EP1631545A2 - Reagents for modifying biopharmaceuticals, the use and production thereof - Google Patents

Reagents for modifying biopharmaceuticals, the use and production thereof

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Publication number
EP1631545A2
EP1631545A2 EP04739807A EP04739807A EP1631545A2 EP 1631545 A2 EP1631545 A2 EP 1631545A2 EP 04739807 A EP04739807 A EP 04739807A EP 04739807 A EP04739807 A EP 04739807A EP 1631545 A2 EP1631545 A2 EP 1631545A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
formula
group
independently
occurrence
compounds
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP04739807A
Other languages
German (de)
French (fr)
Inventor
Ralf KRÄHMER
Frank Leenders
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
celares GmbH
Original Assignee
celares GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by celares GmbH filed Critical celares GmbH
Publication of EP1631545A2 publication Critical patent/EP1631545A2/en
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with hetero atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics

Definitions

  • the present invention relates to compounds which are suitable for coupling to pharmaceuticals, in particular biopharmaceuticals, and to conjugates from the compounds with biomolecules or pharmaceutical active substances.
  • the compounds of the invention can be easily formed by multi-component reactions.
  • Another object of the invention is the use of the conjugates as an improved formulation of pharmaceuticals and their preparation.
  • the invention also provides a laboratory kit for the in vitro production of conjugates from the compounds and pharmaceuticals according to the invention and biotechnological substances, in particular biopharmaceuticals, pharmaceutical active ingredients, synthetic molecules or surfaces.
  • the effectiveness and the duration of action of an active ingredient are determined by its pharmacological profile. Particularly in the case of biopharmaceuticals, a rapid loss of activity is very often observed in vivo, which is generally referred to as "clearance”. The clearance takes place through processes such as metabolism or metabolism, renal excretion and through the response of the immune system to the foreign connection. Proteinogenic substances in particular, an important group of biopharmaceuticals, produce a strong immune response when used therapeutically: this can lead to an allergic shock. In many cases, such adverse effects prevent the commercial or therapeutic use of this otherwise very advantageous class of active ingredient.
  • Abuchowski one of the pioneers in the field of polymer-mediated delivery of biopharmaceuticals, was able to show that covalent coupling of polyethylene glycol chains to a polypeptide molecule produces a positive pharmacological effect with this active ingredient.
  • Such a conjugate is characterized by reduced immunogenicity and an extended half-life in the blood (US Pat. No. 4,179,337, Davis et al .; Abuchowski & Davis "Enzymes as Drugs", Holcenberg & Roberts, ed.
  • the chemical reaction to couple a polyethylene glycol molecule to a biopharmaceutical requires the activation of one of the two components that are reacted.
  • the PEG molecule is provided with a connecting molecule, the so-called activated linker.
  • the entire range of long-established peptide chemistry is available for activation.
  • the linker is often activated in the form of an N-hydroxysuccinimide active ester. Harris, J.M. et al. (U.S. Patent No. 5,672,662) developed this method for propionic and butyric acid linkers, while Zaiipsky, S. et al. (U.S.
  • Patent No. 5,122,614 an activated carbonic acid ester is used.
  • the reaction of a lysine residue with such an activated linker leads to the formation of an amide or urethane bond.
  • Linking a PEG to a biopharmaceutical called PEGylation sometimes leads to a loss of biological activity.
  • One reason for this can be the loss of the positive charge due to the formation of an amide bond on the lysine residue.
  • Reductive amination using PEG aldehydes is a good alternative to using active esters (Harris, JM US Patent No. 5,252,714) because this coupling method leads to the formation of a secondary amine while maintaining the positive charge.
  • Other coupling options are the use of the maleimide method (cysteine residues) and the direct connection without a linker group when using tresyl or halogen compounds.
  • the most commonly used PEGs are linear monomethoxypolyethylene glycol chains (m-PEGs). These linear chains are not conformationally restricted and can 'freely rotate depending on the environment. As a result, the chain-shielded surface of the biopharmaceutical is relatively small.
  • branched modification reagents that contain several PEG chains in one molecule.
  • PEG chains There are few commercial examples of this class of substance.
  • a well-known example of this is an activated lysine provided with two m-PEG chains. Due to the fact that the bindings can also be freely rotated here, the shielding effect is only moderate (Veronese, FM Bioconjugate Chem. 1995, 6, 62-69).
  • P independently represents H, OH, CC 4 -alkyl, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence,
  • R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 C atoms with each occurrence, R 3 OH or Is NR 4 R 5 ,
  • R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n each time an occurrence independently an integer from 1 is to 1000 and x is an integer from 1 to 10 every occurrence and y is an integer from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 each occurrence.
  • the compounds according to the invention have a basic structure which can be obtained by a multi-component reaction, for example a Ugi or a Passerini reaction or by a Ugi reaction carried out in stages.
  • a multi-component reaction for example a Ugi or a Passerini reaction or by a Ugi reaction carried out in stages.
  • first three components are reacted with one another (amine, isonitrile and carbonyl component) and then the fourth component (acid component) is coupled to the reaction product.
  • the compounds according to the invention contain at least one binding group Y, which enables the compound according to the invention to be covalently bound to further molecules, in particular to biotechnological, pharmaceutical or synthetic active substances, and to surfaces or to biocatalysts.
  • the binding group Y is preferably a Compound which can covalently bind with a functional group present in the active substance to be coupled, for example around a binding group which has an amino group, a thiol group, a carboxyl group, a guanidine group, a carbonyl group, a hydroxyl group, a heterocycle, in particular with N as a hetero atom (eg in histidine residues), a C-nucleophilic group, a C-electrophilic group, a phosphate, a sulfate or the like is capable of binding.
  • a binding group which has an amino group, a thiol group, a carboxyl group, a guanidine group, a carbonyl group, a hydroxyl group, a heterocycle, in particular with N as a hetero atom (eg in histidine residues), a C-nucleophilic group, a C-electrophilic group, a phosphate,
  • Non-covalent bonds for example chelates, complexes with metals, for example on surfaces or with radioisotopes, as well as bonds to silicon-containing surfaces are also possible.
  • Suitable binding groups are, for example, a carboxylic acid or an activated carboxylic acid group.
  • the compounds according to the invention preferably contain an activated functionality Y.
  • Y is preferably selected from the group consisting of (O-alkyl) 2 , -OSO 2 CH 2 CF 3 (tresyl), (O-aryl) azides, -CO-Q, maleimidyl, -O-CO-nitrophenyl or trichlorophenyl, -SS-alkyl, -SS-aryl, -SO 2 -alkenyl (vinyl sulfone ), -Halogen (Cl, Br, I), where Q is selected independently from a group consisting of H, O-aryl, O-benzyl, ON-succinimide, ON-sulfosuccinimide, ON-phthalimide, ON-glutarimide, ON- tetrahydrophthalimide, N-norbomene-2,
  • the compounds according to the invention can be covalently bound to active substances and thus form highly desirable, stable conjugates.
  • the compounds according to the invention furthermore have at least one group of the formula (II).
  • the compounds preferably have at least two and more preferably three groups of the formula (II). Due to the flexibility provided by the multi-component reaction, it is possible to insert the groups of the formula (II) at different positions in the molecule. So it is possible to in groups of formula (II) various residues V, W, X or / and Z, in particular in X or / and Z, to be introduced.
  • the compounds of the formula (I) according to the invention have a molecular weight of 200 to 50,000 Da, in particular 1,000 to 20,000 Da. It has furthermore been found that compounds of the formula (I) according to the invention which contain more than one chain of the formula (II) provide good shielding even at lower molecular weights of the entire compound. In the case of compounds which have two to three groupings of the formula (II), a molecular weight of the total compounds of 500 to 25,000 Da, in particular from 500 to 10,000 Da, is sufficient.
  • Compounds which have four or five groupings of the formula (II) preferably have a molecular weight of 200 to 12,500 Da, in particular 500 to 7,500 Da.
  • the molecular weight is particularly preferably ⁇ 7,500 Da and more preferably ⁇ 5000 Da.
  • the groups of the formula (II) are preferably polyalkylene oxides, such as, for example, polyethylene glycol, polyolefin alcohols, such as, for example, polyvinyl alcohol or polyacrylmorpholine.
  • the residues or placeholders P, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , n, x, y and q in a molecule or a residue can in each case be the same or else different from one another ,
  • the rest of formula (II) can be a polyalkylene oxide consisting of polyethylene oxide and polypropylene oxide groups.
  • R 4 and R 5 can be hydrogen or a hydrocarbon radical having 1 to 30 C atoms, in particular 1 to 10 C atoms, more preferably 1 is 6 C atoms, which may contain heteroatoms, in particular one or more heteroatoms, selected from O, N, P and S.
  • the radicals R 4 and R 5 together can also form a ring, for example a morpholine ring.
  • the radical R 1 is hydrogen, hydroxyl or a hydrocarbon radical with 1 to 50 carbon atoms, more preferably 1 to 30 carbon atoms and most preferably 1 to 10 carbon atoms, which optionally contains heteroatoms, in particular O, N, S, P or / and Si.
  • the radical R 1 can be saturated or mono- or polyunsaturated as well as linear, branched or cyclic. HO, CH 3 -O, CH 3 - (CH 2 ) a -O, (CH 3 ) 2 CH-O is particularly preferred, where a is an integer between 1 and 20.
  • n is between 0 and 1000.
  • n (as used herein, for example in Formula II or Formula Ila) is independently an integer from 0 to 1000, more preferably from 1 to 500, even more preferably from 2 to 250, especially at least 3 and most preferably at least every occurrence 4 to 50.
  • n is independently an integer from 0 to 1000, more preferably from 1 to 500, even more preferably from 2 to 250, especially at least 3 and most preferably at least every occurrence 4 to 50.
  • compounds which contain 2 or 3 groups of the formula (II) are often particularly preferred.
  • x is independently an integer from 1 to 10, in particular 1 to 6, more preferably from 2 to 3, and y is an integer from 0 to 50, more preferably from 1 to 10, even more preferably from 2 to 6 .
  • q is 0 or 1 at each occurrence independently.
  • residues V, W, X and Z originate from the reactants reacted in the multicomponent reaction or become, in the event that one of the reactants has two or more functional groups (amine, ketone or aldehyde, isonitrile or acid grouping) exhibits, in the course of
  • Multi-component reaction established. Preference is given to compounds which are obtained in a multicomponent reaction or a multistage multicomponent reaction, in particular a four-component reaction and most preferably in a Ugi reaction, in which at least one starting material which is branched, ie at least two, more preferably at least three, is used Multi-component reaction reactive groups (eg amine, carbonyl, isonitrile or / and acid grouping).
  • the radical V comes from the acid component
  • the radical Z from the isonitrile component
  • the radical X from the amino component
  • the radical W from the carbonyl component.
  • the radicals V, W, X and Z each independently represent hydrogen or a hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms.
  • a hydrocarbon radical here means a radical having 1 to 100,000 carbon atoms, more preferably a radical of 1 to 10,000 carbon atoms, in some preferred cases 1 to 50 carbon atoms, which is 0 to 10,000, more can preferably contain 1 to 1,000 heteroatoms, for example selected from O, P, N or S.
  • the hydrocarbon radicals can be linear or branched and can be saturated or mono- or polyunsaturated.
  • a hydrocarbon residue can also contain cyclic or aromatic sections.
  • hydrocarbon radicals are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, cycloalkenyl, alkynyl, cycloalkynyl, aroyl and heteroaroyl.
  • a hydrocarbon radical, as used herein, can also contain functional groups and in particular a targeting agent and for example an aminocarboxylic acid ester, for example a saturated or unsaturated omega-aminocarboxylic acid ester, a dye, a fluorescent label, an antibiotic, a minor or major groove binder Biotinyl residue, a streptavidin residue, an intercalating residue, an alkylating residue, a steroid, a lipid, a polyamine, folic acid, a receptor agonist or antagonist, an enzyme inhibitor, a peptide, an antibody or an antibody fragment, an amino sugar, a saccharide or oligosaccharide, eg Galactose, glucose or mannose, an antisense polymer, a modified surface, a sur
  • At least one of the residues V, W, X or / and Z comprises a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer.
  • a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer.
  • a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer.
  • the invention it is also possible to provide molecules which contain two or more targeting groups. This enables an increased targeting effect to be achieved and / or the compound or a conjugate formed therewith to be directed to a number of desired locations.
  • the compounds according to the invention can also contain reporter groups, for example fluorescent dyes or fluorescent markers, which enables use for diagnostic purposes.
  • the radical X in the compounds according to the invention is preferably a targeting group, a radical of the formula (II) or a combination of both.
  • x 2, 3 or 4 is particularly preferred.
  • Particularly preferred subunits in the radical X are ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol or combinations thereof with a chain length of 3 to 500, in particular 4 to 100, units.
  • R 1 in the radical X is particularly preferably methoxy or ethoxy, in particular methoxy. Most preferably X is methoxypolyethylene glycol with 1 to 1000, especially 4 to 50 ethylene units.
  • radical X contains a targeting grouping, as indicated above.
  • the shielding function by the formula (II) and the targeting function are present in a radical X.
  • Such a radical X preferably has the formula (IIb)
  • the radical Z which originates from the isonitrile (Z-NC) in the preparation of the compounds according to the invention by means of the Ugi reaction, is preferably a C 1 -C 6 -alkyl radical or a radical which contains one, two or more groups of the formula (II) as well as a targeting function if necessary.
  • Z is particularly preferably a grouping of the formula (Xa), (Xb) or (Xc)
  • P on each occurrence independently represents H, OH, C 1 -C 4 alkyl, OR 2 or CO-R 3 (wherein R 2 and R 3 are as defined above),
  • R 1 is H, OH or a hydrocarbon radical having 1 to 50 carbon atoms , which can contain heteroatoms and is preferably a C 1 -C 4 alkoxy radical
  • a represents an integer from 0 to 50, in particular 1 to 3, in each occurrence, b an integer from 0 to 50, in particular 1 in each occurrence to 3
  • c is an integer from 1 to 10, especially 2 to 4 in each occurrence
  • d is independently an integer from 1 to 1,000, in particular 5 to 100 in each occurrence.
  • the radicals W which originate from the carbonyl compound in the preparation of the compounds according to the invention by a Ugi reaction, are each preferably independently hydrogen or a CC 6 hydrocarbon radical, in particular a C r C 4 alkyl radical and most preferably hydrogen, methyl or ethyl.
  • the use of symmetrical ketones prevents the formation of a center of symmetry on the carbon atom to which the radicals W are bound are prevented. As a result, there are no problems associated with chiral compounds in the formation of conjugates with active substances.
  • W is particularly preferably hydrogen on each occurrence.
  • the radical W is introduced by using an aldehyde as the starting material in the Ugi reaction.
  • one of the radicals W is hydrogen
  • the other radical W is preferably a C r C 6 hydrocarbon and in particular a C 1 -C 4 alkyl radical.
  • one of the radicals W can contain a group of the formula (II), a linker and / or a targeting group.
  • the radical V comes from the carboxylic acid compound in the preparation of the compounds according to the invention by means of the Ugi reaction.
  • the grouping V preferably contains a linker or a binding group Y for coupling the compounds according to the invention to further molecules, in particular to biotechnological, pharmaceutical or synthetic active substances.
  • the radical V can contain, in addition to the binding group, a linker group, preferably a C 1 -C 8 alkylene group or a glycol group, for example a tetraethylene glycol group.
  • the compounds of the formula (I) preferably have one to three, more preferably two to three, groups of the formula (II), namely one group in the radical X and one or two groups in the radical Z.
  • polyfunctional starting materials are used.
  • at least one of the starting materials of the Ugi reaction is used in polyfunctional form, that is to say in difunctional, trifunctional or higher functional form.
  • at least one bifunctional starting material that is to say a dicarboxylic acid, a diamine, a diisonitrile or / and a dialdehyde or diketone, and preferably at least one dicarboxylic acid or / and a diamine.
  • Compounds of the formula (III) can be prepared by a process based on a Ugi-4-component reaction in which a carbonyl, amino, isonitrile and acid component are involved. These components can optionally be reacted with one another at the same time and contain protective groups which are later removed or remain in the molecule.
  • the acid component in formula (purple) here is a 1, 1, 2-ethanetricarboxylic acid which additionally bears a linker group at the 1 position.
  • the carbonyl component used to prepare compounds of formula (purple) is preferably formaldehyde or a symmetrical carbonyl compound, e.g. Acetone or cyclohexanone. This prevents the formation of mixtures of diastereoisomers.
  • asymmetrical aldehydes e.g. Isobutyraldehyde, or ketones can be used.
  • the linker T is preferably represented by an alkyl chain which is branched or unbranched, saturated or unsaturated, and can contain heteroatoms, in particular N, S and O, for example between the branching and T.
  • T preferably has a carbon atom or a nitrogen atom as Link to the branch point in the compounds of formula (III) or (purple).
  • T is more preferably an alkyl chain of structure 1.
  • n is an integer from 1 to 10, but preferably an integer from 1 to 5.
  • the linker has the structure T ' ⁇
  • the present invention helps to reduce the disadvantages or limitations described in the prior art. It encompasses the synthesis of bifunctional compounds which can be used to modify natural products, technical products, biotechnological and synthetic products or pharmaceutical active ingredients.
  • the compounds according to the invention contain an activated linker group which forms a covalent bond with one or more amino functionalities or other functional groups of a biotechnological or synthetic product as part of a chemical reaction under mild reaction conditions and at least one polymer function which influence the biochemical and pharmacological properties of the conjugate.
  • the connections contain further functions, such as e.g. Targeting functions.
  • the present invention preferably provides a multi-branched structure, as well as its synthesis and application for the modification of biotechnological products.
  • the structure can be produced using a multi-component reaction, for example the Ugi reaction (Ugi, I. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 3168-3210; EP 1104677).
  • Ugi reaction Ugi, I. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 3168-3210; EP 1104677.
  • the use of the multi-component reaction enables one combinatorial approach as well as the automation of manufacturing.
  • the present invention preferably provides an unbranched or branched polymer compound that carries only a single activated linker group, thereby avoiding cross-linking reactions.
  • This polymer compound is hydrophilic and biologically compatible. It is easy to manufacture and opens up a wide range of applications for the modification of active pharmaceutical ingredients and technically used products. Conjugates of the polymer compound according to the invention with active pharmaceutical ingredients enable an improvement in the therapeutic use. Furthermore, these conjugates make it possible to reduce the amount of active ingredient to be administered, for example for the treatment of cancer and infectious diseases, when the duration of action is prolonged.
  • the invention further relates to a process for the preparation of the compounds according to the invention, the individual components of the formulas being used in a multicomponent reaction
  • V, W ⁇ X 'and Z' each independently represent a hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms or / and V, W or / and X 'represent hydrogen, at least one of the radicals V, W, X' and Z 'carries a binding group Y and the radicals V, W, X' and Z ' together at least one, in particular at least two, groups of the formula (II)
  • P independently represents H, OH, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence
  • R. H or a hydrocarbon radical having 1 to 50 carbon atoms, which can contain heteroatoms, in particular O, N, S, P or / and Si,
  • R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 carbon atoms with each occurrence
  • R 3 is OH or NR 4 R 5 ,
  • R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O, N, S or / and P, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n each independently occurring is an integer from 1 to 1000 and x is an integer from 1 to 10 each occurrence and y is an integer from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 each occurrence.
  • radicals X ', W, Z and V no longer have any further functionality which is reactive for the multicomponent reaction (ie NH 2 , CO, NC or COOH)
  • educts are 1, 1, 2-ethanetricarboxylic acid with three carboxylic acid residues, ie two carboxylic acid groups in residue V, or residues which contain at least two different functional groups, such as lysine (contains an acid group and an amine group at the same time) or ⁇ - aminobutyric acid.
  • the corresponding groupings V, W, X and Z in the product, starting from the functional group in the remainder V, W, X 'and Z' are only built up during the multicomponent reaction. In this way it is possible to build up highly branched and highly functional compounds in a one-pot reaction, in particular compounds which contain a large number of groupings of the formula (II).
  • h, i are independently 0 or 1 with each occurrence, g and f are independently with each occurrence an integer between 0 and 10, preferably between 0 and 5,
  • A stands for H or - (CO) -NX 2 at each occurrence and
  • XX 2 , X 3 and X 4 and X each independently have the meanings given for X above.
  • achiral molecules can be prepared according to the invention which contain up to 6 (in the case of dicarboxylic acids) or up to 9 (in the case of tricarboxylic acids) groups of the formula ( II) have. Since the coupling of amines to di- or tricarboxylic acids, which are not amino acids, takes place according to the invention, the coupling can be carried out in a simple manner, without the need for a complex synthesis process using protective groups.
  • conjugates of the bifunctional, branched polymer compound with biologically active substances such as proteins (for example human growth factors), enzymes, co-factors for enzymes (for example NAD + / NADH), liposomes, antibodies, synthetic, small active substances, phosphoiipids , Lipids, nucleosides, oligonucleotides, microorganisms, human cells and surfaces.
  • biologically active substances such as proteins (for example human growth factors), enzymes, co-factors for enzymes (for example NAD + / NADH), liposomes, antibodies, synthetic, small active substances, phosphoiipids , Lipids, nucleosides, oligonucleotides, microorganisms, human cells and surfaces.
  • the invention therefore also relates to conjugates comprising compounds of the formula (I) in a covalent linkage to other molecules, in particular to active substances, such as biopharmaceuticals or synthetic active substances, or biotechnological substances which are used in the field of life science, for example in the field of proteomics Such substances are, for example, enzymes, in particular proteases, such as trypsin or chymotrypsin.
