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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Extraktion und Reinigung des hitzelabilen Colienterotoxins mittels Affinitätschromatographie, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Trägergel verwendet, an das amphipathische Substanzen kovalent gebunden sind.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Trägergel insolubilisierte Agarose oder Polyacrylamidgele, an die amphipathische Substanzen kovalent gebunden sind, verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als amphipathische Substanz amphipathische Lipide verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als amphipathische Substanz ein Phosphoglycerid oder Glycolipid verwendet.
Die Isolierung und Charakterisierung des hitzelabilen enterotoxischen Faktors (Enterotoxin), der von pathogenen Escherichia coli-Stämmen produziert und für das Auftreten von Diarrhoe bei Mensch und Tier verantwortlich gemacht wird, ist von grösster Bedeutung für das Verständnis der Pathogenese der Erkrankungen, für die Entwicklung von Methoden der Immunprophylaxe und zur Erstellung eines rasch durchführbaren in vitro Tests für das Diagnostizieren eines pathogenen E. coli-Stammes.
Es ist bekannt, dass das Enterotoxin von V. cholerae, das für die gastrointestinale Manifestierung der klinischen Cholera verantwortlich ist, sehr stark an Ganglioside bindet.
Ganglioside hemmen den biologischen Effekt von Cholera Enterotoxin auf isolierte Fettzellen und hindern die Bindung von Cholera-Enterotoxin an spezifische Rezeptoren der Zellmembran verschiedenster Gewebe. Ähnliche Versuche wurden mit ungereinigten Präparationen von Colienterotoxin durchgeführt, wobei festgestellt wurde, dass die biologische u irkung von Colienterotoxin nur mit hohen Konzentrationen von Gangliosiden beeinflusst werden kann und die Bindung des Colienterotoxins an diese Strukturen offenbar mit geringer Affinität erfolgt. Diese Überlegungen führten nun dazu, dass Ganglioside oder Substanzen ähnlicher Strukturen zur Erstellung eines Affinitätsharzes Verwendung fanden.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion und Reinigung des hitzelabilen Colienterotoxins mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Trägergels, an das amphipathische Substanzen kovalent gebunden sind.
Als Basisträgergel können z.B. insolubilisierte Agarose oder Polyacrylamidgele verwendet werden, als amphipathische Substanzen sind beispielsweise amphipathische Lipide wie Phosphoglyceride oder Glycolipide einsetzbar. Weiters können z.B. als Trägergel auch Fettsäure-Aminoalkyl-Agarose Komplexe verwendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann ausgeführt werden, indem man ein Copolymeres, z.B. Poly-L-Lysin oder Poly-L-L!syl-DL-Alanin nach der Methode von Cuatrecasas (P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245/3059 [1970]) bzw. nach Sica et al. (V. Sica, E. Nola, I. Parikh, G. A. Puca und P. Cuatrecasas [1973], Nature [London] New Biology 244/ 36) an cyanbromidaktivierte Agarose koppelt. Die verwendeten Derivate enthalten vorzugsweise 1,5 bis 1,0 mg, insbesonders ungefähr 1,2 mg Copolymer/ml Agarose und vorzugsweise 2,0 bis 1,0 mg, insbesonders ungefähr 1,4 mg Homopolymer/ml Agarose. Albumin wird auch als makromolekularer Spacera verwendet. Albumin wird entweder in Gegenwart von 10 m Harnstoff oder ohne 10 m Harnstoff an cyanbromid-ak tivierte Agarose gekoppelt.
Ein solches Derivat enth.ilt etwa 2-3 mg Albumin/ml Gel. 3,3-Diaminodipropylamin wird auch als Ligand verwendet, wobei etwa 10 limol per ml abgesetztes Harz gekoppelt wird (P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245/3059 [1970]). Zur Kupplung werden amphipathische Lipide mit freier Carboxylgruppe verwendet. Im speziellen Falle der Ganglioside werden die Carboxylgruppe der terminalen Sialinsäure an die Aminogruppe der oben beschriebenen Agarosederivate unter Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimidreagens oder mittels Dicyclohexylcarbodiimid gekoppelt. Es kann zur Kuppelung entweder ein aktiver N-Hydroxysuccinimidester der Ganglioside verwendet werden.
