DE19607686A1

DE19607686A1 - New metabolizable lipopolyamines, their presentation and application

Info

Publication number: DE19607686A1
Application number: DE1996107686
Authority: DE
Inventors: Stephan Dr Koenig; Roland Dr Kloesel
Original assignee: CHEMICON LAB GmbH
Current assignee: CHEMICON LAB GmbH
Priority date: 1996-02-29
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 1997-09-04
Also published as: WO1997031934A3; WO1997031934A2

Abstract

The invention concerns novel metabolizable lipopolyamines (including their salts), their preparation and their use. These novel compounds enable biologically active materials, such as DNA, antisense DNA/RNA, ribozymes, antiviral substances, proteins and peptides, for example, to be incorporated in eucaryotic cells.

Description

Positiv geladene Lipide (J.P.Behr, Bioconjugate Chem. 5 382-389 (1994)) werden in Form von Liposomen oder als solche zur Einschleusung von biologisch aktiven Substanzen wie Peptiden, Proteinen, antiviralen Wirkstoffen insbesondere aber DNA, RNA, Antisense- DNA/RNA oder Ribozymen in eukariotische Zellen (zum Beispiel Säuger-, Pflanzen-, Insekten-Zellen) eingesetzt. Lipopolyamine sind eine spezielle Klasse von kationischen Lipiden, die vergleichsweise hervorragende Transfektionseigenschaften zeigen. Unter Transfektion versteht man die Einschleusung von Erbmaterial in eukariotische Zellen.Positively charged lipids (J.P.Behr, Bioconjugate Chem. 5 382-389 (1994)) are in the form of liposomes or as such for the introduction of biologically active substances such as Peptides, proteins, antiviral agents, but especially DNA, RNA, antisense DNA / RNA or ribozymes in eukaryotic cells (for example mammalian, plant, Insect cells). Lipopolyamines are a special class of cationic lipids, which show comparatively excellent transfection properties. Under transfection is the introduction of genetic material into eukaryotic cells.

Die Notwendigkeit DNA (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, einzelsträngig oder doppelsträngig), RNA oder verwandte Stoffklassen, wie Antisense-DNA/RNA oder Ribozyme in eukariotische Zellen einzuführen, um beispielsweise erfolgreich Gentherapie betreiben zu können, führte zur Entwicklung einer Vielzahl von Transfektionsmethoden. Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukariotische und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, wie zum Beispiel die CaPO₄-Präzipitationsmethode, die DEAE-Dextran-Methode, Methoden, welche die rezeptorvermittelte Endoeytose nutzen, Elektroporation, Mikroinjektion und Verfahren, die virale Capside als DNA-Carrier benutzen, bekannt. Eine weitere Methode wird Lipofektion (P.L.Felgner et al., Proe.Natl.Aead.Sei. USA 74, 7413 (1987)) genannt. Diese nützt die Tatsache, daß synthetische kationisehe Lipide in Form von Liposomen oder als solche mit der negativ geladenen DNA Komplexe bilden. Stellt man die Mengenverhältnisse von DNA und kationisehem Lipid so ein, daß die resultierenden Komplexe eine positive Nettoladung tragen, so besitzen sie eine hohe Affinität zu der negativ geladenen Membranoberfläche eukariotischer Zellen. Treffen solche DNA/Lipid-Komplexe auf Zellen, so kommt es zu einer Einschleusung des genetischen Materials in die Zelle. Der genaue Mechanismus, wie die DNA in die Zellen gelangt, ist noch weitgehend unbekannt, man vermutet jedoch, daß es entweder zu einer Fusionierung der kationischen Lipide mit der anionischen Zellmembran bei gleichzeitiger Ausschüttung der DNA in das Zellinnere kommt, oder daß die DNA/Lipid-Komplexe als ganzes über einen natürlichen Transportmechanismus der Zellen, die sogenannte Endozytose, in die Zelle gelangen und danach die DNA freigesetzt wird.The need for DNA (for example plasmids, cosmids, single-stranded or double-stranded), RNA or related classes of substances, such as antisense DNA / RNA or ribozymes to be introduced into eukaryotic cells in order to successfully conduct gene therapy, for example led to the development of a variety of transfection methods. For the introduction of nucleic acids in eukaryotic and especially in mammalian cells is a variety of Processes such as the CaPO₄ precipitation method, the DEAE dextran method, Methods using receptor-mediated endoeytosis, electroporation, microinjection and methods using viral capsids as DNA carriers are known. Another method is called lipofection (P.L. Felgner et al., Proe.Natl.Aead. Se. USA 74, 7413 (1987)). This takes advantage of the fact that synthetic cationic lipids in the form of liposomes or as form complexes with the negatively charged DNA. If you put the proportions of DNA and cationic lipid so that the resulting complexes are positive Carry net charge, so they have a high affinity for the negatively charged Membrane surface of eukaryotic cells. Such DNA / lipid complexes meet cells, see above the genetic material is infiltrated into the cell. The exact one The mechanism by which DNA gets into the cells is still largely unknown suspects, however, that either the cationic lipids fuse with the anionic cell membrane with simultaneous release of the DNA into the cell interior, or that the DNA / lipid complexes as a whole have a natural transport mechanism of cells, the so-called endocytosis, get into the cell and then the DNA is released becomes.

Liposomen sind kugelartige Anordnungen von Lipiden in wäßrigen Lösungen mit,"Bilayer- Struktur" und werden typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt (siehe N.Y. Aeademy Seiences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medieine" von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 1000 nm), kleine unilamellare Vesikel (SUV, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30000 nm). Eine Reihe von Herstellungsmethoden für Liposomen ist bekannt und in "Liposome Teehnology" (Gregoriadis, CFC Press, N.Y. 1984) in "Liposomes" (Ostro, Marcel Dekker, N.Y. 1987) oder in Übersichtsartikeln von Lichtenberg et al. (Methods Biochem. Anal. 33 337-462, 1988), Pagano und Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 7 435-68, 1978), oder Szoka und Papahadjopoulos (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980) beschrieben. Bekannte Methoden sind beispielsweise die "reverse-phase evaporation"-Methode und die Extrusionsmethode, bei der eine Lipidlösung durch eine mikroporöse Membran gepreßt wird.Liposomes are spherical arrangements of lipids in aqueous solutions with, "Bilayer- Structure "and are typically divided into three classifications (see N.Y. Aeademy Seiences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medieine" from December 1977): Multilamellar vesicles (MLV, up to 1000 nm), small unilamellar vesicles (SUV, 20-50 nm) and large unilamellar vesicles (LUV, 600-30000 nm). A number of manufacturing methods for liposomes is known and in "Liposome Teehnology" (Gregoriadis, CFC Press, N.Y. 1984) in "Liposomes" (Ostro, Marcel Dekker, N.Y. 1987) or in review articles by Lichtenberg et al. (Methods Biochem. Anal. 33 337-462, 1988), Pagano and Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 7 435-68, 1978), or Szoka and Papahadjopoulos (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980). Known methods are, for example "reverse-phase evaporation" method and the extrusion method in which a lipid solution is pressed through a microporous membrane.

Liposomen werden typischerweise auch auf folgendem Weg hergestellt: Die Lipide werden in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels unter einem Strom von Stickstoff wird an der Glasgefaßwand ein dünner Lipidfilm erzeugt. Zugabe von Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert diesen Film. Die erhaltene Lösung wird zuletzt mit Ultraschall behandelt.Liposomes are typically also produced in the following way: The lipids are made in an organic solvent added. By evaporating the solvent under With a stream of nitrogen, a thin lipid film is created on the glass vessel wall. Encore water or aqueous buffer solution hydrates this film. The solution obtained is last treated with ultrasound.

Kationische Lipide gewinnen zunehmende Bedeutung in der Gentherapie. Dabei werden in vivo mit verschiedenen Verfahren Körperzellen transfektiert, indem Komplexe aus Carrier und DNA intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, in Liquorräume oder direkt in Tumore verabreicht werden oder Körperzellen entnommen, transfektiert und wieder reimplantiert werden. Eine in diesem Zusammenhang favorisierte Methode war bis vor einiger Zeit die Einbringung des genetischen Materials durch virale Carrier. Diese Methode besitzt jedoch die Gefahr der Rückmutation zu einem pathogenen Virus. Desweiteren wird die eingeschleuste DNA stabil in das Erbgut eingebaut, so daß eine Steuerung der Therapie oder eine Rückkehrung der Zellen in ihren ursprünglichen Zustand nicht mehr möglich ist. Zudem besitzen virale Carrier Restriktionen bezüglich der Größe der einzuschleusenden DNA. Modifizierte DNA oder RNA wird durch Viren nicht übertragen.Cationic lipids are becoming increasingly important in gene therapy. Thereby in Transfected with different cell body processes by complexes from carrier and DNA intradermal, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, subcutaneous, intranasal, in Cerebrospinal fluid or directly into tumors or taken from body cells, transfected and reimplanted. A favorite in this context Until recently, the method was the introduction of the genetic material by viral Carrier. However, this method has the risk of return mutation to a pathogenic one Virus. Furthermore, the introduced DNA is stably incorporated into the genome, so that a Control of therapy or a return of the cells to their original state is no longer possible. In addition, viral carriers have restrictions on the size of the DNA to be injected. Modified DNA or RNA is not transmitted by viruses.