  • active substances such as biopharmaceuticals or synthetic active substances, or biotechnological substances which are used in the field of life science, for example in the field of proteomics
  • Such substances are, for example, enzymes, in particular proteases, such as trypsin or chymotrypsin.
  • the compounds linked to the compounds according to the invention in the conjugates are preferably biopharmaceuticals, peptide active substances or other biologically active substances. Conjugates with surfaces or biocatalysts can also be formed ,
  • the invention further relates to conjugates comprising compounds of the formula (I) in covalent linkage to medical devices or auxiliaries Presentation of active ingredients.
  • tissues for heterografts such as heart valves, for example, can be made more tolerable for the recipient.
  • auxiliary agents for the administration of active substances for example liposomes or nanocapsules, can be modified in order to impart desired properties, in particular a longer half-life in the body.
  • the invention further relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the compounds according to the invention and in particular the conjugates according to the invention.
  • Compositions can be used, for example, for the prevention or treatment of cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases, neuronal or cerebral diseases or inflammatory processes such as infections, immune diseases or autoimmune diseases (e.g. rheumatoid arthritis).
  • the compounds or conjugates according to the invention are also outstandingly suitable as diagnostic agents.
  • kits which comprises all the reagents and instructions as well as the compounds according to the invention which make it possible to obtain a Modification of proteins, nucleic acids or other active substances or even surfaces with polymers can be carried out in vitro in a simple manner.
  • the reaction of a substance with the compounds according to the invention takes place, for example, in such a way that, to a solution or a suspension of the substance to be modified, for example a protein, in aqueous buffer the polymer compound according to the invention is at least in molar amount based on the number of modifiable reactive groups, for example amino groups (Lysine residues, histidine, N-terminus), carboxyl groups (aspartic acid, glutamic acid, C-terminus), thiol groups (cysteine), hydroxyl groups (serine, threonine, tyrosine) or carbonyl groups (aldehydes).
  • the polymer compounds according to the invention are preferably used in a molar excess of 1 to 1000, more preferably in a molar excess of 1 to 100 and particularly preferably in a molar excess of 1 to 20, based on the modifiable groups.
  • Suitable reaction solutions are aqueous buffers such as 0.001 to 1.0 molar solutions of sodium or potassium dihydrogen phosphate with disodium or dipotassium hydrogen phosphate or sodium, potassium or ammonium hydrogen carbonate with disodium, disodium or diammonium carbonate or Tris ( hydroxymethyl) aminoethane with hydrochloric acid, buffer solutions are preferably suitable for the pH range between pH 4 and pH 10, particularly preferably between pH 5 and pH 9.
  • the cosolvents methanol, ethanol, propanol, i-propanol, butanol, ethyl acetate, methyl acetate, dimethylformamide, acetonitrile, dimethyl sulfoxide or sulfolane can be added to the buffer in amounts of 0.1 to 50% by volume, more preferably 0.1 to 20 vol% are added, depending on the solubility of the reactants.
  • the reaction temperature is between 0 ° C and 90 ° C, preferably 4 ° C to 40 ° C.
  • stabilizers or detergents can be added to the buffers, for example sodium azide, glycerol, ethylene glycols or ionic or non-ionic detergents.
  • the conjugate crude products obtainable by the process according to the invention can furthermore be purified by dialysis, chromatographic processes or ultrafiltration (including those for centrifuges) with aqueous buffer solutions or pure water and by processes familiar to the person skilled in the art and then used for further use.
  • the structural evidence of the products (conjugates), i.e. the analytical number of covalently bound polymer compounds according to the invention is carried out by direct measurement of the molecular weight, e.g. by means of MALDI-TOF mass spectrometry, by selective determination of one or more covalently bound components or by indirect detection of the unmodified groups.
  • a dye molecule introduced via the compound according to the invention can be determined in a simple manner by measuring the absorbance (UV ⁇ IS).
  • the number of unmodified amino groups for example, can be determined fluorometrically by reaction with fluorescamine.
  • the stability of the conjugate towards proteases can be investigated, for example, as direct evidence of the improvement in the properties of the conjugate from a polymer compound according to the invention.
  • Figure 1 Analysis of conjugates from L-asparaginase and substance 16 using SDS-PAGE.
  • the samples are: lanes 1) and 9) protein standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) L-asparaginase (control, 2 ⁇ g), lane 3) modified L-asparaginase (0.5eq. Substance 16), Lane 4) modified L-asparaginase (1eq. Substance 16), lane 5) modified L-asparaginase (2eq. Substance 16), lane 6) modified L-asparaginase (5eq. Substance 16), lane 7) modified L-asparaginase ( 10eq. Substance 16) and lane 8) modified L-asparaginase (20eq. Substance 16).
  • Figure 2 Protease stability of a conjugate of L-asparaginase and substance 16: Influence of the modification of L-asparaginase with substance 16 on the Stability of L-asparaginase against trypsin derived from residual activity. Modification with substance 16 significantly increases the stability towards trypsin.
  • Figure 3 Influence of the modification of L-asparaginase with substance 16 on the stability of L-asparaginase against chymotrypsin derived from the residual activity. Modification with substance 16 significantly increases the stability towards chymotrypsin.
  • Figure 4 Analysis of conjugates from streptokinase and substance 16 using SDS-PAGE.
  • the samples are: lanes 1) and 8) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) streptokinase (control, 2 ⁇ g), lane 3) modified streptokinase (0.5eq. Substance 16), lane 4) Streptokinase (1eq. Substance 16), lane 5) modified streptokinase (2eq. Substance 16), lane 6) modified streptokinase (5eq. Substance 16) and lane 7) modified streptokinase (10eq. Substance 16).
  • Figure 5 Analysis of conjugates from trypsin and substance 16 using SDS-PAGE.
  • the samples are: lanes 1), 2) and 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) trypsin (control, 2 ⁇ g), lane 3) modified trypsin (0.5eq. Substance 16), lane 4) modified trypsin (1eq. Substance 16), lane 5) modified trypsin (2eq. Substance 16), lane 6) modified trypsin (5eq. Substance 16) and lane 7) modified trypsin (10eq. Substance 16).
  • an amino component, an oxo or carbonyl component, an isocyanine component and an acid component are reacted to the compound according to the invention.
  • the primary amines used are commercially available or, starting from the monomethoxypolyethylene glycols, can be prepared by a Gabriel synthesis or from the corresponding azido compound by catalytic hydrogenation.
  • Secondary amines, symmetrical or asymmetrical, are obtainable from a primary amine by reductive amination with a corresponding aldehyde, which is obtained, for example, by Swern oxidation from monomethoxypolyethylene glycol, or can be obtained by simple substitution reactions.
  • Isonitriles are commercially available on a large scale. A large number of synthetic methods are also available for their production. A very reliable method is the preparation of isonitriles from primary amines via the conversion to formamide with subsequent dehydration using phosgene or POCI 3 (I. Ugi; R. Meyr, Angew. Chem. 1958, 70, 702). Alternatively, isonitriles can be obtained in a simple manner by reacting a primary or secondary amine with a methyl or ethyl ⁇ -isocyanocarboxylic acid ester.
  • aldehydes or ketones can be used as the oxo or carbonyl component.
  • symmetrical ketones such as acetone, and the simple formaldehyde are preferably used.
  • the acid component also serves as a linker for later coupling to the active substance, so that carboxylic acids are preferably used, which can be converted into an activated form of the compound according to the invention by a few synthetic steps after a successful multi-component reaction.
  • carboxylic acids are preferably used, which can be converted into an activated form of the compound according to the invention by a few synthetic steps after a successful multi-component reaction.
  • These can be monoesters of dicarboxylic acids (e.g. succinic acid mono-tert-butyl ester) or unsaturated monocarboxylic acids (e.g. 4-pentenecarboxylic acid).
  • N-substituted amino acids e.g. N-Boc-L-glutamic acid, N-Boc-L-aspartic acid
  • more highly branched carboxylic acids e.g. tricarboxylic acid 7
  • the main step in the synthesis of the compounds according to the invention takes place by a multicomponent reaction, the Ugi reaction with three (U-3CR) or four (U-4CR) components in the liquid phase being preferred.
  • U-3CR three
  • U-4CR four
  • the amine component is reacted in the liquid phase with the oxo component, the acid component and an isocyano component according to the following general formula:
  • azomethine it is advantageous to use one equivalent each of the individual components in the implementation. It may also be advantageous to form the azomethine by precondensation.
  • Aprotic, polar and non-polar, and protic, polar can be used as solvents.
  • Alcohols such as methanol, ethanol, water or water / alcohol mixtures and DMF or are particularly suitable as protic solvents for this Acetonitrile.
  • aprotic solvents dichloromethane, tetrahydrofuran or chloroform are often used.
  • Lewis acids such as boron trifluoride etherate or zinc chloride, have a beneficial effect on the Ugi reaction. The reactions are usually carried out at from -20 ° C. to 100 ° C., but reaction temperatures between 0 ° C. and 50 ° C. are preferred.
  • acid components which simultaneously serve as a protective group for the amino functionality.
  • Such protective groups can then be removed so that the secondary amine formed can also be coupled to carboxylic acids later using generally known methods from peptide chemistry.
  • examples for such acids are trifluoroacetic acid or 4-pentenecarboxylic acid.
  • the acid component In some cases it can be advantageous to replace the acid component with an acid that does not react in the sense of the Ugi reaction.
  • acids used are mineral acids, such as hydrochloric or sulfuric acid, sulfonic acids and Lewis acids, such as boron trifluoride etherate or INCI 3 .
  • water takes on the function of the acid component, forming a secondary amine.
  • This secondary amine can then be coupled to branched or unbranched carboxylic acid functionalities by various amidation methods which are already known from peptide chemistry.
  • the amine component with the oxo component, the acid component (eg sulfuric acid) and an isocyanocomponent are in the liquid phase reacted according to the following general formula:
  • azomethine it is advantageous to use one equivalent each of the individual components in the implementation. It may also be advantageous to form the azomethine by precondensation.
  • Aprotic, polar and non-polar, and protic, polar can be used as solvents.
  • Alcohols such as methanol, ethanol, water or water / alcohol mixtures and DMF or acetonitrile are particularly suitable as protic solvents for this.
  • aprotic solvents dichloromethane, tetrahydrofuran or chloroform are often used. The reactions are usually carried out at from -20 ° C. to 100 ° C., but reaction temperatures between 0 ° C. and 50 ° C. are preferred.
  • the tert-butyl ester is cleaved under standard conditions e.g. with mineral acids such as HCI or HCI in dioxane. Alternatively, trifluoroacetic acid can also be used.
  • Bovine serum albumin (short: BSA, Sigma), L-asparaginase (short: ASNase, ProThera), streptokinase (Sigma), trypsin (Sigma) and chymotrypsin (Sigma) were used for the experiments.
  • L-asparaginase catalyzes the deamidation of L-asparagine to L-aspartic acid. Ammonium released during this reaction was quantified by means of a Nessler reagent to determine the enzyme activity. Streptokinase activates plasminogen. Plasminogen activated in this way catalyzes the hydrolysis of the tripeptide derivative D-Val-Leu-Lys-para-nitroanilide (S-2251). For indirect determination of the activity of streptokinase, the amount of nitroaniline released was quantified photometrically at 405nm. The peptidolytic activity of trypsin was determined using the para-nitroanilide derivative ⁇ -benzoyl-arginine-para-nitroanilide by quantification of the released nitroaniline photometrically at 405nm.
  • the conjugates comprising a compound according to the invention covalently coupled to one biopharmaceutical, pharmaceutical or synthetic active ingredient were incubated in the presence of trypsin or chymotrypsin for at least 90min at 37 ° C. Aliquots were taken at various times and the residual activity of the conjugate to be examined was determined from these. Trypsin cleaves peptides and proteins preferably at the C-terminal of basic amino acids (lysine and arginine residues), chymotrypsin preferably at the C-terminal of aromatic amino acids (tryptophan, phenylalanine and tyrosine residues).
  • Substance 16 (0.5eq. / 0.7 ⁇ L, 1eq./1, 4 ⁇ L, 2eq.) was added to 75 ⁇ L of an L-asparaginase solution (0.5 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) ./2.7 ⁇ L, 5eq./6.8 ⁇ L, 10eq./13.7 ⁇ L or 20eq./27.3 ⁇ L) dissolved in dimethyl sulfoxide (10mg / mL) and with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9, 5) filled up to a total volume of 150 ⁇ L.
  • the reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
  • the modification reduces the activity of the L-asparaginase only slightly. With a degree of PEGylation from 41% to 75% residual activity, with a degree of PEGylation from 43% to 60% residual activity (see Table 1)
  • Streptokinase is modified to 100% of the lysine residues when 10 equivalents of substance 16 are used (see Table 2)
  • Substance 16 (0.5eq. / 1, 5 ⁇ L, 1eq./2.7 ⁇ L, 2eq./ to 120 ⁇ L of a tr ⁇ psin solution (1.0 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5)) 5.4 ⁇ L, 5eq. I3.8 ⁇ L or 10eq./27.3 ⁇ L) dissolved in dimethyl sulfoxide (10mg / mL) and filled with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) to a total volume of 150 ⁇ L.
  • the reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
  • Trypsin is modified with 10 equivalents of substance 16 to 44% of the lysine residues.
  • the residual activity increases to 137%.
  • the increase in activity by modification with reagents containing polyethylene glycol is explained in the literature by a change in the microenvironment of the active center (Zhang, Z., He, Z. & Guan, G. (1999) in Biotechnology Techniques 13: 781-786).
  • R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, d, n independently on each occurrence an integer of 1 up to 1000, c, x independently each time an integer from 1 to 10 and a, b, p, y independently an integer from 0 to 50 and q independently each time 0 or 1.

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Abstract

The invention relates to compounds that are suitable to be coupled to pharmaceuticals, especially biopharmaceuticals, and to conjugates on the basis of said compounds with biomolecules or pharmaceutically active agents. The inventive compounds can be produced in a simple manner by multicomponent reactions. Another object of the invention is the use of the conjugates as improved formulation of pharmaceuticals and the production thereof. The invention further relates to a laboratory kit for the in vitro production of conjugates on the basis of the inventive compounds and pharmaceuticals and to biotechnological substances, especially biopharmaceuticals, to pharmaceutically active agents, synthetic molecules or surfaces.

Description

Reagenzien zur Modifikation von Biopharmazeutika, deren Herstellung und Anwendung Reagents for modifying biopharmaceuticals, their manufacture and use
Beschreibungdescription
Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen, welche zur Kopplung an Pharmazeutika, insbesondere Biopharmazeutika geeignet sind, sowie Konjugate aus den Verbindungen mit Biomolekülen oder pharmazeutischen Wirkstoffen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf einfache Weise durch Mehrkomponentenreaktionen gebildet werden. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der Konjugate als verbesserte Formulierung von Pharmazeutika sowie deren Herstellung. Ferner stellt die Erfindung einen Labor Kit zur in vitro Herstellung von Konjugaten aus den erfindungsgemäßen Verbindungen und Pharmazeutika sowie biotechnologischen Substanzen, insbesondere Biopharmazeutika, pharmazeutischen Wirkstoffen, synthetischen Molekülen oder Oberflächen zur Verfügung.The present invention relates to compounds which are suitable for coupling to pharmaceuticals, in particular biopharmaceuticals, and to conjugates from the compounds with biomolecules or pharmaceutical active substances. The compounds of the invention can be easily formed by multi-component reactions. Another object of the invention is the use of the conjugates as an improved formulation of pharmaceuticals and their preparation. The invention also provides a laboratory kit for the in vitro production of conjugates from the compounds and pharmaceuticals according to the invention and biotechnological substances, in particular biopharmaceuticals, pharmaceutical active ingredients, synthetic molecules or surfaces.
Die Entwicklung von Biopharmazeutika als Arzneistoffe oder für potentielle Arzneistoffe sowie biotechnologischer Produkte für die Anwendung im Bereich Proteomics oder technischen Bereich machte in den vergangenen Jahrzehnten sprunghafte Fortschritte, die durch mehrere Faktoren entscheidend beeinflusst wurden: a) verbesserte Isolierungs- und Reinigungstechniken, b) die revolutionären Entwicklungen in der Gentechnologie und damit verbunden die Möglichkeit zur Herstellung rekombinanter Proteine, c) das bessere Verständnis der Biochemie sowie derThe development of biopharmaceuticals as drugs or for potential drugs as well as biotechnological products for use in the proteomics or technical field has made leaps and bounds in recent decades, which have been decisively influenced by several factors: a) improved insulation and cleaning techniques, b) the revolutionary ones Developments in genetic engineering and the associated possibility of producing recombinant proteins, c) a better understanding of biochemistry and the
Wirkmechanismen von Biophamazeutika und d) die Erschließung neuer Anwendungsgebiete und Methoden für biotechnologische Produkte.Mechanisms of action of biopharmaceuticals and d) the development of new areas of application and methods for biotechnological products.
Die Effektivität und die Dauer der Wirkung eines Wirkstoffs werden durch sein pharmakologisches Profil bestimmt. Besonders bei Biopharmazeutika wird sehr oft in vivo ein schneller Wirkungsverlust beobachtet, was allgemein als „clearance" bezeichnet wird. Die clearance erfolgt durch Prozesse wie Verstoffwechselung bzw. Metabolisierung, renale Ausscheidung und durch die Reaktion des Immunsystems auf die körperfremde Verbindung. Gerade proteinogene Wirkstoffe, eine wichtige Gruppe von Biopharmazeutika, rufen bei deren therapeutischem Einsatz eine starke Immunantwort: hervor, die bis zum allergischen Schock führen kann. Solche nachteiligen Effekte verhindern in vielen Fällen den kommerziellen bzw. therapeutischen Einsatz dieser sonst sehr vorteilhaften Wirkstoffklasse.The effectiveness and the duration of action of an active ingredient are determined by its pharmacological profile. Particularly in the case of biopharmaceuticals, a rapid loss of activity is very often observed in vivo, which is generally referred to as "clearance". The clearance takes place through processes such as metabolism or metabolism, renal excretion and through the response of the immune system to the foreign connection. Proteinogenic substances in particular, an important group of biopharmaceuticals, produce a strong immune response when used therapeutically: this can lead to an allergic shock. In many cases, such adverse effects prevent the commercial or therapeutic use of this otherwise very advantageous class of active ingredient.
Wissenschaftler beschäftigen sich seit vielen Jahren damit, Strategien zu entwickeln, den therapeutischen Einsatz von Biopharmazeutika dennoch zu ermöglichen. Eine der ersten Methoden war die Änderung der Oberflächenladung durch Umsetzung von Proteinen mit Bernsteinsäureanhydrid. Diese Modifikation wird als Succinylierung bezeichnet (Habeeb, A.F.S.A. Arch. Biochem. Biophys. 1968, 121, 652). Eine kovalente Bindung einer biologisch aktiven Verbindung an verschiedenste Polymere stellt eine der erfolgreichsten Strategien der letzten Jahre dar und wurde zu einer der wichtigsten Methoden zur Verbesserung der pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften von biopharmazeutischen Wirkstoffen. Eines der am häufigsten verwendeten Polymere ist hierbei das Polyalkylenoxid Polyethylenglykol, kurz PEG genannt.Scientists have spent many years developing strategies to enable the therapeutic use of biopharmaceuticals. One of the first methods was to change the surface charge by reacting proteins with succinic anhydride. This modification is called succinylation (Habeeb, A.F.S.A. Arch. Biochem. Biophys. 1968, 121, 652). Covalent binding of a biologically active compound to a wide variety of polymers is one of the most successful strategies in recent years and has become one of the most important methods for improving the pharmacological and toxicological properties of biopharmaceutical active substances. One of the most frequently used polymers here is the polyalkylene oxide, polyethylene glycol, or PEG for short.
Abuchowski, einer der Pioniere auf dem Gebiet der polymervermittelten Darreichung von Biopharmazeutika, konnte zeigen, dass eine kovalente Kopplung von Polyethylenglykolketten an ein Polypeptidmolekül einen positiven pharmakologischen Effekt bei diesem Wirkstoff erzeugt. Ein solches Konjugat zeichnet sich durch eine verminderte Immunogenität und eine verlängerte Halbwertszeit im Blut aus (US-Patent Nr. 4 179 337, Davis et al.; Abuchowski & Davis „Enzymes as Drugs", Holcenberg & Roberts, Hrsg. John Wiley & Sons, N.Y. 1981 , 367-383). Ferner hat die Modifikation biotechnologischer Produkte, wie z.B. Enzyme, häufig Einfluss auf weitere biochemische Parameter, z.B. auf deren pH- und Thermostabilität. Eine Modifikation kann deshalb z.B. für technische Enzyme zum Einsatz in Waschmitteln aufgrund einer erhöhten Thermostabilität oder für Biopharmazeutika im Hinblick auf eine orale Verabreichung aufgrund einer erhöhten pH-Stabilität vorteilhaft sein.Abuchowski, one of the pioneers in the field of polymer-mediated delivery of biopharmaceuticals, was able to show that covalent coupling of polyethylene glycol chains to a polypeptide molecule produces a positive pharmacological effect with this active ingredient. Such a conjugate is characterized by reduced immunogenicity and an extended half-life in the blood (US Pat. No. 4,179,337, Davis et al .; Abuchowski & Davis "Enzymes as Drugs", Holcenberg & Roberts, ed. John Wiley & Sons , NY 1981, 367-383) In addition, the modification of biotechnological products, such as enzymes, often has an influence on other biochemical parameters, for example on their pH and thermal stability, and a modification can therefore be made, for example, for technical enzymes for use in detergents due to an increased Thermostability or for biopharmaceuticals may be advantageous in terms of oral administration due to increased pH stability.
