DE2362067A1

DE2362067A1 - Verfahren zur herstellung nicht-pathogener, infektioeser rinder-rhinotracheitisvirusstaemme und diese virusstaemme enthaltende lebendvakzine

Info

Publication number: DE2362067A1
Application number: DE2362067A
Authority: DE
Inventors: Michele Lobmann; Nathan Zygraich
Original assignee: Recherche Et Industrie Therapeutiques Rit Genval (belgien); RIT RECH IND THERAPEUT
Current assignee: Smithkline Beckman - Animal Health Products Sa
Priority date: 1972-12-18
Filing date: 1973-12-13
Publication date: 1974-06-27
Also published as: CH590929A5; ES421549A1; AR200895A1; HU169119B; GB1413614A; AU6300873A; DE2362067C2; FR2210387A1; IE38638L; FR2210387B1; ZA738918B; US3907986A; BE808708A; NL7317251A; JPS5812258B2; JPS504233A; CA961410A; IE38638B1; DD110516A5; YU328073A

Description

RECHERCHE ST INDUSTRIE THERAPEUTIQÜES, Genval, Belgien

"Verfahren zur Hex^sstellung nicht-pathogen&r, infektiöser Rinder-Ririnotracheitis-Virus stamme und diese Virus st ärorcie enthaltende Lebendvskzine"

Priorität: 18. Dezember 1972, V.St.A., Nr. 316 178 .

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung genetisch stabiler, nicht-pathogener Stämme von infektiösem Rinder-Rhino-

■ - st 5ύνΐη§Λ" tracheitis-(IBR)~Yirus und diese Virus^eiört halt ende abgeschv/äch-

te Lebendvalcsine.

Es sind zwar verschiedene·IBR-Eebendvirusvakzxne bekannt; diese Vakzine zeigen jedoch eine ausgesprochene Restpathogenität v/egen der ungehindex^ten Vermehrung ihres viralen Materials in den innei^ven Organen des Tieres, v/odurch z.B. bei trächtigen Kühen Fehlgeburten verursacht werden.

Es wurde nun iibexrraschenderweise gefunden, daß beim Kombinieren von (a) Induktion und Isolierung temperaturempfindlicher (ts) Mutantenstämme von infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus xind (b) Serienpassagen der erhaltenen ts-Stämme in heterologen ZeIl-

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kulturen, wobei beide Stufen unter definierten Bedingungen durchgeführt werden, genetisch stabile, nicht-pathogene »Stämme von infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus erhalten werden. Diese Stämme eignen sich insbesondere zur Verwendung als Vakzine oder zur Herstellung von Vakzine , da sie nicht die Pathogenität dor bekannten IBR-Virusvakzine' auf v/eisen.

Ein v/eiterer Vorteil der erfindungsgemäßen Vakzine . liegt in ihrer Verabx^eichungsart. Die erfindungsgemäßen Vakzine werden. intranasal verabreicht. Die in ihnen enthaltenen IBR-Virusstamme vermehren sich nur lokal in den oberen Atemv;egen der Tiere, ohne daß eine nachweisbare Virusvermehrung an den v/ärmeren Stollen des Organismus, d.h., in den inneren Organen der Tiere, auftritt.

Zur Herstellung der nicht-pathogenen IBR-Virus st ämrie, die sich zur erfindungsgemaßen Vakzineherstellung eignen , kann als Ausgangsmaterial entweder ein aus einem klinischen Fall direkt isolierter IBR-Virusstaram oder ein nach Durchführung von •Serienpassagen in Gewebekulturen erhaltener IBR-Virusstamm verwendet werden. Die Serienpassagen können z.B. in primären Rindernieren-(PBK)-Zellkulturen bei Temperaturen von 30 bis 32⁰C (+_ 1°C) durchgeführt v/erden; als Ausgangsmaterial kann z.B. IBR 3760 von Institut national de Recherches Veterinaires, Brüssel, Belgien verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung nicht-pathogener, infektiöser Rinder-Rhinotrachei'tis-Virusstamme aus einem pathogenen, infektiösen Rinder—Rhinotracheitis—Virusstäinin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man aus diesem Stamm durch Induktion einen temperaturempfindlichen Mutantenstamm" von

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BAD ORIQiNAL

infektiösem Rinder-Rhiriotracheitis-Virus herstellt und isoliert und den,Mutantenstamm so lange Serienpassagen in heterolögen Zellkulturen unterwirft, bis vollständige Abschv/ächung eingetreten ist.