Außerdem können nur sich teilende Zellen auf diesem Wege transfektiert werden.In addition, only dividing cells can be transfected in this way.

Die Transfektion mit kationischen Lipiden ist diesen Restriktionen hingegen nicht unterworfen. Die Transfektion verläuft in der Regel transient, das heißt die transfektierte DNA oder RNA wird nur für eine bestimmte Zeit exprimiert, da sie nicht in das Erbgut eingebaut wird, sondern nur ins Cytoplasma transportiert und dort durch Nukleasen mit der Zeit abgebaut wird. Auf diese Weise kann Gentherapie dosiert und reversibel gemacht werden. Restriktionen bezüglich der Größe der DNA bestehen nicht und modifizierte DNA oder RNA kann mittels kationiseher Lipide in Zellen eingeschleust werden. Auch sieh nicht teilende Zellen, wie zum Beispiel Nervenzellen, können durch kationische Lipide transfektiert werden. Transfection with cationic lipids, however, is not subject to these restrictions. The transfection is usually transient, that is, the transfected DNA or RNA is only expressed for a certain time because it is not built into the genome, but rather only transported into the cytoplasm and degraded there over time by nucleases. On this way, gene therapy can be dosed and made reversible. Restrictions on the size of the DNA does not exist and modified DNA or RNA can be cationized Lipids can be introduced into cells. Also see non-dividing cells, such as Nerve cells can be transfected by cationic lipids.

Während die in vivo-Anwendung von Mikroinjektion und Elektroporation aus Verfahrensgründen nicht möglich erscheinen, besitzen die CaPO₄- und DEAE-Dextran- Methoden verglichen mit der Lipofektion eine schlechtere Transfektionseffizienz.During the in vivo application of microinjection and electroporation The CaPO₄ and DEAE dextran Methods compared to lipofection have poorer transfection efficiency.

Unter den kationischen Lipiden gibt es eine Klasse, die die bekannt hohe Affinität zwischen Spermin und DNA zur Transfektion ausnützt, in dem das bei einem physiologischen pH-Wert positiv geladene Spermin mit einem hydrophilen Rest, in manchen Fällen über einen Spacer, verknüpft wird. Spermin bildet besonders stabile Komplexe mit DNA und ähnlichen Verbindungen, indem es über Wasserstoffbrückenbindung in der Furche der DNA gebunden wird.Among the cationic lipids there is a class that is known to have high affinity between Sperm and DNA is used for transfection, in that at a physiological pH positively charged spermine with a hydrophilic residue, in some cases via a spacer, is linked. Spermin forms particularly stable complexes with DNA and the like Connections by being hydrogen bonded in the groove of DNA becomes.

Die ersten solchen Liposperminderivate wurden von Behr, J. P.et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986; EP 0394111 synthetisiert. Dabei verknüpften sie Carboxyspermin über einen Spacer mit zwei unterschiedlichen hydrophilen Resten. Die Struktur des dabei erhaltenen 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:The first such lipospermine derivatives were from Behr, J. P. et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986; EP 0394111 synthesized. They linked carboxyspermine via a spacer with two different hydrophilic residues. The structure of the 5-carboxyspermylglycine dioctadecylamide (DOGS) obtained is:

DOGS ist als Transfectam^TM (Promega) kommerziell erhältlich. Die zweite von Behr et al. entwickelte Verbindung ist Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5- carboxyspermylamid (DPPES):DOGS is commercially available as Transfectam ^™ (Promega). The second by Behr et al. developed compound is dipalmitoylphosphatidylethanolamine-5-carboxyspermylamide (DPPES):

wobei R = CR₃(CH₂)₁₅ ist.where R = CR₃ (CH₂) ₁₅.

Ein weiteres Liposperminderivat wird von P.L.Felgner et al. in WO 9116024 unter der Bezeichnung L-Spermin-5-earboxyl-3-(DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β-hydroxyethyl amin) beansprucht. In der Patentschrift beschrieben ist jedoch L-Spermin-5-carboxyl-3-(DL- 1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamin):Another lipospermine derivative is described by P.L. Felgner et al. in WO 9116024 under the Name L-Spermin-5-earboxyl-3- (DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β-hydroxyethyl amine). However, L-spermine-5-carboxyl-3- (DL- 1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamine):

Gebeyehu, G. et al. beschreiben in WO 9405624 die Verbindung N-[N-(5- Carboxyspermyl)aminoethyl]N,N-dimethyl-2,3-bis(9-octadecenyloxy) 1-propanammonium tetra(trifluoracetat), welches kommerziell als Lipofectamin^TM (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.) erhältlich ist.Gebeyehu, G. et al. in WO 9405624 describe the compound N- [N- (5-carboxyspermyl) aminoethyl] N, N-dimethyl-2,3-bis (9-octadecenyloxy) 1-propanammonium tetra (trifluoroacetate), which is commercially available as Lipofectamin ^TM (Gibco- BRL: Life Technologies Inc.) is available.

Trotz großer Fortschritte auf diesem Gebiet, verbleibt ein Bedarf an einer größeren Auswahl an kationischen Lipiden. Bis heute wurde kein kationisches Lipid gefunden, daß mit allen Zelltypen befriedigende Ergebnisse liefert. Da verschiedene Zelltypen sich in ihrer Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es nicht verwunderlich, daß verschiedene Kompositionen von Lipiden und verschiedenartige Lipidtypen für eine effektive Transfektion unterschiedlicher Zellen benötigt werden.Despite great advances in this area, there remains a need for more choice of cationic lipids. To date, no cationic lipid has been found that with all Cell types gives satisfactory results. Because different cell types differ in their Differ membrane composition, it is not surprising that different Compositions of lipids and different types of lipids for effective transfection different cells are needed.

Von besonderer Bedeutung ist die Metabolisierbarkeit und Toxizität der Lipide und ihrer Abbauprodukte. Diese sind die bestimmenden Faktoren für die Verträglichkeit der Lipide für die Zellen. Die Metabolisierbarkeit wird hauptsächlich durch die in den Lipiden enthaltenen chemischen Verknüpfungen bestimmt.The metabolism and toxicity of the lipids and their is of particular importance Degradation products. These are the determining factors for the tolerance of the lipids for the cells. The metabolism is mainly due to that contained in the lipids chemical linkages determined.

Da über den eigentlichen Transfektionsschritt bis heute noch wenig bekannt ist, ist die Entwicklung von neuen kationischen Lipiden weitgehend empirisch. Wichtige zu beachtende Punkte für das Design solcher Lipide sollte ihre Toxizität gegenüber den zu transfektierenden Zielzellen, desweiteren ihre Stabilität, Metabolisierbarkeit, die Möglichkeit einer in vivo- Anwendung und einfache Synthesewege sein.Since little is known about the actual transfection step to date, this is Development of new cationic lipids largely empirically. Important to note Points for the design of such lipids should be their toxicity towards those to be transfected Target cells, further their stability, metabolizability, the possibility of an in vivo Application and simple synthetic routes.

