gealtert und mit 1 M 2-Aminoäthanol bei Zimmertemperatur umgesetzt, um etwaige noch aktivierte Gruppen der Sepharose abzusättigen. Solcherart präparierte Derivate enthalten ungefähr 20 Mole freie Aminogruppen/ml Agarose.
Die entsprechende Fettsäure (z. B. Palmitinsäure) wird durch 3 Tage Rühren der gewählten Aminoalkylamino-Sepharose im 1, 5fachen Volumen einer 0, 1 M Lösung einer Natriumseife der Fettsäure bei PH 10 und unter Zufügen von 50 mg l-Äthyl-3- (3-dimethylaminopropyI) -carbodiimid per ml Sepharose bei 37 C gekuppelt. 25% Äthanol werden zugefügt, um die Löslichkeit der Seife zu erhöhen. Das Produkt wird bei 370C mit 50% (V/V) Äthanol, Äthanol-0, 075 M Natriumphosphat (1 : 1)'PH 2, 4, und mit Äthanol- 0,05 N NaOH (1 : l) gewaschen. Nicht bei der Reaktion umgesetzte Gruppen werden durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid abgesättigt.
In der Folge werden Untersuchungen des erfindungsgemäss gereinigten hitzelabilen Colienterotoxins beschrieben : a) Molekulargewichtsbestimmung durch Gelfiltration
Zur Bestimmung des Molekulargewichts von Colienterotoxin wird die Methode der Gelfiltration angewendet. Eine Sephadex G-150 Säule wird nach der Methode von P. Andrews (Biochem. J. 96/595 [1965 ]) unter Verwendung von Pferdeherzcytochrom C (MG = 1, 3. 10"), Rinderpankreaschymotrypsino-
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4. 10"),Weiters wird zur Erstellung der Eichkurve titriertes Wasser (MG = 1, 11. 10" dpm) messend erfasst durch Flüssigkeitszintillation, sowie eine gesättigte Lösung von Blue Dextran, dessen optische Dichte bei 620 mu als Nachweis verwendet wird.
Die Sephadex Säule ist mit 50 mM Tris-chlorid, PH 7,5, 100 mM KCl und 0,01 M 2-Mercapto- äthanol equilibriert. Alle oben genannten Substanzen werden in einem totalen Volumen von 0, 7 ml auf die Säule aufgetragen und in 0, 9 ml Fraktionen eluiert. Das Experiment wird bei 4 C durchgeführt. Das derart ermittelte Molekulargewicht von hitzelabilem Colienterotoxin beträgt 102000 : 3000. b) Molekulargewichtsbestimmung durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Natriumdodecylsulfat
Polyacrylamid-Gelelektrophorese in 0, 1% Natriumdodecylsulfat wird bei einem PH von 7, 2 in
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7, 5% Acrylamid entsprechend der Methode von A. L. Shapiro, E. Vinuela, J. Maizel (Biochem. Biophys.
Res. Commun. 28/215 [1967]) und K. Weber, M. Osborn (J. B. C. 244/4406 [1969]) ausgeführt. Folgende Proteine werden als Standard verwendet :
Trypsinogen aus Rinderpankreas (Molekulargewicht der Polypeptidkette : : 2, 4. 10'), Laktatdehydrogenase aus Rinderherzen (MG = : 3, 6. 10'), Rinderserumalbumin (MG = : 6, 8. 10'), Phosphorylase aus Kaninchenmuskeln (MG = 9, 4. 10") und E. coli-ss-Galaktosidase (MG = : 1, 3. 105).
Zunächst wird eine l% ige Lösung der Probe in Natriumdodecylphosphat und 2-Mercaptoäthanol 3 min lang gekocht, um die Möglichkeit eines proteolytischen Abbaus zu verhindern. Die Proben werden gegen eine Lösung, bestehend aus 0, 1% Natriumdodecylphosphat und 2-Mercaptoäthanol, 0, 01 M Natriumphosphat, PH 7, 1, dialysiert. Die Vergleichsproteine werden in gleicher Weise behandelt. Das derart ermittelte Molekulargewicht von hitzelabilem Colienterotoxin beträgt nach dieser Methode 102000 3000. c) Bestimmung des isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in einem Saccha- rosedichtegradienten
Zur Bestimmung des isoelektrischen Punktes für das gereinigte Colienterotoxin wird zur isoelektrischen Fokussierung eine Glaskolonne (Typ 8100,110 ml) nach der Methode von 0. Versterberg und H. Svensson (Chem.