Die Induktion des temperaturempfindlichen Mutantenstammes .wird insbesondere so vorgenommen, daß man infektiöses Rinder-Rhinotracheitis-Virus bei einem pH-Wert von 4 bis 5 -mit einer gepufferten wäßrigen Lösung von salpetriger Säure in Kontakt bringt. Die gepufferte v/äßrige Lösung'von salpetriger Säure ist vorzugsweise salpeti^ige Säure in Acetatpuffer, wobei die Konzentration

-en.) der salpetrigen Säure und der Acetation/" im Reaktionsmedium 1 η bzw. n/A- beträgt und der Kontakt 1 bis 15 Minuten aufrechterhalten wird. Der Kontakt wird z.B. 10 (+.-1) Minuten bei einem pH-Wert von 4-,6 (+0,1) bei Raumtemperatur aufrechterhalten.

Der so erhaltene temperaturempfindliche (ts) Mutantenst&mrn wird dann isoliert, indem man ihn in einer bekannten, das Wachstum von infektiösem Rinder-Rhinötracheitis-Virus erlaubenden Gewebekultur passagiert. So wird ζ.13. die Isolierung durch eine Passage .in primären fötalen Rindernieren-(PFBK)-Zellkulturen vorgenommen, wobei diese Passage 10 bis 20 Tage lang, vorzugsweise 14· (±1) Tage, bei 30⁰C (± 1°C) durchgeführt wird. ' ·

Der isolierte Stamm wird anschließend in heterolögen Zellkulturen weiter passagiert,bis vollständige Abschv/ächung eingetreten ist. Vor der Verwendung entweder als Vakzine oder, zur Vakzineherstellung v/erden, z.B. 5 his 15. Passagen in primären Kaninchennieren-(PRK)-Zellkulturen bei einer Temperatur von . 30 Lis 37°C (± I⁰C) ' und vorzugsweise etwa 10 Passagen bei 37⁰C (± 1°C) durchgeführt.

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Ein nach, dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellter genetisch stabiler, nicht-pathogener Stamm von infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus hat in der Sammlung der Anmelderin die Bezeich--' nung IBR RLB 106 erhalten; Proben dieses Stammes sind auf schriftliche Anfrage erhältlich.

Fur das erfindungsgemäße Verfahren ist es nicht erforderlich, daß die Dauer jeder Serienpassage in heterologen Zellkulturen präzise festgelegt ist. Es ist hingegen ausreichend, daß das Virus gewachsen ist, bevor· man es erntet und zur Durchführung der nächsten Passage in eine andere Zellkultur inokuliert. Es ist trotzdem nicht zu empfehlen, die Passagendauer übermäßig zu verlängern; es ist ratsam, für die erfindungsgemäßen Zwecke die Maximale! aucrfür jede Serienpassage auf eine Woche festzulegen.

Die so erhaltenen Virusstämme zeigen gegenüber dem als Ausgangsmaterial dienenden pathogenen IBR-Virusstamm keinen v/esentlichen Verlust ihrer Immunisierungsfähigkeit. Die erfindungsgemäßen Virusstämme sind temperaturempfindlich und nicht-pathogen; sie stellen wertvolle infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-Lebendvirusvakzine dar oder dienen zur-Herstellung solcher Vakzine ., wobei hierfür jede bekannte Technik zur Vakzineherstellung und Stabilisierung geeignet ist. Die Erfindung bezieht sich daher auch auf infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-Lebendvirusvakzine , die mindestens einen infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamm enthalten, der durch Induktion und Isolierung eines tempcraturempfindlichen Mutantenstammes von infektiösem Binder-Rhinotracheitis-Virus und Passagieren dieses temperaturempfindlichcn Stammes in heterologen Zellkulturcn bis zur vollständigen Ab-

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Schwächung erhalten wird. Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser Vakzine aus dem erfindungsgemäß erhaltenen Stamm.

