DD287949A5 - PROCESS FOR THE PRODUCTION OF COMPOUNDS WITH BIOLOGICAL ACTIVITY - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen mit biologischer Aktivitaet. Biologisch aktive Verbindungen werden an wasserloesliche Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyether mit primaeren, aromatischen Aminogruppen nach deren Aktivierung durch Diazotierung kovalent gebunden. Die Kupplungsreaktionen werden in waeszrigen Loesungen, organischen Loesungsmitteln oder Gemischen beider durchgefuehrt. Die Reaktionstemperaturen liegen bei 10C bis 40C, und die Reaktionsloesungen sind entweder gepufferte, vorzugsweise alkalische p H-Werte besitzende Reaktionsloesungen oder saeurebindende Mittel enthaltende Reaktionsloesungen. Die neuen Verbindungen mit biologischer Aktivitaet koennen in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen der stoffwandelnden Industrie eingesetzt werden.{Verfahren; biologisch aktive Verbindungen; kovalente Bindung; Polyoxyalkylenglykole und ihre Monoalkoxyether; loeslich; Wasser; organische Loesungsmittel; aromatische Aminogruppen; Diazotierung}The invention relates to a process for the preparation of compounds with biological activity. Biologically active compounds are covalently bound to water-soluble polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy ethers with primary, aromatic amino groups after activation by diazotization. The coupling reactions are carried out in aqueous solutions, organic solvents or mixtures of both. The reaction temperatures are 10C to 40C, and the reaction solutions are either buffered reaction solutions, preferably having alkaline pH values, or reaction solutions containing acid scavengers. The new compounds with biological activity can be used in medicine, biotechnology and other branches of the substance-converting industry. {Process; biologically active compounds; Covalent bond; Polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy ethers; soluble; Water; organic solvents; aromatic amino groups; diazotization}
Description
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen mit biologischer Aktivität. Das Verfahren und die neuen Verbindungen werden in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen oder stoffumwandelnden Industrie eingesetzt.The invention relates to a process for the preparation of novel compounds having biological activity. The process and the new compounds are used in medicine, biotechnology and other branches or material converting industry.
Charakteristik des bekannten Standes der TechnikCharacteristic of the known state of the art
Umsetzungen von biologisch aktiven Verbindungen wie Biokatalysatoren, biokatalytisch inaktiven Proteinen und synthetischen Verbindungen mit biologischen Aktivitäten mit löslichen Polymeren sind besonders in den letzten Jahren verstärkt angewandte Methoden zur chemischen Modifikation dioser Verbindungen. Besondere Bedeutung haben dabei solcherart modifizierte Proteine (Trends Biotechnol. 1986,7,190-194) und auf diese Weise erhaltene polymere Derivate und Koenzymen erlangt, bei denen zum Beispiel die Koenzyme NADH beziehungsweise NADPH an Polymere wie Dextrane, Polyethylenglykol oder Kopolymere aus Methylvinylether/Maleinsäureanhydrid kovalent gebunden wurden (DE-AS 2841414). Die Gründe für die verstärkte Zuwendung zu solchen Modifizierungsreaktionen an biologisch aktiven Verbindungen bestehen darin, daß zum einen diese modifizierten Verbindung zur Aufklärung von Struktur-Wirkungs-Beziehungen herangezogen werden können und zum anderen die Eigenschaften von zum Beispiel mit wasserlöslichen Polymeren modifizierten Proteinen oder auch Pharmaka drastisch verändert werden können, so daß sich neue und ungewöhnliche Anwendungsmöglichkeiten für diese modifizierten, biologisch aktiven Verbindungen in der Medizin und Biotechnologie ergeben.Reactions of biologically active compounds such as biocatalysts, biocatalytically inactive proteins and synthetic compounds with biological activities with soluble polymers are especially in recent years increasingly used methods for the chemical modification of dioser compounds. Particular importance is attached to proteins modified in this way (Trends Biotechnol., 1986, 7, 190-194) and polymeric derivatives and coenzymes obtained in this manner, in which, for example, the coenzymes NADH or NADPH covalently bind to polymers such as dextranes, polyethylene glycol or copolymers of methyl vinyl ether / maleic anhydride were bound (DE-AS 2841414). The reasons for the increased attention to such modification reactions on biologically active compounds is that, on the one hand, this modified compound can be used for the elucidation of structure-activity relationships and, on the other, the properties of, for example, water-soluble polymers modified proteins or pharmaceuticals drastically can be changed, so that there are new and unusual applications for these modified, biologically active compounds in medicine and biotechnology.