Das auf diese Weise hergestellte Gel wird als Träger bei der an sich bekannten Methode der Affinitätschromatographie zur Extraktion und Reinigung des Colienterotoxins eingesetzt.
Zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens kann man beliebige Chromatographievorrichtungen verwenden, z.B. eine Affinitätssäule.
Das nachfolgende Beispiel dient zur Erläuterung der Erfindung.
Beispiel Clzromatographie eines rohen Kulturmedienüberstandes über eine Affinitätssäule:
Die Säule (10 ml Gel in einer Glassäule [1 X20 cm]) wird bei Zimmertemperatur 2 Tage mit 50% (V/V) Methanol, gefolgt von 6 M Guanidin . HCI (200 ml, 6 Stunden) und einem Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer pH 7,4 (100 ml, 3 Stunden), gewaschen. 50 g lyophilisierter Kulturmedien überstand wird in 150 ml Krebs-Ringer-Bicarbonat-Puffer pH 7,4 aufgenommen und erschöpfend bei 40C dagegen dialysiert. Die Probe wird hierauf aufgetragen und die Säule wird mit einer Fliessgeschwindigkeit von 5 ml/Stunde bei 40C entwickelt. Es wird mit 500 ml 0,1M NH4HCO,-Puffer pH 8,0 gewaschen.
Die Elution der biologischen Aktivität erfolgt hernach bei Zimmertemperatur mit 0,1M NH4HCO,- Puffer pH 8,0, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS). Das mit SDS eluierte Material wird gesondert nachstehender Behandlung zur Entfernung von SDS und Renaturierung aus einer Harnstofflösung unterworfen (K. Weber, D.J. Kuter: J. Biol.
Chem. 246/4504 [1971]):
Die Proteinlösung wird durch Zugabe von festem Harnstoff auf 6 Molar in Harnstoff gebracht u. 30 Minuten inkubiert, hierauf wird gegen Pufferlösung A (0,05 m Tris-acetat pH 7,8 6 M in Harnstoff) dialysiert. Das SDS wird auf einer Säule aus Dowex 1 X 2, äquilibriert mit Puffer A, entfernt.
Die Entwicklung der Säule erfolgt mit derselben Pufferlösung.
Die Rekonstitution des Proteins aus der Harnstofflösung erfolgt bei Zimmertemperatur durch tropfenweise Verdünnung in einen 0,05 M Tris-acetat-Puffer pH 7,8, so dass die Endverdünnung mindestens 10fach ist. Die Lösung wird hierauf bei 4"C über Diaflo UM 10 Filter in einer Amicon-Zelle konzentriert und gegen den 0,05 M Tris-acetat-Puffer pH 7,8 bei 40C dialysiert, um Reste von Harnstoff zu entfernen.
Der benötigte lyophilisierte Kulturmediumüberstand kann folgendermassen erhalten werden:
Der gefriergetrocknete E. coli Stamm wird in Wasser aufgenommen, auf Blutagarplatten ausgestrichen und 12 Stunden bei 37"C kultiviert. Dann werden mit einer Platinschleife Zellen aus der Oberfläche in einen 1 Liter Erlenmeyerkolben übertragen, der 200 ml eines modifizierten trypticase soy broth -Mediums enthält und der sich auf einem rotierenden Schüttelapparat befindet. Die Bakterien werden 4 Stunden bei 37"C kultiviert. Dann wird damit eine 2 Liter Kultur beimpft, die ihrerseits nach Erreichen der Mitte der logarithmischen Phase als Impfflüssigkeit für einen 20 Liter Fermenter, in dem das Medium mit 500 U/min ge
rührt und mit 10 Liter/min Luft belüftet wird, verwendet wird. Um ein Schäumen der Lösung zu verhindern, wird 1 ml eines 25%gen Antischaummittels (Gew./Vol.) zugesetzt. Es wird 9 Stunden bei 37"C inkubiert. Dann werden die Zellen durch Zentrifugieren in einer gekühlten Ultrazentrifuge bei 4"C geerntet. Die überstehende Flüssigkeit wird durch ein 0,45 pm Membranfilter filtriert und das Filtrat auf Sterilität geprüft (durch Bestreichen einer Blutagarplatte). Das sterile Filtrat wird durch Behandlung mit einem Ionenaustauscherharz entsalzt, lyophilisiert und bei -20" bis -700C für die weitere Verwendung gelagert.
