DD287951A5 - PROCESS FOR IMMOBILIZING BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS ON POLYOXYALKYLENE GLYCOL AND ITS MONOALKOXY DERIVATIVES - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate. Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate, einschlieszlich ihrer thiolgruppenhaltigen Derivate, werden als ihre mit Chlorameisensaeureestern aktivierten Ester mit biologisch aktiven Verbindungen umgesetzt, die nukleophile Gruppen besitzen. Die Reaktionen werden in waeszrigen Loesungen, organischen Loesungsmitteln oder Gemischen dieser Loesungsmittel miteinander und untereinander bei 0C bis 150C in Gegenwart von Puffersubstanzen oder saeurebindenden Mitteln durchgefuehrt. Die erfindungsgemaeszen Immobilisate besitzen ein breites Anwendungsspektrum in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Medizin.{Verfahren; Immobilisierung; Polyoxyalkylenglykole; mit Chlorameisensaeureestern aktivierte Polymere; biologisch aktive Verbindungen}The invention relates to a process for the immobilization of biologically active compounds to polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives. Polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives, including their thiol group-containing derivatives, are reacted as their esters of chloroformates with biologically active compounds having nucleophilic groups. The reactions are carried out in aqueous solutions, organic solvents or mixtures of these solvents with each other and with each other at 0C to 150C in the presence of buffering agents or acid-binding agents. The immobilizates according to the invention have a broad spectrum of applications in biotechnology, biochemistry, pharmacy and medicine. immobilization; polyoxyalkylene; polymers activated with chloroformic acid esters; biologically active compounds}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivato. Das Verfahren kann in der Biotechnologie, Biochemie, Pharmazie und Medizin angewendet werden.The invention relates to a process for the immobilization of biologically active compounds to polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxyderivato. The method can be used in biotechnology, biochemistry, pharmacy and medicine.
Biologisch aktive Verbindungen wio Biokatalysatoren, biokatalytisch inaktive Proteine oder Pharmaka, die kovalent an lösliche oder unlösliche Trägermaterialien gebunden wurden, werden bereits in großem Umfange praktisch genutzt. Stoffwandlungsreaktionen durch biotechnologische Verfahren und auch Proteinreinigungsmethoden - auch solche im vergrößerten Maßstab -werden heute in vielen Fällen unter Einsatz unlöslich und damit wiederverwendbar gemachte, biologisch aktiver Verbindungen durchgeführt.Biologically active compounds such as biocatalysts, biocatalytically inactive proteins, or drugs that have been covalently bound to soluble or insoluble carrier materials are already being widely used. Metabolism reactions by biotechnological methods and also protein purification methods - even those on an enlarged scale - are nowadays often carried out using insoluble and thus reusable, biologically active compounds.
Aber auch synthetische Makromoleküle wie Dextrane, Polyaminosäuren, Polyvinylalkohol oder Polyoxyalkylenglykole, die in wäßrigen Systemen löslich sind, finden zunehmend Interesse und auch Anwendung in der Biotechnologie und Medizin. Koenzyme mit einem Adeninringsystem werden zum Beispiel an Typen der genannten, wasserlöslichen Polymeren kovalent gebunden und als solche Makromoleküle in biochemischen Reaktionen angewendet (BRD-Auslegeschrift 2841414). Aber auch Proteine - sowohl biokatalytisch aktive als auch biokatalytisch inaktive - wurden schon an wasserlösliche Polymere gebunden (Trends Biotechnol., 1986,4,68-73), und die Immobilisate wurden auf ihre Anwendung hin geprüft.However, synthetic macromolecules such as dextranes, polyamino acids, polyvinyl alcohol or polyoxyalkylene glycols, which are soluble in aqueous systems, are also finding increasing interest and application in biotechnology and medicine. Coenzymes with an adenine ring system are covalently bound, for example, to types of said water-soluble polymers and, as such, macromolecules are used in biochemical reactions (Federal Republic of Germany Patent Application 2841414). However, proteins - both biocatalytically active and biocatalytically inactive - have already been bound to water-soluble polymers (Trends Biotechnol., 1986, 4, 68-73), and the immobilizates were tested for their application.