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Verbindungen der allgemeinen Formel I:The present invention relates to new compounds of the general formula I:

die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei a, b, e, d, e und f unabhängig voneinander 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sind und wobei a nur dann 0 ist, wenn b 0 ist und e nur dann 0 ist, wenn f0 ist, R₁ ein Rest der allgemeinen Formel II ist:which are present in the D, L or DL form in the presence of an asymmetry center, including their salts, where a, b, e, d, e and f independently of one another 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 and where a is only 0 if b is 0 and e is only 0 if f is 0, R₁ is a radical of the general formula II:

in welcher g 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, h 0,1,2 oder 3 ist, wobei g 0 ist, wenn h 0 ist und h 1 ist, wenn g 0 ist, X -O- oder -NH-, alle Positionen der Steroid-Substitnenten α- oder β- konfiguriert sein können, die C-Atome 5 und 6 oder die C-Atome 8 und 9 über eine Doppelbindung verknüpft sind, R₂ und R₃ unabhängig voneinander Wasserstoff oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkyl- oder ein verzweigter oder unverzweigter Alkenyl- oder ein substituierter oder unsubstituierter Aryl- oder Aralkyfrest sind, R₄ H oder Methyl ist, oder R₁ ein Rest der allgemeinen Formel III ist:in which g is 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6, h is 0, 1, 2 or 3, where g is 0 when h is 0 and h is 1, if g is 0, X -O- or -NH-, all positions of the steroid substituents α- or β- can be configured, the C atoms 5 and 6 or the C atoms 8 and 9 via a Double bond are linked, R₂ and R₃ are independently hydrogen or a branched or unbranched alkyl or a branched or unbranched alkenyl or are a substituted or unsubstituted aryl or aralky radical, R₄ is H or methyl, or R₁ is a radical of the general formula III:

wobei alle chirale Zentren in D-, L- oder als Racemat vorliegen, m 0,1,2 oder 3 ist, k 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 ist, wobei k 0 ist, wenn m 0 ist und m 1 ist, wenn k 0 ist, n, p und q unabhängig voneinander 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sind, R₂ wie vorstehend definiert ist, X₁, X₂, und X₃ unabhängig voneinanderwhere all chiral centers are in D-, L- or as a racemate, m is 0, 1, 2 or 3, k Is 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6, where k is 0 when m is 0 and m is 1 when k is 0, n, p and q are independently 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6, R₂ is as defined above, X₁, X₂, and X₃ independently of each other

sind,
R₅ und R₆ unabhängig voneinander verzweigte oder unverzweigte Alkyl- oder Alkenylreste mit 5-30 Kohlenstoffatomen sind.are,
R₅ and R₆ are independently branched or unbranched alkyl or alkenyl radicals having 5-30 carbon atoms.

Die erfindungsgemäßen Lipide enthalten also Polyamine als DNA-affine Kopfgruppen, die gegebenenfalls über einen Spacer an Lipidstrukturen gebunden sind. Die Kopfgruppe wird dabei über biologisch abbaubare Verbindungen an das Restmolekül gebunden, welches wiederum aus biologisch abbaubaren Verbindungen aufgebaut ist. Eine Vielzahl der erfindungsgemäßen Lipide läßt sich aus nicht oder nur wenig toxischen Verbindung einfach durch Aufbau über Amid- und Urethanverknüpfungen herstellen. Damit erreicht man eine Kombination von guter Metabolisierbarkeit, niedriger beziehungsweise gar keiner Toxizität und hoher Stabilität, sowie einen Zugang zu einfach durchführbaren Synthesewegen.The lipids according to the invention thus contain polyamines as DNA-affine head groups that optionally bound to lipid structures via a spacer. The head group will bound to the residual molecule via biodegradable compounds which is in turn made up of biodegradable compounds. A variety of Lipids according to the invention can be easily obtained from compounds which are not or only slightly toxic by building via amide and urethane linkages. So you get one Combination of good metabolizability, low or no toxicity and high stability, as well as access to synthetic routes that are easy to carry out.

Der besondere Wert der erfindungsgemäßen Lipide liegt in ihrer Stabilität in Lösung, bei gleichzeitiger Metabolisierbarkeit durch die Zelle, da die Lipide zu einem wesentlichen Anteil aus Amidverknüpfungen aufgebaut sind.The particular value of the lipids according to the invention lies in their stability in solution Simultaneous metabolizability by the cell, since the lipids to a large extent are made up of amide linkages.

Von ganz besonderem Interesse sind Lipopolyamine der Formel I, worin a, d, e = 3, b, f = 1 und c = 0 sind. Of particular interest are lipopolyamines of the formula I, in which a, d, e = 3, b, f = 1 and c = 0.

Von ganz besonderem Interesse sind außerdem Verbindungen der Formel I, wobei a, d, e = 3, b, f= 1 und c = 0 sind, R₁ die Formel H aufweist, wobei die Reste und Indizes wie vorstehend definiert sind und direkt oder über einen Spacer, wie zum Beispiel Aminosäuren, verknüpft sein können. Dies entspricht Verbindungen der Formel II, wobei h = 0 oder 1, g (falls h = 1 ist) 1, 2, 3, 4, 5 oder 6,
R₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl und
R₃=Of particular interest are also compounds of formula I, wherein a, d, e = 3, b, f = 1 and c = 0, R₁ has the formula H, the radicals and indices are as defined above and directly or via a spacer, such as amino acids, can be linked. This corresponds to compounds of the formula II, where h = 0 or 1, g (if h = 1) 1, 2, 3, 4, 5 or 6,
R₂ = hydrogen, methyl, 2-propyl, isopropyl, 1- (1-methyl-) propyl or benzyl and
R₃ =

ist.is.

Weiterhin von besonderem Interesse sind Verbindungen der Formel I, wobei a, d, e = 3, b, f= 1 und c = 0 ist und die allgemeine Formel IV, V oder VI aufweist:Also of particular interest are compounds of the formula I, where a, d, e = 3, b, f = 1 and c = 0 and has the general formula IV, V or VI:

oderor

Von ganz besonderem Interesse sind dabei solche Verbindungen, in denen das Grundgerüst der Lipidkomponente, welche die Formel IV, V oder VI aufweist, aus natürlich vorkommenden Aminosäuren besteht, wie zum Beispiel Ornithin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, an die zwei von natürlich vorkommenden Fettsäuren, zum Beispiel Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Myristoylsäure etc., abgeleitete Alkylketten über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Lipidkomponente kann wiederum direkt oder über einen Spacer an den Polyamin- Rest, welcher der Formel 1 entspricht, wobei a, d, e = 3, b, f= 1 und c = 0 ist, gebunden sein. Dies bedeutet in Formel IV, daß n = 0, m = 0 oder 1, für m = 1 und k = 1 der Spacer ebenfalls aus einer natürlich vorkommenden Aminosäure aufgebaut ist, so daß R₂ = Wasserstoff Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5, oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalanin, Aminocapronsäure usw. darstellen kann, q = 3, und p = 0, R₅ = -(CH₂)₁₇CH₃ und R₆ = -(CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃ sein kann.Of particular interest are those compounds in which the basic structure of the lipid component, which has the formula IV, V or VI, is naturally occurring Amino acids exist, such as ornithine, glutamic acid or aspartic acid, to which two naturally occurring fatty acids, for example oleic acid, palmitic acid, Stearic acid, myristoyl acid, etc., derived alkyl chains linked via peptide bonds are. The lipid component can in turn be attached directly or via a spacer to the polyamine Radical which corresponds to formula 1, where a, d, e = 3, b, f = 1 and c = 0, are bound. In formula IV this means that n = 0, m = 0 or 1, for m = 1 and k = 1 the spacers also is made up of a naturally occurring amino acid, so that R₂ = hydrogen methyl, Can be 2-propyl, isopropyl, 1- (1-methyl-) propyl or benzyl, for m = 1 and k = 2, 3, 4, 5, or 6 of the spacers can represent the compounds homoalanine, aminocaproic acid etc., q = 3, and p = 0, R₅ = - (CH₂) ₁₇CH₃ and R₆ = - (CH₂) ₇CH = CH (CH₂) ₇CH₃ can be.

Dies bedeutet in Formel V, daß n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 oder 6, der Spacer somit aus der Diaminokomponente, wie Ethylendiamin, Propylendiamin, Butylendiamin, Siaminopentan, Diaminohexan, besteht, R₅ und R₆ = (CH₂)₇CH=CH(CH₂)₇CH₃ sein kann. In formula V, this means that n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 or 6, the spacer thus the diamino component, such as ethylenediamine, propylenediamine, butylenediamine, Siaminopentane, diaminohexane, exists, R₅ and R₆ = (CH₂) ₇CH = CH (CH₂) ₇CH₃ can be.

Dies bedeutet für Formel VI, daß n = 0, m = 0 oder 1, q = 0, p = 0, 1 oder 2, k = 1 (falls m = 1) R₂ = Wasserstoff, Methyl, 2-Propyl, Isopropyl, 1-(1-Methyl-)propyl oder Benzyl sein kann, für m = 1 und k = 2, 3, 4, 5 oder 6 der Spacer die Verbindungen Homoalanin, Aminocapronsäure usw. darstellen kann, R₅ und R₆ = -(CH₂)₁₇H₃ ist.For formula VI this means that n = 0, m = 0 or 1, q = 0, p = 0, 1 or 2, k = 1 (if m = 1) R₂ can be hydrogen, methyl, 2-propyl, isopropyl, 1- (1-methyl) propyl or benzyl, for m = 1 and k = 2, 3, 4, 5 or 6 of the spacers, the compounds homoalanine, Can represent aminocaproic acid, etc., R₅ and R₆ = - (CH₂) ₁₇H₃.