Gemäß dieser Aüsf uhr ungs form betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer nicht-pathogenen, infektiösen Rinder-Rhinotraeheitis-Lebendvirusvakzine,das dadurch gekennzeichnet ist ,daß man einen wie vorstehend beschrieben hergestellten temperaturempfindlichen und nicht-pathogenen, infektiösen Rinder-Rhino-tracheitis-Virusstamm. in einer bekannten, das Wachstum von infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus erlaubenden Zellkultur bei einer Temperatur nicht über 37⁰C (+_ 1°C) und vorzugsweise von 30 bis 32°C (+ 1°C) eine für das- Wachstum einer großen Virusmenge ausreichende Zeit inkubiert und das erhaltene Virusmaterial erntet. Die Inkubation kann z.B.- in einer Rinder-Zellenl.inienkultur oder einer primären Rinder-Zellkultur, vorzugsweise in einer primären fötalen Rindernieren-(PFBK)-Zellkultur durchgeführt v/erden·

Die so erhaltenen infektiösen Rinder-Rliinotracheitis-Lebendvirusvakzine werden lokal in den Nasen-Rachen-Raum in Dosiereinheiten

ti- ? ■ ··

von mindestens 10 * TCnW (gewebekultur-infektiöse Dosis 50 Pro-

c ρ

zent) und vorzugsweise von ICr'TCID₁-Q verabreicht.

Zur Verwendung als Vakzine wird das Virus vorzugsweise in gefrier-^ getrockneter Form aufbewahrt. Aus dem gefriergetrockneten Produkt erfolgt die Wiederherstellung der Vakzine ohne weitere Vorbereitungen durch Zugabe von Wasser oder gedem anderen bekannten, pharmakologisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Verdünnungsgemisch, das zur Herstellung von in die -Nase verabreichbaren Präparationen, wie Tropfen oder Sprühmittel, verwendet werden kann. i&iiiSsfiG ολγ. - " 409826/1092

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Der pathogene infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-(IBR)-Virusst-ar.im IBR 3760 wird nach 12 Serienpassagen eines aus einem typischen , klinischen Fall isolierten IBR-VirusStammes in primären Rindernieren— (PBK)-Gewebekulturen erhalten. Der so erhaltene Stamm wird 43 Serienpassagen in primären fötalen ßindernieren-(Pi¹BK)-Gewebekulturen unterworfen. Durch Ernten des über stands der letzten Passage v/ird eine Virussuspension erhalten, die 10 '^ ₀ pro ml enthält.

1 ml dieser Virussuspension wird mit 0,5 RiI einer 4 m wäßrigen Natriumnitrit-Lösung in 0,5 ml 1 m Essigsäure/Katriumacetat-Puffer vermischt.. Dieser Baffer wurcs durch Vermischen von 6 g Eisessig mit destilliertem V/asser bis zu einem Volumen von 100 ml und 3 Volumina einer Lösung von 13»6 g Natriumacetat in 100 ml destilliertem V/asser hergestellt, v/ob ei beide Lösungen 30 Minuben bei- 121°C sterilisiert werden· Der Ehd-pH-V/ert beträgt 4,6.

Das Gemisch v/ird 10 Minuten bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Die Reaktion v/ird darin durch tropfenv/eise Zugabe von 1 η Natronlauge unter Rühren bis zu einem pH-Wert von 7»5 (± Oj5) beendet.: Die pH-Einstellung wird mit Hilfe der Farbänderung des in der Virussuspension enthaltenen Phenolrot-Indikators verfolgt.

Das Medium v/ird dann sofort 5 Stunden bei +4⁰C (+_ 1°C) gegen phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung dialysiert. (Diese Lösung besteht aus 8 g NaGl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₄ in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), ver-