in den letzten Jahren hat sich aber gleichzeitig herausgestellt, daß es für die Synthese' ,odifizierte, biologisch aktiver Verbindungen keine universell anwendbaren und immerzu biologisch aktiver Verbind jngen führende Modifizierungsverfahren gibt und für jede biologisch aktive Verbindung ein für sie optimales Modifizierungsverfahren gefunden und erarbeitet werden muß, um eine optimale biologische Aktivität zu erreichen.In recent years, however, been found at the same time that it odifizierte for the synthesis', biologically active compounds jngen no universally applicable and constantly biologically active Connectivity is leading modification process and are found optimal for them modification process for each biologically active compound and develops must to achieve optimal biological activity.
Diese allgemeine Erkenntnis trifft auch auf die chemische Modifikation von biologisch aktiven Verbindungen mit Polyoxyalkylenglykolen oder Ihren Monoalkoxyethern zu. Für deren kovalente Bindung an biologisch aktive Verbindungen stehen zudem bisher noch vergleichsweise wenige Methoden zu Verfugung, weil einerseits die Hydroxylgruppen dieser löslichen Polymeren nur wenige Kupplungsreaktionen mit den in vielen Fällen nicht stabilen, biologisch aktiven Verbindungen erlauben und andererseits die Hydroxylgruppen oftmals mit teuren oder kompliziert aufgebauten und damit schwer herstellbaren oder oft noch toxischen Reagentien aktiviert werden müssen.This general finding also applies to the chemical modification of biologically active compounds with polyoxyalkylene glycols or their monoalkoxy ethers. For their covalent bonding to biologically active compounds also comparatively few methods are still available, because on the one hand allow the hydroxyl groups of these soluble polymers only a few coupling reactions with unstable in many cases, biologically active compounds and on the other hand, the hydroxyl groups often constructed with expensive or complicated and thus hard-to-produce or often toxic reagents must be activated.
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung von neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität zu entwickeln, das die Modifizierung biologisch aktiver Verbindungen mit Polyoxyalkylenglykolen und ihren Monoalkoxyethern einschließt, das durch die Verwendung billiger Aktivierung smittel zur Herstellung aktivierter Derivate der Polyoxyalkylenglykole und Ihrer Monoalkoxyether gekennzeichnet ist und das zu stabilen und modifizierten Derivaten von modifizierten Derivaten von biologisch aktiven Verbindungen führt, die in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen der stoffwandelnden Industrie eingesetzt werden können.The object of the invention is to develop a process for the preparation of novel compounds having biological activity which involves the modification of biologically active compounds with polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxyethers characterized by the use of inexpensive activating agents to produce activated derivatives of the polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy ethers and which results in stable and modified derivatives of modified derivatives of biologically active compounds which can be used in medicine, biotechnology and other branches of the materials converting industry.
Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung struktur!! neuer Verbindungen mit biologischer Aktivität durch Umsetzung biologisch aktiver Verbindungen mit aktivierten Polymere,, vom Typ der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyether.The object of the invention is the development of a method for producing structure !! new compounds with biological activity by reacting biologically active compounds with activated polymers ,, the type of polyoxyalkylene glycols or their monoalkoxy ethers.