Nachstehend werden allgemeine Synthesewege der folgenden ganz besonders interessanten Verbindungen erläutert.In the following, general synthetic routes of the following are particularly interesting Connections explained.

Zunächst zwei Verbindungen, die durch die Formeln I und II gekennzeichnet sind. Als Ausgangsverbindung dient in beiden Fällen 5-Cholesten-3-amin, wobei durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden einerseits über die Spacer-Gruppe Glycin, andererseits direkt der Sperminrest an die Aminofunktion der Ausgangsverbindung gebunden wird. Als Endprodukte erhält man N-[2,5-Bis (3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]cholesteryl-3-amid und N-(2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-1-oxopentylglycylcholesteryl-3-amid.-First two compounds, which are characterized by formulas I and II. In both cases, 5-cholesten-3-amine serves as the starting compound, with general known peptide linkage methods on the one hand via the spacer group glycine, on the other hand the spermine residue is bound directly to the amino function of the starting compound. As End products are obtained N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] cholesteryl-3-amide and N- (2,5-bis (3-aminopropyl) amino] -1-oxopentylglycylcholesteryl-3-amide.-

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Steroid-Grundgerüste und Spacer bestehen:Furthermore, such connections are of particular interest in this context, which consist of combinations of the following steroid frameworks and spacers:

a) steroid framework: cholesterol-3-amine, lanosterol-3-amine, campesterin-3-amine, Stigmast-5-en-3-amine, Stigmasta-5,22-dien-3-amine.
b) spacer: glycine, alanine, β-alanine, 4-aminobutyric acid, 5-aminopentanoic acid, 6-aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid.

Das nächste Beispiel beschreibt die Synthese eines Lipopolyamins, welche durch die Formeln I und VI gekennzeichnet ist:
Als Edukt wird Asparaginsäure eingesetzt, weiche über allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden an den Carboxyfunktionen, in diesem Falle jeweils mit Stearylamin und nach der Entschützung der Aminofunktion direkt an 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl-Rest gebunden wird. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis(3- aminopropyl)amino-1-oxopentylasparagyldistearylamidThe next example describes the synthesis of a lipopolyamine, which is characterized by the formulas I and VI:
The starting material used is aspartic acid, which is bonded to the carboxy functions via generally known peptide linking methods, in this case in each case with stearylamine and, after deprotection of the amino function, directly to 2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl radical. The end product is N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentylasparagyldistearylamide

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und Aminen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsäuren ableitet, bestehen:Furthermore, such connections are of particular interest in this context, those from combinations of the following amino acid backbones, spacers and amines, their The alkyl radical is derived from the following listed fatty acids:

a) Basic amino acid structures: aspartic acid, glutamic acid, α-aminomalonic acid.
b) spacer: glycine, alanine, β-alanine, 4-aminobutyric acid, 5-aminopentanoic acid, 6-aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid.
c) fatty acids: oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid, Palmitoleic acid, linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, Lignoceric acid.

Im nächsten Beispiel wird die Synthese einer weiteren Verbindung vorgestellt, welche durch die Formel I und V gekennzeichnet ist. Hierbei wird als Grundgerüst die an der Carboxyfunktion als tert-Butylester geschützte α-Aminosäure Ornithin eingesetzt. Ebenfalls durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden wird jene Verbindung in diesem Falle mit Ölsäure und nach der Entschützung der Carboxyfunktion über den Spacer Ethylendiamin an 2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-carboxypentyl-Rest gebunden. Als Endprodukt erhält man N-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino-1-oxopentyl]-N′-[(N-α-,N-δ-dioleoyl)ornithyl]ethylen diamin.In the next example the synthesis of another compound is presented, which by the formula I and V is marked. Here, the basic structure is that of the Carboxyfunction used as tert-butyl ester protected α-amino acid ornithine. Likewise in this case, that compound is made by well known peptide linkage methods with oleic acid and after deprotection of the carboxy function via the spacer ethylenediamine bound to 2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl residue. The end product is obtained N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] -N ′ - [(N-α-, N-δ-dioleoyl) ornithyl] ethylene diamine.

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer und den aufgelisteten Fettsäuren bestehen:Furthermore, such connections are of particular interest in this context, those from combinations of the following amino acid backbones, spacers and those listed Fatty acids exist:

a) Basic amino acid frameworks: lysine, ornithine.
b) spacer: ethylenediamine, propylenediamine, butylenediamine, pentamethylenediamine, Hexamethylenediamine.
c) fatty acids: oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid, Palmitoleic acid, linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, Lignoceric acid.

Im nächsten Beispiel, welches die Synthese einer Verbindung, charakterisiert durch die Formel I und IV, beschreibt, wird als Grundkörper wiederum die α-Aminosäure Ornithin verwendet, wobei die α-Aminofunktion durch die basenlabile Fluorenylmethoxycarbonyl-Gruppe und die δ-Aminofunktion durch die bekannterweise säurelabile tert-Butoxycarbonyl-Gruppe geschützt sind. Durch allgemein bekannte Peptidverknüpfungsmethoden wird zunächst die α- Carboxyfunktion mit Stearylamin, dann nach Entschützung der δ-Aminofunktion jene mit Ölsäure und im darauffolgenden Schritt die α-Aminogruppe nach deren Entschützung direkt mit der Polyaminkomponente gekennzeichnet durch den 2,5-Bis(3-aminopropyl) amino-1- carboxypentyl-Rest gekuppelt. Als Endprodukt erhält man N-α-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl]-N-δ-oleoylomithylstearylamidIn the next example, which is the synthesis of a compound, characterized by the formula I and IV, the α-amino acid ornithine is again used as the base, where the α-amino function by the base-labile fluorenylmethoxycarbonyl group and the δ-amino function protected by the known acid-labile tert-butoxycarbonyl group are. The α- is first Carboxy function with stearylamine, then after deprotection of the δ-amino function with Oleic acid and in the subsequent step the α-amino group directly after deprotection with the polyamine component characterized by the 2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1- carboxypentyl residue coupled. The end product obtained is N-α- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] -N-δ-oleoylomithylstearylamide

Desweiteren sind in diesem Zusammenhang solche Verbindungen von besonderem Interesse, die aus Kombinationen folgender Aminosäure-Grundgerüste, Spacer, Aminen, deren Alkylrest sich aus den folgenden aufgelisteten Fettsäuren ableitet, und den Fettsäuren als solche bestehen:Furthermore, such connections are of particular interest in this context, those from combinations of the following amino acid backbones, spacers, amines, their alkyl radical is derived from the following listed fatty acids and the fatty acids as such consist:

a) Basic amino acid frameworks: ornithine, lysine
b) spacer: glycine, alanine, β-alanine, 4-aminobutyric acid, 5-aminopentanoic acid, 6-aminocaproic acid, 7-aminoheptanoic acid.
c) fatty acids: oleic acid, palmitic acid, myristic acid, stearic acid, lauric acid, Palmitoleic acid, linolenic acid, linoleic acid, arachidonic acid, arachic acid, Lignoceric acid.

Als letztes Beispiel wird die Synthese einer Lipopolyamin-Verbindung ausgeführt, welche in der Formel I und in enthalten ist. Als Grundgerüst dient hier die an beiden Aminofunktionen durch die allgemein angewendete Benzyloxycarbonylgruppe geschützte α-Aminosäure Ornithin. Zunächst wird über Curtius-Abbau die Carboxyfunktion in die primäre Aminfunktion übergeführt, welche mit an den Aminofunktionen des pergeschützten 2,5-Bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl-Restes über allgemein bekannte Peptidwerknüpfungsmethoden gekuppelt wird. Nach Entschützung der Aminofunktionen werden jene nach gleicher Methodik jeweils mit Ölsäure verknüpft. Als Endprodukt erhält man 1,4-Dioleoylarnido-1-[2,5-Bis (3- aminopropyl)amino-1-oxopentyl]amidobutanAs a last example, the synthesis of a lipopolyamine compound is carried out, which is described in of the formula I and contained in. The basic structure here is that of both amino functions protected by the commonly used benzyloxycarbonyl group α-amino acid Ornithine. First, the carboxy function is converted into the primary amine function via Curtius degradation transferred to the amino functions of the per-protected 2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-carboxypentyl residue via generally known peptide linking methods is coupled. After deprotection of the amino functions, those using the same methodology each linked with oleic acid. The end product is 1,4-dioleoylarnido-1- [2,5-bis (3- aminopropyl) amino-1-oxopentyl] amidobutane

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche in wäßriger oder wäßriger Puffer- oder ethanolischer Lösung angewendet werden. Es können jedoch auch Liposomen mit oben genannten Lipiden allein, oder in Kombination mit anderen Lipiden wie zum Beispiel Cholesterol, Cholesterylamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder Dioleoylphospatidylcholin (DOPC) formuliert werden.As such, the compounds according to the invention can be used in aqueous or aqueous buffer or ethanolic solution. However, there can also be liposomes with the top mentioned lipids alone, or in combination with other lipids such as Cholesterol, cholesterylamine, dioleoylphosphatidylethanolamine (DOPE) or Dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) can be formulated.