Das in der Säule benötigte Gel kann folgendermassen erhalten werden: A) Kupplung mit Carbodiimid:
Das Agarosederivat (25 ml) wird mit Wasser gewaschen und hierauf in 50 ml einer 50 % (V/V) wässrigen Dioxanlösung suspendiert. 50 mg des entsprechenden Gangliosids (z.B. sialinidaseresistente Monosialosylgangliosid GM1 oder GGnSLC) werden zu dieser Suspension gegeben und 15 Minuten bei Zimmertemperatur geschüttelt. Nach der Zugabe von 100 mg 1 -Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid wird die Suspension 6 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt, hierauf wird nochmals 100 mg des Carbodiimids hinzugefügt. Nach 12 Stunden weiterem Schütteln wird das Gel mit 500 ml Wasser, 500 ml 75% (V/V) wässrigem Methanol, 250 ml 6 M Guanidinhydrochlorid und 500 ml Wasser gewaschen.
Der Gehalt an Gangliosid, bestimmt aus der Differenz des wiedergewonnenen, nicht umgesetzten Gangliosids, ist ungefähr 0,5 mg/ml Gel.
Die Kupplung kann auch wie folgt in einem organischen Lösungsmittel durchgeführt werden, indem 20 mg Gangliosid und 5 mg Dicyclohexylcarbodiimid in 10 ml Dioxan 30 Minuten bei 15"C umgesetzt werden. Dieser Ansatz wird zu 20 ml in Dioxan suspendierte Albuminagarose zu einem Gesamtvolumen von 40 ml zugesetzt. Nach 15 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Gel mit 500 ml Dioxan, 500 ml 90% (V/V) Methanol und letztlich mit 6 M Guanidin. HC1 gewaschen.
B) N-Hydroxysuccinimidester:
20 mg Gangliosid wird mit 2,5 mg H-Hydroxysuccinimid und 2,5 mg Dicyclohexylcarbodiimid 30 Minuten bei 150C in 10 ml Dioxan umgesetzt. Die Lösung wird hierauf zu 20 ml Albuminagarose, suspendiert zu einem Endvolumen von 40 ml in Dioxan, gegeben. Nach 15 Stunden Schütteln bei 40C wird das Gel mit 500 ml Dioxan, 500 ml 90% (V/V) Methanol und mit 250 ml 6 M Guanidin. HCI gewaschen.
C) Gemischte Anhydride:
100 tal 0,1 M N-Methylmorpholin in Tetrahydrofuran werden zu einer Lösung von 20 mg Gangliosid in wasserfreiem Tetrahydrofuran gegeben. Die Lösung wird 10 Minuten bei 0 C gerührt, hierauf werden 100 kl 0,1 M Isobutylchlorameisensäure in Tetrahydrofuran hinzugegeben und 20 Minuten bei 0 C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird zu 20 ml eines in Dioxan suspendierten Aminoagarosederivates gegeben und 15 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten.
Hierauf wird wie oben beschrieben gewaschen.