Scand. 20/820 [1966]) verwendet. Der Anodenelektrolyt (Phosphorsäure) befindet sich am Boden der Apparatur. Der"Ampholine carrier Ampholyte" umfasst einen pH-Bereich von 3 bis 10. Die optische Dichte wird bei 280 mm gemessen, u. zw. wird die Säule durch die Messzelle eines Uvicord II-UV-Absorptiometers entleert. Der isoelektrische Punkt wird bei 4 C durch Messung des PH der eluierten Fraktionen mit einer kombinierten Mikroelektrode bestimmt. Der derart ermittelte isoelektrische Punkt liegt für hitzelabiles Colienterotoxin bei 6, 95. d) Bestimmung des isoelektrischen Punktes durch isoelektrische Fokussierung in Dünnschicht-
Polyacrylamidgel
Colienterotoxin wird an einer 5% Polyacrylamidgelplatte (entsprechend Z. L.
Awdeh et al. : Nature (London) 219/66 [1968], modifiziert, nach J. Bours ! ì van Doorenmaalen W. J. : Science Tools
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stellt mit einer Endkonzentration von 2% "Ampholine carrier Ampholyte" mit einem PH-Bereich von 3 bis 5,5 bis 7 und 7 bis 10 im Verhältnis 1 : 1 : 1. Das Gel wird 2 h mit Riboflavin als Photokatalysator polymerisiert. 19 bis 25 pl einer 0,1%gen Lösung des Proteins in 2% Ampholine, PH 3 bis 10, werden auf 10 x 5 mm Whatman 3 MM Papierstreifen, die auf das Gel gelegt werden, aufgebracht. Die isoelektrische Fokussierung wird bei 10 C in einem Elektrophoreseapparat durchgeführt.
Bevor die Gelplatten an den Elektroden befestigt werden, werden die Elektroden mit 0, 5 x 25 cm Filterpapierstreifen, die mit 0, 1% (Vol/Vol. ) Äthylendiaminlösung (Kathode) befeuchtet sind, bedeckt. Der Anfangstrom besitzt 50 mA (und wird auf 28 mA vermindert), während 2, 5 h bei 210 V (auf 1080 V steigend). Der PH-Gradient wird mit einer kombinierten Mikrooberflächenelektrode bestimmt. Nach der Isofokussierung werden die Proteine mit 14%iger Trichloressigsäure bei 60 C gefällt.
Dann wird das Gel bei Zimmertemperatur mit 10-, 5- und 3%iger Trichloressigsäure 24 h gewaschen, um den"carrier Ampholyte"zu entfernen. Das Gel wird dann mit einer 0,05%gen Lösung von Coomassie brillant Blau R-250 (gelöst in Methanol/Essigsäure/Wasser = 45/9/46) 2 h angefärbt und anschliessend mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen. Zum Quellen wird das Gel
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auf PH 7 eingestellt. Der Inhalt jedes Teströhrchens wird sowohl im Kaninchendarmschlingentest als auch im Schweinedarmschlingentest zu 2 ml (0, 5 mg) per Darmschlinge untersucht.
Es zeigt sich, dass die enterotoxische Aktivität höchst säurelabil ist. Die Aktivität wird bereits ab PH 6 deutlich beeinflusst und ist ab PH 4 vollständig zerstört. f) Einfluss von Hitze
Mengen von je 5 mg des erfindungsgemäss gereinigten hitzelabilen Colienterotoxins werden
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mit je 20 ml Tyrodelösung aufgenommen und 30 min lang auf 40,50, 60,65, 70 bzw. 100 C erhitzt. Die erhitzten Lösungen werden mit einer unbehandelten Lösung als Kontrolle sowohl im Kaninchendarmschlingentest als auch im Schweinedarmschlingentest untersucht. Es werden pro Darmschlinge 2 ml (0, 5 mg) verabreicht.