Um die Transfektionseffizienz der erfindungsgemäßen Lipide zu steigern, besteht die Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Substanzen zu transfektieren, die die enzymatische Aktivität in den Lysosomen inhibieren, sogenannte lysosomatotrope Substanzen, wie zum Beispiel Chloroquin oder von Viren abgeleitete lysosomatropisch wirkende Proteine.In order to increase the transfection efficiency of the lipids according to the invention, there is Possibility to transfect cells in the presence of substances that are enzymatic Inhibit activity in the lysosomes, so-called lysosomatotropic substances, such as Example chloroquine or lysosomatropically acting proteins derived from viruses.

Die erfindungsgemäßen Lipopolyamine sind bei physiologischem pH positiv geladen und können daher mit negativ geladenen Makromolekülen, insbesondere mit DNA und verwandten Stoffklassen stabile Aggregate bilden. Die mit den Lipopolyaminen bemäntelten und positivierten Makromoleküle wechselwirken mit der negativ geladenen Zellmembran auf eine Weise, die zu einer Einschleusung der Makromoleküle in die Zelle führt. Dabei sind in vitro als auch in vivo Anwendungen möglich. Analoges gilt für Liposomenformulierungen der erfindungsgemäßen Lipide.The lipopolyamines according to the invention are positively charged and at physiological pH can therefore with negatively charged macromolecules, especially with DNA and related Form classes of stable aggregates. Those covered with lipopolyamines and Positive macromolecules interact with the negatively charged cell membrane on one This leads to the macromolecules being introduced into the cell. Here are in vitro as also possible in vivo applications. The same applies to liposome formulations lipids according to the invention.

Im Vergleich zur zielgerichteten rezeptorvermittelten Endocytose (Wu et al., J. Chem. 262, 4429-4432 (1987)), in denen Polykationen, welche auch DNA-Binder genannt werden (zum Beispiel Polylysin etc.) an sogenannte Internalisierungsfaktoren (zum Beispiel bestimmte Glykoproteine) gebunden sind, die zielgerichtet an Oberflächenrezeptoren bestimmter Zellen binden, besitzen die erfindungsgemaßen Lipide, bzw. deren Liposomenformulierungen keine Zellspezifität. Eine zielgerichtete Lieferung durch die erfindungsgemäßen Lipide bzw. derer Liposomenformulierungen kann dadurch erreicht werden, daß die Ladungen von Lipiden und den zu transportierenden Biomolekülen ausgeglichen werden und zusätzlich an das Aggregat zwischen Biomolekül und Lipiden Intemalisierungsfaktoren angebracht werden. Dies kann zum Beispiel durch Liposomenformulierung mit Colipiden erreicht werden, falls die Colipide als Kopfgruppe solche Intemalisierungsfaktoren tragen. Eine andere Möglichkeit ist ein auf Ladungsneutralität abgestimmtes Aggregat aus Biomolekül, Lipiden und Internalisierung faktoren. Sogenannte Internalisierungsfaktoren sind Transferrin, Galactose, Mannose, Mannose-6-phosphat, Asialglycoprotein, Conalbumin, Lectine, Transcobalamin, α-2- Makroglobulin, Biotin, Folat, mannosylierte Glycoproteine. Weitere sind in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden. Analog wie Internalisierungsfaktoren, können auch zellspezifische Antikörper eingesetzt werden.Compared to targeted receptor-mediated endocytosis (Wu et al., J. Chem. 262, 4429-4432 (1987)), in which polycations, which are also called DNA binders (for Example polylysine etc.) to so-called internalization factors (for example certain Glycoproteins) are bound to specific surface receptors of certain cells bind, the lipids according to the invention or their liposome formulations do not have any Cell specificity. A targeted delivery by the lipids according to the invention or their Liposome formulations can be achieved in that the charges of lipids and the biomolecules to be transported are balanced and additionally to the aggregate between the biomolecule and lipid intalization factors. This can lead to Example can be achieved by liposome formulation with colipids if the colipids are considered Head group carry such internalization factors. Another option is an on Charge neutrality coordinated aggregate of biomolecule, lipids and internalization factors. So-called internalization factors are transferrin, galactose, mannose, Mannose-6-phosphate, asialglycoprotein, conalbumin, lectins, transcobalamin, α-2- Macroglobulin, biotin, folate, mannosylated glycoproteins. More are in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808, which are incorporated herein by reference. Analogous to internalization factors, cell-specific antibodies can also be used will.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Insbesondere können solche Verbindungen für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidamie, Adenosindeaminasemangel und Hypercholesterinamie, Hämophilie, β- Thalassämie genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA-Fragmente mittels dieser Lipide in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfalten soll. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA-Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel Antisense-DNA/RNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können tümorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene eine Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefaßkrakkheiten geleistet werden. Weiters können DNA, welche Ribozyme kodiert, oder Ribozyme selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (HIV, Herpes, Hepatitis) kann auf diesem Wege unterbrochen werden. The compounds according to the invention can be used for therapeutic purposes. In particular, such compounds can be used for gene therapy by, for example, cystic Fibrosis, muscular dystrophy, phenylketonuria, maple syrup disease, propionic acidemia, Methylmalonic acidemia, adenosine deaminase deficiency and hypercholesterolemia, hemophilia, β- Thalassemia can be used. Gene therapy methods of treatment are furthermore interesting if hormones, growth factors, cytotoxins or immunomodulatory proteins to be synthesized in the organism. For the purposes mentioned above DNA fragments can be brought into cells in which these DNA should have the desired effect. The desired effect, the replacement may be missing or defective DNA areas or the inhibition of DNA areas (for example Antisense-DNA / RNA) that trigger the disease must be in the diseased cell type. To this Tumor-suppressing genes can be used in cancer therapy or by the introduction of cholesterol regulating genes contributes to the prevention of cardiac and Blood vessel diseases are performed. Furthermore, DNA encoding ribozymes can or Ribozymes themselves can be introduced into diseased cells. The translation of that DNA creates active ribozymes that catalytically cleave m-RNA at specific sites and in this way prevent transcription. For example, viral m-RNA can be cleaved in this way without affecting another cellular m-RNA. Of the The multiplication cycle of viruses (HIV, herpes, hepatitis) can be interrupted in this way will.

Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist jene auch mögliches Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Verbindungen.Transfection for the production of cancer vaccines also always plays a role in cancer therapy growing role. So that is also a possible area of application for the compounds of the invention.

Eine weitere Anwendung können solche Lipide zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt.Such lipids can also be used, for example, in vaccination methods based on the basis of the expression of DNA encoding immunogenic peptides in the body of Humans and animals work. For this, lipid / DNA complexes are used as vaccines.

Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die Innunantwort aus.The introduction of the DNA into the body cells leads to the expression of the immunogenic Peptide and thus triggers the innate response.

Abgesehen von DNA können auch andere Makromoleküle, wie zum Beispiel Peptide oder Proteine, in Zellen eingeschleust werden. Zu diesem Zweck können sie mit den erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche bemäntelt werden oder in Liposomen, welche als Komponente die erfindungsgemaßen Lipopolyamine enthalten, eingeschlossen oder an deren Oberfläche adsorbiert werden. Bringt man derartige Aggregate mit Zellen in Kontakt, so findet ein Transport dieser Moleküle durch die Zellwand statt. Therapeutische Peptide haben einen günstigen Einfluß auf zahlreiche Erkrankungen. Solche Peptide oder Proteine sind zum Beispiel Lymphokine, Interleukine, Tumore Nekrose Faktoren oder Interferone, weiterhin Wachstumsfaktoren, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor-VIII: c, Granulocyten- Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor, Erythropoietin, Insulin, Calcitonin, Thymidinkinase und andere. Auch toxische Peptide wie Ricin, Diphteriatoxin und andere können therapeutisch gewinnbringend eingesetzt werden.In addition to DNA, other macromolecules, such as peptides or Proteins that are introduced into cells. For this purpose you can use the lipopolyamines according to the invention are coated as such or in liposomes which contain, as a component or included, the lipopolyamines according to the invention whose surface is adsorbed. If such aggregates are brought into contact with cells, see above these molecules are transported through the cell wall. Have therapeutic peptides a beneficial influence on numerous diseases. Such peptides or proteins are used for Example lymphokines, interleukins, tumors, necrosis factors or interferons, furthermore Growth factors, tissue plasminogen activator, factor VIII: c, granulocyte Macrophage colony stimulating factor, erythropoietin, insulin, calcitonin, Thymidine kinase and others. Also toxic peptides like ricin, diphtheria toxin and others can be used therapeutically for profit.