Eine besondere Rolle bei der Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an wasserlösliche Polymere spielen Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate. Dies ist darin begründet, daß diese Polymere sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln löslich sind. Mit Vorteil können diese Polymeren damit auch in den genannten Lösungsmitteln modifiziert werden zu Polymeren mit anderen funktioneilen Gruppen als den Hydroxylgruppen, die in den Grundpolymeren vorliegen. Von besonderer Bedeutung ist dabei aber auch, daß diese Polymeren zur Immobilisierung von biologisch aktiven Verbindungen in organischen Lösungsmitteln unter wasserfreien Bedingungen aktiviert werden können und damit weitaus mehr Aktivierungsmethoden der Polymeren zur Verfügung stehen, als für Polymere, die in organischen Lösungsmitteln nicht löslich sind, sondern nur in wäßrigen Systemen. Für die Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate sind solche Aktivierungsreaktionen in organischen Lösungsmitteln beschrieben, zum Beispie! mit Cyanurchlorid als Aktivierungsmittel. Diese Aktivierungsmethode für hydroxylgruppenhaltige Polymere ist aber auf Grund der hohen Toxizität des Cyanurchlorids und seiner Substitutionsprodukte für Anwendungen von mit Cyanurchlorid aktivierten Polymeren in der Lebensmittelindustrie und auch Medizin als bedenklich einzuschätzen.A special role in the immobilization of biologically active compounds in water-soluble polymers play polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives. This is because these polymers are soluble in both water and organic solvents. Advantageously, these polymers can thus also be modified in the abovementioned solvents to give polymers having functional groups other than the hydroxyl groups present in the base polymers. It is also of particular importance, however, that these polymers can be activated for the immobilization of biologically active compounds in organic solvents under anhydrous conditions and thus far more activation methods of the polymers are available than for polymers which are not soluble in organic solvents, but only in aqueous systems. For the polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives, such activation reactions in organic solvents are described, for example! with cyanuric chloride as activator. However, this activation method for hydroxyl-containing polymers is due to the high toxicity of cyanuric chloride and its substitution products for applications of cyanuric activated polymers in the food industry and medicine considered questionable.
Ziel der Erfindung ist es, ein neues Verfahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderivate zu erarbeiten, daß nichttoxischc beziehungsweise wenig toxische Aktivierungsmittel verwendet und stabile Immobilisate ergibt.The aim of the invention is to develop a novel process for the immobilization of biologically active compounds to polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives, which uses non-toxic or less toxic activating agents and gives stable immobilizates.
Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein Vt -fahren zur Immobilisierung biologisch aktiver Verbindungen zu erarbeiten, bei denen diese an mit nichttoxischen oder wenig xischen Aktivierungsmitteln aktivierten, hydroxylgruppenhaltigen oder thiolgruppenhaltigen Polyoxyalkylenglykolen c >r ihren ebenso substituierten Monoalkoxyderivaten kovalent gebunden werden. Erfindungsgemäß wird die Aufgabe da -urch gelöst, daß die biologisch aktiven Verbindungen mit geeigneten, durch Chlorameisensäureester aktivierte Polymere mit Hydroxylgruppen oder Thiolgruppen vom Typ der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyderivate, in wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln beziehungsweise Gemischen organischer Lösungsmittel oder Gemischen aus wäßrigen Lösungen und organischen Lösungsmitteln im Zeitraum von 30 Minuten bis 12 Stunden bei Reaktionstemperaturen von OX bis 150°C, gegebenenfalls in Gegenwart von Puffersubstanzen oder anderen säurebindenden Mitteln umgesetzt werden. Als aktivierte Polymere werden vorzugsweise mit Chloramei jensäure-N-hydroxysuccinimidester, Ci\lorameisensäure-1 -hydroxybenztriazolester oder N-(Chlorcarbonyloxy)-5-noi bornen^.S-dikarboximid aktivierte, hydroxylgruppenhaltige oder thiolgruppenhaltige Polyoxyalkylenglykole oder mit den