Die biologische Aktivität des hitzelabilen Colienterotoxins wird durch 30 min langes Erhitzen
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K12 wird, wie bereits früher für den Stamm 263 beschrieben, verwendet, um einen zellfreien Fermentationsüberstand zu gewinnen. Dieser Fermentationsüberstand dient als Probe mit unbekannter Zusammensetzung von Antigen Ag-X.
Die Identifizierung und Quantifizierung wird mittels eines Referenzantigens, Ref-Ag (das reine Colienterotoxin vom Stamm 263 bzw. vom Stamm H19), und eines Referenzantiserums, Ref-Ab (monovalentes Antiserum gegen Colienterotoxin) durchgeführt.
Die beiden Fragen, ob Ag-X ein Antigen enthält, das "identisch" mit Ref-Ag ist, und, falls dies zutrifft, wie die Konzentration dieses Antigens verglichen mit der bekannten Konzentration des Antigens Ref-Ag ist, können mittels "crossed immunoelectrophoresis" (H. G. M. Clarke und T. Free- man : Clin. Sci. 35/403, 1968) und "tandem crossed immunoelectrophoresis" (Kroll J., A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis edit. N. H. Axelsen, J. Kross, B. Heecke, Universitetsforlaget, Oslo, S. 57 [1973], Suppl. 1/1973, Scandinavian Journal of Immunology) beantwortet werden.
Die Fig. 1 zeigt ein "crossed immunoelectrophoresis"-Bild des Ref-Ag, entwickelt gegen RefAb. Es tritt nur ein Präzipitat auf.
In Fig. 2 wurde Ag-X anstatt Ref-Ag verwendet. Auf Grund der Position des Präzipitates in Fig. 2 kann angenommen weren, dass Ag-X ein Antigen enthält, das identisch ist mit Ref-Ag. Diese Annahme kann noch erhärtet werden durch die Reaktion der "Identität" mittels "fusing precipitates". Dieses Experiment wird mit Hilfe der "tandem crossed immunoelectrophoresis" durchgeführt (Fig. 3).
Durch Vergleiche der Fig. 3 mit Fig. l kann gezeigt werden, dass Ag-X das Ref-Ag enthält und dass die Konzentrationen dieses Antigens im Ag-X geringer ist als im Ref-Ag. Die Quantifizie-
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K12 Stammes verwendet, so tritt in Fig. 2 kein Präzipitat auf. Dieses Resultat bekräftigt die Aussage, dass das in Fig. 2 auftretende Präzipitat dem Enterotoxin pathogener E. Coli-Stämme zuzuordnen ist.
Dieselbe Versuchsanordnung wird vorgenommen, um die immunologische Identität bzw. Kreuzimmunität zwischen humanpathogenem und schweinepathogenem Colienterotoxin festzustellen. In diesem Versuch dient als Ref-Ag das reine Colienterotoxin vom schweinepathogenen E. Coli-Stamm P263, als Referenzantiserum Ref-Ab das monovalente Antiserum gegen das Colienterotoxin P263. Das humanpathogene Colienterotoxin H19 dient als Probe mit unbekannter Zusammensetzung von Antigen Ag-X.
Wie obenstehend bereits in Fig. 2 beschrieben, tritt auch hier im Bild einer "crossed immunoelectro- phoresis"des Ag-X, entwickelt gegen Ref-Ab, nur ein Präzipitat an der identen Stelle wie in Fig. l auf. Auf Grund der Position des Präzipitats kann angenommen werden, dass Ag-X ein Antigen enthält, das identisch ist mit Ref-Ag. Die Reaktion der"Identität"mittels"fusing precipitates"unter Anwendung der "tandem crossed immunoelectrophoresis" zeigt (Fig. 3), dass Ag-X und Ref-Ag serologisch ident sind. Somit ergibt sich die Möglichkeit, wahlweise das humanpathogene oder schweinepathogene Colienterotoxin als Antigen zur Immunisierung bzw. zur Präparation eines Toxoids zu verwenden.
Unter Beibehaltung der identen Versuchsanordnung wird untersucht, ob zwischen Colieneterotoxin und V. cholerae Enterotoxin eine vollständige bzw. partielle immunologische Identität besteht.