Die oben beschriebenen Arbeiten beschleunigten massiv die Forschung auf dem Gebiet der Konjugation von Wirkstoffen mit dem Polymer Polyethylenglykol. Die Modifikation mit Polyethylenglykol bietet auch bei herkömmlichen kleinen Wirkstoffen einige Vorteile. Die kovalente Bindung eines kleinen Wirkstoffs an das hydrophile Molekül Polyethylenglykol erhöht die Löslichkeit des Konjugates und kann außerdem die Toxizität verringern (Kratz, F. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7, 2517-2524). Die wichtigsten Übersichtsartikel zur Konjugation mit Polyethylenglykol sind im Folgenden benannt: Greenwald, R.B., J. of Controlled Release 2001 , 74, 159-171 ; Zaiipsky, S. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, 16, 157-182; Zaiipsky, S. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 150-165; N. K. Jain, N.K.; et al. Pharmazie 2002, 57, 5 - 29.The work described above massively accelerated research the field of conjugation of active ingredients with the polymer polyethylene glycol. Modification with polyethylene glycol also offers some advantages with conventional small active ingredients. The covalent binding of a small active substance to the hydrophilic molecule polyethylene glycol increases the solubility of the conjugate and can also reduce the toxicity (Kratz, F. et al. Bioorganic & Medicinal Chemistry 1999, 7, 2517-2524). The most important review articles on conjugation with polyethylene glycol are listed below: Greenwald, RB, J. of Controlled Release 2001, 74, 159-171; Zaiipsky, S. Advanced Drug Delivery Reviews, 1995, 16, 157-182; Zaiipsky, S. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 150-165; NK Jain, NK; et al. Pharmacy 2002, 57, 5-29.
Die chemische Reaktion zur Kopplung eines Polyethylenglykolmoleküls an ein Biopharmazeutikum erfordert die Aktivierung einer der beiden Komponenten, die zur Reaktion gebracht werden. Im Regelfall wird hierzu das PEG-Molekül mit einem Verbindungsmolekül, dem so genannten aktivierten Linker versehen. Zur Aktivierung steht die gesamte Breite der lange etablierten Peptidchemie zur Verfügung. Zur Modifikation von Aminofunktionalitäten, meist von Lysinresten als Baustein einer biologisch aktiven Verbindung, wird der Linker häufig in Form eines N- Hydroxysuccinimid Aktivesters aktiviert. Harris, J.M. et al. (US-Patent Nr. 5,672,662) entwickelte diese Methode für Propion- und Buttersäurelinker, während bei Zaiipsky, S. et al. (US-Patent Nr. 5,122,614) ein aktivierter Kohlensäureester zum Einsatz kommt. Die Reaktion eines Lysinrestes mit einem solchen aktivierten Linker führt zur Bildung einer Amid- bzw. Urethanbindung. Die Verknüpfung eines PEGs mit einem Biopharmazeutikum, PEGylierung genannt, führt in manchen Fällen zum Verlust der biologischen Aktivität. Ein Grund dafür kann der Verlust der positiven Ladung durch die Bildung einer Amidbindung am Lysinrest sein.The chemical reaction to couple a polyethylene glycol molecule to a biopharmaceutical requires the activation of one of the two components that are reacted. As a rule, the PEG molecule is provided with a connecting molecule, the so-called activated linker. The entire range of long-established peptide chemistry is available for activation. To modify amino functionalities, usually lysine residues as a building block of a biologically active compound, the linker is often activated in the form of an N-hydroxysuccinimide active ester. Harris, J.M. et al. (U.S. Patent No. 5,672,662) developed this method for propionic and butyric acid linkers, while Zaiipsky, S. et al. (U.S. Patent No. 5,122,614) an activated carbonic acid ester is used. The reaction of a lysine residue with such an activated linker leads to the formation of an amide or urethane bond. Linking a PEG to a biopharmaceutical called PEGylation sometimes leads to a loss of biological activity. One reason for this can be the loss of the positive charge due to the formation of an amide bond on the lysine residue.
Die reduktive Aminierung unter Verwendung von PEG-Aldehyden stellt eine gute Alternative zu der Verwendung von Aktivestern dar (Harris, J.M. US- Patent Nr. 5,252,714), weil diese Kopplungsmethode zur Bildung eines sekundären Amins unter Erhalt der positiven Ladung führt. Weitere Kopplungsmöglichkeiten bestehen in der Verwendung der Maleinimidmethode (Cysteinreste) und der direkten Verbindung ohne eine Linkergruppe beim Einsatz von Tresyl- oder Halogenverbindungen. Bei den am häufigsten verwendeten PEGs handelt es sich um lineare Monomethoxypolyethylenglykol-Ketten (m-PEGs). Diese linearen Ketten sind konformativ nicht eingeschränkt und können sich' je nach Umgebung frei drehen. Folglich ist die von den Ketten abgeschirmte Oberfläche des Biopharmazeutikums relativ gering. Um die Oberflächenabschirmung zu verbessern, werden verzweigte Modifizierungsreagenzien entwickelt, die mehrere PEG-Ketten in einem Molekül enthalten. Von dieser Substanzklasse gibt es nur wenig kommerzielle Beispiele. Ein bekanntes Beispiel dafür ist ein mit zwei m-PEG-Ketten versehnes, aktiviertes Lysin. Aufgrund der auch hier vorhanden freien Drehbarkeit der Bindungen, ist der Abschirmeffekt jedoch nur mäßig (Veronese, F.M. Bioconjugate Chem. 1995, 6, 62-69).Reductive amination using PEG aldehydes is a good alternative to using active esters (Harris, JM US Patent No. 5,252,714) because this coupling method leads to the formation of a secondary amine while maintaining the positive charge. Other coupling options are the use of the maleimide method (cysteine residues) and the direct connection without a linker group when using tresyl or halogen compounds. The most commonly used PEGs are linear monomethoxypolyethylene glycol chains (m-PEGs). These linear chains are not conformationally restricted and can 'freely rotate depending on the environment. As a result, the chain-shielded surface of the biopharmaceutical is relatively small. To improve surface shielding, branched modification reagents are developed that contain several PEG chains in one molecule. There are few commercial examples of this class of substance. A well-known example of this is an activated lysine provided with two m-PEG chains. Due to the fact that the bindings can also be freely rotated here, the shielding effect is only moderate (Veronese, FM Bioconjugate Chem. 1995, 6, 62-69).
Obwohl die PEGylierung schon sehr weit entwickelt ist, bleiben noch einige entscheidende Nachteile bestehen: a) die Modifikation von Biopharmazeutika führt in vielen Fällen zu einem dramatischen Abfall der biologischen Aktivität, b) Polymere, wie Polyethylenglykol, liegen aus Prozessgründen als komplexes Gemisch verschiedener Molekulargewichte vor, was als Polydispersität bezeichnet wird und häufig zu Problemen bei der Reproduzierbarkeit bzw. Qualität führt, c) in Abhängigkeit von der Qualität des m-PEGs und der Art der Aktivierung kommt es in einigen Fällen zu unerwünschten Quervernetzungsreaktionen, d) die Optimierung der Reaktionsbedingungen, die Abschätzung des pharmakologischen Effekts und die Wahl des richtigen Modifizierungsreagenzes sind schwierig und zeitaufwendig und e) die Modifizierung von Biopharmazeutika mit Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, ist bis heute Speziallabors vorbehalten.Although PEGylation is already very well developed, there are still some crucial disadvantages: a) the modification of biopharmaceuticals leads in many cases to a dramatic drop in biological activity, b) polymers, such as polyethylene glycol, are present as a complex mixture of different molecular weights for process reasons , which is referred to as polydispersity and often leads to problems with reproducibility or quality, c) depending on the quality of the m-PEG and the type of activation, undesired cross-linking reactions occur in some cases, d) optimization of the reaction conditions, the assessment of the pharmacological effect and the choice of the right modifying reagent are difficult and time-consuming and e) the modification of biopharmaceuticals with polymers, such as, for example Polyethylene glycol is still reserved for special laboratories.
Aufgrund der beschriebenen Defizite beim Stand der Technik gibt es einen großen Bedarf an Modifizierungsreagenzien mit neuen, variablen Eigenschaften, deren Anwendung zu entscheidenden Verbesserungen bei biotechnologischen sowie auch bei herkömmlichen, synthetischen Produkten führt. Ferner wäre es wünschenswert, diese Technologie auch Anwendern zugänglich zu machen, die nicht über eigene, spezielle Laborausstattungen verfügen bzw. keinen Zugriff auf Speziallabors haben.Because of the deficits described in the prior art, there is a great need for modification reagents with new, variable properties, the use of which leads to decisive improvements in biotechnological and also in conventional, synthetic products. It would also be desirable to make this technology accessible to users who do not have their own special laboratory equipment have or have no access to special laboratories.
Eine Aufgabe der Erfindung bestand deshalb darin, Verbindungen bereitzustellen, welche an Biopharmazeutika gebunden werden können und mit denen die Nachteile von Biopharmazeutika-Konjugaten des Standes der Technik zumindest teilweise überwunden werden können. Eine weitere Aufgabe bestand darin, einen Labor Kit zur Verfügung zu stellen, der es jedem geneigten Wissenschaftler ermöglicht, eine Substanz mit Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol, zu modifizieren.It was therefore an object of the invention to provide compounds which can be bound to biopharmaceuticals and with which the disadvantages of biopharmaceutical conjugates of the prior art can be at least partially overcome. Another task was to provide a laboratory kit that would allow any inclined scientist to add a substance with polymers such as e.g. Modify polyethylene glycol.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Bereitstellung von Verbindungen der Formel (la/b)This object is achieved according to the invention by providing compounds of the formula (Ia / b)
H o w oH o w o
-N - -N - -V-N - -N - -V
W X Formel (la)W X formula (la)
H O W oH O W o
-N- -o- -v-N- -o- -v
w Formel (Ib)w formula (Ib)
gelöst, wobei Verbindungen der Formel (la) mittels einer Ugi-Reaktion und der Formel (Ib) mittels einer Passerini-Reaktion hergestellt werden können und worin die Reste V, W, X und Z jeweils unabhängig voneinander einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher Heteroatome enthalten kann oder/und V, W, oder/und X Wasserstoff darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Reste V, W, X oder/und Z eine Bindegruppe Y trägt und dass die Reste V, W, X und Z zusammen mindestens eine Gruppe der Formel (II) Formel (II)solved, compounds of the formula (Ia) by means of a Ugi reaction and of the formula (Ib) by means of a Passerini reaction and in which the radicals V, W, X and Z each independently represent a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms or / and V, W, or / and X represent hydrogen, characterized in that at least one of the radicals V, W, X or / and Z bears a binding group Y and that the radicals V, W, X and Z together comprise at least one group of the formula (II) Formula (II)
aufweisen, worinhave wherein
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, C C4-Alkyl, O-R2 oder CO-R3 darstellt,P independently represents H, OH, CC 4 -alkyl, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence,
R., H, OH oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt, R3 OH oder NR4R5 ist,R., H, OH or a hydrocarbon radical with 1 to 50 carbon atoms, which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 C atoms with each occurrence, R 3 OH or Is NR 4 R 5 ,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n each time an occurrence independently an integer from 1 is to 1000 and x is an integer from 1 to 10 every occurrence and y is an integer from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 each occurrence.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen ein Grundgerüst auf, welches durch eine Mehrkomponentenreaktion, beispielsweise eine Ugi- oder eine Passerini-Reaktion bzw. durch eine stufenweise durchgeführte Ugi-Reaktion erhältlich ist. Bei einer stufenweise durchgeführten Ugi-Reaktion werden zunächst drei Komponenten miteinander umgesetzt (Amin-, Isonitril- und Carbonylkomponente) und an das Reaktionsprodukt dann die vierte Komponente (Säurekomponente) gekoppelt. Durch Verwendung einer solchen Mehrkomponentenreaktion ist es möglich, bei Auswahl geeigneter Ausgangsverbindungen gezielt funktioneile Gruppen auf einfache Weise in einem Molekül bereitzustellen. Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten als funktioneile Gruppe wenigstens eine Bindegruppe Y, welche eine kovalente Bindung der erfindungsgemäßen Verbindung an weitere Moleküle, insbesondere an biotechnologische, pharmazeutische oder synthetische Wirkstoffe, sowie an Oberflächen oder an Biokatalysatoren ermöglicht. Bei der Bindegruppe Y handelt es sich bevorzugt um eine Verbindung, welche mit einer in dem zu koppelnden Wirkstoff vorliegenden funktionellen Gruppe kovalent binden kann, beispielsweise um eine Bindegruppe, die mit einer Aminogruppe, einer Thiolgruppe, einer Carboxylgruppe, einer Guanidingruppe, einer Carbonylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Heterozyklus, insbesondere mit N als Heteroatom (z.B. in Histidinresten), einer C-nukleophilen Gruppe, einer C-elektrophilen Gruppe, einem Phosphat, einem Sulfat oder ähnlichem bindefähig ist. Möglich sind auch nicht kovalente Bindungen, z.B. Chelate, Komplexe mit Metallen, z.B. an Oberflächen oder mit Radioisotopen sowie Bindungen an Silicium-haltige Oberflächen. Geeignete Bindegruppen sind beispielsweise eine Carbonsäure oder eine aktivierte Carbonsäuregruppe.The compounds according to the invention have a basic structure which can be obtained by a multi-component reaction, for example a Ugi or a Passerini reaction or by a Ugi reaction carried out in stages. In a step-by-step Ugi reaction, first three components are reacted with one another (amine, isonitrile and carbonyl component) and then the fourth component (acid component) is coupled to the reaction product. By using such a multicomponent reaction, it is possible to provide functional groups in a molecule in a simple manner when selecting suitable starting compounds. As a functional group, the compounds according to the invention contain at least one binding group Y, which enables the compound according to the invention to be covalently bound to further molecules, in particular to biotechnological, pharmaceutical or synthetic active substances, and to surfaces or to biocatalysts. The binding group Y is preferably a Compound which can covalently bind with a functional group present in the active substance to be coupled, for example around a binding group which has an amino group, a thiol group, a carboxyl group, a guanidine group, a carbonyl group, a hydroxyl group, a heterocycle, in particular with N as a hetero atom (eg in histidine residues), a C-nucleophilic group, a C-electrophilic group, a phosphate, a sulfate or the like is capable of binding. Non-covalent bonds, for example chelates, complexes with metals, for example on surfaces or with radioisotopes, as well as bonds to silicon-containing surfaces are also possible. Suitable binding groups are, for example, a carboxylic acid or an activated carboxylic acid group.
Zur späteren Kopplung der Verbindung an ein biotechnologisches oder synthetisches Produkt sowie an Naturstoffe und technische Produkte enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen bevorzugt eine aktivierte Funktionalität Y. In der aktivierten Form ist Y bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus (O-alkyl)2, -OSO2CH2CF3 (Tresyl), (O-aryl)-Azide, -CO- Q, Maleimidyl, -O-CO-Nitrophenyl oder Trichlorphenyl, -S-S-Alkyl, -S-S-Aryl, -SO2-Alkenyl (Vinylsulfon), -Halogen (Cl, Br, I) besteht, wobei Q unabhängig aus einer Gruppe ausgewählt ist, die aus H, O-Aryl, O-Benzyl, O-N- Succinimid, O-N-Sulfosuccinimid, O-N-Phthalimid, O-N-Glutarimid, O-N- Tetrahydrophthalimid, N-Norbomene-2,3-dicarboximid, Hydroxybenzotriazole und Hydroxy-7-azabenzotriazole besteht. Bevorzugt handelt es sich bei Y um eine Gruppe -CO-Q. Eine gute Übersicht über mögliche Aktivierungen bietet der Review von Zaiipsky, S. erschienen in Bioconjugate Chem. 1995, 6, 150-165.For later coupling of the compound to a biotechnological or synthetic product and to natural products and technical products, the compounds according to the invention preferably contain an activated functionality Y. In the activated form, Y is preferably selected from the group consisting of (O-alkyl) 2 , -OSO 2 CH 2 CF 3 (tresyl), (O-aryl) azides, -CO-Q, maleimidyl, -O-CO-nitrophenyl or trichlorophenyl, -SS-alkyl, -SS-aryl, -SO 2 -alkenyl (vinyl sulfone ), -Halogen (Cl, Br, I), where Q is selected independently from a group consisting of H, O-aryl, O-benzyl, ON-succinimide, ON-sulfosuccinimide, ON-phthalimide, ON-glutarimide, ON- tetrahydrophthalimide, N-norbomene-2,3-dicarboximide, hydroxybenzotriazoles and hydroxy-7-azabenzotriazoles. Y is preferably a group -CO-Q. The review by Zaiipsky, S. published in Bioconjugate Chem. 1995, 6, 150-165 provides a good overview of possible activations.
Durch die Gruppe Y können die erfindungsgemäßen Verbindungen kovalent an Wirkstoffe gebunden werden und somit höchst wünschenswerte, stabile Konjugate bilden.Through group Y, the compounds according to the invention can be covalently bound to active substances and thus form highly desirable, stable conjugates.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen weiterhin mindestens eine Gruppe der Formel (II) auf. Bevorzugt weisen die Verbindungen mindestens zwei und noch mehr bevorzugt drei Gruppen der Formel (II) auf. Aufgrund der durch die Mehrkomponentenreaktion bereitgestellten Flexibilität ist es möglich, die Gruppen der Formel (II) an verschiedenen Positionen im Molekül einzufügen. So ist es möglich, Gruppen der Formel (II) in verschiedenen Resten V, W, X oder/und Z, insbesondere in X oder/und Z, einzuführen. Auf diese Weise ist es möglich, eine Verbindung bereitzustellen, welche mehrere und insbesondere eine große Anzahl an Gruppierungen der Formel (II) enthält, welche einem Konjugat aus Verbindung der Formel (I) und einem Wirkstoff insbesondere eine verminderte Immunogenität, eine verlängerte Halbwertszeit im Körper, eine höhere Proteolysestabilität, eine Erhöhung der Löslichkeit, eine Verringerung der Toxizität, eine verbesserte pH-Stabilität sowie eine erhöhte Thermostabilität verleihen.The compounds according to the invention furthermore have at least one group of the formula (II). The compounds preferably have at least two and more preferably three groups of the formula (II). Due to the flexibility provided by the multi-component reaction, it is possible to insert the groups of the formula (II) at different positions in the molecule. So it is possible to in groups of formula (II) various residues V, W, X or / and Z, in particular in X or / and Z, to be introduced. In this way it is possible to provide a compound which contains several and in particular a large number of groupings of the formula (II) which, in particular, a conjugate of the compound of the formula (I) and an active ingredient have a reduced immunogenicity, an extended half-life in the body , higher proteolysis stability, an increase in solubility, a reduction in toxicity, an improved pH stability and an increased thermostability.
Alternativ oder zusätzlich ist es auch möglich, in einem der Reste V, W, X oder/und Z, insbesondere X oder/und Z, mehrere Gruppen der Formel (II), bevorzugt zwei Gruppen der Formel (II) einzufügen.Alternatively or additionally, it is also possible to insert several groups of the formula (II), preferably two groups of the formula (II), into one of the radicals V, W, X or / and Z, in particular X or / and Z.
Insbesondere ist es erfindungsgemäß möglich, eine gute Abschirmung durch eine oder mehrere kurzkettige Gruppen der Formel (II) zu erreichen, wobei kurzkettige Gruppen der Formel (II) mit gleicher Kettenlänge mit guter Reproduzierbarkeit erhalten und eingeführt werden können. Alternativ ist es auch möglich, gleichzeitig Gruppen der Formel (II) mit unterschiedlichen Kettenlängen einzuführen. Ferner ist es auch möglich, polydisperse Gruppierungen der Formel (II) einzusetzen.In particular, it is possible according to the invention to achieve good shielding by one or more short-chain groups of the formula (II), it being possible for short-chain groups of the formula (II) with the same chain length to be obtained and introduced with good reproducibility. Alternatively, it is also possible to simultaneously introduce groups of the formula (II) with different chain lengths. It is also possible to use polydisperse groups of the formula (II).
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass eine gute Abschirmung von an erfindungsgemäße Verbindungen gekoppelten Wirkstoffen bereits erreicht werden kann, wenn die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel (I) ein Molekulargewicht von 200 bis 50.000 Da, insbesondere 1.000 bis 20.000 Da aufweist. Ferner wurde festgestellt, dass erfindungsgemäße Verbindungen der Formel (I), die mehr als eine Kette der Formel (II) enthalten, bereits bei geringeren Molekulargewichten der gesamten Verbindung eine gute Abschirmung bewirken. Bei Verbindungen, welche zwei bis drei Gruppierungen der Formel (II) aufweisen, ist bereits ein Molekulargewicht der gesamten Verbindungen von 500 bis 25.000 Da, insbesondere von 500 bis 10.000 Da ausreichend. Verbindungen welche vier oder fünf Gruppierungen der Formel (II) aufweisen, weisen bevorzugt ein Molekulargewicht von 200 bis 12.500 Da, insbesondere von 500 bis 7.500 Da auf. Bei Verbindungen, welche sechs oder mehr Gruppierungen der Formel (II) enthalten, beträgt das Molekulargewicht besonders bevorzugt < 7.500 Da und noch mehr bevorzugt < 5000 Da.According to the invention, it was found that good shielding of active compounds coupled to compounds according to the invention can already be achieved if the compounds of the formula (I) according to the invention have a molecular weight of 200 to 50,000 Da, in particular 1,000 to 20,000 Da. It has furthermore been found that compounds of the formula (I) according to the invention which contain more than one chain of the formula (II) provide good shielding even at lower molecular weights of the entire compound. In the case of compounds which have two to three groupings of the formula (II), a molecular weight of the total compounds of 500 to 25,000 Da, in particular from 500 to 10,000 Da, is sufficient. Compounds which have four or five groupings of the formula (II) preferably have a molecular weight of 200 to 12,500 Da, in particular 500 to 7,500 Da. In the case of compounds which contain six or more groupings of the formula (II), the molecular weight is particularly preferably < 7,500 Da and more preferably <5000 Da.