Erfindungsgemäß besteht das Verfahren zur Herstellung neuer Verbindungen mit biologischer Aktivität darin, daß in einem ersten Reaktionsschritt Polyoxyalkylenglykole oder Ihre Monoalkoxyether, in denen die Hydroxylgruppen teilweise oder vollständig durch primäre, aromatische Aminogruppen substituiert sind, In wäßrigen Lösungen oder organischen Lösungsmitteln durch Diazotierung in eine aktivierte Form überführt werden. Diese Diazotierungsreaktionen an aromatische Aminogruppen enthaltenden Derivaten der Polyoxyalkylenglykole und ihrer Monoalkoxyether werden nach an sich bekannten Methoden ausgeführt, vorzugsweise also mit salpetriger Säure durch Freisetzung dieser aus Natriumnitrit mit einer verdünnten Säure. Auf Grund des niedrigen Gehaltes an primären, aromatischen Aminogruppen im Vergleich zum überwiegenden Kohlenwasserstoffgerüst besonders bei den höhermolekularen Polymeren und wegen der guten Löslichkeit der Polymeren in organischen Lösungsmitteln können die Diazotierungareaktionon auch nach beschriebenen Methoden mit Vorteil und ohne Gefahren in organischen Lösungsmitteln wie Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid beziehungsweise Benzen oder Gemischen dieser Lösungsmittel untereinander oder Gemischen dieser Lösungsmittel mit halogenieren, aliphatischen Kohlenwasserstoffen wie Chloroform und Methylenchlorid durchgeführt werden.According to the invention, the process for the preparation of novel compounds having biological activity is that in a first reaction step polyoxyalkylene glycols or their monoalkoxy ethers in which the hydroxyl groups are partially or completely substituted by primary, aromatic amino groups, in aqueous solutions or organic solvents by diazotization in an activated form be transferred. These diazotization reactions on aromatic amino-containing derivatives of the polyoxyalkylene glycols and their monoalkoxy ethers are carried out by methods known per se, preferably with nitrous acid by liberation of these from sodium nitrite with a dilute acid. Due to the low content of primary, aromatic amino groups compared to the predominant hydrocarbon backbone especially in the higher molecular weight polymers and because of the good solubility of the polymers in organic solvents Diazotierungareaktionon can also by methods described with advantage and without dangers in organic solvents such as dimethylformamide, dimethyl sulfoxide or Benzen or mixtures of these solvents with each other or mixtures of these solvents with halogenated, aliphatic hydrocarbons such as chloroform and methylene chloride are performed.
In einem zweiten Reaktionsschritt- der kovalenten Verknüpfung -werden die durch Diazotierung aktiv!«, rten Derivate der Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyderivate in Lösungen eingetragen, die die biologisch aktiven Verbindungen gelöst oder suspendiert enthalten. Als biologisch aktive Verbindungen werden Biokatalysatoren wie Enzyme, mit Vorteil solche aus den Klassen der Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen und Isomerasen, Mikroorganismen, tierische, pflanzliche und humane Zellen, Zellorganellen, synthetische Enzyme und Koenzyme oder biokatalytisch inaktive Proteine wie Antigene, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Blutgerinnungsfaktoren, Interferone, Hemoproteine, Albumine, zuckerbindende P- Meine wie Lektine oder in vitro hergestellte Konjugate aus Biokatalysatoren und biokatalytisch inaktiven Proteinen oder nieder- oder hochmolekulare Effektoren wie Nukleinsäuren, Bruchstücke von Nukleinsäuren, Koenzyme, Peptide, Heptene, Hormone, Vitamine, Pharmaka, Sauerstoff bindende, aktivierende und transportierende, synthetische Verbindungen sowie Affinitätsliganden gegenüber den biologisch aktiven Verbindungen eingesetzt.In a second reaction step-the covalent linkage-the derivatives active by diazotization are introduced into derivatives of the polyoxyalkylene glycols or their monoalkoxy derivatives in solutions containing the biologically active compounds dissolved or suspended. As biologically active compounds are biocatalysts such as enzymes, advantageously those from the classes of oxidoreductases, transferases, hydrolases and isomerases, microorganisms, animal, plant and human cells, cell organelles, synthetic enzymes and coenzymes or biocatalytically inactive proteins such as antigens, antibodies, growth factors, Blood coagulation factors, interferons, hemoproteins, albumins, sugar-binding P- my as lectins or in vitro produced conjugates of biocatalysts and biocatalytically inactive proteins or low- or high-molecular effectors such as nucleic acids, fragments of nucleic acids, coenzymes, peptides, heptene, hormones, vitamins, pharmaceuticals, Oxygen-binding, activating and transporting, synthetic compounds and affinity ligands used against the biologically active compounds.