Als Ref-Ag dient das reine Colienterotoxin vom schweinepathogenen E. Coli-Stamm P263 ; als Ref-Ab
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wird das E. Coli P263 Antitoxin verwendet und als Antigenprobe Ag-X'wird reines V. cholerae Toxin eingesetzt.
Die Fig. 4 zeigt wieder ein "crossed immunophoresis"-Bild des Ref-Ag, entwickelt gegen das Ref-Ab. Es tritt, wie bereits gezeigt, nur ein Präzipitat auf.
In Fig. 5 wird Ag-X'anstatt Ref-Ag verwendet. Es tritt wieder eine Präzipitatlinie, aber in Position und Form verschieden mit dem Präzipitat aus Fig. 4 auf.
Wird nun die Technik der "tandem crossed immunelectrophoresis" durchgeführt, so wird das Präzipitationsbild der Fig. 6 erhalten, woraus auf eine deutliche partielle Identität der Antigene Ref-Ag (Colienterotoxin) und Ag-X' (V. cholerae Enterotoxin) geschlossen werden kann. h) Durchführung einer aktiven Immunisierung
Zuchtsauen werden künstlich besamt und einen Monat vor dem voraussichtlichen Wurftermin das erste Mal immunisiert :
0, 95 mg erfindungsgemäss gereinigtes hitzelabiles Colienterotoxin werden zusammen mit
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ss-Mercaptoäthanol) i. m. gegeben. Nach 2 Wochen werden 0, 35 mg Colienterotoxin in 5 ml 0, 9% NaClLösung i. v. gegeben.
Da die serologische Identität zwischen humanpathogenem und schweinepathogenem Colienterotoxin gegeben ist, kann zur Immunisierung wahlweise H19 oder P263 Colienterotoxin verwendet werden.
Nach dem Abferkeln der auf diese Art immunisierten Zuchtsauen wird 6,12 und 24 h später Kolostrum abgesaugt und gesammelt. 56 h nach dem Wurftermin wird der Zuchtsau Blut zur Gewinnung von Serum entnommen.
Die Bestimmung der Antikörpertiter erfolgt mit dem Bentonit-Flokkulations-Mikrotest (SBF-Test) und ergibt folgende Resultate :
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<tb>
<tb> Zeit <SEP> Titer <SEP>
<tb> Kolostrum <SEP> 6 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 512
<tb> 12 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 512
<tb> 24 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 64 <SEP>
<tb> Serum <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 64 <SEP>
<tb>
Ein 1 : 2 verdünntes Schweineserum wird zu Neutralisationsstudien in den Kaninchendarmschlingentest eingesetzt. Bei Einsatz einer Toxindosis von 0, 25 mg/Darmschlinge (d. h. % 3 Toxin Units) wird eine mehr als 60%ige Hemmung erreicht.
Entsprechende Versuche mit Kolostrum (Abnahmezeitpunkt 6 h post partem) zeigen im Kaninchenmodell eine vollständige Neutralisierung der Toxinwirkung.
Als 1 Toxin Unit wird die effektive Dosis 50 für Enterosorption im Darmschlingentest, oder die ED 5 0 für Adenylatcyclasestimulierung im Adenylatcyclasesystem definiert. i) Präparation eines Toxoids
Um optimale Bedingungen für die Inaktivierung zu erzielen, wird bei Zugrundelegung eines Molekulargewichtes von 102000 für das Toxinmolekül die Konzentration des Glutaraldehyds anfänglich zwischen 50 und 1000 Mol/Mol Toxin variiert. Die Reaktion wird in einem Konzentrationsbereich von 100 bis 1000 pg/ml Toxin, bei 30 C in einem 0, 065 M PBS-Puffer PH 7, 8 bei unterschiedlicher Inkubationszeit durchgeführt. Die Reaktionen werden durch zweimaliges Dialysieren gegen das 100fa-
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600 pg/ml beginnt das Reaktionsprodukt mit steigender Glutaraldehydkonzentration unlöslich zu werden.
Wird die Toxinkonzentration zwischen 100 und 600 pg/ml gehalten und die Glutaraldehydkonzentration zwischen 50 und 400 Mol/Mol Toxin variiert, bleibt das Reaktionsprodukt in löslicher Form.