Die Gruppen der Formel (II) stellen bevorzugt Polyalkylenoxide, wie beispielsweise Polyethylenglykol, Polyolefinalkohole, wie beispielsweise Polyvinylalkohol oder Polyacrylmorpholin dar.The groups of the formula (II) are preferably polyalkylene oxides, such as, for example, polyethylene glycol, polyolefin alcohols, such as, for example, polyvinyl alcohol or polyacrylmorpholine.
In den Gruppen der Formeln (II) können die Reste bzw. Platzhalter P, R2, R3, R4, R5, n, x, y sowie q in einem Molekül bzw. einem Rest jeweils gleich oder auch unabhängig voneinander unterschiedlich sein. So kann der Rest der Formel (II) beispielsweise ein aus Polyethylenoxid- und Polypropylenoxidgruppen bestehendes Polyalkylenoxid sein.In the groups of the formulas (II), the residues or placeholders P, R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , n, x, y and q in a molecule or a residue can in each case be the same or else different from one another , For example, the rest of formula (II) can be a polyalkylene oxide consisting of polyethylene oxide and polypropylene oxide groups.
Für P = CO-R3 handelt es sich um Polyacrylsäuregruppierungen (R3 = OH) bzw. Polyacrylamide (R3 = NR4R5). R4 und R5 können dabei Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 30 C-Atomen, insbesondere 1 bis 10 C-Atomen, mehr bevorzugt 1 ist 6 C-Atomen darstellen, welcher Heteroatome enthalten kann, insbesondere ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus O, N, P und S. Die Reste R4 und R5 können zusammen auch einen Ring bilden, beispielsweise einen Morpholinring.P = CO-R 3 are polyacrylic acid groups (R 3 = OH) or polyacrylamides (R 3 = NR 4 R 5 ). R 4 and R 5 can be hydrogen or a hydrocarbon radical having 1 to 30 C atoms, in particular 1 to 10 C atoms, more preferably 1 is 6 C atoms, which may contain heteroatoms, in particular one or more heteroatoms, selected from O, N, P and S. The radicals R 4 and R 5 together can also form a ring, for example a morpholine ring.
Bei dem Rest R1 handelt es sich um Wasserstoff, Hydroxy oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, mehr bevorzugt 1 bis 30 Kohlenstoffatomen und am meisten bevorzugt 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, welcher gegebenenfalls Heteroatome, insbesondere O, N, S, P oder/und Si, enthalten kann. Der Rest R1 kann gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sowie linear, verzweigt oder zyklisch sein. Besonders bevorzugt ist , HO, CH3-O, CH3-(CH2)a-O, (CH3)2CH-O, wobei a eine ganze Zahl zwischen 1 und 20 ist. R., kann weiterhin bevorzugt ausgewählt werden aus einem Acetal, z.B. (CH3O)2- und (CH3-CH2O)2-, einem Aldehyd, z.B. OHC-CH2-O-, einer Alkenylgruppe, z.B. CH2=CH-CH2- O-, einem Acrylat, z.B. CH2=CH-CO2-, oder einem Methacrylat, z.B. CH2=C(CH3)-CO2-, einem Acrylamid, z.B. CH2=CH-CONH-, einer Aminoalkylgruppe, z.B. H2N-CH2-CH2-, einer geschützten Aminoalkylgruppe, z.B. A--NH-CH2-CH2", wobei A eine Schutzgruppe darstellt, insbesondere N- Acyl, N-Sulfonyl, N-Silylschutzgruppen, wie z.B. tert. Boc-, Alloc-, Fmoc, Tr-, Z-, Moz-, einer Thioalkylgruppe HS-CH2-CH2-, oder einer geschützten Thioalkylgruppe. Bevorzugt weist die Gruppierung der Formel (II) die Formel (Ila)The radical R 1 is hydrogen, hydroxyl or a hydrocarbon radical with 1 to 50 carbon atoms, more preferably 1 to 30 carbon atoms and most preferably 1 to 10 carbon atoms, which optionally contains heteroatoms, in particular O, N, S, P or / and Si. The radical R 1 can be saturated or mono- or polyunsaturated as well as linear, branched or cyclic. HO, CH 3 -O, CH 3 - (CH 2 ) a -O, (CH 3 ) 2 CH-O is particularly preferred, where a is an integer between 1 and 20. R., can furthermore preferably be selected from an acetal, for example (CH 3 O) 2 - and (CH 3 -CH 2 O) 2 -, an aldehyde, for example OHC-CH 2 -O-, an alkenyl group, for example CH 2 = CH-CH 2 - O-, an acrylate, for example CH 2 = CH-CO 2 -, or a methacrylate, for example CH 2 = C (CH 3 ) -CO 2 -, an acrylamide, for example CH 2 = CH-CONH -, an aminoalkyl group, for example H 2 N-CH 2 -CH 2 -, a protected aminoalkyl group, for example A - NH-CH 2 -CH 2 ", where A represents a protective group, in particular N-acyl, N-sulfonyl, N -Silyl protective groups, such as, for example, tert-Boc, Alloc, Fmoc, Tr, Z, Moz, a thioalkyl group HS-CH 2 -CH 2 -, or a protected thioalkyl group. The grouping of the formula (II) preferably has the formula (Ila)
Rr(CH2-CH2-0)n-CH2-CH2- Formel (Ila)R r (CH 2 -CH 2 -0) n -CH 2 -CH 2 - formula (Ila)
auf, wobei n zwischen 0 und 1000 ist.where n is between 0 and 1000.
n (wie hierin verwendet, z.B. in Formel II oder Formel Ila) ist bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 1000, mehr bevorzugt von 1 bis 500, noch mehr bevorzugt von 2 bis 250, insbesondere mindestens 3 und am meisten bevorzugt mindestens 4 bis 50. Erfindungsgemäß ist es möglich, Verbindungen mit einer großen Anzahl an Gruppierungen der Formel (II) bereitzustellen, bevorzugt mit mindestens 2, insbesondere mindestens 3, bevorzugt mindestens 4, mehr bevorzugt mindestens 5 und am meisten bevorzugt mindestens 9 Gruppierungen der Formel (II). Oftmals sind jedoch bereits Verbindungen besonders bevorzugt, welche 2 oder 3 Gruppierungen der Formel (II) enthalten.n (as used herein, for example in Formula II or Formula Ila) is independently an integer from 0 to 1000, more preferably from 1 to 500, even more preferably from 2 to 250, especially at least 3 and most preferably at least every occurrence 4 to 50. According to the invention, it is possible to provide compounds having a large number of groupings of the formula (II), preferably having at least 2, in particular at least 3, preferably at least 4, more preferably at least 5 and most preferably at least 9 groups of the formula ( II). However, compounds which contain 2 or 3 groups of the formula (II) are often particularly preferred.
x ist bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere 1 bis 6, mehr bevorzugt von 2 bis 3 und y ist eine ganze Zahl von 0 bis 50, mehr bevorzugt von 1 bis 10, noch mehr bevorzugt von 2 bis 6. q ist bei jedem Auftreten unabhängig voneinander 0 oder 1.x is independently an integer from 1 to 10, in particular 1 to 6, more preferably from 2 to 3, and y is an integer from 0 to 50, more preferably from 1 to 10, even more preferably from 2 to 6 . q is 0 or 1 at each occurrence independently.
Die Reste V, W, X und Z stammen aus den bei der Multikomponentenreaktion umgesetzten Edukten bzw. werden, für den Fall, dass eines der Edukte zwei oder mehr funktionelle Gruppen (Amin-, Keton- bzw. Aldehyd-, Isonitril- oder Säuregruppierung) aufweist, im Verlauf derThe residues V, W, X and Z originate from the reactants reacted in the multicomponent reaction or become, in the event that one of the reactants has two or more functional groups (amine, ketone or aldehyde, isonitrile or acid grouping) exhibits, in the course of
Multikomponentenreaktion aufgebaut. Bevorzugt sind Verbindungen, die bei einer Mehrkomponentenreaktion oder einer mehrstufigen Mehrkomponentenreaktion, insbesondere einer Vierkomponentenreaktion und am meisten bevorzugt bei einer Ugi-Reaktion erhalten werden, in der wenigstens ein Edukt eingesetzt wird, welches verzweigt ist, d.h. wenigstens zwei, mehr bevorzugt wenigstens drei in der Mehrkomponentenreaktion reaktive Gruppierungen (z.B. Amin-, Carbonyl-, Isonitril- oder/und Säuregruppierung) aufweist. Bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mittels einer Ugi- Reaktion stammt der Rest V aus der Säurekomponente, der Rest Z aus der Isonitrilkomponente, der Rest X aus der Aminokomponenten und der Rest W aus der Carbonylkomponente.Multi-component reaction established. Preference is given to compounds which are obtained in a multicomponent reaction or a multistage multicomponent reaction, in particular a four-component reaction and most preferably in a Ugi reaction, in which at least one starting material which is branched, ie at least two, more preferably at least three, is used Multi-component reaction reactive groups (eg amine, carbonyl, isonitrile or / and acid grouping). When the compounds according to the invention are prepared by means of an Ugi reaction, the radical V comes from the acid component, the radical Z from the isonitrile component, the radical X from the amino component and the radical W from the carbonyl component.
Die Reste V, W, X und Z stellen jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff oder einen Kohlenwasserstoffrest dar, welcher gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann. Ein Kohlenwasserstoffrest bedeutet hierin, soweit nicht explizit anders angegeben, einen Rest mit 1 bis 100.000 C- Atomen, mehr bevorzugt einen Rest von 1 bis 10.000 C-Atomen, in einigen bevorzugten Fällen 1 bis 50 C-Atomen, welcher 0 bis 10.000, mehr bevorzugt 1 bis 1.000 Heteroatome enthalten kann, beispielsweise ausgewählt aus O, P, N oder S. Die Kohlenwasserstoffreste können linear oder verzweigt sein und gesättigt oder ein- oder mehrfach ungesättigt sein. Ein Kohlenwasserstoffrest kann auch zyklische oder aromatische Abschnitte enthalten. Bevorzugte Kohlenwasserstoffreste sind Alkyl, Cycloalkyl, Alkenyl, Cycloalkenyl, Alkinyl, Cycloalkinyl, Aroyl sowie Heteroaroyl. Ein Kohlenwasserstoffrest, wie hierin verwendet, kann aber auch funktioneile Gruppen und insbesondere ein Targeting-Agens enthalten und beispielsweise einen Aminocarbonsäureester, beispielsweise einen gesättigten oder ungesättigten Omega-Aminocarbonsäureester, einen Farbstoff, einen Fluoreszenzmarker, ein Antibiotikum, einen Minor oder Major Groove Binder, einen Biotinylrest, einen Streptavidinrest, einen intercalierenden Rest, einen alkylierenden Rest, ein Steroid, ein Lipid, ein Polyamin, Folsäure, einen Rezeptoragonisten oder -antagonisten, einen Enzyminhibitor, ein Peptid, einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, einen Aminozucker, ein Saccharid oder Oligosaccharid, z.B. Galactose, Glucose oder Mannose, ein Antisenspolymer, eine modifizierte Oberfläche, ein grenzflächenaktives Agens oder ein komplexierendes Agens umfassen.The radicals V, W, X and Z each independently represent hydrogen or a hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms. Unless explicitly stated otherwise, a hydrocarbon radical here means a radical having 1 to 100,000 carbon atoms, more preferably a radical of 1 to 10,000 carbon atoms, in some preferred cases 1 to 50 carbon atoms, which is 0 to 10,000, more can preferably contain 1 to 1,000 heteroatoms, for example selected from O, P, N or S. The hydrocarbon radicals can be linear or branched and can be saturated or mono- or polyunsaturated. A hydrocarbon residue can also contain cyclic or aromatic sections. Preferred hydrocarbon radicals are alkyl, cycloalkyl, alkenyl, cycloalkenyl, alkynyl, cycloalkynyl, aroyl and heteroaroyl. A hydrocarbon radical, as used herein, can also contain functional groups and in particular a targeting agent and for example an aminocarboxylic acid ester, for example a saturated or unsaturated omega-aminocarboxylic acid ester, a dye, a fluorescent label, an antibiotic, a minor or major groove binder Biotinyl residue, a streptavidin residue, an intercalating residue, an alkylating residue, a steroid, a lipid, a polyamine, folic acid, a receptor agonist or antagonist, an enzyme inhibitor, a peptide, an antibody or an antibody fragment, an amino sugar, a saccharide or oligosaccharide, eg Galactose, glucose or mannose, an antisense polymer, a modified surface, a surfactant or a complexing agent.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst wenigstens einer der Reste V, W, X oder/und Z eine Targeting-Gruppierung, die das zielgerichtete Dirigieren der erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere von die erfindungsgemäßen Verbindungen enthaltenden Konjugaten an einen gewünschten Zielort, beispielsweise einen Ort einer Erkrankung, wie einen Entzündungsherd oder ein Krebsgeschwür ermöglicht. Als Targeting- Gruppierung können z.B. Folat, Biotin, Mannose, Maltose, Succinat, Aconitat, Dexamethason, Alkylglycoside, Glykoside und Peptide, z.B. mit Arg-Gly-Asp Motiv, dienen.In a preferred embodiment, at least one of the residues V, W, X or / and Z comprises a targeting group which enables the targeted directing of the compounds according to the invention and in particular of the conjugates containing the compounds according to the invention to a desired target location, for example a location of a disease, such as an inflammatory focus or a cancer. For example, folate, biotin, mannose, maltose, succinate, Aconitat, dexamethasone, alkylglycosides, glycosides and peptides, for example with Arg-Gly-Asp motif, are used.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, Moleküle bereitzustellen, welche zwei oder mehr Targeting-Gruppierungen enthalten. Dadurch kann eine erhöhte Targeting-Wirkung erzielt werden oder/und die Verbindung bzw. ein damit gebildetes Konjugat an mehrere gewünschte Stellen dirigiert werden.According to the invention, it is also possible to provide molecules which contain two or more targeting groups. This enables an increased targeting effect to be achieved and / or the compound or a conjugate formed therewith to be directed to a number of desired locations.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Verbindungen auch Reportergruppierungen enthalten, beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder Fluoreszenzmarker, welche eine Anwendung für diagnostische Zwecke ermöglicht.Furthermore, the compounds according to the invention can also contain reporter groups, for example fluorescent dyes or fluorescent markers, which enables use for diagnostic purposes.
Bei dem Rest X in den erfindungsgemäßen Verbindungen (der Rest, der in einer Ugi-Reaktion durch die Verwendung eines primären Amins X-NH2 eingeführt wird) handelt es sich bevorzugt um eine Targeting-Gruppierung, um einen Rest der Formel (II) oder eine Kombination aus beiden. Besonders bevorzugt ist dabei x = 2, 3 oder 4. Besonders bevorzugte Untereinheiten im Rest X sind Ethylenglykol, Propylenglykol, Butylenglykol oder Kombinationen davon mit einer Kettenlänge von 3 bis 500, insbesondere von 4 bis 100 Einheiten. R1 im Rest X ist besonders bevorzugt Methoxy oder Ethoxy, insbesondere Methoxy. Am meisten bevorzugt ist X Methoxypolyethylenglykol mit 1 bis 1000, insbesondere 4 bis 50 Ethyleneinheiten. Kurzkettige Methoxypolyethylenglykol-Reste, beispielsweise mit 3 bis 10, insbesondere mit 3 bis 4 Ethyleneinheiten werden besonders bevorzugt monodispers eingesetzt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält der Rest X eine Targeting- Gruppierung, wie oben angegeben. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die Abschirmfunktion durch die Formel (II) und die Targeting-Funktion in einem Rest X vorhanden. Ein solcher Rest X weist bevorzugt die Formel (llb)The radical X in the compounds according to the invention (the radical which is introduced in a Ugi reaction by using a primary amine X-NH 2 ) is preferably a targeting group, a radical of the formula (II) or a combination of both. In this context, x = 2, 3 or 4 is particularly preferred. Particularly preferred subunits in the radical X are ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol or combinations thereof with a chain length of 3 to 500, in particular 4 to 100, units. R 1 in the radical X is particularly preferably methoxy or ethoxy, in particular methoxy. Most preferably X is methoxypolyethylene glycol with 1 to 1000, especially 4 to 50 ethylene units. Short-chain methoxypolyethylene glycol residues, for example with 3 to 10, in particular with 3 to 4, ethylene units are particularly preferably used in monodisperse form. In a further preferred embodiment, the radical X contains a targeting grouping, as indicated above. In a particularly preferred embodiment, the shielding function by the formula (II) and the targeting function are present in a radical X. Such a radical X preferably has the formula (IIb)
Targeting-Gruppe oder "(CH)X- -to]q -(CH)y ZusatzfunktionTargeting group or "(CH) X - -to] q - (CH) y additional function
J n Formel (llb) auf, worin die Bedeutungen der Platzhalter hierin wie oben angegeben sind. J n formula (llb) in which the meanings of the placeholders herein are as given above.
Der Rest Z, welcher bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mittels Ugi-Reaktion aus dem Isonitril (Z-NC) stammt, ist bevorzugt ein C,- Cg-Alkylrest oder ein Rest, welcher eine, zwei oder mehr Gruppierungen der Formel (II) enthält sowie gegebenenfalls eine Targeting-Funktion. Besonders bevorzugt ist Z eine Gruppierung der Formel (Xa), (Xb) oder (Xc)The radical Z, which originates from the isonitrile (Z-NC) in the preparation of the compounds according to the invention by means of the Ugi reaction, is preferably a C 1 -C 6 -alkyl radical or a radical which contains one, two or more groups of the formula (II) as well as a targeting function if necessary. Z is particularly preferably a grouping of the formula (Xa), (Xb) or (Xc)
Formel (Xa) Formula (Xa)
R1-4-(CH)c -o- -(CH2)b N- -CO- -(CH2)a R 1 -4- (CH) c -o- - (CH 2 ) b N- -CO- - (CH 2 ) a
HH
Formel (Xb)Formula (Xb)
Formel (Xc) und insbesondere Formula (Xc) and in particular
worinwherein
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, C^C^Alkyl, O-R2 oder CO-R3 darstellt (wobei R2 und R3 wie oben definiert sind), R1 H, OH oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome enthalten kann und bevorzugt ein C^C^-Alkoxyrest ist, a bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 0 bis 50, insbesondere von 1 bis 3 darstellt, b bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 0 bis 50, insbesondere von 1 bis 3 darstellt, c bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10, insbesondere 2 bis 4 ist und d bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1.000, insbesondere von 5 bis 100 ist.P on each occurrence independently represents H, OH, C 1 -C 4 alkyl, OR 2 or CO-R 3 (wherein R 2 and R 3 are as defined above), R 1 is H, OH or a hydrocarbon radical having 1 to 50 carbon atoms , which can contain heteroatoms and is preferably a C 1 -C 4 alkoxy radical, a represents an integer from 0 to 50, in particular 1 to 3, in each occurrence, b an integer from 0 to 50, in particular 1 in each occurrence to 3, c is an integer from 1 to 10, especially 2 to 4 in each occurrence, and d is independently an integer from 1 to 1,000, in particular 5 to 100 in each occurrence.
Die Reste W, welche bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen durch eine Ugi-Reaktion aus der Carbonylverbindung stammen, sind bei jedem Auftreten unabhängig bevorzugt Wasserstoff oder ein C C6- Kohlenwasserstoffrest, insbesondere ein CrC4-Alkylrest und am meisten bevorzugt Wasserstoff, Methyl oder Ethyl. In einer besonders bevorzugte Ausführungsform sind die beiden Reste W in Verbindungen der Formel (I) identisch, stammen also von Formaldehyd (W = W = H) oder von symmetrischen Ketonen, wie beispielsweise Aceton oder 3-Pentanon. Durch die Verwendung von symmetrischen Ketonen wird das Entstehen eines Symmetriezentrums an dem Kohlenstoffatom, an das die Reste W gebunden sind, verhindert. Dadurch treten keine mit chiralen Verbindungen assoziierten Probleme bei Bildung von Konjugaten mit Wirkstoffen auf. Besonders bevorzugt ist W bei jedem Auftreten Wasserstoff.The radicals W, which originate from the carbonyl compound in the preparation of the compounds according to the invention by a Ugi reaction, are each preferably independently hydrogen or a CC 6 hydrocarbon radical, in particular a C r C 4 alkyl radical and most preferably hydrogen, methyl or ethyl. In a particularly preferred embodiment, the two radicals W in compounds of the formula (I) are identical, that is to say they originate from formaldehyde (W = W = H) or from symmetrical ketones, such as, for example, acetone or 3-pentanone. The use of symmetrical ketones prevents the formation of a center of symmetry on the carbon atom to which the radicals W are bound are prevented. As a result, there are no problems associated with chiral compounds in the formation of conjugates with active substances. W is particularly preferably hydrogen on each occurrence.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Rest W durch Verwendung eines Aldehyds als Ausgangsstoff bei der Ugi-Reaktion eingeführt. In diesem Fall ist einer der Reste W Wasserstoff, während der andere Rest W bevorzugt ein CrC6-Kohlenwasserstoff und insbesondere ein C1-C4-Alkylrest ist. In diesem Fall kann einer der Reste W eine Gruppe der Formel (II), einen Linker oder/und eine Targeting-Gruppe enthalten.In a further preferred embodiment, the radical W is introduced by using an aldehyde as the starting material in the Ugi reaction. In this case, one of the radicals W is hydrogen, while the other radical W is preferably a C r C 6 hydrocarbon and in particular a C 1 -C 4 alkyl radical. In this case, one of the radicals W can contain a group of the formula (II), a linker and / or a targeting group.