gleichen Aktivierungsgruppen substituierte Monoalkoxyderivate dieser Polymeren eingesetzt. Für die erfindungsgei laßen Immobilisierungsreaktionen kommen aber auch andere Chlorameisensäureester in Frage, zum Beispiel mit C> ilorameisensäurep-nitrop) enylester oder Chlorameisensäure-2,4,6-trichlorphenylester aktivierte Polyoxyalkylenglykole oder ihre Monoalkoxyderivate und ihre thiolgruppenhaltigen Analoga, vor allem dann, wenn die Immobilisate außerhalb der Medizin und Nahrungsmittelindustrie verwendet werden sollen.The object of the invention is to develop a Vt method for the immobilization of biologically active compounds in which they are covalently bound to their likewise substituted monoalkoxy derivatives by means of hydroxyl-containing or thiol-containing polyoxyalkylene glycols activated with non-toxic or sparingly active activating agents. According to the invention, this object is achieved by the fact that the biologically active compounds with suitable activated by chloroformate polymers with hydroxyl groups or thiol groups of the type of polyoxyalkylene or their monoalkoxy derivatives, in aqueous solutions or organic solvents or mixtures of organic solvents or mixtures of aqueous solutions and organic Solvents are reacted in the period of 30 minutes to 12 hours at reaction temperatures of from 0 to 150 ° C, optionally in the presence of buffering agents or other acid-binding agents. Activated polymers are preferably N-hydroxysuccinimide esters of chloroformic acid, C-1-hydroxybenzotriazole or N- (chlorocarbonyloxy) -5-norbornene, S-dikarboximide-activated, hydroxyl-containing or thiol-containing polyoxyalkylene glycols or monoalkoxy derivatives substituted by the same activating groups Used polymers. However, other chloroformic esters are also suitable for the immobilization reactions according to the invention, for example p-nitrophenylphenolate or 2,4,6-trichlorophenyl chloroformate-activated polyoxyalkylene glycols or their monoalkoxy derivatives and their thiol group-containing analogs, especially if the immobilizates outside the medical and food industries.
Als biologisch aktive Verbindungen können eine Vielzahl nieder· und hochmolekulare Verbindungen eingesetzt werden. Weitere Voraussetzung für das Gelingen der Immobilisierungsreaktionen, neben ihrer biologischen Aktivität, ist lediglich das Vorliegen funktioneller Gruppen mit nukleophilen Eigenschaften. Solche biologisch aktiven Verbindungen sind unter anderem Biokatalysatoren wie Enzyme, vorzugsweise aus den Klassen der Hydrolasen, Oxidoreduktasen, Transferasen und Isomerasen Mikroorganismen oder Zellen, beziehungsweise biokatalytisch inaktive Proteine wie Antikörper, Antigene, Hemoproteine, Albumine und andere oder niedermolekulare Verbindungen wie verschiedene Hormone, Vitamine, Koenzyme, Pharmaka, Synzyme und Affinitätsliganden, wie sie zum Beispiel in der Affinitätschromatographie benutzt werden. Da sich die mit Chlorameisensäureestern aktivierten Polymeren durch eine hohe Reaktivität auszeichnen, werden erfindungsgemäß auch instabile, biologisch aktive Verbindungen an diesen Polymeren immobilisiert, da die Anwendung auch milder Reaktionsbedingungen wie niedrige Reaktionstemperaturen oder kurze Reaktionszeiten zu Immobilisaten mit hoher biologischer Aktivität führt.As biologically active compounds, a variety of low and high molecular weight compounds can be used. Another prerequisite for the success of Immobilisierungsreaktionen, in addition to their biological activity, is only the presence of functional groups with nucleophilic properties. Such biologically active compounds include biocatalysts such as enzymes, preferably from the classes of hydrolases, oxidoreductases, transferases and isomerases microorganisms or cells, or biocatalytically inactive proteins such as antibodies, antigens, hemoproteins, albumins and other or low molecular weight compounds such as various hormones, vitamins, Coenzymes, drugs, synzymes and affinity ligands such as those used in affinity chromatography. Since the activated with chloroformates polymers characterized by a high reactivity, unstable, biologically active compounds are immobilized on these polymers according to the invention, since the application also mild reaction conditions such as low reaction temperatures or short reaction times leads to immobilizates with high biological activity.