D) Präparierung eines Fettsäure-Agarosederivat-Komplexes:
Aminoäthylamino-, Aminohexylamino- und Aminodecylamino-Agarosederivate können entsprechend der Methode nach Cuatrecasas und Anfinsen (Methods in Enzymol. 22/345 [1971]) durch Aktivierung von Sepharose 4 B mit 200 mg CNBr/ml abgesetztes Harz bei pH 11-11,5, und Rühren bei pH 10 und 3"C über 15 Stunden mit dem entsprechenden Diamin hergestellt werden. Das molare Verhältnis Hexandiamin oder Decandiamin zu CNBr ist 1, das von Äthylendiamin zu CNBr 5. Die Aminoalkylamino-Agarosepräparationen werden 5 Tage gealtert und mit 1 M 2-Aminoäthanol bei Zimmertemperatur umgesetzt, um etwaige noch aktivierte Gruppen der Sepharose abzusättigen. Solcherart präparierte Derivate enthalten ungefähr 20 Mole freie Aminogruppen/ ml Agarose. Die entsprechende Fettsäure (z.B.
Palmitinsäure) wird durch 3 Tage Rühren der gewählten Aminoalkylamino-Sepharose im 1,5fachen Volumen einer 0,1 M Lösung einer Natriumseife der Fettsäure bei pH 10 und unter Zufügen von 50 mg Äthyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbo- diimid per ml Sepharose bei 37"C gekuppelt. 25% Äthanol wird zugefügt, um die Löslichkeit der Seife zu erhöhen. Das Produkt wird bei 370C mit 50% (V/V) Äthanol, Äthanol0,075 M Natriumphosphat (1:1), pH 2,4 und mit Äthanol0,05 N NaOH (1:1) gewaschen. Nicht bei der Reaktion umgesetzte Gruppen werden durch Acetylierung mit Essigsäureanhydrid abgesättigt.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the extraction and purification of the heat-labile colonic terotoxin by means of affinity chromatography, characterized in that a carrier gel is used to which amphipathic substances are covalently bound.
2. The method according to claim 1, characterized in that insolubilized agarose or polyacrylamide gels to which amphipathic substances are covalently bound are used as carrier gel.
3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that amphipathic lipids are used as the amphipathic substance.
4. The method according to claim 1 and 3, characterized in that a phosphoglyceride or glycolipid is used as the amphipathic substance.
The isolation and characterization of the heat-labile enterotoxic factor (enterotoxin), which is produced by pathogenic Escherichia coli strains and is responsible for the occurrence of diarrhea in humans and animals, is of the greatest importance for the understanding of the pathogenesis of the diseases, for the development of Methods of immunoprophylaxis and for the preparation of a rapid in vitro test for the diagnosis of a pathogenic E. coli strain.
V. cholerae enterotoxin, which is responsible for the gastrointestinal manifestation of clinical cholera, is known to bind very strongly to gangliosides.
Gangliosides inhibit the biological effect of cholera enterotoxin on isolated fat cells and prevent the binding of cholera enterotoxin to specific receptors in the cell membrane of various tissues. Similar experiments were carried out with unpurified preparations of colienterotoxin, whereby it was found that the biological effect of colienterotoxin can only be influenced with high concentrations of gangliosides and the binding of the colienterotoxin to these structures apparently takes place with low affinity. These considerations led to gangliosides or substances with similar structures being used to create an affinity resin.
The invention relates to a method for extracting and purifying the heat-labile colonic terotoxin by means of affinity chromatography using a carrier gel to which amphipathic substances are covalently bound.
As a base carrier gel e.g. insolubilized agarose or polyacrylamide gels are used, for example amphipathic lipids such as phosphoglycerides or glycolipids can be used as amphipathic substances. Furthermore, e.g. fatty acid-aminoalkyl-agarose complexes can also be used as carrier gel.