Die Lipide werden aufgrund ihrer positiven Ladung vorwiegend dazu eingesetzt, negativ geladene Moleküle wegen ihrer negativen Ladung zu komplexieren und in Zellen einzuschleusen. Durch sogenannte "self assembling Systems" können jedoch auch positiv geladene Moleküle transportiert werden, in dem zunächst negativ geladene Liposomen mit diesem positiv geladenen Molekülen komplexiert werden. Wählt man die Verhältnisse so, daß eine negative Nettoladung verbleibt, können diese Komplexe mit diesen erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche oder in Form von Liposomen positiviert werden, in dem die gegensätzlich geladenen Komponenten in Kontakt gebracht werden. Die resultierenden positiv geladenen Gesamtkomplexe werden von den Zellen aufgenommen.The lipids are mainly used due to their positive charge, negative charged molecules to complex because of their negative charge and in cells infiltrate. Through so-called "self assembling systems" can also be positive charged molecules are transported in the initially negatively charged liposomes this positively charged molecules are complexed. If you choose the conditions so that a negative net charge remains, these complexes with these invention Lipopolyamines as such or in the form of liposomes are positive, in which the oppositely charged components are brought into contact. The resulting positive charged total complexes are taken up by the cells.

Weitere Anwendungsmöglichkeiten für kationische Lipide sind den Veröffentlichungen WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746 (1992) zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden. Other possible uses for cationic lipids are the publications WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746 (1992), which herein be included with reference.

Beispiele der für derzeit als therapeutisch aussichtsreich angesehene Sequenzen für genetisches Material sind in der Übersicht von F.W.Anderson, Science 256, 808 (1992) entnehmbar, die ebenfalls hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.Examples of the sequences currently regarded as therapeutically promising for genetic material are in the overview by F.W. Anderson, Science 256, 808 (1992) removable, which are also incorporated herein by reference.

Examples

Bezugsquellen:
1. Plasmide pCH1 10 (enthält β-Gal als Reportergen) und pMSGCAT: Pharmacia Fine Chemicals,Uppsala, Schweden
L-[2,5-Bis (3-aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan(tetra--BOC- ACP) wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, (1998) synthetisiert.
5-Cholesten-3-amin wurde nach H. Brunner, G. Sperl; Bull. Soc. Chim. Belg. 101, 935 (1992) synthetisiert.Sources of supply:
1. Plasmids pCH1 10 (contains β-Gal as reporter gene) and pMSGCAT: Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden
L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane (tetra-BOC-ACP) was obtained according to J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, (1998).
5-cholesten-3-amine was obtained according to H. Brunner, G. Sperl; Bull. Soc. Chim. Belg. 101, 935 (1992).

example 1 Synthesis of N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] cholesteryl-3-amide

Zu einer Lösung von 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis (3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy carboxy-1-oxopentan und 385 mg (1 mmol) 5-Cholesten-3-amin in 10 ml THF (Tetrahydroturan) oder DMF (N,N-Dirnethylförmamid) werden 206 mg (Immol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) gegeben. Die Reaktion wird bei Raumtemperatur (RT) unter Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem Dicyclohexylharnstoff (DCH) abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.To a solution of 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] tetra-tert-butyloxy carboxy-1-oxopentane and 385 mg (1 mmol) 5-cholesten-3-amine in 10 ml THF (Tetrahydroturan) or DMF (N, N-dirnethylformamide) are 206 mg (Immol) Dicyclohexylcarbodiimid (DCCI) given. The reaction is under at room temperature (RT) Stirring of the reaction mixture carried out. After a reaction time of 12 h filtered out precipitated dicyclohexylurea (DCH) and the solvent removed. The product obtained is purified by flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines Trifluoressigsäure (TFA)/CH₂CH₂-Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.10 ml of a trifluoroacetic acid are added to the purified compound obtained at RT (TFA) / CH₂CH₂ mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ deducted. The TFA salt of the final product can be saturated, aqueous Sodium hydrogen carbonate solution can be converted into the free amine.

Example 2 Synthesis of N- (2,5-bis (3-aminopropyl) amino] -1-oxopentylglycylcholesteryl-3-amide

Zu einer Lösung von 175 mg (1 mmol) N-Boc-Glycin und 385 mg (1 mmol) 5-Cholesten-3- amin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg (1 mmol) DCCI gegeben und bei RT 12 h gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen.To a solution of 175 mg (1 mmol) N-Boc-Glycine and 385 mg (1 mmol) 5-Cholesten-3- amine in 10 ml THF or DMF are given 206 mg (1 mmol) DCCI and at RT for 12 h touched. The precipitated DCH is then filtered off and the solvent is stripped off.

Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.The product obtained is purified by flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren des Gemisches wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopen-tan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt und bei RT für 12 h gerührt. Danach wird das ausgefallene DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt. Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.10 ml of a TFA / CH₂CH₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring the mixture for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ deducted. The TFA salt of the protected precursor is replaced by saturated, aqueous Sodium hydrogen carbonate solution converted into the free amine. After that, along with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane in 10 ml of THF or DMF and the solution was mixed with 206 mg (1 mmol) of DCCI and stirred at RT for 12 h. Then the precipitated DCH is filtered off and that Stripped solvent. The product obtained is purified by flash chromatography. 10 ml of a TFA / CH₂CH₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ is removed. The TFA salt of the final product can be saturated with aqueous sodium bicarbonate solution be converted into the free amine.

Example 3 Synthesis of N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentylasparagyl distearyl amide

Zu einer Lösung von 233 mg (1 mmol) N.Boc-Asparaginsäure und 540 mg (2 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT und Rühren des Reaktionsgemisches durchgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.To a solution of 233 mg (1 mmol) of N.Boc aspartic acid and 540 mg (2 mmol) Stearylamine in 10 ml THF or DMF are given 412 mg (2 mmol) DCCI. The reaction is carried out at RT and stirring the reaction mixture. After a response time of Precipitated DCH is filtered off for 12 h and the solvent is stripped off. The received The product is purified by means of flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des geschützten Vorläuferproduktes wird durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxipen-tan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Die Reaktion wird wiederum bei RT und unter Rühren ausgeführt und nach einer Reaktionszeit von 12 h wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.10 ml of a TFA / CH₂CH₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ is removed. The TFA salt of the protected precursor is replaced by saturated, aqueous Sodium hydrogen carbonate solution converted into the free amine. After that, along with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxipentane in 10 ml of THF or DMF and the solution was mixed with 206 mg (1 mmol) of DCCI. The reaction is carried out again at RT and with stirring and after a reaction time The precipitated DCH is filtered off for 12 h and the solvents are stripped off. The product obtained is purified by flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.10 ml of a TFA / CH₂CH₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ is removed. The TFA salt of the final product can be saturated with aqueous sodium bicarbonate solution be converted into the free amine.