Der Adenylatcyclasetest zeigt, dass optimale Detoxifizierungim p -Bereich 7, 8 bis 8, 2 erfolgt.
Wird die Toxinkonzentration zwischen 400 und 600 ug/ml gewählt, so nimmt die Resttoxizität (gemes-
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sen nach Inkubation über 72 h bei 30 C) um das 10fache ab bei zweifachem Anstieg der Glutaraldehydkonzentration zwischen 50 und 200 Mol/Mol Toxin. Wird die Glutaraldehydkonzentration von 200 auf 400 Mol/Mol Toxin erhöht, so ist die Restaktivität auch mit den empfindlichsten Testmethoden (Adenylatcyclasetest) nicht feststellbar.
Um Präparationen des inaktivierten Colienterotoxins (Toxoid) quantitativ zu erfassen, wurden Toxoid Units (TU) entsprechend der Methode nach Craig (J. P. Craig : 1971, Cholera toxins p. 189- 254 in S. Kadis, C. Montie und S. Ajl (ed. ) Microbial toxins, Vol. 2, Academic Press Inc., New York) bestimmt. Diese Bestimmung basiert auf der Fähigkeit des Toxins, mit dem Antitoxin in vitro zu reagieren. Der Test bestimmt die Abnahme des Neutralisationsvermögens einer bekannten Menge des Antitoxins, nachdem mit Toxoid inkubiert wird. Eine Reihe von Teströhrchen, die dasselbe Volumen des Antitoxins (2 AU/ml) und eine entsprechende Verdünnung des Toxoids enthalten, werden bei 37 C 30 min inkubiert.
Eine andere Serie von Teströhrchen dient als Kontrolle, wobei zum selben Volumen des Antitoxins (2 AU/ml) Puffer gegeben und unter denselben Bedingungen inkubiert wird. Nach der Inkubation werden idente Volumina einer 0, 15 log Serienverdünnung des Toxins zu den Teströhrchen gegeben und die Bestimmung wird mit dem Adenylatcyclase-Test ausgeführt.
Die Verschiebung des 50%-Wertes in der Dosis-Wirkungskurve wird dazu benutzt, um die Menge von freiem und gebundenem Antitoxin im Antitoxin-Toxoid-Gemisch zu bestimmen. 1 TU ist die Menge Toxoid, die 1 AU des Antitoxins bindet (AU = Antitoxin Unit). j) Vorschrift zur Durchführung des Adenylatcyclasetests
Die Herstellung der Adenylatcyclasepräparationen wird nach der Methode von Levey
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zentration 0, 15 mg Protein pro Prüfung. Die Inkubation wird durch Zugabe des Enzyms begonnen und 30 min bei 370C durchgeführt. Zur Beendigung der Reaktion werden 500 pl 7, 5% iger Trichloressigsäure zugesetzt und die Mischung 10 min bei 4 C gehalten. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation abgetrennt und das überstehende Material zu 5 ml mit Wasser gesättigtem Äthyläther gegeben.
Die Schichten werden durch Zentrifugieren getrennt und die Ätherphase wird entfernt. Nach insgesamt dreimaliger Ätherextraktion wird die wässerige Lösung bei 60 bis 700C am Wasserbad mit einem Luftstrom zur Trockne gebracht. Der Rückstand wird in 1 ml 0, 2 M Acetatpuffer von
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für die Höhe der Aktivierung der Adenylatcyclase durch Colienterotoxin, wird mittels des eingangs beschriebenen Tests bestimmt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Reinigung und Isolierung von hitzelabilem Colienterotoxin aus einem rohen oder vorgereinigten zellfreien Kulturfiltrat einer Fermentkultur eines enteropathogenen E. Coli-Stammes, dadurch gekennzeichnet, dass man das Kulturfiltrat einer affinitätschromatographischen Trennung unterwirft und gegebenenfalls nach Prüfung auf Colienterotoxinaktivität die Colienterotoxinaktivität zeigenden Fraktionen sammelt und konzentriert, wobei die Trenn- und Identifizierungsschritte wiederholt werden können.