Der Rest V schließlich stammt aus der Carbonsäureverbindung bei Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen mittels Ugi-Reaktion. Bevorzugt enthält die Gruppierung V einen Linker bzw. eine Bindegruppe Y zur Kopplung der erfindungsgemäßen Verbindungen an weitere Moleküle, insbesondere an biotechnologische, pharmazeutische oder synthetische Wirkstoffe. Der Rest V kann neben der Bindegruppe eine Linkergruppe enthalten, bevorzugt eine C1-C8-Alkylengruppe oder eine Glykolgruppe, beispielsweise eine Tetraethylenglykolgruppe.Finally, the radical V comes from the carboxylic acid compound in the preparation of the compounds according to the invention by means of the Ugi reaction. The grouping V preferably contains a linker or a binding group Y for coupling the compounds according to the invention to further molecules, in particular to biotechnological, pharmaceutical or synthetic active substances. The radical V can contain, in addition to the binding group, a linker group, preferably a C 1 -C 8 alkylene group or a glycol group, for example a tetraethylene glycol group.
In der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform weisen die Verbindungen der Formel (I) bevorzugt eine bis drei, mehr bevorzugt zwei bis drei Gruppen der Formel (II) auf, nämlich eine Gruppe im Rest X und eine oder zwei Gruppen im Rest Z.In the preferred embodiment described above, the compounds of the formula (I) preferably have one to three, more preferably two to three, groups of the formula (II), namely one group in the radical X and one or two groups in the radical Z.
Eine besonders bevorzugte Struktur solcher Verbindungen ist im Folgenden als Formel (XI) dargestellt, wobei n = 0 bis 10.A particularly preferred structure of such compounds is shown below as formula (XI), where n = 0 to 10.
Formel (XI) Formula (XI)
Während oben eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, nämlich die Herstellung von Verbindungen unter Verwendung von monofunktionellen Ausgangsmaterialien mittels Ugi-Reaktion näher erläutert wurde, können in einer weiteren erfindungsgemäßen bevorzugten Ausführungsform polyfunktionelle Ausgangsmaterialien eingesetzt werden. Dazu wird wenigstens eines der Ausgangsmaterialien der Ugi-Reaktion in polyfunktioneller Form, also in difunktioneller, trifunktioneller oder höherfunktioneller Form eingesetzt. Besonders bevorzugt wird wenigstens ein bifunktionelles Ausgangsmaterial, also eine Dicarbonsäure, ein Diamin, ein Diisonitril oder/und ein Dialdehyd bzw. Diketon und bevorzugt mindestens eine Dicarbonsäure oder/und ein Diamin eingesetzt. Durch Verwendung solcher polyfunktioneller Ausgangsmaterialien werden Verbindungen der Formel (I) erhalten, in welchen mehrere Gruppen V, X, W und Z und insbesondere mehrere Gruppierungen X und Z vorliegen und somit eine Vielzahl an Gruppierungen der Formel (II) vorgesehen sein können. Ein Beispiel für solche Verbindungen, in denen eine Tricarbonsäure als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, wird durch die folgende allgemeine Formel (III) repräsentiert:While a preferred embodiment of the invention, namely the preparation of compounds using monofunctional starting materials by means of the Ugi reaction, was explained in more detail above, in In a further preferred embodiment according to the invention, polyfunctional starting materials are used. For this purpose, at least one of the starting materials of the Ugi reaction is used in polyfunctional form, that is to say in difunctional, trifunctional or higher functional form. It is particularly preferred to use at least one bifunctional starting material, that is to say a dicarboxylic acid, a diamine, a diisonitrile or / and a dialdehyde or diketone, and preferably at least one dicarboxylic acid or / and a diamine. By using such polyfunctional starting materials, compounds of the formula (I) are obtained in which there are a plurality of groups V, X, W and Z and in particular a number of groups X and Z and a plurality of groups of the formula (II) can therefore be provided. An example of such compounds in which a tricarboxylic acid was used as the starting material is represented by the following general formula (III):
Formel (III) Formula (III)
und insbesondere Formel (lila; wobei p, q, r unabhängig voneinander eine ganze Zahl zwischen 0 und 50, mehr bevorzugt zwischen 0 und 10 sein kann. Bevorzugt ist r = 0.and particularly Formula (purple; where p, q, r can independently be an integer between 0 and 50, more preferably between 0 and 10. Preferably r = 0.
Verbindungen der Formel (III) können mit einem Verfahren auf der Basis einer Ugi-4-Komponentenreaktion hergestellt werden, an der eine Carbonyl-, Amino-, Isonitril- und Säurekomponente beteiligt sind. Diese Komponenten können gegebenenfalls gleichzeitig miteinander umgesetzt werden und Schutzgruppen enthalten, die später entfernt werden oder im Molekül verbleiben.Compounds of the formula (III) can be prepared by a process based on a Ugi-4-component reaction in which a carbonyl, amino, isonitrile and acid component are involved. These components can optionally be reacted with one another at the same time and contain protective groups which are later removed or remain in the molecule.
Die Säurekomponente in Formel (lila) ist hier eine 1 ,1 ,2- Ethantricarbonsäure, die zusätzlich eine Linkergruppe an der 1 -Position trägt. Die zur Herstellung von Verbindungen der Formel (lila) verwendete Carbonylkomponente ist bevorzugt Formaldehyd oder eine symmetrische Carbonylverbindung, z.B. Aceton oder Cyclohexanon. Hierdurch wird die Entstehung von Diastereoisomerengemischen vermieden. Alternativ können auch unsymmetrische Aldehyde, z.B. Isobutyraldehyd, oder Ketone verwendet werden.The acid component in formula (purple) here is a 1, 1, 2-ethanetricarboxylic acid which additionally bears a linker group at the 1 position. The carbonyl component used to prepare compounds of formula (purple) is preferably formaldehyde or a symmetrical carbonyl compound, e.g. Acetone or cyclohexanone. This prevents the formation of mixtures of diastereoisomers. Alternatively, asymmetrical aldehydes, e.g. Isobutyraldehyde, or ketones can be used.
Der Linker T ist bevorzugt repräsentiert durch eine Alkylkette, die verzweigt oder unverzweigt, gesättigt oder ungesättigt ist, und Heteroatome, insbesondere N, S und O, z.B. zwischen der Verzweigung und T enthalten kann. Bevorzugt weist T ein Kohlenstoffatom oder ein Stickstoffatom als Verknüpfung zur Verzweigungsstelle in den Verbindungen der Formel (III) bzw. (lila) auf. Mehr bevorzugt ist T eine Alkylkette der Struktur 1.The linker T is preferably represented by an alkyl chain which is branched or unbranched, saturated or unsaturated, and can contain heteroatoms, in particular N, S and O, for example between the branching and T. T preferably has a carbon atom or a nitrogen atom as Link to the branch point in the compounds of formula (III) or (purple). T is more preferably an alkyl chain of structure 1.
T = -(CH2)n T = - (CH 2 ) n
Struktur 1Structure 1
wobei m eine ganze Zahl von 1 bis 10, bevorzugt aber eine ganze Zahl von 1 bis 5 ist.where m is an integer from 1 to 10, but preferably an integer from 1 to 5.
Für den Fall,In the case,
(O-Alkyl)(O-alkyl)
/ dass Y ein Acetal darstellt, weist der Linker die Struktur T' \/ that Y represents an acetal, the linker has the structure T '\
(O-Alkyl) auf.(O-alkyl).
Weitere bevorzugte Verbindungen, in denen eine Dicarbonsäure als Ausgangsmaterial eingesetzt wurde, werden durch die allgemeine Formel (XII) repräsentiert:Further preferred compounds in which a dicarboxylic acid was used as the starting material are represented by the general formula (XII):
Formel (XII) Formula (XII)
worin p und q jeweils ganze Zahlen von 0 bis 5 darstellen. Bevorzugte Verbindungen, die durch Verwendung von Diaminen erhältlich sind, werden durch die allgemeine Formel (XIII) dargestellt: Formel (XIII)where p and q each represent integers from 0 to 5. Preferred compounds obtainable using diamines are represented by the general formula (XIII): Formula (XIII)
worin p und q jeweils ganze Zahlen von 0 bis 5 darstellen.where p and q each represent integers from 0 to 5.
Die vorliegende Erfindung trägt dazu bei, die beschriebenen, im Stand der Technik auftretenden Nachteile oder Einschränkungen zu verringern. Sie umfasst die Synthese bifunktionaler Verbindungen, welche zur Modifikation von Naturstoffen, technischen Produkten, biotechnologischen und synthetischen Produkten oder von pharmazeutischen Wirkstoffen verwendet werden können.The present invention helps to reduce the disadvantages or limitations described in the prior art. It encompasses the synthesis of bifunctional compounds which can be used to modify natural products, technical products, biotechnological and synthetic products or pharmaceutical active ingredients.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten eine aktivierte Linkergruppe, die mit einer oder mehreren Aminofunktionalitäten oder anderen funktionellen Gruppen eines biotechnologischen oder synthetischen Produktes im Rahmen einer chemischen Reaktion unter milden Reaktionsbedingungen eine kovalente Bindung eingeht und mindestens eine Polymerfunktion, die die biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften des Konjugats beeinflussen. In bevorzugten Ausführungen enthalten die Verbindungen weitere Funktionen, wie z.B. Targeting- Funktionen.The compounds according to the invention contain an activated linker group which forms a covalent bond with one or more amino functionalities or other functional groups of a biotechnological or synthetic product as part of a chemical reaction under mild reaction conditions and at least one polymer function which influence the biochemical and pharmacological properties of the conjugate. In preferred embodiments, the connections contain further functions, such as e.g. Targeting functions.
Die vorliegende Erfindung stellt bevorzugt eine mehrfach verzweigte Struktur bereit, sowie deren Synthese und Anwendung zur Modifikation von biotechnologischen Produkten. Die Struktur kann unter Verwendung einer Mehrkomponentenreaktion, z.B. der Ugi-Reaktion (Ugi, I. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 3168-3210; EP 1104677), hergestellt werden. Die Verwendung der Mehrkomponentenreaktion ermöglicht einen kombinatorischen Ansatz sowie die Automation der Herstellung.The present invention preferably provides a multi-branched structure, as well as its synthesis and application for the modification of biotechnological products. The structure can be produced using a multi-component reaction, for example the Ugi reaction (Ugi, I. et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2000, 39, 3168-3210; EP 1104677). The use of the multi-component reaction enables one combinatorial approach as well as the automation of manufacturing.
Die vorliegende Erfindung stellt bevorzugt eine unverzweigte oder verzweigte Polymerverbindung bereit die nur eine einzige aktivierte Linkergruppe trägt, wodurch Quervernetzungsreaktionen vermieden werden. Diese Polymerverbindung ist hydrophil und biologische verträglich. Sie ist einfach herzustellen und eröffnet breite Anwendungsmöglichkeiten bei der Modifikation pharmazeutischer Wirkstoffe und technisch eingesetzter Produkte. Konjugate der erfindungsgemäßen Polymerverbindung mit pharmazeutischen Wirkstoffen ermöglichen eine Verbesserung des therapeutischen Einsatzes. Weiterhin ermöglichen diese Konjugate bei Verlängerung der Wirkdauer die Verringerung der zu verabreichenden Menge an Wirkstoff, so zum Beispiel für die Behandlung von Krebs- und Infektionskrankheiten.The present invention preferably provides an unbranched or branched polymer compound that carries only a single activated linker group, thereby avoiding cross-linking reactions. This polymer compound is hydrophilic and biologically compatible. It is easy to manufacture and opens up a wide range of applications for the modification of active pharmaceutical ingredients and technically used products. Conjugates of the polymer compound according to the invention with active pharmaceutical ingredients enable an improvement in the therapeutic use. Furthermore, these conjugates make it possible to reduce the amount of active ingredient to be administered, for example for the treatment of cancer and infectious diseases, when the duration of action is prolonged.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei man in einer Mehrkomponentenreaktion die Einzelkomponenten der FormelnThe invention further relates to a process for the preparation of the compounds according to the invention, the individual components of the formulas being used in a multicomponent reaction
X'-NH2 (IV)X'-NH 2 (IV)
(W)2C = O (V)(W) 2 C = O (V)
Z'-NC (VI)Z'-NC (VI)
undand
V'-COOH (VII)V'-COOH (VII)
miteinander umsetzt, wobei V, W\ X' und Z' jeweils unabhängig voneinander einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann oder/und V, W oder/und X' Wasserstoff darstellen, wobei wenigstens einer der Reste V, W, X' und Z' eine Bindegruppe Y trägt und wobei die Reste V, W, X' und Z' zusammen mindestens eine, insbesondere mindestens zwei Gruppen der Formel (II)reacted with one another, where V, W \ X 'and Z' each independently represent a hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms or / and V, W or / and X 'represent hydrogen, at least one of the radicals V, W, X' and Z 'carries a binding group Y and the radicals V, W, X' and Z ' together at least one, in particular at least two, groups of the formula (II)
Formel (II) Formula (II)
aufweisen, worinhave wherein
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, O-R2 oder CO-R3 darstellt,P independently represents H, OH, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence,
R., H oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome, insbesondere O, N, S, P oder/und Si, enthalten kann,R., H or a hydrocarbon radical having 1 to 50 carbon atoms, which can contain heteroatoms, in particular O, N, S, P or / and Si,
R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt,R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 carbon atoms with each occurrence,
R3 OH oder NR4R5 ist,R 3 is OH or NR 4 R 5 ,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome, insbesondere O, N, S oder/und P, enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O, N, S or / and P, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n each independently occurring is an integer from 1 to 1000 and x is an integer from 1 to 10 each occurrence and y is an integer from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 each occurrence.
Als Mehrkomponentenreaktion wird insbesondere eineAs a multi-component reaction, in particular
Vierkomponentenreaktion, mehr bevorzugt eine Ugi- oder Passerini-Reaktion und am meisten bevorzugt eine Ugi-Reaktion eingesetzt. Für den Fall, dass die Reste X', W, Z und V keine weitere für die Mehrkomponentenreaktion reaktive Funktionalität (also NH2, CO, NC oder COOH) mehr aufweisen, entsprechen die in den Edukten vorhandenen Reste V, W, X' und Z' gerade den in den erfindungsgemäßen Verbindungen wieder zu findenden Resten V, W, X und Z. Bevorzugt ist es aber, wenigstens ein Edukt einzusetzen, welches eine weitere Funktionalität (NH2, CO, NC oder COOH) enthält. In diesem Fall wird ein verzweigtes Molekül erhalten. Beispiele für solche Edukte sind die 1 ,1 ,2-Ethantricarbonsäure mit drei Carbonsäureresten, also zwei Carbonsäuregruppierungen im Rest V, oder Reste, welche mindestens zwei verschiedene funktioneile Gruppen enthalten, wie beispielsweise Lysin (enthält gleichzeitig eine Säuregruppierung und eine Amingruppierung) oder γ-Aminobuttersäure. Bei Verwendung solcher mehrfunktioneller Edukte werden die entsprechenden Gruppierungen V, W, X bzw. Z im Produkt ausgehend von der funktioneilen Gruppe im Rest V, W, X' bzw. Z' erst bei der Mehrkomponentenreaktion aufgebaut. Auf diese Weise ist es möglich, in einer Eintopfreaktion hochverzweigte und hochfunktionelle Verbindungen aufzubauen, insbesondere Verbindungen, die eine Vielzahl an Gruppierungen der Formel (II) enthalten.Four component reaction, more preferably a Ugi or Passerini reaction and most preferably a Ugi reaction. In the event that the radicals X ', W, Z and V no longer have any further functionality which is reactive for the multicomponent reaction (ie NH 2 , CO, NC or COOH), the radicals V, W, X' and Z 'precisely the residues V, W, X and Z to be found in the compounds according to the invention. However, it is preferred to use at least one starting material which contains a further functionality (NH 2 , CO, NC or COOH). In in this case a branched molecule is obtained. Examples of such educts are 1, 1, 2-ethanetricarboxylic acid with three carboxylic acid residues, ie two carboxylic acid groups in residue V, or residues which contain at least two different functional groups, such as lysine (contains an acid group and an amine group at the same time) or γ- aminobutyric acid. When such multifunctional educts are used, the corresponding groupings V, W, X and Z in the product, starting from the functional group in the remainder V, W, X 'and Z', are only built up during the multicomponent reaction. In this way it is possible to build up highly branched and highly functional compounds in a one-pot reaction, in particular compounds which contain a large number of groupings of the formula (II).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Verbindungen bereitgestellt, welche wenigstens zwei Gruppierungen der Formel (II) aufweisen. Diese Verbindungen weisen die allgemeine Formel (XIV) aufIn a further preferred embodiment of the present invention, compounds are provided which have at least two groupings of the formula (II). These compounds have the general formula (XIV)
Formel (XIV) Formula (XIV)
worin h, i bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 sind, g und f bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, bevorzugt zwischen 0 und 5 sind,where h, i are independently 0 or 1 with each occurrence, g and f are independently with each occurrence an integer between 0 and 10, preferably between 0 and 5,
A bei jedem Auftreten für H oder -(CO)-NX2 steht undA stands for H or - (CO) -NX 2 at each occurrence and
X X2, X3 und X4 sowie X jeweils unabhängig voneinander die oben für X angegebenen Bedeutungen aufweisen.XX 2 , X 3 and X 4 and X each independently have the meanings given for X above.
Bevorzugt steht T-Y für die Gruppierung -CH2-CH2-CH=CH2, wobei an der Doppelbindung beliebige Funktionalitäten zur Kopplung an Wirkstoffe eingefügt werden können.TY is preferably the grouping -CH 2 -CH 2 -CH = CH 2 , where at the Any functionalities for coupling to active substances can be inserted.
Weiterhin bevorzugt sind Verbindungen, in denen g = f, h = i, X., = X3, X2 = X4, wobei in solchen Verbindungen das Kohlenstoffatom in der markierten Position 1 kein Chiralitätszentrum ist. Durch die Verknüpfung einer Dicarbonsäure oder Tricarbonsäure mit einem eine Gruppe der Formel (II) enthaltenden Amin können erfindungsgemäß achirale Moleküle hergestellt werden, die bis zu 6 (im Fall von Dicarbonsäuren) bzw. bis zu 9 (im Fall von Tricarbonsäuren) Gruppen der Formel (II) aufweisen. Da erfindungsgemäß die Kopplung von Aminen an Di- bzw. Tricarbonsäuren erfolgt, welche keine Aminosäuren sind, kann die Kopplung auf einfache Weise durchgeführt werden, ohne dass ein aufwändiges Syntheseverfahren unter Verwendung von Schutzgruppen notwendig wäre.Also preferred are compounds in which g = f, h = i, X., = X 3 , X 2 = X 4 , in which case the carbon atom in the marked position 1 is not a chiral center. By linking a dicarboxylic acid or tricarboxylic acid with an amine containing a group of the formula (II), achiral molecules can be prepared according to the invention which contain up to 6 (in the case of dicarboxylic acids) or up to 9 (in the case of tricarboxylic acids) groups of the formula ( II) have. Since the coupling of amines to di- or tricarboxylic acids, which are not amino acids, takes place according to the invention, the coupling can be carried out in a simple manner, without the need for a complex synthesis process using protective groups.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden auch Konjugate der bifunktionalen, verzweigten Polymerverbindung mit biologisch aktiven Substanzen, wie Proteinen (z.B. humane Wachstumsfaktoren), Enzymen, Co-Faktoren für Enzyme (z.B. NAD+/NADH), Liposomen, Antikörpern, synthetischen, kleinen Wirkstoffen, Phosphoiipiden, Lipiden, Nucleosiden, Oligonucleotiden, Mikroorganismen, humanen Zellen und Oberflächen bereitgestellt.In the context of the present invention, conjugates of the bifunctional, branched polymer compound with biologically active substances, such as proteins (for example human growth factors), enzymes, co-factors for enzymes (for example NAD + / NADH), liposomes, antibodies, synthetic, small active substances, phosphoiipids , Lipids, nucleosides, oligonucleotides, microorganisms, human cells and surfaces.