Example 4 Synthesis of N- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] -N ′ - [(N-α-, N-δ-dioleoyl) - ornithyl] ethylenediamine

Zu einer Lösung von 455 mg (1 mmol) Ornithin-OtBu und 566 mg (2 mmol) Ölsäure in 10 ml THF oder DMF werden 412 mg (2 mmol) DCCI gegeben. Die Reaktion wird bei RT 12 h lang gerührt. Danach wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.To a solution of 455 mg (1 mmol) ornithine OtBu and 566 mg (2 mmol) oleic acid in 10 ml THF or DMF are given 412 mg (2 mmol) DCCI. The reaction is at RT for 12 h touched. The precipitated DCH is then filtered off and the solvent is stripped off. The product obtained is purified by means of flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine 95%ige wäßrige Lösung von TFA gegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/H20 abgezogen. Danach wird zusammen mit 160 mg (1 mmol) N-Boc-Ethylendiamin in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Das Reaktionsgemisch wird bei RT gerührt und nach einer Reaktionszeit von 12 h von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.A 95% aqueous solution of TFA is added to the purified compound obtained at RT given. After stirring for 2 h, excess TFA / H20 is removed. After that taken together with 160 mg (1 mmol) of N-Boc-ethylenediamine in 10 ml of THF or DMF and 206 mg (1 mmol) of DCCI were added to the solution. The reaction mixture is at RT stirred and filtered after a reaction time of 12 h from precipitated DCH and that Stripped solvent. The product obtained is purified by flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird von überschüssigem TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das erhaltene TFA-Salz wird durch gesättigte, wäßrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt. Danach wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3- aminopropyl)amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.10 ml of a TFA / CH₂CH₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ is removed. The TFA salt obtained is in saturated, aqueous sodium bicarbonate solution in the free amine transferred. Then together with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3- aminopropyl) amino] tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane in 10 ml of THF or DMF recorded and the solution with 206 mg (1 mmol) DCCI added. After stirring at RT for 12 h is filtered off from precipitated DCH and the solvent is stripped off. The received The product is purified by means of flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂CH₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂CH₂ abgezogen. Das TFA-Salz des Endproduktes kann durch gesättigte, wässrige Natriumhydrogencarbonatlösung in das freie Amin übergeführt werden.10 ml of a TFA / CH₂CH₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂CH₂ is removed. The TFA salt of the final product can be saturated, aqueous sodium bicarbonate solution be converted into the free amine.

Example 5 Synthesis of N-α- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] -N-δ- oleoylornithylstearylamide

Zu einer Lösung von 455 mg (1 mmol) N-α-Fmoc-N-δ-Boc-Ornithin und 270 mg (1 mmol) Stearylamin in 10 ml THF oder DMF werden 206 mg (1 mmol) DCCI gegeben. Der bei RT und unter Rühren durchgeführte Reaktionsansatz wird nach einer Reaktionszeit von 12 h vom ausgefallenem DCH filtriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.To a solution of 455 mg (1 mmol) N-α-Fmoc-N-δ-Boc-ornithine and 270 mg (1 mmol) Stearylamine in 10 ml THF or DMF are given 206 mg (1 mmol) DCCI. The one at RT and carried out with stirring reaction mixture after a reaction time of 12 h filtered out precipitated DCH and the solvent removed. The product obtained is purified by means of flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung werden bei RT 10 ml eines TFA/CH₂Cl₂- Gemisches zugegeben. Nach 2 h Rühren wird überschüssiges TFA/CH₂Cl₂ abgezogen. Danach wird zusammen mit 283 mg (1 mmol) Ölsäure in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und die Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.10 ml of a TFA / CH₂Cl₂- are obtained at RT to the purified compound obtained. Mixture added. After stirring for 2 h, excess TFA / CH₂Cl₂ is removed. After that is taken up together with 283 mg (1 mmol) of oleic acid in 10 ml of THF or DMF and the 206 mg (1 mmol) of DCCI were added to the solution. After stirring at RT for 12 h filtered out precipitated DCH and the solvents removed. The product obtained is purified by flash chromatography.

Zu der erhaltenen gereinigten Verbindung wird bei RT eine Lösung von 10% Diethylamin in DMF zugegeben. Nach Einengen im Vakuum und Reinigung durch Flashchromatographie wird das erhaltene Produkt zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl)amino]- tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (1 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.A solution of 10% diethylamine in is added to the purified compound obtained at RT DMF added. After concentration in vacuo and purification by flash chromatography the product obtained together with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] - tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane added in 10 ml of THF or DMF and the 206 mg (1 mmol) of DCCI were added to the solution. After stirring at RT for 12 h filtered out precipitated DCH and the solvent removed. The product obtained is purified by means of flash chromatography.

Example 6 Synthesis of 1,4-dioleoylamido-1- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino-1-oxopentyl] amidobutane

Zu einer Lösung von 400 mg (1 mmol) N-α-N-δ-di-CBz-Ornithin in 20 ml CH₂Cl₂ werden 140 µl NEt₃ und 119 mg SOCl₂ tropfenweise zugegeben, wobei das Reaktionsgemisch 0°C nicht übersteigen sollte. Nach Erwärmen des Gemisches auf RT werden 0.33-0.65 g NaN₃ (5- 10 facher Überschuß) zusammen mit Tetra-n-Butylammoniumhydrogensulfat (10 mol% bezüglich Edukt) zugegeben. Nach ca. 6 h unter Rückfluß wird mit gesättigter, wäßriger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser mehrmals gewaschen. Das erhaltene Rohprodukt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.To a solution of 400 mg (1 mmol) of N-α-N-δ-di-CBz-ornithine in 20 ml of CH₂Cl₂ 140 µl NEt₃ and 119 mg SOCl₂ added dropwise, the reaction mixture 0 ° C should not exceed. After warming the mixture to RT, 0.33-0.65 g NaN₃ (5- 10-fold excess) together with tetra-n-butylammonium hydrogen sulfate (10 mol% regarding educt) added. After about 6 hours under reflux, it is saturated with aqueous Washed sodium bicarbonate solution and water several times. The crude product obtained is purified by means of flash chromatography.

Das erhaltene Produkt wird zusammen mit 647 mg (1 mmol) L-[2,5-Bis(3-aminopropyl) amino]-tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentan in 10 ml THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 206 mg (X mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.The product obtained is combined with 647 mg (1 mmol) of L- [2,5-bis (3-aminopropyl) amino] -tetra-tert-butyloxy-carboxy-1-oxopentane added in 10 ml of THF or DMF and 206 mg (X mmol) of DCCI were added to the solution. After stirring at RT for 12 h filtered out precipitated DCH and the solvent removed. The product obtained is purified by flash chromatography.

Nach Abspaltung der Cbz-Gruppen durch Hydrogenolyse bei RT und Rühren mit 5% Pd auf Aktivkohle in Methanol wird das Lösungsmittel abgezogen, danach wird der Rückstand zusammen mit 565 mg (2 mmol) Ölsäure in 10 m THF oder DMF aufgenommen und die Lösung mit 412 mg (2 mmol) DCCI versetzt. Nach 12 h Rühren bei RT wird von ausgefallenem DCH abfiltriert und das Lösungsmittel abgezogen. Das erhaltene Produkt wird mittels Flashchromatographie gereinigt.After splitting off the Cbz groups by hydrogenolysis at RT and stirring with 5% Pd Activated carbon in methanol is stripped off the solvent, then the residue taken together with 565 mg (2 mmol) of oleic acid in 10 m THF or DMF and the Solution with 412 mg (2 mmol) DCCI added. After stirring at RT for 12 h filtered out precipitated DCH and the solvent removed. The product obtained is purified by means of flash chromatography.

Example 7 Liposome formulation

Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol und Cholesteryl amin werden in einem organischen Lösungsmittel gelöst. Die Lipide aus den Beispielen 1-6 werden als solche oder in Form ihrer Salze, zum Beispiel Trifluoracetat-Salze in einem organischen Lösungsmittel gelöst Durch Kombination verschiedener Mengen der unterschiedlichen Lösungen werden verschiedene Kompositionen aus einzelnen Lipiden aus den Beispielen 1-6 oder Lipidgemische aus Colipiden und Lipiden aus den Beispielen 1-6 hergestellt. In einem Glaskolben wird mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein dünner Lipidfilm erzeugt. Dieser wird im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit. Der Film wird mit soviel Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert, daß die Konzentration 1mg Lipid pro ml Lösung beträgt. Danach wird unter Kühlung mit Ultraschall behandelt. Die Liposomenformulierung wird durch einem Filter (Porenweite 0.2 µm) sterilfitriert.Dioleoylphosphatidylethanolamine, dioleoylphosphatidylcholine, cholesterol and cholesteryl amine are dissolved in an organic solvent. The lipids from Examples 1-6 are used as such or in the form of their salts, for example trifluoroacetate salts in one organic solvents dissolved by combining different amounts of Different solutions are made up of different compositions from individual lipids Examples 1-6 or lipid mixtures of colipids and lipids from Examples 1-6 produced. In a glass flask, a thin one is made using a rotary evaporator Lipid film created. This is freed from solvent residues in a high vacuum. The film will hydrated with so much water or aqueous buffer solution that the concentration 1mg lipid per ml of solution. Then it is treated with ultrasound under cooling. The Liposome formulation is sterile filtered through a filter (pore size 0.2 µm).

Example 8 Lipid solutions

Die Lipide aus den Beispielen 1-6 werden als solche und in Form ihrer TFA-Salze zu einer Konzentration von 1-2.5 mg/ml in Wasser, Ethanol und einem Gemisch aus Wasser und Ethanol verschiedener Zusammensetzung gelöst. The lipids from Examples 1-6 as such and in the form of their TFA salts become one Concentration of 1-2.5 mg / ml in water, ethanol and a mixture of water and Dissolved ethanol of various compositions.