In Abhängigkeit von der Stabilität und Löslichkeit der biologisch aktiven Verbindungen - die aktivierten Polyoxyalkylenglykolo und ihre Monoalkoxyderivate sind sowohl in wäßrigen Lösungen als auch in organischen Lösungsmitteln löslich -werden die Immobilisierungsreaktionen unter den verschiedenartigsten Reaktionsbedingungen ausgeführt. Eine Möglichkeit besteht darin, daß in Pufferlösungen mit pH-Werten von 5 bis 12, vorzugsweise von 7 bis 9, bei O0C bis 30°C gearbeitet wird und die Reaktionszeit in diesen Fällen 1 Stunde bis 12 Stunden beträgt. Weiterhin werden die Immobilisierungsreaktionen in wäßrigen Lösungen, Gemischen dieser mit organischen Lösungsmitteln, organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel bei O0C bis 10O0C bei Reaktionszeiten von 1 Stunde bis 12 Stunden und in diesen Fällen vorwiegend in Gegenwart eines säurebindenden Mittels durchgeführt. Eine weitere erfindungsgemäße Immobilisierungsvariante ist dadurch gekennzeichnet, daß Biokatalysatoren und hierbei bevorzugt Enzyme, in organischen Lösungsmitteln oder Gemischen organischer Lösungsmittel in Anwesenheit säurebindender Mittel bei O0C bis 1000C im Verlauft) von 1 Stunde bis 8 Stunden mit den aktivierten Polymeren umgesetzt werden.Depending on the stability and solubility of the biologically active compounds - the activated polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives are soluble in both aqueous solutions and organic solvents - the immobilization reactions are carried out under a wide variety of reaction conditions. One possibility is that working in buffer solutions with pH values from 5 to 12, preferably from 7 to 9, at 0 0 C to 30 ° C and the reaction time in these cases is 1 hour to 12 hours. Furthermore, the immobilization reactions are carried out in aqueous solutions, mixtures of these with organic solvents, organic solvents or mixtures of organic solvents at 0 0 C to 10O 0 C at reaction times of 1 hour to 12 hours and in these cases mainly in the presence of an acid-binding agent. A further immobilization variant according to the invention is characterized in that biocatalysts and in this case preferably enzymes, in organic solvents or mixtures of organic solvents in the presence of acid-binding agent at 0 0 C to 100 0 C in the course) are reacted from 1 hour to 8 hours with the activated polymers.
Für die Bindung der bei den Immobilisierungsreaktionen freigesetzten Mineralsäure werden neben Puffersystemen auch andere säurebindenden Verbindungen verwendet. Dazu gehören zum Beispiel tertiäre Amine, Heterocyclen mit endocyclischem, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten oder Hoteroaromaten.In addition to buffer systems, other acid-binding compounds are used for the binding of the mineral acid released in the immobilization reactions. These include, for example, tertiary amines, heterocycles having an endocyclic, tertiary nitrogen atom, alkali metal hydroxides, alkali metal carbonates, alkali metal alkoxides or alkali metal salts of condensed aromatics or hoteroaromatics.
Die Isolierung der an Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyderlvate immobilisierten, biologisch aktiven Verbindungen ist nach verschiedenen Methoden möglich. Eine Möglichkeit besteht in der Dialyse, Ultrafiltration und Lyophilisisrung der . Reaktionslösungen. Eine andere Möglichkeit im Ausfällen mit organischen Lösungsmitteln oder anorganischen Salzen, notwendigenfalls nach Dialyse der Reaktionslösungen. Und schließlich können die Immobilisate, nachdem die Reaktionslösungen mit einer ausreichenden Menge Wasser versetzt wurden, zunächst mit in Wasser nicht löslichen oder mischbaren, organischen Lösungsmitteln extrahiert werden und aus derorganischen Phase durch Verdampfen der organischen Lösungsmittel oder Einengen derselben und Versetzen der restlichen Lösungen mit Ether oder Petrolether durch Ausfällung isoliert werden. Bei besonderen Reinheitsanforderungen werden die Immobilisate mit Hilfe chromatographischer Methoden weiter gereinigt.The isolation of the biologically active compounds immobilized on polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives is possible by various methods. One possibility is in dialysis, ultrafiltration and lyophilization of. Reaction solutions. Another possibility in precipitation with organic solvents or inorganic salts, if necessary after dialysis of the reaction solutions. Finally, after adding sufficient water to the reaction solutions, the immobilizates may be first extracted with water-insoluble or miscible organic solvents, and from the organic phase by evaporating or concentrating the organic solvents and adding the remaining solutions with ether or Petroleum ethers are isolated by precipitation. For special purity requirements, the immobilizates are further purified by means of chromatographic methods.