Die Lösungen, in denen die biologisch aktiven Verbindungen aufgelöst werden, sind bevorzugt wäßrige, gepufferte Lösungen mit pH-Werten im Bereich von 4,0 bis 12,0, vor-jgsweise von 8,0 bis 12,0. In Fällen jedoch, in denen die kovalente Bindung der aktivierten Polyoxyalkylenglykole oder ihrer Monoalkoxyether mit den biologisch aktiven Verbindungen in organischen Lösungsmitteln durchgeführt wird, werden die aktivierten Polymeren in organische Lösungsmittel eingetragen, die die biologisch aktiven Verbindungen und ein säurebindendes Mittel gelöst, suspendiert oder teilweise gelöst enthalten. Als säurebindende Mittel werden dabei in Abhängigkeit vom verwendeten Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch Trialkylamine, Heterocyclen mit endocyclischom, tertiärem Stickstoffatom, Alkalihydroxide, Alkalikarbonate, Alkalialkoholate oder Alkalisalze kondensierter Aromaten oder Heteroaromaten eingesetzt.The solutions in which the biologically active compounds are dissolved are preferably aqueous, buffered solutions having pH's in the range of 4.0 to 12.0, preferably from 8.0 to 12.0. However, in cases where the covalent bonding of the activated polyoxyalkylene glycols or their monoalkoxy ethers with the biologically active compounds is carried out in organic solvents, the activated polymers are introduced into organic solvents which dissolve, suspend or partially dissolve the biologically active compounds and an acid binding agent contain. As acid-binding agents, trialkylamines, heterocycles with endocyclic, tertiary nitrogen, alkali metal hydroxides, alkali metal carbonates, alkali metal or alkali metal salts of condensed aromatics or heteroaromatics are used depending on the solvent or solvent mixture used.
Die Umsetzungen mit durch Diazotierung aktivierten Polyoxyalkylenglykolen oder Monoalkoxyethern werden bei Temperaturen im Bereich von -1O0C bis +4O0C ausgeführt, und die Reaktionszeiten für diese Reaktionen liegen bei 10 Minuten bis 24 Stunden.The reactions with diazotization-activated polyoxyalkylene glycols or monoalkoxy ethers are carried out at temperatures ranging from -1O 0 C to + 4O 0 C, and the reaction times for these reactions are from 10 minutes to 24 hours.
Die neuen Verbindungen mit biologischer Aktivität werden auf unterschiedliche Art und Weise aus den Reaktionslöuungen isoliert. Wäßrige Reaktionslösungen werden zunächst dialysiert, anschließend durch Ultrafiltration eingeengt und die Reaktionsprodukte daraus entweder durch Lyophilisation oder durch Ausfällen oder durch Extraktion gewonnen. Reaktionslösungen aus organischen Lösungsmitteln werden bei möglichst niedrigen Temperaturen eingeengt und die Reaktionsprodukte daraus durch Ausfällen isoliert. Eine andere Möglichkeit zur Isolierung der Reaktionsprodukte besteht darin, daß die engeengten Reaktionslösungen in Wasser gegossen und aus dem Lösungsmittelgemisch die Reaktionsprodukte extrahiert werden.The new compounds with biological activity are isolated in different ways from the reaction solutions. Aqueous reaction solutions are first dialyzed, then concentrated by ultrafiltration and the reaction products are recovered therefrom either by lyophilization or by precipitation or by extraction. Reaction solutions of organic solvents are concentrated at the lowest possible temperatures and the reaction products are isolated therefrom by precipitation. Another way to isolate the reaction products is that the tight reaction concentrated solutions are poured into water and extracted from the solvent mixture, the reaction products.