Example 9 Cell cultures

Die Zelllinien COS-7, Hela und BHK-21 werden in "Dulbecco′s-moditied Eagle′s medium" (DMEM), das 10% fötales Kälberserum (FBS), 2mM L-Glutamin (Gin), 0. 1 mM nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 100U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin enthält, in einem Inkubator (5% CO₂-Atmosphäre) kultiviert.The cell lines COS-7, Hela and BHK-21 are in "Dulbecco’s-modified Eagle’s medium" (DMEM), the 10% fetal calf serum (FBS), 2mM L-glutamine (Gin), 0.1mm not contains essential amino acids (NEAA), 100U / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin, in an incubator (5% CO₂ atmosphere) cultivated.

Example 10 Transfection

Die Zellen werden auf einer 96-well-Mikrotiterplatte ausplattiert und über Nacht zu annähernd 60% Konfluenz inkubiert. Um die Zellen in einem "well" zu transfizieren, werden 1-2 µg von pCHl 10 oder pMSGCAT in 100 µl Opti-MEM 1 gelöst. Das kationische Lipid als ethanolische Lösung oder Liposomenformulierung wird ebenfalls in 100 µl Opti-MEM I gelöst. Die beiden Lösungen werden in einem Polystyrolbehälter gemischt, für 10-15 min stehengelassen, um die Bildung des Lipid/DNA-Komplexes zu ermöglichen. Danach wird auf 1 ml aufgefüllt indem 0.8 ml Opti-MEM I oder DMEM mit 5% FBS, 2 mM GIn, 0.5 mM NEAA ohne Antibiotika zugegeben werden.The cells are plated on a 96-well microtiter plate and too close overnight Incubated 60% confluence. To transfect the cells in a "well", 1-2 µg of pCHl 10 or pMSGCAT dissolved in 100 µl Opti-MEM 1. The cationic lipid as ethanolic Solution or liposome formulation is also dissolved in 100 µl Opti-MEM I. The two Solutions are mixed in a polystyrene container, left to stand for 10-15 min To enable formation of the lipid / DNA complex. Then make up to 1 ml by 0.8 ml Opti-MEM I or DMEM with 5% FBS, 2 mM GIn, 0.5 mM NEAA without antibiotics be added.

Die Zellen werden einmal mit Opti-MEM 1 oder serumfreien DMEM gewaschen und der DNA/Lipid-Komplex wird direkt zu den Zellen gegeben. Nach 6 h Inkubationszeit bei 37°C wird der Transfektionskomplex entfernt und 2 ml DMEM mit 10% FBS, 2 mM GIn, 0.2 mM NEAA, 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zu jedem "well" hinzugegeben. Die Zellen werden weitere 48 h kultiviert und durch ein bis zweimaliges Frieren und Tauen in 300 µl 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8-8.0), welches 0. 1 0% Triton X-100 enthält, lysiert. Die Zelllysate werden auf β-Galactosidase oder Chloramphenicolacetyltransferase getestet. Diese Tests werden mit kommerziell erhältlichen ELISA-Testkits nach den Anweisungen der Hersteller durchgeführt.The cells are washed once with Opti-MEM 1 or serum-free DMEM and the DNA / lipid complex is added directly to the cells. After 6 h of incubation at 37 ° C the transfection complex is removed and 2 ml DMEM with 10% FBS, 2 mM GIn, 0.2 mM NEAA, 100 U / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin were added to each "well". The Cells are cultivated for a further 48 h and freeze and thaw once or twice in 300 µl 0.1 M Tris-HCl (pH 7.8-8.0), which contains 0.1% Triton X-100, is lysed. The cell lysates are tested for β-galactosidase or chloramphenicol acetyl transferase. These tests with commercially available ELISA test kits according to the manufacturer's instructions carried out.

Claims

1. Compounds of the general formula I: which are present in the D, L or DL form in the presence of an asymmetry center, including their salts, where a, b, c, d, e and f are independently 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 and where a is only 0 when b is 0 and e is only 0 when f is 0, R₁ is a radical of the general formula II: in which g is 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6, h is 0, 1, 2 or 3, where g is 0 when h is 0 and h is 1 when g is 0, X -O - or -NH-, all positions of the steroid substituents can be configured α- or β-, the C atoms 5 and 6 or the C atoms 8 and 9 are linked via a double bond, R₂ and R₃ independently of one another hydrogen or are a branched or unbranched alkyl or a branched or unbranched alkenyl or a substituted or unsubstituted aryl or aralky radical, R₄ is H or methyl or R₁ is a radical of the general formula III: where all chiral centers are independently in D or L form, m is 0, 1, 2 or 3, k is 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6, with k being 0 when m is 0 and m is 1 when k is 0, n, p and q are independently 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6, R₂ is as defined above, X₁, X₂, and X₃ are mutually dependent are,
R₅ and R₆ are independently branched or unbranched alkyl or alkenyl radicals having 5-30 carbon atoms.

2. Compounds according to claim 1, wherein a, d and e are 3, b and f are 1 and c is 0.

3. Compounds according to any one of the preceding claims, wherein h is 0 or 1 and g (if h is 1) is 1, 2, 3, 4, 5 or 6, R₂ = hydrogen-methyl, 2-propyl, isopropyl, 1- (1-methyl) propyl or benzyl and
R₃ = is.

4. Compounds according to claim 1 or claim 2, wherein R₁ is a radical of the general formula IV: wherein k, m, n, p, q, R₂, R₅, and R₆ are as defined in claim 1.

5. Compounds according to claim 4, wherein n = 0, in = 0 or 1, q = 3, and p = 0, k (if m = 1) = 1,2, 3, 4, 5 or 6, R₂ is hydrogen, methyl, 2-propyl, isopropyl, 1- (1-methyl) propyl or Benzyl, R₅ = - (CH₂) ₁₇CH₃ and R₆ = - (CH₂) ₇CH = CH (CH₂) ₇CH₃.

6. Compounds according to claim 1 or claim 2, wherein R₁ is a radical of the general formula V: wherein k is 0, 1, 2, 3, 4, 5 or 6 and n, p, q, R₅ and R₆ are as defined in claim 1.

7. Compounds according to claim 6, in which n = 0, p = 3, q = 0, k = 2, 3, 4, 5 or 6, R₅ and R₆ = - (CH₂) ₇CH = CH (CH₂) ₇CH₃.

8. Compounds according to claim 1 or claim 2, wherein R₁ is a radical of the general formula VI: wherein k, m, n, p, q, R₂, R₅, and R₆ are as defined in claim 1.

9. Compounds according to claim 8, in which n is 0, in 0 or 1, q is 0, p is 0, 1 or 2, k 0 is when in 0, k, if in I, is I, 2, 3, 4, 5 or 6, R₂ = hydrogen, methyl, 2-propyl, Isopropyl, 1- (1-methyl) propyl or benzyl, R₅ and R₆ = - (CH₂) ₁₇CH₃.

10. A process for the preparation of compounds according to any one of claims 1 to 9, wherein a polyamine derivative of the formula VII: where a, b, c, d, e and f are as defined in claim 1,
optionally with a spacer, which can consist of aminoalkylene acid derivatives or diaminoalkylene derivatives of the formula VIII: where k, in and R₂ are as defined in claim 1 and X₄ can be -COOH or -NH₂,
and with a steroid structure of formula IX: wherein R₃ and R₄ are as defined in claim 1, all positions on the steroid backbone can be α- or β-configured, the C atoms 5 and 6 or the C atoms 8 and 9 are linked via a double bond, X₅ -NH₂ or can be -OH,
or a trifunctional framework of formula X: where n, p, q, X₂, X₃, R₅ and R₆ are as defined in claim 1 and X₆ corresponds to -NH₂ or -COOH, is reacted.

11. Liposome formulations with compounds according to any one of claims 1-9 with or without Colipid.

12. Method for introducing biologically active compounds, such as DNA, RNA, Ribozymes, antisense DNA, antisense RNA, peptides and proteins in eukariotic cells, wherein compounds or formulations according to any one of claims 1-9 or 11 with the Compounds to be introduced and the resulting complexes with eukaryotic cells in be contacted in vivo or in vitro.

13. Use of the compounds or formulations according to any one of claims 1-9 or 11 as a reagent for introducing biologically active compounds, such as DNA, RNA, Ribozymes, antisense DNA, antisense RNA, peptides and proteins in vivo or in vitro in eukaryotic cells.