Nach dem erfindungsgemäßen Immobilisierungsverfahren werden eine Vielzahl stabiler und neuer Immobilisate von biologisch aktiven Verbindungen mit Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoalkoxyderivaten synthetisiert. Auf Grund der großen Reaktivität der mit Chlorameisensäureestern aktivierten Polymeren sind die Umsetzungen unter milden Reaktionsbedingungen möglich, die zu Immobilisaten führen, die in der Medizin und Nahrungsmittelindustrie eingesetzt werden können. Weitere Einsatzgebiete für die sowohl in Wasser als auch in organischen Lösungsmitteln löslichen Polymeren sind die Biotechnologie, Chemie und PharmazieAccording to the immobilization method of the present invention, a variety of stable and novel immobilizates of biologically active compounds are synthesized with polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy derivatives. Due to the high reactivity of the activated with chloroformates polymers, the reactions are possible under mild reaction conditions, which lead to immobilizates that can be used in the medical and food industries. Further fields of application for the polymers soluble in both water and organic solvents are biotechnology, chemistry and pharmacy
Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert. The invention will be further explained by examples.
10mg Penicillinacylase werden in 15ml eines 0,1 molaren Boratpuffers vom pH-Wert 8,0 gelöst. Zu dieser Lösung werden 0,4g mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Polyethylenglykol (MG 6000) in fester Form addiert bei einerTemperatur vo.i 4°C. Die anfängliche Suspension und spätere Lösung wird auf Zimmertemperatur erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Die Lösung wird danach gegen destilliertes Wasser dialysiert, eine Ultrafiltration unterworfen, und die restliche Lösung wird lyophilisiert.10 mg of penicillin acylase are dissolved in 15 ml of a 0.1 molar borate buffer of pH 8.0. To this solution is added 0.4 g of N- (chlorocarbonyloxy) -5-norbornene-2,3-dikarboximide-activated polyethylene glycol (MW 6000) in solid form at a temperature of 4 ° C. The initial suspension and later solution is warmed to room temperature and stirred for 3 hours at this temperature. The solution is then dialyzed against distilled water, subjected to ultrafiltration, and the remaining solution is lyophilized.
0,6g mit N-fChlorkarbonyloxyJ-succinimid aktiviertos w.w'-Dimercapto-polyethylenglykol (MG 6000) werden in 25ml trockenem Benzen gelöst. Zu dieser Lösung werden 0,5g Imidazol und 20mg Lipase aus Rhizopus arrhizus addhrt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 6O0C gerührt, danach filtriert und das Benzen im Vakuum bei Umgebungstemperatur abdestilliert. Der Rückstand wird in 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 aufgenommen, die Lösung wird gegen destilliertes Wasser dialysiert, ultrafiltriert und der Rest der Lösung wird lyophilisiert. Der Rückstand wird gelchromatographisch mit Sephadex G100 weiter aufgereinigt, wobei eine biokatalytisch aktive und modifizierte Lipase als erste Fraktion von der Chromatographiesäule eluiertwird0.6 g with N-chloro-carbonyloxy-succinimide activated w.w'-dimercapto-polyethylene glycol (MW 6000) are dissolved in 25 ml of dry benzene. 0.5 g imidazole and 20 mg lipid from Rhizopus arrhizus are added to this solution. The reaction mixture is stirred for 3 hours at 6O 0 C, then filtered and the benzene distilled off in vacuo at ambient temperature. The residue is taken up in 0.1 molar phosphate buffer of pH 7.0, the solution is dialyzed against distilled water, ultrafiltered and the remainder of the solution is lyophilized. The residue is further purified by gel chromatography with Sephadex G100, eluting a biocatalytically active and modified lipase as the first fraction from the chromatography column
Ausbeute: 43mg Yield: 43mg