Die Erfindung betrifft deshalb auch Konjugate, umfassend Verbindungen der Formel (I) in kovalenter Verknüpfung an weitere Moleküle, insbesondere an Wirkstoffe, wie etwa Biopharmazeutika oder synthetische Wirkstoffe, oder biotechnologische Substanzen, die im Bereich „Life Science" eingesetzt werden, z.B. im Bereich Proteomics oder Diagnostik. Solche Substanzen sind z.B. Enzyme, insbesondere Proteasen, wie z.B. Trypsin oder Chymotrypsin. Die in den Konjugaten an den erfindungsgemäßen Verbindungen verknüpften Verbindungen sind vorzugsweise Biopharmazeutika, peptidische Wirkstoffe oder andere biologisch aktive Substanzen. Weiterhin können auch Konjugate mit Oberflächen oder Biokatalysatoren gebildet werden.The invention therefore also relates to conjugates comprising compounds of the formula (I) in a covalent linkage to other molecules, in particular to active substances, such as biopharmaceuticals or synthetic active substances, or biotechnological substances which are used in the field of life science, for example in the field of proteomics Such substances are, for example, enzymes, in particular proteases, such as trypsin or chymotrypsin. The compounds linked to the compounds according to the invention in the conjugates are preferably biopharmaceuticals, peptide active substances or other biologically active substances. Conjugates with surfaces or biocatalysts can also be formed ,
Die Erfindung betrifft weiterhin Konjugate, umfassend Verbindungen der Formel (I) in kovalenter Verknüpfung an Medizinprodukte oder Hilfsmittel zur Darreichung von Wirkstoffen. Durch die Anknüpfung der erfindungsgemäßen Verbindungen können beispielsweise Gewebe für Heterotransplantate, wie beispielsweise Herzklappen, für den Empfänger verträglicher gemacht werden. Weiterhin können Hilfsmittel zur Darreichung von Wirkstoffen, beispielsweise Liposomen oder Nanokapseln, modifiziert werden, um ihnen gewünschte Eigenschaften, insbesondere eine längere Halbwertszeit im Körper, zu verleihen.The invention further relates to conjugates comprising compounds of the formula (I) in covalent linkage to medical devices or auxiliaries Presentation of active ingredients. By connecting the compounds according to the invention, tissues for heterografts, such as heart valves, for example, can be made more tolerable for the recipient. Furthermore, auxiliary agents for the administration of active substances, for example liposomes or nanocapsules, can be modified in order to impart desired properties, in particular a longer half-life in the body.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die erfindungsgemäßen Verbindungen und insbesondere die erfindungsgemäßen Konjugate. . Solche pharmazeutischenThe invention further relates to a pharmaceutical composition comprising the compounds according to the invention and in particular the conjugates according to the invention. , Such pharmaceutical
Zusammensetzungen können beispielsweise zur Prävention oder Behandlung von Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Stoffwechsel- Erkrankungen, neuronalen bzw. cerebralen Erkrankungen oder entzündlichen Prozessen, wie Infektionen, Immunerkrankungen oder Autoimmunerkrankungen (z.B. rheumatoide Arthritis) eingesetzt werden.Compositions can be used, for example, for the prevention or treatment of cancer, cardiovascular diseases, metabolic diseases, neuronal or cerebral diseases or inflammatory processes such as infections, immune diseases or autoimmune diseases (e.g. rheumatoid arthritis).
Die erfindungsgemäßen Verbindungen bzw. Konjugate eignen sich auch hervorragend als diagnostische Mittel.The compounds or conjugates according to the invention are also outstandingly suitable as diagnostic agents.
Aufgrund der Mehrkomponentenreaktion ist es erfindungsgemäß ohne weiteres möglich, eine große Vielfalt von Verbindungen nach Anspruch 1 herzustellen. Durch Variation der Edukte können über weite Bereiche variierende und den jeweiligen Erfordernissen angepasste Verbindungen erhalten werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind somit kombinatorische Bibliotheken bzw. die Herstellung solcher Bibliotheken, welche wenigstens zwei, mehr bevorzugt wenigstens fünf, noch mehr bevorzugt wenigstens 10 und am meisten bevorzugt wenigstens 100 der erfindungsgemäßen Substanzen enthalten. Mit Hilfe solcher Bibliotheken kann auf einfache Weise nach gewünschten Eigenschaften, beispielsweise Bindeeigenschaften an Wirkstoffmoleküle oder Abschirmeigenschaften für bestimmte Wirkstoffe oder nach gewünschten Targetingeigenschaften gescreent werden.Because of the multi-component reaction, it is readily possible according to the invention to produce a wide variety of compounds according to claim 1. By varying the starting materials, compounds which vary over a wide range and are adapted to the respective requirements can be obtained. The present application therefore also relates to combinatorial libraries or the production of those libraries which contain at least two, more preferably at least five, more preferably at least 10 and most preferably at least 100 of the substances according to the invention. With the help of such libraries, it is easy to screen for desired properties, for example binding properties to active substance molecules or shielding properties for certain active substances, or for desired targeting properties.
Schließlich ist es erfindungsgemäß ohne weiteres möglich, einen Kit zur Verfügung zu stellen, der alle Reagenzien und Anleitungen sowie die erfindungsgemäßen Verbindungen umfasst, die es ermöglichen, eine Modifizierung von Proteinen, Nukleinsäuren oder anderen Wirkstoffen bzw. auch Oberflächen mit Polymeren in vitro auf einfache Weise durchzuführen. Die Umsetzung einer Substanz mit den erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt z.B. derart, dass zu einer Lösung oder einer Suspension der zu modifzierenden Substanz, z.B. eines Proteins, in wässrigem Puffer die erfindungsgemäße Polymer Verbindung mindestens in molarer Menge bezogen auf die Anzahl der modifizierbaren reaktiven Gruppen, z.B. Aminogruppen (Lysinreste, Histidin, N-Terminus), Carboxylgruppen (Asparaginsäure, Glutaminsäure, C-Terminus), Thiolgruppen (Cystein), Hydroxylgruppen (Serin, Threonin, Tyrosin) oder Carbonylgruppen (Aldehyde) gegeben wird. Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Polymer Verbindungen in einem molaren Überschuss von 1 bis 1000, mehr bevorzugt in einem molaren Überschuss von 1 bis 100 und besonders bevorzugt in einem molaren Überschuss von 1 bis 20 bezogen auf die modifizierbaren Gruppen eingesetzt.Finally, it is readily possible according to the invention to provide a kit which comprises all the reagents and instructions as well as the compounds according to the invention which make it possible to obtain a Modification of proteins, nucleic acids or other active substances or even surfaces with polymers can be carried out in vitro in a simple manner. The reaction of a substance with the compounds according to the invention takes place, for example, in such a way that, to a solution or a suspension of the substance to be modified, for example a protein, in aqueous buffer the polymer compound according to the invention is at least in molar amount based on the number of modifiable reactive groups, for example amino groups (Lysine residues, histidine, N-terminus), carboxyl groups (aspartic acid, glutamic acid, C-terminus), thiol groups (cysteine), hydroxyl groups (serine, threonine, tyrosine) or carbonyl groups (aldehydes). The polymer compounds according to the invention are preferably used in a molar excess of 1 to 1000, more preferably in a molar excess of 1 to 100 and particularly preferably in a molar excess of 1 to 20, based on the modifiable groups.
Als Reaktionslösungen eignen sich wässrige Puffer wie beispielsweise 0,001 bis 1 ,0 molare Lösungen von Natrium- oder Kalium-dihydrogenphosphat mit Dinatrium- oder Dikalium-hydrogenphosphat oder Natrium-, Kalium- oder Ammonium-hydrogencarbonat mit Dinatrium-, Dinatrium- oder Diammoniumcarbonat oder Tris(hydroxymethyl)-aminoethan mit Salzsäure, bevorzugt geeignet sind Pufferlösungen für den pH-Bereich zwischen pH 4 und pH 10, besonders bevorzugt zwischen pH 5 und pH 9.Suitable reaction solutions are aqueous buffers such as 0.001 to 1.0 molar solutions of sodium or potassium dihydrogen phosphate with disodium or dipotassium hydrogen phosphate or sodium, potassium or ammonium hydrogen carbonate with disodium, disodium or diammonium carbonate or Tris ( hydroxymethyl) aminoethane with hydrochloric acid, buffer solutions are preferably suitable for the pH range between pH 4 and pH 10, particularly preferably between pH 5 and pH 9.
Dem Puffer können bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Cosolventien Methanol, Ethanol, Propanol, i-Propanol, Butanol, Essigsäureethylester, Essigsäuremethylester, Dimethylformamid, Acetonitril, Dimethylsulfoxid oder Sulfolan in Mengen von 0,1 bis 50 Vol-%, mehr bevorzugt 0,1 bis 20 Vol-% zugesetzt werden, je nach Löslichkeit der Reaktionspartner. Die Reaktionstemperatur liegt zwischen 0°C und 90°C, bevorzugt bei 4°C bis 40°C.In the process according to the invention, the cosolvents methanol, ethanol, propanol, i-propanol, butanol, ethyl acetate, methyl acetate, dimethylformamide, acetonitrile, dimethyl sulfoxide or sulfolane can be added to the buffer in amounts of 0.1 to 50% by volume, more preferably 0.1 to 20 vol% are added, depending on the solubility of the reactants. The reaction temperature is between 0 ° C and 90 ° C, preferably 4 ° C to 40 ° C.
Des Weiteren können den Puffern Stabilisatoren oder Detergenzien zugesetzt sein, z.B. Natriumazid, Glycerin, Ethylenglykole bzw. ionische oder nicht-ionische Detergenzien.. Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Konjugat- Rohprodukte können weiterhin durch Dialyse, chromatographische Verfahren oder Ultrafiltration (auch solche für Zentrifugen) mit wässrigen Pufferlösungen oder reinem Wasser sowie durch dem Fachmann geläufige Verfahren gereinigt und dann der weiteren Anwendung zugeführt werden.Furthermore, stabilizers or detergents can be added to the buffers, for example sodium azide, glycerol, ethylene glycols or ionic or non-ionic detergents. The conjugate crude products obtainable by the process according to the invention can furthermore be purified by dialysis, chromatographic processes or ultrafiltration (including those for centrifuges) with aqueous buffer solutions or pure water and by processes familiar to the person skilled in the art and then used for further use.
Der Strukturnachweis der Produkte (Konjugate), d.h. die analytische Anzahl der kovalent gebundenen erfindungsgemäßen Polymer-Verbindungen erfolgt durch die direkte Messung des Molekulargewichts, z.B. mittels der MALDI- TOF-Massenspektrometrie, durch selektive Bestimmung einer oder mehrerer kovalent gebundener Komponenten oder durch indirekten Nachweis der nicht modifizierten Gruppen. So lässt sich beispielsweise ein über die erfindungsgemäße Verbindung eingeführtes Farbstoffmolekül in einfacher Weise über die Messung der Extinktion (UVΛ IS) bestimmen. Ferner lässt sich beispielsweise die Zahl nicht modifizierter Aminogruppen durch Umsetzung mit Fluorescamin fluorometrisch bestimmen.The structural evidence of the products (conjugates), i.e. the analytical number of covalently bound polymer compounds according to the invention is carried out by direct measurement of the molecular weight, e.g. by means of MALDI-TOF mass spectrometry, by selective determination of one or more covalently bound components or by indirect detection of the unmodified groups. For example, a dye molecule introduced via the compound according to the invention can be determined in a simple manner by measuring the absorbance (UVΛIS). Furthermore, the number of unmodified amino groups, for example, can be determined fluorometrically by reaction with fluorescamine.
Als direkter Nachweis der Verbesserung der Eigenschaften des Konjugats aus einer erfindungsgemäßen Polymer Verbindung kann beispielsweise die Stabilität des Konjugats gegenüber Proteasen untersucht werden.The stability of the conjugate towards proteases can be investigated, for example, as direct evidence of the improvement in the properties of the conjugate from a polymer compound according to the invention.
Die Erfindung wird durch die beigefügten Beispiele und Abbildungen weiter erläutert:The invention is further illustrated by the attached examples and figures:
Abbildung 1 : Analyse von Konjugaten aus L-Asparaginase und Substanz 16 mittels SDS-PAGE. Die Proben sind: Spuren 1 ) und 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), Spur 2) L- Asparaginase (Kontrolle, 2μg), Spur 3) modifizierte L-Asparaginase (0,5eq. Substanz 16), Spur 4) modifizierte L-Asparaginase (1eq. Substanz 16), Spur 5) modifizierte L-Asparaginase (2eq. Substanz 16), Spur 6) modifizierte L- Asparaginase (5eq. Substanz 16), Spur 7) modifizierte L-Asparaginase (10eq. Substanz 16) und Spur 8) modifizierte L-Asparaginase (20eq. Substanz 16).Figure 1: Analysis of conjugates from L-asparaginase and substance 16 using SDS-PAGE. The samples are: lanes 1) and 9) protein standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) L-asparaginase (control, 2μg), lane 3) modified L-asparaginase (0.5eq. Substance 16), Lane 4) modified L-asparaginase (1eq. Substance 16), lane 5) modified L-asparaginase (2eq. Substance 16), lane 6) modified L-asparaginase (5eq. Substance 16), lane 7) modified L-asparaginase ( 10eq. Substance 16) and lane 8) modified L-asparaginase (20eq. Substance 16).
Abbildung 2: Proteasestabilität eines Konjugats aus L-Asparaginase und der Substanz 16: Einfluss der Modifikation von L-Asparaginase mit Substanz 16 auf die Stabilität von L-Asparaginase gegenüber Trypsin abgeleitet aus der Restaktivität. Durch Modifikation mit Substanz 16 wird die Stabilität gegenüber Trypsin deutlich erhöht.Figure 2: Protease stability of a conjugate of L-asparaginase and substance 16: Influence of the modification of L-asparaginase with substance 16 on the Stability of L-asparaginase against trypsin derived from residual activity. Modification with substance 16 significantly increases the stability towards trypsin.
Abbildung 3: Einfluss der Modifikation von L-Asparaginase mit Substanz 16 auf die Stabilität von L-Asparaginase gegenüber Chymotrypsin abgeleitet aus der Restaktivität. Durch Modifikation mit Substanz 16 wird die Stabilität gegenüber Chymotrypsin deutlich erhöht.Figure 3: Influence of the modification of L-asparaginase with substance 16 on the stability of L-asparaginase against chymotrypsin derived from the residual activity. Modification with substance 16 significantly increases the stability towards chymotrypsin.
Abbildung 4: Analyse von Konjugaten aus Streptokinase und Substanz 16 mittels SDS-PAGE. Die Proben sind: Spuren 1 ) und 8) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), Spur 2) Streptokinase (Kontrolle, 2μg), Spur 3) modifizierte Streptokinase (0,5eq. Substanz 16), Spur 4) modifizierte Streptokinase (1eq. Substanz 16), Spur 5) modifizierte Streptokinase (2eq. Substanz 16), Spur 6) modifizierte Streptokinase (5eq. Substanz 16) und Spur 7) modifizierte Streptokinase (10eq. Substanz 16).Figure 4: Analysis of conjugates from streptokinase and substance 16 using SDS-PAGE. The samples are: lanes 1) and 8) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) streptokinase (control, 2μg), lane 3) modified streptokinase (0.5eq. Substance 16), lane 4) Streptokinase (1eq. Substance 16), lane 5) modified streptokinase (2eq. Substance 16), lane 6) modified streptokinase (5eq. Substance 16) and lane 7) modified streptokinase (10eq. Substance 16).
Abbildung 5: Analyse von Konjugaten aus Trypsin und Substanz 16 mittels SDS-PAGE. Die Proben sind: Spuren 1 ), 2) und 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), Spur 2) Trypsin (Kontrolle, 2μg), Spur 3) modifiziertes Trypsin (0,5eq. Substanz 16), Spur 4) modifiziertes Trypsin (1eq. Substanz 16), Spur 5) modifiziertes Trypsin (2eq. Substanz 16), Spur 6) modifiziertes Trypsin (5eq. Substanz 16) und Spur 7) modifiziertes Trypsin (10eq. Substanz 16).Figure 5: Analysis of conjugates from trypsin and substance 16 using SDS-PAGE. The samples are: lanes 1), 2) and 9) Protein Standard (Low Molecular Weight Marker, Amersham Pharmacia), lane 2) trypsin (control, 2μg), lane 3) modified trypsin (0.5eq. Substance 16), lane 4) modified trypsin (1eq. Substance 16), lane 5) modified trypsin (2eq. Substance 16), lane 6) modified trypsin (5eq. Substance 16) and lane 7) modified trypsin (10eq. Substance 16).
A. Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen gemäß Ansprüchen 1 bis 6A. Examples of compounds according to the invention according to claims 1 to 6
Im Rahmen der Mehrkomponentenreaktion werden eine Aminokomponente, eine Oxo- bzw. Carbonylkomponente, eine Isocyankomponente und eine Säurekomponente zur erfindungsgemäßen Verbindung umgesetzt. Die verwendeten primären Amine sind kommerziell erhältlich oder können, ausgehend von den Monomethoxypolyethylenglykolen, durch eine Gabriel- Synthese oder aus der entsprechenden Azidoverbindung durch katalytische Hydrierung hergestellt werden. Sekundäre Amine, symmetrisch oder unsymmetrisch, sind aus einem primären Amin durch reduktive Aminierung mit einem entsprechenden Aldehyd, der z.B. über eine Swern-Oxidation aus Monomethoxypolyethylenglykol erhalten wird, zugänglich oder können durch einfache Substitutionsreaktionen gewonnen werden.In the context of the multi-component reaction, an amino component, an oxo or carbonyl component, an isocyanine component and an acid component are reacted to the compound according to the invention. The primary amines used are commercially available or, starting from the monomethoxypolyethylene glycols, can be prepared by a Gabriel synthesis or from the corresponding azido compound by catalytic hydrogenation. Secondary amines, symmetrical or asymmetrical, are obtainable from a primary amine by reductive amination with a corresponding aldehyde, which is obtained, for example, by Swern oxidation from monomethoxypolyethylene glycol, or can be obtained by simple substitution reactions.
11
MS (ES+): m/z: 398,2 [M+H]+, 420,2 [M+Na]+; C18H39O8.MS (ES +): m / z: 398.2 [M + H] + , 420.2 [M + Na] + ; C 18 H 39 O 8 .
Isonitrile sind im großen Umfang kommerziell erhältlich. Weiterhin steht eine große Anzahl von synthetischen Methoden zu deren Herstellung zur Verfügung. Ein sehr zuverlässiges Verfahren ist die Darstellung von Isonitrilen aus primären Aminen über die Umsetzung zum Formamid mit anschließender Dehydratisierung unter Verwendung von Phosgen oder POCI3 (I. Ugi; R. Meyr, Angew. Chem. 1958, 70, 702). Alternativ dazu können Isonitrile auf einfache Weise durch Umsetzung eines primären oder sekundären Amins mit einem Ω-Isocyanocarbonsäuremethyl- bzw. ethylester erhalten werden.Isonitriles are commercially available on a large scale. A large number of synthetic methods are also available for their production. A very reliable method is the preparation of isonitriles from primary amines via the conversion to formamide with subsequent dehydration using phosgene or POCI 3 (I. Ugi; R. Meyr, Angew. Chem. 1958, 70, 702). Alternatively, isonitriles can be obtained in a simple manner by reacting a primary or secondary amine with a methyl or ethyl Ω-isocyanocarboxylic acid ester.
Schema: 1Scheme: 1
Zu 2 (3,00 g; 18,4 mmol) wird unter Rühren Isocyanoessigsäuremethylester (1 ,82 g; 18,4 mmol) bei 20-25°C zugegeben. Die erhalten Reaktionsmischung wird anschließend 24 Stunden bei 20-25°C gerührt. Säulenchromatographische Reinigung ergibt 4 (3,64 g; 86 %) als hellgelbesTo 2 (3.00 g; 18.4 mmol) methyl isocyanoacetate (1.82 g; 18.4 mmol) is added at 20-25 ° C. with stirring. The reaction mixture obtained is then stirred at 20-25 ° C for 24 hours. Purification by column chromatography gives 4 (3.64 g; 86%) as light yellow
Öl.Oil.
MS (ES-): m/z: 229.2 [M-H]", MS (ES+): m/z: 231.1 [M+H]+; C10H18N2O4 MS (ES-): m / z: 229.2 [MH] " , MS (ES +): m / z: 231.1 [M + H] + ; C 10 H 18 N 2 O 4
Als Oxo- bzw. Carbonylkomponente kann eine große Anzahl an Aldehyden oder Ketonen verwendet werden. Um jedoch die Bildung von Chiralitätszentren und die sich daraus ergebenden Enatiomeren- bzw. Diastereomerengemischen (höherer Verzweigungsgrad) zu vermeiden, werden symmetrische Ketone, wie z.B. Aceton, und der einfache Formaldehyd bevorzugt verwendet. Zur Darstellung von Aldehyden des Polyethylenglykols bzw. Monomethoxyethylenglykols gibt es eine breite Auswahl an synthetischen Möglichkeiten. Sie können durch direkte Oxidation der terminalen Hydroxyfunktion (z.B. Swem-Oxidation) oder auch aus ungesättigten Ethern oder Estern (z.B. Allylethem) durch oxidative Spaltung der Doppelbindung (z.B. Ozonolyse, kat. OsO4/NalO4) erhalten werden.A large number of aldehydes or ketones can be used as the oxo or carbonyl component. However, in order to avoid the formation of chirality centers and the resulting enantiomer or diastereomer mixtures (higher degree of branching), symmetrical ketones, such as acetone, and the simple formaldehyde are preferably used. There is a wide range of synthetic options for the preparation of aldehydes of polyethylene glycol or monomethoxyethylene glycol. They can be obtained by direct oxidation of the terminal hydroxyl function (for example Swem oxidation) or from unsaturated ethers or esters (for example allyl ether) by oxidative cleavage of the double bond (for example ozonolysis, cat. OsO 4 / NalO 4 ).