The process according to the invention can be carried out by using a copolymer, e.g. Poly-L-lysine or poly-L-L! Syl-DL-alanine according to the method of Cuatrecasas (P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245/3059 [1970]) or according to Sica et al. (V. Sica, E. Nola, I. Parikh, G.A. Puca and P. Cuatrecasas [1973], Nature [London] New Biology 244/36) couples to cyanobromide-activated agarose. The derivatives used preferably contain 1.5 to 1.0 mg, particularly approximately 1.2 mg copolymer / ml agarose and preferably 2.0 to 1.0 mg, particularly approximately 1.4 mg homopolymer / ml agarose. Albumin is also used as a macromolecular spacera. Albumin is coupled to cyanobromide-activated agarose either in the presence of 10 m urea or without 10 m urea.
Such a derivative contains about 2-3 mg albumin / ml gel. 3,3-Diaminodipropylamine is also used as a ligand, with about 10 limol per ml of resin deposited being coupled (P. Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245/3059 [1970]). Amphipathic lipids with a free carboxyl group are used for coupling. In the special case of gangliosides, the carboxyl group of the terminal sialic acid is coupled to the amino group of the agarose derivatives described above using a water-soluble carbodiimide reagent or using dicyclohexylcarbodiimide. Either an active N-hydroxysuccinimide ester of ganglioside can be used for coupling.
The gel produced in this way is used as a carrier in the affinity chromatography method known per se for the extraction and purification of the colonic terotoxin.
Any chromatography device can be used to carry out the method according to the invention, e.g. an affinity column.
The following example serves to explain the invention.
Example clromatography of a crude culture media supernatant over an affinity column:
The column (10 ml gel in a glass column [1 X20 cm]) is at room temperature for 2 days with 50% (v / v) methanol, followed by 6 M guanidine. HCI (200 ml, 6 hours) and a Krebs-Ringer bicarbonate buffer pH 7.4 (100 ml, 3 hours). 50 g of lyophilized culture media supernatant is taken up in 150 ml of Krebs-Ringer bicarbonate buffer pH 7.4 and dialysed exhaustively at 40C. The sample is then applied and the column is developed at a flow rate of 5 ml / hour at 40C. It is washed with 500 ml 0.1M NH4HCO, buffer pH 8.0.
The biological activity is then eluted at room temperature with 0.1M NH4HCO, buffer pH 8.0, 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). The material eluted with SDS is subjected to the separate treatment below for the removal of SDS and renaturation from a urea solution (K. Weber, D.J. Kuter: J. Biol.
Chem. 246/4504 [1971]):
The protein solution is brought up to 6 molar in urea by adding solid urea u. Incubated for 30 minutes, then dialyzed against buffer solution A (0.05 M Tris-acetate pH 7.8 6 M in urea). The SDS is removed on a Dowex 1 X 2 column equilibrated with Buffer A.
The column is developed with the same buffer solution.
The protein is reconstituted from the urea solution at room temperature by dropwise dilution in a 0.05 M Tris-acetate buffer pH 7.8, so that the final dilution is at least 10 times. The solution is then concentrated at 4 "C over Diaflo UM 10 filters in an Amicon cell and dialyzed against the 0.05 M Tris-acetate buffer pH 7.8 at 40C to remove residues of urea.
The required lyophilized culture medium supernatant can be obtained as follows:
The freeze-dried E. coli strain is taken up in water, spread on blood agar plates and cultivated for 12 hours at 37 ° C. Then cells are transferred from the surface with a platinum loop into a 1 liter Erlenmeyer flask which contains 200 ml of a modified trypticase soy broth medium and which is on a rotating shaker. The bacteria are cultivated at 37 "C for 4 hours. Then a 2 liter culture is inoculated, which in turn, after reaching the middle of the logarithmic phase, is used as the inoculation liquid for a 20 liter fermenter in which the medium is at 500 rpm
stirred and aerated with 10 liters / min of air is used. To prevent the solution from foaming, 1 ml of a 25% w / v antifoaming agent is added. It is incubated for 9 hours at 37 ° C. Then the cells are harvested by centrifugation in a cooled ultracentrifuge at 4 ° C. The supernatant liquid is filtered through a 0.45 pm membrane filter and the filtrate is checked for sterility (by brushing a blood agar plate). The sterile filtrate is desalted by treatment with an ion exchange resin, lyophilized and stored at -20 "to -700C for further use.