Das erfindungsgemäße Verfahren liefert neue, modifizierte Verbindungen mit biologischer Aktivität. Ein wesentlicher Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß die für die Modifizierung bekannter, biologisch aktiver Verbindungen verwendeten und mit primären, aromatischen Aminogruppen substituierten Polyoxyalkylenglykole oder ihre ebenso substituierten Monoalkoxyether nach einem einfachen und auch unter technischen Bedingungen leicht ausführbaren Verfahren aktiviert werden. Die Umsetzung der aktivierten Polymeren mit biologisch aktiven Verbindungen führt zu Derivaten dieser Verbindungen, die aufgrund der erhalten gebliebenen biologischen Aktivität, einer verbesserten Stabilität und veränderter Löslichkeiten mit Vorteil in der Medizin, Biotechnologie und anderen Zweigen der stoffwandelnden Industrie eingesetzt werden können. Die Erfindung wird durch Beispiele weiter erläutert.The process according to the invention provides novel, modified compounds with biological activity. An essential advantage of the process is that the polyoxyalkylene glycols used for the modification of known, biologically active compounds and substituted with primary, aromatic amino groups or their mono-substituted monoalkoxy ethers are activated according to a simple and easily carried out under technical conditions. The reaction of the activated polymers with biologically active compounds leads to derivatives of these compounds which, due to the retained biological activity, improved stability and altered solubilities, can be advantageously used in medicine, biotechnology and other branches of the substance-converting industry. The invention will be further explained by examples.
500mg Polymeres der Struktur500mg polymer of structure
werden in 15ml destilliertem Wasser gelöst. Unter Eiskühlung tropft man zu dieser Lösung 3 ml konzentrierte Salzsäure und anschließend 200μΙ einer Natriumnitridlösung, die 200mg Natriumnitrit pro Milliliter destilliertem Wasser enthält. Nach 10 Minuten Rühren unter Eiskühlung werden noch einmal 50μΙ Natriumnitritlösung gleicher Konzentration addiert. Die Lösung wird danach mit 100mg Amidosulfonsäure versetzt und unter pH-Kontrole mit eiskalter 1 normaler Natronlauge auf einen pH-Wert von 2,0 eingestellt. Diese Lösung mit dem aktivierten Polymeren wird bei O0C bis4°C zu 20 ml einer Pufferlösung addiert, die hergestellt wurde durch Auflösen von 25mg Glukoseoxidase (aus Penicillium notatum mit einer Aktivität von 43U/mg Einwaage) in 20ml 0,5 molarem Boraipuffer vom pH-Wert 9,0. Das Reaktionsgemisch wird anschließend 6 Stunden bei 4°C und danach 2 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Nach dieser Reak" - ^eit wird die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert, auf etwa 5ml eingeengt und lyophilisiert. Das Umsetzungspn . oesitzt eine Aktivität von 1,4 U/mg Einwaage.are dissolved in 15 ml of distilled water. With ice-cooling, 3 ml of concentrated hydrochloric acid are added dropwise to this solution, followed by 200 μl of a sodium nitrite solution containing 200 mg of sodium nitrite per milliliter of distilled water. After stirring for 10 minutes under ice-cooling, another 50 μM sodium nitrite solution of the same concentration is added. The solution is then mixed with 100 mg of sulfamic acid and adjusted to pH 2.0 with ice-cold 1 normal sodium hydroxide solution under pH control. This solution with the activated polymer is added at 0 ° C. to 4 ° C. to 20 ml of a buffer solution prepared by dissolving 25 mg glucose oxidase (from Penicillium notatum with an activity of 43 U / mg weight) in 20 ml 0.5 molar Bora buffer of pH 9.0. The reaction mixture is then stirred for 6 hours at 4 ° C and then for 2 hours at ambient temperature. After this reaction, the solution is dialyzed against distilled water, concentrated to about 5 ml and lyophilized The reaction pH has an activity of 1.4 U / mg.