Die Säurekomponente dient gleichzeitig als Linker für die spätere Kopplung an den Wirkstoff, sodass bevorzugt Carbonsäuren verwendet werden, die durch wenige synthetische Schritte nach erfolgreicher Mehrkomponentenreaktion in eine aktivierte Form der erfindungsgemäßen Verbindung umgewandelt werden können. Dies können Monoester von Dicarbonsäuren (z.B. Bernsteinsäure-mono-tert-butylester) oder ungesättigte Monocarbonsäuren (z.B. 4-Pentencarbonsäure) sein. Zur Erreichung eines höheren Verzweigungsgrades der erfindungsgemäßen Verbindung können N-substituierte Aminosäuren (z.B. N-Boc-L- Glutaminsäure, N-Boc-L- Asparaginsäure) oder höherverzweigte Carbonsäuren (z.B. Tricarbonsäure 7) verwendet werden.The acid component also serves as a linker for later coupling to the active substance, so that carboxylic acids are preferably used, which can be converted into an activated form of the compound according to the invention by a few synthetic steps after a successful multi-component reaction. These can be monoesters of dicarboxylic acids (e.g. succinic acid mono-tert-butyl ester) or unsaturated monocarboxylic acids (e.g. 4-pentenecarboxylic acid). To achieve a higher degree of branching of the compound according to the invention, N-substituted amino acids (e.g. N-Boc-L-glutamic acid, N-Boc-L-aspartic acid) or more highly branched carboxylic acids (e.g. tricarboxylic acid 7) can be used.
7 ist einfach aus der CH-aziden Verbindung 5 in zwei Schritten zugänglich. Alternativ dazu kann diese Verbindung auch ausgehend von Malonsäure dargestellt werden (A.N. Blanchard, DJ. Burneil, Tetrahedron Lett. 2001, 42, 4779-4781 ). Solche Tricarbonsäuretriester können auch durch thermische Decarboxylierung in die Dicarbonsäurediester überführt werden, sodass sehr leicht eine Vielzahl von Dicarbonsäuren verfügbar wird. Schema 2:7 is easily accessible from the CH-acidic compound 5 in two steps. Alternatively, this connection can also be prepared starting from malonic acid (AN Blanchard, DJ. Burneil, Tetrahedron Lett. 2001, 42, 4779-4781). Such tricarboxylic acid triesters can also be converted into the dicarboxylic acid diesters by thermal decarboxylation, so that a large number of dicarboxylic acids are very easily available. Scheme 2:
Zu einer Suspension von NaH (34 mg; 60 % in Öl) in einer Mischung von THF (3 mL) und DMF (1mL) wird 5 (200 mg; 0,81 mmol) bei 20-25°C zugegeben. Nach ca. 10 min (Wasserstoffentwicklung) wird 5-Brom-1-penten (121 mg; 0,81 mmol) bei 20-25°C zugegeben. Die erhaltene Reaktionsmischung wird anschließend bei 50°C 48 Stunden gerührt. Nach dem Abkühlen auf 20-25°C wird die Reaktionsmischung mit einer Ammoniumchloridlösung (0,5 M; 2mL) verdünnt. Chromatographische Reinigung des Rohproduktes, das durch Extraktion mit Ethylacetat erhalten wird, ergibt 6 (214 mg; 84 %) als farbloses Öl. 1H-NMR (200 MHz, CDCI3): δ = 1 ,20-1 ,40 (11 H); 1 ,93-2,10 (4H); 2,97 (s, 2H); 4,15-4,25 (OCH2) 6H); 4,95-5,05 (2H); 5,70-5,85 (1 H) MS (ES+): m/z: 315,1 [M+H]+, 337,0 [M+Na]+; C16H26O6.5 (200 mg; 0.81 mmol) at 20-25 ° C is added to a suspension of NaH (34 mg; 60% in oil) in a mixture of THF (3 mL) and DMF (1 ml). After approx. 10 min (evolution of hydrogen), 5-bromo-1-pentene (121 mg; 0.81 mmol) is added at 20-25 ° C. The reaction mixture obtained is then stirred at 50 ° C. for 48 hours. After cooling to 20-25 ° C, the reaction mixture is diluted with an ammonium chloride solution (0.5 M; 2mL). Chromatographic purification of the crude product, which is obtained by extraction with ethyl acetate, gives 6 (214 mg; 84%) as a colorless oil. 1 H NMR (200 MHz, CDCI 3 ): δ = 1, 20-1, 40 (11 H); 1.93-2.10 (4H); 2.97 (s, 2H); 4.15-4.25 (OCH 2) 6H); 4.95-5.05 (2H); 5.70-5.85 (1H) MS (ES +): m / z: 315.1 [M + H] + , 337.0 [M + Na] + ; C 16 H 26 O 6 .
Zu einer Lösung von 6 (2,0 g; 6,4 mmol) in Ethanol (20mL) wurde NaOH (2M, 5mL) bei 20-25°C gegeben. Diese Mischung wurde auf 55°C erhitzt und anschließend 72 Stunden bei dieser Temperatur gerührt. Die Reaktionsmischung wurde anschließend auf 20-25°C abgekühlt und das Ethanol wurde im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in Wasser/Methanol (1 :1 , 20mL) gelöst und auf aktiviertes Dowex 50 (H+-Form 10 g) aufgegeben. Das Produkt wurde mit Wasser/MeOH (4:1 ,40 mL) eluiert. Azeotrope Destillation mit Toluol im Vakuum ergibt 7 (1 ,45 g, quantitativ) als weiß-grauen Feststoff.NaOH (2M, 5mL) was added to a solution of 6 (2.0 g; 6.4 mmol) in ethanol (20mL) at 20-25 ° C. This mixture was heated to 55 ° C. and then stirred at this temperature for 72 hours. The reaction mixture was then cooled to 20-25 ° C and the ethanol was removed in vacuo. The residue was dissolved in water / methanol (1: 1, 20mL) and activated Dowex 50 (H + form 10 g) abandoned. The product was eluted with water / MeOH (4: 1, 40 mL). Azeotropic distillation with toluene in vacuo gives 7 (1.45 g, quantitative) as a white-gray solid.
1H-NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1 ,15-1 ,29 (2H); 1 ,75-2,05 (4H); 2,72 (s, 2H); 4,87-5,05 (2H); 5,63-5,85 (1 H). 1 H NMR (200 MHz, DMSO-d6): δ = 1.15-1.29 (2H); 1.75-2.05 (4H); 2.72 (s, 2H); 4.87-5.05 (2H); 5.63-5.85 (1H).
13H-NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 23,39; 32,25; 33,41 ; 37,25; 54,43; 13 H NMR (50 MHz, DMSO-d6): δ = 23.39; 32.25; 33.41; 37.25; 54.43;
115,16; 138,33; 171 ,90; 172,31 ; 172,32.115.16; 138.33; 171, 90; 172.31; 172.32.
MS (ES+): m/z: 231 ,0 [M+H]+, 253,0 [M+Na]+; C10H14O6.MS (ES +): m / z: 231.0 [M + H] + , 253.0 [M + Na] + ; C 10 H 14 O 6 .
Der Hauptschritt der Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen erfolgt durch eine Mehrkomponentenreaktion, wobei die Ugi-Reaktion mit drei (U- 3CR) oder vier (U-4CR) Komponenten in flüssiger Phase bevorzugt ist. Im Fall der U-4CR wird in flüssiger Phase die Aminkomponente mit der Oxokomponente, der Säurekomponente und einer Isocyanokomponente nach der folgenden allgemeinen Formel zur Reaktion gebracht:The main step in the synthesis of the compounds according to the invention takes place by a multicomponent reaction, the Ugi reaction with three (U-3CR) or four (U-4CR) components in the liquid phase being preferred. In the case of the U-4CR, the amine component is reacted in the liquid phase with the oxo component, the acid component and an isocyano component according to the following general formula:
Schema 3: Allgemeines Reaktionsschema U-4CRScheme 3: General reaction scheme U-4CR
w oWhere
NH, + C=0 + -v + -NCNH, + C = 0 + -v + -NC
HO'HO '
X wX w
H o wH o w
-N- -N- -V-N- -N- -V
W XW X
Vorteilhaft ist es, je ein Äquivalent der Einzelkomponenten bei der Umsetzung zu verwenden. Weiterhin kann es auch von Vorteil sein, das Azomethin durch eine Vorkondensation zu bilden. Als Lösungsmittel können aprotische, polar sowie unpolar, und protische, polare verwendet werden. Besonders eigenen sich hierfür als protische Lösungsmittel Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Wasser bzw. Wasser/Alkoholgemische sowie DMF oder Acetonitril. Bei den aprotischen Lösungsmitteln werden häufig Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Chloroform verwendet. Lewis Säuren, wie Bortrifluoridetherat oder Zinkchlorid, wirken förderlich auf die Ugi- Reaktion. Üblicherweise werden die Reaktionen bei -20°C bis 100°C durchgeführt, jedoch sind Reaktionstemperaturen zwischen 0°C und 50°C bevorzugt.It is advantageous to use one equivalent each of the individual components in the implementation. It may also be advantageous to form the azomethine by precondensation. Aprotic, polar and non-polar, and protic, polar can be used as solvents. Alcohols such as methanol, ethanol, water or water / alcohol mixtures and DMF or are particularly suitable as protic solvents for this Acetonitrile. For the aprotic solvents, dichloromethane, tetrahydrofuran or chloroform are often used. Lewis acids, such as boron trifluoride etherate or zinc chloride, have a beneficial effect on the Ugi reaction. The reactions are usually carried out at from -20 ° C. to 100 ° C., but reaction temperatures between 0 ° C. and 50 ° C. are preferred.
Allgemeine Vorschrift:General rule:
Eine Lösung aus der Aminkomponente (3,4 mmol) und der Oxokomponente (3,4 mmol) in Methanol (30 mL) wird 10 - 15 min gerührt. Zu dieser Lösung wird anschließend das Isonitril (3,4 mmol) und die Säurekomponente (3,4 mmol) zugegeben. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt chromatographisch oder durch Kristallisation gereinigt.A solution of the amine component (3.4 mmol) and the oxo component (3.4 mmol) in methanol (30 mL) is stirred for 10-15 min. The isonitrile (3.4 mmol) and the acid component (3.4 mmol) are then added to this solution. The reaction solution is stirred for 12 hours. The solvent is then removed in vacuo and the crude product is purified by chromatography or by crystallization.
Beispiel 1 :Example 1 :
1H-NMR (200 MHz, CDCI3): δ = 1 ,21 (t, 3H); 1 ,37 (s, 9H); 2,45-2,65 ( 4H); 3,32 (s, 3H) 3,45-3,65 (16H); 3,90-3,99 (2H); 4,05-4,16 (4H); 7,18 (t, NH) MS (ES+): m/z: 507,3 [M+H]+, 529,3 [M+Na]+; C23H42N2O10. 1 H NMR (200 MHz, CDCI 3 ): δ = 1, 21 (t, 3H); 1.37 (s, 9H); 2.45-2.65 (4H); 3.32 (s, 3H) 3.45-3.65 (16H); 3.90-3.99 (2H); 4.05-4.16 (4H); 7.18 (t, NH) MS (ES +): m / z: 507.3 [M + H] + , 529.3 [M + Na] + ; C 23 H 42 N 2 O 10 .
Beispiel 2:Example 2:
MS (ES+): m/z: 624,4 [M+H]+, 646,4 [M+Na]+; C28H53O 12 Beispiel 3:MS (ES +): m / z: 624.4 [M + H] + , 646.4 [M + Na] + ; C 28 H 53 O 1 2 Example 3:
MS (ES+): m/z: 902,9 [M+H]+; (ES-): m/z: 879,1 [M-H]"; C40H73N5O16 MS (ES +): m / z: 902.9 [M + H] + ; (ES-): m / z: 879.1 [MH] " ; C 40 H 73 N 5 O 16
Beispiel 4:Example 4:
MS (ES+): m/z: 916,3 [M+H]+; 938,3 [M+Na]+; C49H78N4O12 MS (ES +): m / z: 916.3 [M + H] + ; 938.3 [M + Na] + ; C 49 H 78 N 4 O 12
Weiterhin kann es von Vorteil sein, Säurekomponenten zu verwenden, die gleichzeitig als Schutzgruppe der Aminofunktionalität dienen. Solche Schutzgruppen können anschließend entfernt werden, sodass das gebildete sekundäre Amin auch über allgemein bekannte Methoden aus der Peptidchemie später an Carbonsäuren gekoppelt werden kann. Beispiele für solche Säuren sind Trifluoressigsäure oder 4-Pentencarbonsäure.It may also be advantageous to use acid components which simultaneously serve as a protective group for the amino functionality. Such protective groups can then be removed so that the secondary amine formed can also be coupled to carboxylic acids later using generally known methods from peptide chemistry. examples for such acids are trifluoroacetic acid or 4-pentenecarboxylic acid.
Beispiel: 5Example: 5
MS (ES+): m/z: 465,3 [M+H]+; 487,3 [M+Na]+; C25H40N2O6 MS (ES +): m / z: 465.3 [M + H] + ; 487.3 [M + Na] + ; C 25 H 40 N 2 O 6
Beispiel 6:Example 6:
MS (ES+): m/z: 608,6 [M+H]+; 630,3 [M+Na]+; C24H44F3 30^MS (ES +): m / z: 608.6 [M + H] + ; 630.3 [M + Na] + ; C 24 H 44 F 3 3 0 ^
In manchen Fällen kann es von Vorteil sein, die Säurekomponente durch eine Säure zu ersetzen, die nicht im Sinne der Ugi-Reaktion reagiert. Als Säuren kommen z.B. Mineralsäuren, wie Salz- oder Schwefelsäure, Sulfonsäuren und Lewissäuren, wie Bortrifluoridetherat oder lnCI3 zum Einsatz. Wasser übernimmt bei dieser U-3CR die Funktion der Säurekomponente, wobei ein sekundäres Amin gebildet wird. Dieses sekundäre Amin kann danach durch verschiedene Amidierungsmethoden, die aus der Peptidchemie bereits bekannt sind, an verzweigte oder unverzweigte Carbonsäurefunktionalitäten gekoppelt werden. Im Fall der U- 3CR wird in flüssiger Phase die Aminkomponente mit der Oxokomponente, der Säurekomponente (z.B. Schwefelsäure) und einer Isocyanokomponente nach der folgenden allgemeinen Formel zur Reaktion gebracht:In some cases it can be advantageous to replace the acid component with an acid that does not react in the sense of the Ugi reaction. Examples of acids used are mineral acids, such as hydrochloric or sulfuric acid, sulfonic acids and Lewis acids, such as boron trifluoride etherate or INCI 3 . With this U-3CR, water takes on the function of the acid component, forming a secondary amine. This secondary amine can then be coupled to branched or unbranched carboxylic acid functionalities by various amidation methods which are already known from peptide chemistry. In the case of the U-3CR, the amine component with the oxo component, the acid component (eg sulfuric acid) and an isocyanocomponent are in the liquid phase reacted according to the following general formula:
Schema 3: allgemeines Reaktionsschema U-3CRScheme 3: general reaction scheme U-3CR
Vorteilhaft ist es, je ein Äquivalent der Einzelkomponenten bei der Umsetzung zu verwenden. Weiterhin kann es auch von Vorteil sein, das Azomethin durch eine Vorkondensation zu bilden. Als Lösungsmittel können aprotische, polar sowie unpolar, und protische, polare verwendet werden. Besonders eigenen sich hierfür als protische Lösungsmittel Alkohole, wie Methanol, Ethanol, Wasser bzw. Wasser/Alkoholgemische sowie DMF oder Acetonitril. Bei den aprotischen Lösungsmitteln werden häufig Dichlormethan, Tetrahydrofuran oder Chloroform verwendet. Üblicherweise werden die Reaktionen bei -20°C bis 100°C durchgeführt, jedoch sind Reaktionstemperaturen zwischen 0°C und 50°C bevorzugt.It is advantageous to use one equivalent each of the individual components in the implementation. It may also be advantageous to form the azomethine by precondensation. Aprotic, polar and non-polar, and protic, polar can be used as solvents. Alcohols such as methanol, ethanol, water or water / alcohol mixtures and DMF or acetonitrile are particularly suitable as protic solvents for this. For the aprotic solvents, dichloromethane, tetrahydrofuran or chloroform are often used. The reactions are usually carried out at from -20 ° C. to 100 ° C., but reaction temperatures between 0 ° C. and 50 ° C. are preferred.
Allgemeine Vorschrift:General rule:
Eine Lösung aus der Aminkomponente (1 ,2 mmol) und der Oxokomponente (1 ,2 mmol) in Methanol (2 mL) wird 10 - 15 min gerührt. Zu dieser Lösung wird anschließend das Isonitril (1 ,2 mmol) und die Säure oder eine Lewis Säure (1 ,2 mmol) zugegeben. Die Reaktionslösung wird 12 Stunden gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und das Rohprodukt chromatographisch oder durch Kristallisation gereinigt. Beispiel 7:A solution of the amine component (1.2 mmol) and the oxo component (1.2 mmol) in methanol (2 mL) is stirred for 10-15 min. The isonitrile (1.2 mmol) and the acid or a Lewis acid (1.2 mmol) are then added to this solution. The reaction solution is stirred for 12 hours. The solvent is then removed in vacuo and the crude product is purified by chromatography or by crystallization. Example 7:
1414
MS (ES+): m/z: 349,4 [M+H]+, 371 ,4 [M+Na]+; C16H32N2O6 MS (ES +): m / z: 349.4 [M + H] + , 371.4 [M + Na] + ; C 16 H 32 N 2 O 6
Umwandlung zu einem Aktivester am Beispiel von 7Conversion to an active ester using the example of 7
Die Spaltung des tert-Butylesters erfolgt unter Standardbedingungen z.B. mit Mineralsäuren wie HCI oder HCI in Dioxan. Alternativ dazu kann auch Trifluoressigsäure verwendet werden.The tert-butyl ester is cleaved under standard conditions e.g. with mineral acids such as HCI or HCI in dioxane. Alternatively, trifluoroacetic acid can also be used.
MS (ES+): m/z: 451 ,2 [M+H]+, 473,2 [M+Na]+; C19H34N2O10 MS (ES +): m / z: 451.2 [M + H] + , 473.2 [M + Na] + ; C 19 H 34 N 2 O 10
Durch Umsetzung von 15 mit DCC und N-Hydroxysuccinimid wird 16 erhalten.Reaction of 15 with DCC and N-hydroxysuccinimide gives 16.
1H-NMR (200 MHz, CDCI3): δ = 1 ,23 (t, 3H); 2,64-2,70 (2H); 2,82 (bs, 4H); 2,93-3,00 (2H) 3,36 (s, 3H) 3,50-3,72 (16H); 3,96-4,05 (2H); 4,08-4,20 (4H); 7,14 (t, NH) MS (ES+): m/z: 548,3 [M+H]+, 570,3 [M+Na]+; C23H37N3O12 B. Beispiele für die Modifikation von biopharmazeutischen, pharmazeutischen oder/und synthetischen Wirkstoffen mit erfindungsgemäßen Verbindungen 1 H NMR (200 MHz, CDCI 3 ): δ = 1, 23 (t, 3H); 2.64-2.70 (2H); 2.82 (bs, 4H); 2.93-3.00 (2H) 3.36 (s, 3H) 3.50-3.72 (16H); 3.96-4.05 (2H); 4.08-4.20 (4H); 7.14 (t, NH) MS (ES +): m / z: 548.3 [M + H] + , 570.3 [M + Na] + ; C 23 H 37 N 3 O 12 B. Examples of the modification of biopharmaceutical, pharmaceutical and / or synthetic active ingredients with compounds according to the invention
Die folgenden Beispiele sollen den Nutzen der erfindungsgemäßen Verbindungen demonstrieren, die Erfindung jedoch nicht einschränken.The following examples are intended to demonstrate the utility of the compounds of the invention, but are not intended to limit the invention.
Allgemeine Methoden: Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford mit Coomassie Brilliant Blau G-250 mit Rinderserumalbumin als Referenzprotein ermittelt (Bradford 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254. ). Denaturierende Polyacrylamid-Gelelektrophoresen (SDS-PGAE) wurden nach Laemmli (1970) mit 7,5% Polyacrylamidgelen durchgeführt. Proteine wurden anschließend mit Coomassie Brilliant Blau R-250 angefärbt. Der Grad der Modifikation von Lysinresten wurde nach der Methode von Stocks et al. (Stocks et. al. 1986, Anal. Biochem. 154, 232-234) durch Quantifizierung der nicht modifzierten Aminogruppen mit Fluorescamin bestimmt (λex = 390nm; λem= 475nm).General methods: Protein concentrations were determined using the Bradford method with Coomassie Brilliant Blau G-250 with bovine serum albumin as the reference protein (Bradford 1976, Anal. Biochem. 72, 248-254.). Denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PGAE) was carried out according to Laemmli (1970) with 7.5% polyacrylamide gels. Proteins were then stained with Coomassie Brilliant Blue R-250. The degree of modification of lysine residues was determined using the method of Stocks et al. (Stocks et. Al. 1986, Anal. Biochem. 154, 232-234) by quantification of the unmodified amino groups with fluorescamine (λ ex = 390 nm; λ em = 475 nm).
Für die Experimente wurden Rinderserumalbumin (kurz: BSA, Sigma), L- Asparaginase (kurz: ASNase, ProThera), Streptokinase (Sigma), Trypsin (Sigma) und Chymotrypsin (Sigma) verwendet.Bovine serum albumin (short: BSA, Sigma), L-asparaginase (short: ASNase, ProThera), streptokinase (Sigma), trypsin (Sigma) and chymotrypsin (Sigma) were used for the experiments.