The gel required in the column can be obtained as follows: A) Coupling with carbodiimide:
The agarose derivative (25 ml) is washed with water and then suspended in 50 ml of a 50% (v / v) aqueous dioxane solution. 50 mg of the corresponding ganglioside (e.g. sialinidase-resistant monosialosylganglioside GM1 or GGnSLC) are added to this suspension and shaken for 15 minutes at room temperature. After the addition of 100 mg of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, the suspension is shaken for 6 hours at room temperature, after which another 100 mg of the carbodiimide is added. After further shaking for 12 hours, the gel is washed with 500 ml of water, 500 ml of 75% (v / v) aqueous methanol, 250 ml of 6 M guanidine hydrochloride and 500 ml of water.
The ganglioside content, determined from the difference in the recovered unreacted ganglioside, is approximately 0.5 mg / ml gel.
The coupling can also be carried out as follows in an organic solvent by reacting 20 mg of ganglioside and 5 mg of dicyclohexylcarbodiimide in 10 ml of dioxane for 30 minutes at 15 ° C. This approach becomes 20 ml of albumin agarose suspended in dioxane to a total volume of 40 ml After 15 hours at room temperature, the gel is washed with 500 ml of dioxane, 500 ml of 90% (v / v) methanol and finally with 6 M guanidine HC1.
B) N-hydroxysuccinimide ester:
20 mg ganglioside is reacted with 2.5 mg H-hydroxysuccinimide and 2.5 mg dicyclohexylcarbodiimide for 30 minutes at 150C in 10 ml dioxane. The solution is then added to 20 ml of albumin agarose, suspended to a final volume of 40 ml in dioxane. After shaking for 15 hours at 40C, the gel is mixed with 500 ml of dioxane, 500 ml of 90% (v / v) methanol and with 250 ml of 6 M guanidine. HCI washed.
C) Mixed anhydrides:
100 tal 0.1 M N-methylmorpholine in tetrahydrofuran are added to a solution of 20 mg ganglioside in anhydrous tetrahydrofuran. The solution is stirred at 0 C for 10 minutes, then 100 ml of 0.1 M isobutylchloroformic acid in tetrahydrofuran are added and the mixture is kept at 0 C for 20 minutes. The reaction mixture is added to 20 ml of an aminoagarose derivative suspended in dioxane and kept at room temperature for 15 hours.
It is then washed as described above.
D) Preparation of a fatty acid-agarose derivative complex:
Aminoethylamino, aminohexylamino and aminodecylamino agarose derivatives can be prepared according to the Cuatrecasas and Anfinsen method (Methods in Enzymol. 22/345 [1971]) by activating Sepharose 4 B with 200 mg CNBr / ml resin at pH 11-11.5 , and stirring at pH 10 and 3 "C for 15 hours with the corresponding diamine. The molar ratio of hexanediamine or decanediamine to CNBr is 1, that of ethylenediamine to CNBr 5. The aminoalkylamino agarose preparations are aged for 5 days and with 1 M 2-Aminoethanol reacted at room temperature to saturate any activated groups of the Sepharose. Derivatives prepared in this way contain about 20 moles of free amino groups / ml agarose. The corresponding fatty acid (e.g.
Palmitic acid) is stirred by 3 days of the selected aminoalkylamino-Sepharose in 1.5 times the volume of a 0.1 M solution of a sodium soap of the fatty acid at pH 10 and with the addition of 50 mg of ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) carbodimide ml Sepharose coupled at 37 "C. 25% ethanol is added to increase the solubility of the soap. The product is at 370C with 50% (v / v) ethanol, ethanol 0.075 M sodium phosphate (1: 1), pH 2 , 4 and washed with ethanol 0.05 N NaOH (1: 1). Unreacted groups are saturated by acetylation with acetic anhydride.