500mg Polymeres der Struktur500mg polymer of structure
werden entsprechend Beispiel 1 aktiviert und wie dort beschrieben mit 50mg Penicillinacylase (aus Escherichia coli mit einer Aktivität von 920μΓηοΙ 6-Aminoponicillansäuro pro Stunde und mg Einwaage) umgesetzt. Nach der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches durch Dialyse, Ultrafiltration und Lyophilisierung wird eine biokatalytisch aktive Pinicillinacylase erhalten, bei der die Aktivität von 1 mg unmodifizierter Penicillinacylase entspricht.are activated according to Example 1 and as described there reacted with 50mg penicillin acylase (from Escherichia coli with an activity of 920μΓηοΙ 6-Aminoponicillansäuro per hour and mg weight). After working up the reaction mixture by dialysis, ultrafiltration and lyophilization, a biocatalytically active pinicillin acylase is obtained in which the activity corresponds to 1 mg of unmodified penicillin acylase.
500g Polymeres der Struktur500g polymer of the structure
werden in 10 ml frisch destilliertem Dimethy Isulfoxid gelöst und die Lösung wird auf O0C bis 4°C mit Eis abgekühlt. Unter weiterer Eiskühlung worden 3ml 32%ige Salzsäure, 4ml destilliertes Wasser und 1 ml 32%ige Salzsäure, 4 ml destilliertes Wasser und 1 pil 3 molare Natriumnitritlösung zur Lösung des Polymeren addiert. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 0°C bis 4°C gerührt und danach mit 150mg fester Amidosulfonsäure versetzt.are dissolved in 10 ml of freshly distilled Dimethy isulfoxide and the solution is cooled to 0 0 C to 4 ° C with ice. Under further ice-cooling, 3 ml of 32% hydrochloric acid, 4 ml of distilled water and 1 ml of 32% hydrochloric acid, 4 ml of distilled water and 1 microliter of 3 molar sodium nitrite solution were added to the solution of the polymer. The reaction mixture is stirred for 15 minutes at 0 ° C to 4 ° C and then treated with 150 mg of solid sulfamic acid.
Nach weiterem Stehen der Lösung mit dem aktivierten Polymeren für 30 Minuten bei maximal 40C wird diese Lösung zu 5ml einer auf O0C bis 4°C abgekühlten Suspension eines peroxidatisch aktiven Komplexes aus 14mg Imidazol und 13mg Hämin sowie von 400mg Kaliumkarbonat getropft. Das Reaktionsgemisch wird unter Eiskühlung 5 Stunden und bei Umgebungstemperatur 2 Stunden gerührt. Die danach klare, dunkle Lösung wird in 200ml destilliertes Wasser eingetragen. Der ausgefallenen Niederschlag wird abgetrennt und verworfen. Die restliche Lösung wird dreimal mi! jeweils 25 ml Chloroform ausgeschüttelt. Aus der mit Natriumsulfat getrockneten Chloroformlösung werden nach Abdestillieren des Chloroform 185mg polymeres Derivat des Komplexes aus Hämin und Imidazol erhalten.After further standing the solution with the activated polymer for 30 minutes at a maximum of 4 0 C, this solution is added dropwise to 5ml of a cooled to 0 0 C to 4 ° C suspension of a peroxidatively active complex of 14mg imidazole and 13mg hemin and 400mg of potassium carbonate. The reaction mixture is stirred under ice-cooling for 5 hours and at ambient temperature for 2 hours. The clear, dark solution is then added to 200 ml of distilled water. The precipitated precipitate is separated and discarded. The remaining solution is washed three times mi! shaken out in each case 25 ml of chloroform. From the chloroform solution dried with sodium sulfate, after distilling off the chloroform, 185 mg of polymeric derivative of the complex of hemin and imidazole are obtained.