Bestimmung der Enzymaktivitäten: L-Asparaginase katalysiert die Deamidierung von L-Asparagin zu L-Asparaginsäure. Bei dieser Reaktion freiwerdendes Ammonium wurde zur Bestimmung der Enzymaktivität mittels Neßler Reagenz quantifiziert. Streptokinase aktiviert Plasminogen. Auf diese Weise aktiviertes Plasminogen katalysiert die Hydrolyse des Tripeptid- Derivates D-Val-Leu-Lys-para-Nitroanilid (S-2251). Zur indirekten Bestimmung der Aktivität von Streptokinase wurde die Menge an freigesetzten Nitroanilins photometrisch bei 405nm quantifiziert. Die peptidolytische Aktivität von Trypsin wurde mithilfe des para-Nitroanilid- Derivates α-Benzoyl-Arginin-para-Nitroanilid durch Quantifizierung des freigesetzten Nitroanilins photometrisch bei 405nm ermittelt.Determination of enzyme activities: L-asparaginase catalyzes the deamidation of L-asparagine to L-aspartic acid. Ammonium released during this reaction was quantified by means of a Nessler reagent to determine the enzyme activity. Streptokinase activates plasminogen. Plasminogen activated in this way catalyzes the hydrolysis of the tripeptide derivative D-Val-Leu-Lys-para-nitroanilide (S-2251). For indirect determination of the activity of streptokinase, the amount of nitroaniline released was quantified photometrically at 405nm. The peptidolytic activity of trypsin was determined using the para-nitroanilide derivative α-benzoyl-arginine-para-nitroanilide by quantification of the released nitroaniline photometrically at 405nm.
Untersuchung der Stabilität der erfindungsgemäßen Konjugate gegenüber Proteolyse durch Trypsin bzw. Chymotrypsin: Die Konjugate, umfassend eine erfindungsgemäße Verbindung kovalent gekoppelt an einen biopharmazeutischen, pharmazeutischen oder synthetischen Wirkstoff, wurden in Gegenwart von Trypsin oder Chymotrypsin für mindestens 90min bei 37°C inkubiert. Zu verschiedenen Zeitpunkten wurden Aliquots entnommen und aus diesen die Restaktivität des zu untersuchenden Konjugats bestimmt. Trypsin spaltet Peptide und Proteine vorzugsweise C- terminal von basischen Aminosäuren (Lysin- und Argininresten), Chymotrypsin vorzugsweise C-terminal von aromatischen Aminosäuren (Tryptophan-, Phenylalanin- und Tyrosinresten).Investigation of the stability of the conjugates according to the invention against proteolysis by trypsin or chymotrypsin: The conjugates comprising a compound according to the invention covalently coupled to one biopharmaceutical, pharmaceutical or synthetic active ingredient were incubated in the presence of trypsin or chymotrypsin for at least 90min at 37 ° C. Aliquots were taken at various times and the residual activity of the conjugate to be examined was determined from these. Trypsin cleaves peptides and proteins preferably at the C-terminal of basic amino acids (lysine and arginine residues), chymotrypsin preferably at the C-terminal of aromatic amino acids (tryptophan, phenylalanine and tyrosine residues).
Beispiel B1 :Example B1:
Herstellung eines Konjugates aus einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Substanz 16 und L-Asparaginase.Preparation of a conjugate from a compound according to the invention according to substance 16 and L-asparaginase.
Zu 75μL einer L-Asparaginase-Lösung (0,5mg/mL) in Natriumcarbonat- Puffer (pH 8,5 bis 9,5) wurde Substanz 16 (0,5eq./0,7μL, 1eq./1 ,4μL, 2eq./2,7μL, 5eq./6,8μL, 10eq./13,7μL bzw. 20eq./27,3μL) gelöst in Dimethylsulfoxid (10mg/mL) gegeben und mit Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) auf ein Gesamtvolumen von 150μL aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde 1h bei 25°C und 300rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Substanz 16 mittels Filtration in Zentrifugenfiltrationseinheiten (10kDa cut-off) mit Wasser als Spülflüssigkeit entfernt.Substance 16 (0.5eq. / 0.7μL, 1eq./1, 4μL, 2eq.) Was added to 75 μL of an L-asparaginase solution (0.5 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) ./2.7μL, 5eq./6.8μL, 10eq./13.7μL or 20eq./27.3μL) dissolved in dimethyl sulfoxide (10mg / mL) and with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9, 5) filled up to a total volume of 150μL. The reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
Durch die Modifizierung wird die Aktivität der L-Asparaginase nur geringfügig vermindert. Bei einem PEGlyierungsgrad von 41% auf 75% Restaktivität, bei einem PEGylierungsgrad von 43% auf 60% Restaktivität, (vgl. Tabelle 1)The modification reduces the activity of the L-asparaginase only slightly. With a degree of PEGylation from 41% to 75% residual activity, with a degree of PEGylation from 43% to 60% residual activity (see Table 1)
Die Stabilität gegenüber Proteasen (Trypsin und Chymotrypsin) wird durch die PEGylierung mit Substanz 16 dagegen deutlich gesteigert, (vgl.The stability towards proteases (trypsin and chymotrypsin), on the other hand, is significantly increased by PEGylation with substance 16 (cf.
Abbildungen 1 und 2) Tabelle 1 : Grad der Modifizierung und Restaktivität der Konjugate aus L- Asparaginase und Substanz 16Figures 1 and 2) Table 1: Degree of modification and residual activity of the conjugates of L-asparaginase and substance 16
Beispiel B2:Example B2:
Herstellung eines Konjugates aus einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Substanz 16 und Streptokinase. Zu 120μL einer Streptokinase-Lösung (0,25mg/mL) in Natriumcarbonat- Puffer (pH 8,5 bis 9,5) wurde Substanz 16 (0,5eq./0,9μL, 1eq./2,1 μL, 2eq./3,9μL, 5eq./10,2μL bzw. 10eq./20,1 μL) gelöst in Dimethylsulfoxid (5mg/mL) gegeben und mit Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) auf ein Gesamtvolumen von 150μL aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde 1 h bei 25°C und 300rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Substanz 16 mittels Filtration in Zentrifugenfiltrationseinheiten (10kDa cut-off) mit Wasser als Spülflüssigkeit entfernt.Preparation of a conjugate from a compound according to the invention according to substance 16 and streptokinase. Substance 16 (0.5eq. / 0.9μL, 1eq./2.1 μL, 2eq.) Was added to 120 μL of a streptokinase solution (0.25 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5). / 3.9μL, 5eq./10.2μL or 10eq./20.1 μL) dissolved in dimethyl sulfoxide (5mg / mL) and with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) to a total volume of 150μL refilled. The reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
Streptokinase wird bei 10 eingesetzten Äquivalenten der Substanz 16 zu 100% an den Lysin-Resten modifiziert, (vgl. Tabelle 2)Streptokinase is modified to 100% of the lysine residues when 10 equivalents of substance 16 are used (see Table 2)
Tabelle 2: Grad der Modifizierung der Konjugate aus Streptokinase und Substanz 16Table 2: Degree of modification of the conjugates from streptokinase and substance 16
Beispiel B3: Example B3
Herstellung eines Konjugates aus einer erfindungsgemäßen Verbindung gemäß Substanz 16 und Trypsin.Preparation of a conjugate from a compound according to the invention according to substance 16 and trypsin.
Zu 120μL einer Trγpsin-Lösung (1 ,0mg/mL) in Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) wurde Substanz 16 (0,5eq./1 ,5μL, 1eq./2,7μL, 2eq./5,4μL, 5eq. I3,8μL bzw. 10eq./27,3μL) gelöst in Dimethylsulfoxid (10mg/mL) gegeben und mit Natriumcarbonat-Puffer (pH 8,5 bis 9,5) auf ein Gesamtvolumen von 150μL aufgefüllt. Der Reaktionsansatz wurde 1 h bei 25°C und 300rpm auf einem Thermomixer inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Substanz 16 mittels Filtration in Zentrifugenfiltrationseinheiten (10kDa cut-off) mit Wasser als Spülflüssigkeit entfernt.Substance 16 (0.5eq. / 1, 5μL, 1eq./2.7μL, 2eq./ to 120μL of a trγpsin solution (1.0 mg / mL) in sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5)) 5.4μL, 5eq. I3.8μL or 10eq./27.3μL) dissolved in dimethyl sulfoxide (10mg / mL) and filled with sodium carbonate buffer (pH 8.5 to 9.5) to a total volume of 150μL. The reaction mixture was incubated for 1 h at 25 ° C. and 300 rpm on a thermomixer. Excess substance 16 was then removed by filtration in centrifuge filtration units (10 kDa cut-off) with water as the rinsing liquid.
Trypsin wird mit 10 Äquivalenten Substanz 16 zu 44% an den Lysin-Resten modifiziert. Die Restaktivität steigt dabei auf 137%. Die Aktivitätszunahme durch Modifizierung mit Polyethylenglykolhaltigen Reagenzien wird in der Literatur durch eine Veränderung der Mikroumgebung des aktiven Zentrums erklärt (Zhang, Z., He, Z. & Guan, G. (1999) in Biotechnology Techniques 13: 781-786).Trypsin is modified with 10 equivalents of substance 16 to 44% of the lysine residues. The residual activity increases to 137%. The increase in activity by modification with reagents containing polyethylene glycol is explained in the literature by a change in the microenvironment of the active center (Zhang, Z., He, Z. & Guan, G. (1999) in Biotechnology Techniques 13: 781-786).
Tabelle 3: Grad der Modifizierung und Restaktivität der Konjugate aus Tryspin und Substanz 16Table 3: Degree of modification and residual activity of the conjugates from tryspin and substance 16
C. Weitere Beispiele für erfindungsgemäße Verbindungen gemäß Ansprüchen 1 bis 6 C. Further examples of compounds according to the invention according to claims 1 to 6
Formel (Xllb)Formula (Xllb)
Ausführungsbeispiel für Formel (Xllb):Example for formula (Xllb):
Formel (Xllc)Formula (Xllc)
Ausführungsbeispiel Formel (Xllc):Embodiment formula (Xllc):
Formel (XV)Formula (XV)
Ausführungsbeispiel für Formel (XV):Exemplary embodiment for formula (XV):
Formel (XVI)Formula (XVI)
Ausführungsbeispiel für Formel (XVI):Exemplary embodiment for formula (XVI):
In den Beispielen C (Formeln Xllb, Xllc, XV und XVI) bedeuten: P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, C C4-Alkyl, O-R2 oder CO-R3, R1 H, OH oder einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen, R3 OH oder NR4R5,In examples C (formulas Xllb, Xllc, XV and XVI): P each time independently occurs H, OH, CC 4 alkyl, OR 2 or CO-R 3 , R 1 H, OH or a hydrocarbon radical with 1 to 50 Carbon atoms, which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, R 2 independently each time a hydrocarbon residue with 1 to 6 Carbon atoms, R 3 OH or NR 4 R 5 ,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome, insbesondere O oder/und N, enthalten kann, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, d, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000, c, x bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 10 und a, b, p, y unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 50 und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1. R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, in particular O or / and N, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, d, n independently on each occurrence an integer of 1 up to 1000, c, x independently each time an integer from 1 to 10 and a, b, p, y independently an integer from 0 to 50 and q independently each time 0 or 1.

Claims

Ansprüche Expectations
1. Verbindungen der Formel (I)1. Compounds of formula (I)
o w Oo w O
-N - -N - -V-N - -N - -V
W X Formel (la)W X formula (la)
H O W oH O W o
-N- -O- -V-N- -O- -V
W Formel (Ib)W formula (Ib)
worin die Reste V, W, X und Z jeweils unabhängig voneinander einenwherein the radicals V, W, X and Z each independently have one
Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher Heteroatome enthalten kann oder/und V, W, oder/und X Wasserstoff darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Reste V, W, X oder/und Z eine Bindegruppe Y trägt und dass die Reste V, W, X und Z zusammen mindestens eine Gruppe der Formel (II)Represent hydrocarbon radical which may contain heteroatoms or / and V, W, or / and X represent hydrogen, characterized in that at least one of the radicals V, W, X or / and Z bears a binding group Y and that the radicals V, W, X and Z together at least one group of the formula (II)
Formel (II) Formula (II)
aufweisen, worinhave wherein
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, O-R2 oder CO-R3 darstellt,P independently represents H, OH, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence,
R., H oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome enthalten kann,R., H or a hydrocarbon radical with 1 to 50 carbon atoms, which may contain heteroatoms,
R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt,R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 carbon atoms with each occurrence,
R3 OH oder NR4R5 ist,R 3 is OH or NR 4 R 5 ,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical, which may contain heteroatoms, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n is independently an integer from 1 to 1000 in each occurrence and x is an integer from 1 to 10 each occurrence and y is an integer Represents a number from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 at each occurrence.
2. Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Bindegruppe Y ausgewählt ist aus Gruppen, die mit einer Aminogruppe, einer Thiolgruppe, einer Carboxylgruppe, einer2. Compounds according to claim 1, characterized in that the binding group Y is selected from groups containing an amino group, a thiol group, a carboxyl group, one
Guanidingruppe, einer Carbonylgruppe, einer Hydroxylgruppe, einem Heterozyklus, einer C-nukleophilen Gruppe, einer C-elektrophilen Gruppe, einem Phosphat oder einem Sulfat bindefähig sind oder ein Chelat oder einen Komplex mit Metallen bilden können oder eine Bindung an Silicium-haltigen Oberflächen eingehen können.Guanidine group, a carbonyl group, a hydroxyl group, a heterocycle, a C-nucleophilic group, a C-electrophilic group, a phosphate or a sulfate are capable of binding or can form a chelate or a complex with metals or can bond to silicon-containing surfaces ,
3. Verbindungen nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens zwei Gruppen der Formel (II) enthält.3. Compounds according to claim 1 and 2, characterized in that they contain at least two groups of formula (II).
4. Verbindungen nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reste X oder/und Z verzweigt ist und mindestens zwei Gruppen der Formel (II) enthält.4. Compounds according to claim 1, characterized in that at least one of the radicals X or / and Z is branched and contains at least two groups of the formula (II).
5. Verbindungen nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der Reste X oder/und Z weiterhin eine Targeting-Gruppierung aufweist. 5. Compounds according to any one of the preceding claims, characterized in that at least one of the radicals X and / and Z further has a targeting grouping.
6. Verbindung mit der Formel (XIV)6. Compound with the formula (XIV)
worin h, i bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 sind, g und f bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl zwischen 0 und 10, bevorzugt zwischen 0 und 5 sind, A bei jedem Auftreten für H oder -(CO)-NX2 steht undwhere h, i are independently 0 or 1 in each occurrence, g and f are independently an integer between 0 and 10, preferably between 0 and 5 in each occurrence, A is H or - (CO) -NX 2 in each occurrence and
Xι> X2> X3 ur|d X4 sowie X jeweils unabhängig voneinander die oben für X angegebenen Bedeutungen aufweisen.Xι > X 2> X 3 ur | d X 4 and X each independently have the meanings given for X above.
7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man in einer7. A method for producing a compound according to any one of claims 1 to 6, characterized in that in a
Mehrkomponentenreaktion als Edukte die Verbindungen der FormelnMulti-component reaction as starting materials the compounds of the formulas
X'-NH2 (IV)X'-NH 2 (IV)
(W')2C = O (V)(W ') 2 C = O (V)
Z'-NC (VI) undZ'-NC (VI) and
V'-COOH (VII)V'-COOH (VII)
miteinander umsetzt, wobei V, W, X' und Z' jeweils unabhängig voneinander einen Kohlenwasserstoffrest darstellen, welcher gegebenenfalls Heteroatome enthalten kann oder/und V, W oder/und X' Wasserstoff darstellen, wobei wenigstens einer der Reste V, W, X' und Z' eine Bindegruppe Y trägt und wobei die Reste V, W, X' und 71 zusammen mindestens eine Gruppe der Formel (II)reacted with one another, where V, W, X 'and Z' each independently represent a hydrocarbon radical which may optionally contain heteroatoms or / and V, W or / and X 'represent hydrogen, at least one of the radicals V, W, X' and Z 'carries a linking group Y and the residues V, W, X' and 71 together at least one group of formula (II)
Rt "(CH)X- -[Q]q- — (CH)y Rt "(CH) X - - [Q] q - - (CH) y
n Formel (II) n formula (II)
aufweisen, worinhave wherein
P bei jedem Auftreten unabhängig H, OH, O-R2 oder CO-R3 darstellt,P independently represents H, OH, OR 2 or CO-R 3 on each occurrence,
R1 H oder ein Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 50 Kohlenstoffatomen ist, welcher Heteroatome enthalten kann,R 1 is H or a hydrocarbon radical with 1 to 50 carbon atoms, which may contain heteroatoms,
R2 bei jedem Auftreten unabhängig einen Kohlenwasserstoffrest mit 1 bis 6 C-Atomen darstellt,R 2 independently represents a hydrocarbon radical with 1 to 6 carbon atoms with each occurrence,
R3 OH oder NR4R5 ist,R 3 is OH or NR 4 R 5 ,
R4 und R5 jeweils unabhängig H oder einen Kohlenwasserstoffrest, welcher Heteroatome enthalten kann, darstellen, wobei R4 und R5 zusammen auch ein Ringsystem bilden können, n bei jedem Auftreten unabhängig eine ganze Zahl von 1 bis 1000 ist und x bei jedem Auftreten eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und y eine ganze Zahl von 0 bis 50 darstellt und q bei jedem Auftreten unabhängig 0 oder 1 ist.R 4 and R 5 each independently represent H or a hydrocarbon radical which may contain heteroatoms, where R 4 and R 5 together can also form a ring system, n is independently an integer from 1 to 1000 in each occurrence and x in each occurrence is an integer from 1 to 10 and y represents an integer from 0 to 50 and q is independently 0 or 1 each time it occurs.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens einer der Reste V, W, X' oder/und Z mindestens eine weitere Funktionalität, ausgewählt aus NH2, C=O, NC oder/und COOH enthält.8. The method according to claim 7, characterized in that at least one of the radicals V, W, X 'or / and Z contains at least one further functionality selected from NH 2 , C = O, NC or / and COOH.
9. Konjugat, umfassend eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der9. A conjugate comprising a compound of formula (I) as in one of the
Ansprüche 1 bis 6 definiert, kovalent gebunden an einen biopharmazeutischen, pharmazeutischen oder/und synthetischen Wirkstoff.Claims 1 to 6 defined, covalently bound to a biopharmaceutical, pharmaceutical or / and synthetic active ingredient.
10. Konjugat, umfassend eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, kovalent gebunden an eine Oberfläche oder/und einen Biokatalysator.10. Conjugate comprising a compound of formula (I) as defined in any one of claims 1 to 6, covalently bound to a surface and / or a biocatalyst.
11. Konjugat, umfassend eine Verbindung der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, kovalent gebunden an ein Enzym.11. Conjugate comprising a compound of formula (I) as in one of the Claims 1 to 6 defined, covalently bound to an enzyme.
12. Konjugat umfassend eine Verbindung der Formel (I) wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert kovalent gebunden an Medizinprodukte oder Hilfsmittel zur Darreichung von Wirkstoffen.12. Conjugate comprising a compound of formula (I) as defined in one of claims 1 to 6 covalently bound to medical devices or aids for the administration of active substances.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Konjugat nach Anspruch 9 oder 11.13. A pharmaceutical composition comprising a compound according to any one of claims 1 to 6 or a conjugate according to claim 9 or 11.
14. Diagnostische Zusammensetzung, umfassend eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein Konjugat nach Anspruch 9 oder 10.14. A diagnostic composition comprising a compound according to any one of claims 1 to 6 or a conjugate according to claim 9 or 10.
15. Verwendung eines Konjugats nach Anspruch 9 zur Herstellung eines15. Use of a conjugate according to claim 9 for the preparation of a
Arzneimittels zur Behandlung von Krebs oder Herz-Kreislauf- Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen, neuronale bzw. cerebrale Erkrankungen, z.B. Alzheimer oder Parkinson, oder entzündlichen Prozessen, z.B. Infektionen und Immun- oder Autoimmumerkrankungen, insbesondere rheumatoide Arthritis.Medicament for the treatment of cancer or cardiovascular diseases, metabolic diseases, neuronal or cerebral diseases, e.g. Alzheimer's or Parkinson's, or inflammatory processes, e.g. Infections and immune or autoimmune diseases, especially rheumatoid arthritis.
16. Verfahren zur Herstellung einer Substanzbibliothek, dadurch gekennzeichnet, dass man gemäß dem Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 wenigstens zwei verschiedene Verbindungen gemäß Anspruch 1 herstellt.16. A process for the preparation of a substance library, characterized in that at least two different compounds according to claim 1 are prepared according to the process according to claim 7 or 8.
17. Substanzbibliothek, umfassend mindestens zwei unterschiedliche Verbindungen der Formel (I), wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.17. substance library comprising at least two different compounds of formula (I) as defined in any one of claims 1 to 6.
18. Kit, umfassend18. Kit, comprehensive
(a) wenigstens eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 sowie(a) at least one compound according to one of claims 1 to 6 and
(b) Pufferlösungen und gegebenenfalls (c) Standard proteine oder/und Mittel zur Aufreinigung von(b) buffer solutions and optionally (c) standard proteins and / or agents for the purification of
Konjugaten, gebildet mit der Verbindung aus (a). Conjugates formed with the compound from (a).
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