1 g mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Monomethoxy-polyethylenglykol (MG 5000) wird in 15ml destilliertem Dimethylsulfoxid gelöst. Zu dieser Lösung werden bei 4°C 50mg in 50ml 0,2 molarem Boratpuffer vom pH-Wert 8,0 aufgelöstes Hemoglobin addiort. Das Reaktionsgemisch wird auf Zimmertemperatur erwärmt und 3 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Danach wird die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert, ultrafiltriert, und lyophilisiert. Eine weitere Reinigung des modifizierten Hemoglobins erfolgt durch Gelchromatographie an einer Säule, die mit Sephadex G25 gefüllt ist1 g of N- (chlorocarbonyloxy) -5-norbornene-2,3-dikarboximide-activated monomethoxy-polyethylene glycol (MW 5000) is dissolved in 15 ml of distilled dimethyl sulfoxide. 50mg of 50mg hemoglobin dissolved in 50ml of 0.2M borate buffer pH 8.0 are added to this solution at 4 ° C. The reaction mixture is warmed to room temperature and stirred for 3 hours at this temperature. Thereafter, the solution is dialyzed against distilled water, ultrafiltered, and lyophilized. Further purification of the modified hemoglobin is carried out by gel chromatography on a column filled with Sephadex G25
Ausbeute: 220mg Yield: 220mg
1 g mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Monomethoxy-polyethylenglykol (MG 5000) wird in 15ml destilliertem Dimethylsulfoxid gelöst. Bei 40C werden 50mg in 25ml 0,1 molarem Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,0 suspendierte Zellen vom Mikroorganismus Trichosporon cutaneum addiert. Die Suspension wird auf Zimmertemperatur erwärmt und 6 Stunden bei dieser Temperatur vorsichtig bewegt. Danach werden die modifizierten Zellen abfiltriert, mit obigem Phosphatpuffer gewaschen und bei 4°C unter sterilen Bedingungen gelagert.1 g of N- (chlorocarbonyloxy) -5-norbornene-2,3-dikarboximide-activated monomethoxy-polyethylene glycol (MW 5000) is dissolved in 15 ml of distilled dimethyl sulfoxide. At 4 0 C in 25ml 50mg molar 0.1 phosphate buffer, pH 7.0, suspended cells are added by the microorganism Trichosporon cutaneum. The suspension is warmed to room temperature and gently agitated for 6 hours at this temperature. Thereafter, the modified cells are filtered off, washed with the above phosphate buffer and stored at 4 ° C under sterile conditions.
0,3g Eisen(lll)-protoporhurin IX und 0,8g Histamin werden in 15ml frisch destilliertem Dimethylformamid gelöst. Zu dieser Lösung wird 1 g mit i-Chlorkarbonyloxy-4-nitrobenzen aktiviertes Polyethylenglykol (MG 6000) in fester Form addiert. Die Lösung wird 3 Stunden bei 60°C gerührt und nach dem Abkühlen in 100 ml destilliertes Wasser eingetragen. Nach dem Filtrieren wird die Lösung dreimal mit jeweils 20ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformphasen werden mit Natriumsulfat getrocknet und auf etwa 10ml eingeengt. Dieser Rest wird mit 100ml Petrolether versetzt, und der ausgefallenen Niederschlag wird gesammelt und bei Umgebungstemperatur getrocknet0.3 g of iron (III) -protoporhurin IX and 0.8 g of histamine are dissolved in 15 ml of freshly distilled dimethylformamide. To this solution is added 1 g of i-chlorocarbonyloxy-4-nitrobenzene activated polyethylene glycol (MW 6000) in solid form. The solution is stirred for 3 hours at 60 ° C and added after cooling in 100 ml of distilled water. After filtering, the solution is extracted three times with 20 ml each of chloroform. The combined chloroform phases are dried with sodium sulfate and concentrated to about 10 ml. This residue is added with 100 ml of petroleum ether and the precipitate is collected and dried at ambient temperature
Ausbeute: 520 mg Yield: 520 mg
Beispiel βExample β
dem 500mg mit N-(Chlorkarbonyloxy)-5-norbornen-2,3-dikarboximid aktiviertes Polyethylenglykol (MG 6000} aufgelöst waren.the 500mg with N- (chlorocarbonyloxy) -5-norbornene-2,3-dikarboximid activated polyethylene glycol (MG 6000} were dissolved.