500mg Polymeres der Struktur500mg polymer of structure
werden nach Beispiel 1 aktiviert. Die Lösung des diazotierten, polymeren Amins wird bei O0C bis 40C in einem 3 molaren Boratpuffer vom pH-Wert 9,0 eingetragen, in dem 50mg Hämoglobin (vom Rind) aufgelöst waren. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0°C bis 4°C und 1 Stunde bei Umgebungstemperatur gerührt und danach gegen destilliertes Wasser dialysiert. Anschließend wird die Lösung durch Ultrafiltration eingeengt, und die restliche Lösung wird lyophilisiert. Nach der Lyophilisierung werden 320mg modifiziertes Hämoglobin erhalten, das durch eine Gelchromatographie an Sephadex G 25 weiter aufgereinigt werden kann.are activated according to example 1. The solution of the diazotized, polymeric amine is added at 0 ° C to 4 0 C in a 3 molar borate buffer, pH 9.0, in the 50mg were dissolved hemoglobin (bovine). The reaction solution is stirred for 2 hours at 0 ° C to 4 ° C and 1 hour at ambient temperature and then dialyzed against distilled water. The solution is then concentrated by ultrafiltration and the remaining solution is lyophilized. After lyophilization, 320 mg of modified hemoglobin are obtained, which can be further purified by gel chromatography on Sephadex G25.
200 mg Polymeres der Struktur200 mg of polymer of the structure
werden entsprechend Beispiel 1 aktiviert. Die Lösung mit dem diazotierten, polymeren Amin wird bei O0C bis 40C in einen 3 molaren Boratpuffer vom pH-Wert 8,0 eingetragen, in dem 25mg NADH aufgelöst waren. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei 0°C bis 4°C und 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wird die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert, durch Ultrafiltration eingeengt und das Reaktionsgemisch wird gelchromatographisch mit Sephadex G 50 aufgetrennt. Das modifizierte NADH fällt in einer Ausbeute von 62 mg an. Es bestitzt auch als polymeres Derivat des NADH die für das reduzierte NADH typischen Absorptionsbanden bei 267nm und 340nm.are activated according to example 1. The solution with the diazotized polymeric amine is added at 0 ° C to 4 0 C in a 3 molar borate buffer, pH 8.0, were dissolved in the 25mg NADH. The reaction solution is stirred at 0 ° C to 4 ° C for 2 hours and at ambient temperature for 30 minutes. Thereafter, the solution is dialyzed against distilled water, concentrated by ultrafiltration and the reaction mixture is separated by gel chromatography with Sephadex G 50. The modified NADH is obtained in a yield of 62 mg. As a polymeric derivative of NADH it also has the absorption bands typical for reduced NADH at 267nm and 340nm.
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| DD33271889A DD287949A5 (en) | 1989-09-15 | 1989-09-15 | PROCESS FOR THE PRODUCTION OF COMPOUNDS WITH BIOLOGICAL ACTIVITY |
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| DD (1) | DD287949A5 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995022991A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-31 | Nycomed Imaging As | Block copolymers |
-
1989
- 1989-09-15 DD DD33271889A patent/DD287949A5/en not_active IP Right Cessation
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1995022991A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-31 | Nycomed Imaging As | Block copolymers |
| WO1995022991A3 (en) * | 1994-02-28 | 1995-10-12 | Nycomed Imaging As | Block copolymers |
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