Unter pH-Kontrolle, derpH-Wert der Lösung sollte durch Zutropfen von geringen Mengen 0,01 normaler Natronlauge Im Bereich von pH-Wort 4 bis pH-Wert 5 gehalten werden, wird die Lösung 3 Stunden bei 2O0C bis 300C gorührt. Die Lösung wird anschließend gegen destilliertes Wasser dlalyslert und mit Natriumhydrogenkarbonat versetzt, so daß sie einen pH-Wert von 8,0 erreicht. Danach werden 2g Natriumdithionit zur Lösung addiert und das modifizierte Koenzym wird innerhalb 20 Minuten bei 50°C reduziert. Die Lösung wird erneut gegen destilliertes Wasser dialysiert, danach auf pH-Werte zwischen 10 und 11 gebracht und60 Minuten auf 6O0C bis 7O0C erhitzt. Die Löseng wird abgekühlt, gegen eine 0,01 molare Kaliumchloridlösung vom pH-Wert 8,0 dialysiert, ultrafiltriert und lyophilisiertUnder pH control, the pH of the solution should be kept in the range of pH word 4 to pH 5 by dropwise addition of small amounts of 0.01 normal sodium hydroxide solution, the solution is 3 hours at 2O 0 C to 30 0 C gorührt , The solution is then dlalyslert against distilled water and treated with sodium bicarbonate, so that it reaches a pH of 8.0. Thereafter, 2 g of sodium dithionite are added to the solution and the modified coenzyme is reduced within 20 minutes at 50 ° C. The solution is dialyzed again against distilled water, then brought to pH 10 to 11 and 60 minutes at 6O 0 C to 7O 0 C heated. The solution is cooled, dialyzed against a 0.01 molar potassium chloride solution of pH 8.0, ultrafiltered and lyophilized
Ausbeute: 185 g Yield: 185 g
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996040791A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Novo Nordisk A/S | Modification of polypeptides |
| WO1996040792A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Novo Nordisk A/S | Modification of polypeptides |
| EP0779894A1 (en) * | 1994-09-09 | 1997-06-25 | Surface Engineering Technologies Division Of Innerdyne, Inc. | Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces |
| WO2001045796A2 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Shearwater Corporation | Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
-
1989
- 1989-09-15 DD DD33272089A patent/DD287951A5/en not_active IP Right Cessation
Cited By (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0779894A1 (en) * | 1994-09-09 | 1997-06-25 | Surface Engineering Technologies Division Of Innerdyne, Inc. | Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces |
| EP0779894A4 (en) * | 1994-09-09 | 1998-10-14 | Surface Eng Tech | Electrophilic polyethylene oxides for the modification of polysaccharides, polypeptides (proteins) and surfaces |
| WO1996040791A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Novo Nordisk A/S | Modification of polypeptides |
| WO1996040792A1 (en) * | 1995-06-07 | 1996-12-19 | Novo Nordisk A/S | Modification of polypeptides |
| US7977427B2 (en) | 1999-12-22 | 2011-07-12 | Nektar Therapeutics | Method involving 1-benzotriazolyl carbonate esters of polymers |
| WO2001045796A3 (en) * | 1999-12-22 | 2002-05-10 | Shearwater Corp | Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
| WO2001045796A2 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-28 | Shearwater Corporation | Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
| US8299173B2 (en) | 1999-12-22 | 2012-10-30 | Nektar Therapeutics | Method involving 1-benzotriazolyl carbonate esters of polymers |
| EP2070968A3 (en) * | 1999-12-22 | 2013-07-24 | Nektar Therapeutics | Method for the Preparation of 1-Benzotriazolyl Carbonate Esters of Poly(ethylene glycol) |
| US8563651B2 (en) | 1999-12-22 | 2013-10-22 | Nektar Therapeutics | Method involving 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
| US8816002B2 (en) | 1999-12-22 | 2014-08-26 | Nektar Therapeutics | Method involving 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
| US9346917B2 (en) | 1999-12-22 | 2016-05-24 | Nektar Therapeutics | Method involving 1-benzotriazolyl carbonate esters of poly(ethylene glycol) |
| EP1259563B2 (en) † | 1999-12-22 | 2016-08-10 | Nektar Therapeutics | Method for the preparation of 1-benzotriazolyl carbonate esters of water soluble polymers. |
| US9839695B2 (en) | 1999-12-22 | 2017-12-12 | Nektar Therapeutics | Polymer-active agent conjugate |
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