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mischt mit einer Lösung von 0,1g MgCIo♦6HpO in 100 ml de st illiertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaC^ in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung Wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Vfert liegt zwischen 7^2 bis 7,4.) Die phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung-wird mehrmals bis zur Entfernung der Kitri'üonen erneuert. Eine Probe > v/ird titriert, und der.Virusvorrat wird bei -70°C aufbewahrt. Die Titration v/ird mittels der Röhrclien-Endpunkt-Verdünnungsmethöde in primären fötalen Rindernieren-Gewebekulturen bei der unerlaub- ■ ten Temperatur von 59°G/_+ I⁰G unter Verwendung von zwei Röhrchen pro Verdünnung durchgeführt. Nach 2wöchiger Inkubation wird der Titer bestimmt, und die bei -7O⁰G aufbewahrte Probe wird so weit verdünnt, bis sie'l TCIDc-₀/0,2 ml enthält. Diese verdünnte Probe wird in 28 Röhrchen mit primären fötalen Rindernieren-Gewebekulturen unter Verwendung von 0,1 ml Inokulum pro Röhrchen inokuliert. Die Röhrchen v/erden bei der erlaubten Temperatur von 30°C/ +_ 1°C inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten von 7 bis 17 Tagen zeigen 10 inokulierte Röhrchen einen typischen IBR-cytopathogenen Effekt; diese Röhrchen werden mit den Nummern 1 bis markiert und bei -7Ö°C aufbewahrt. Es werden Päralleltitrationen dieser 10 positiven Proben, bei der erlaubten Temperatur von-30 G und bei der unerlaubten Temperatur von 39⁰C durchgeführt. Die Proben, die einen bedeutenden Unterschied im Titer zwischen der •erlaubten und der unerlaubten Temperatur aufweisen, werden durch Grenzverdünnungs-Passagen (Passagen, für die die letzte aktive Verdünnung verwendet worden.ist), weiter geklont. Auf diese Weise wird durch Vereinigen der positiven Röhrchen bei der'.10~-^?-Ver-

dünnung der Probe Nr. 6 eine Suspension eines Stammes erhalten, der als RLB 105"bezeichnet wird. ■

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Der Test des so erhaltenen Stammes RLB 105 in empfindliehen "Kälbern zeigt, daß der Stamm noch, eine gewisse Restpathogenitat hat. Nach der intranasalen Inokulation des vorgenannten Stammes wird eine schwache nasale■Absonderung beobachtet.

Der Stamm RLB 105 wird dann wie nachstehend beschrieben 10 Passagen in-primären Kaninchennieren-Zellkulturen unterworfen: Als Nierenspender dienen 3 bis 6 Wochen alte Kaninchen , die aus einer spezifischen, pathogen-freien Zucht stammen. Die Nieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt. Nach dem Zerkleinern wird das Nierengewebe in phosphatgepufferter physiologischer .Kochsalzlösung gewaschen. (Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄ und 0,2 g KH₂PO₄ in destilliertem V/asser (bis auf 8OO ml) ,vermischt mit. einer Lösung von 0,1 g Vi^Gl^.6IL->0 in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaOIp in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt zwischen 7,2 und 7,4·) Anschließend wird das Nierencewebe mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung von Trypsin (2,5 g/Liter) trypsinisiert. Das Gemisch wird dann 10 Minuten ohne Unterbrechung bei 37 G gerührt. Sodann wird die Flüssigkeit abgegossen und durch dasselbe Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehan&lung wird dann unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die in der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zeit zu Zeit entfernt und dann bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird so in einem Wachstumsmedium (Eagles Basalmedium, das mit 10 Prozent auf Virus geprüftem Kalbsserum versetzt ist und pro ml 100 Einheiten Penicillin G-Natr ium und 100 meg Streptomycinsulfat enthält) suspen-

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diert, daß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

1 ml-Proben der Zellsuspension werden in sterile Röhrchen gegeben und 4 bis 5 Tage bei 37°C inkubiert. Am Ende dieser ersten Inkubationsperiode wird das Wachstumsmedium entfernt und pro Röhrchen durch 1,5 ml Eagles Basalmedium ersetzt, das lediglich

2 Prozent i"-globulinfreies,auf Virus geprüftes Kalbsserum enthält. 10 Röhrchen' v/erden mit Q,2 ml der vorstehend erhaltenen RLB 105-Virussuspension inokuliert und bei 37 C während 3 his 5 Tagen inkubiert. Das Wachstum des Virus zeigt sich an dem typischen cytopathogenen Effekt. Die Serienpassage des Virus auf eine neue •primäre Kaninchennieren-Gewebekultur wird durchgeführt, wenn etwa 50 Prozent der Zellen den besagten cytopathogenen Effekt aufweisen. Die überstehende Flüssigkeit v/ird dann geerntete eine 0,2 ml-Probe des Uberstands v/ird als Inokulum für die- nächste Passage verwendet.

Die überstehenden Flüssigkeiten der letzten Passage werden geern-. tet, vereinigt und im Volumverhältnis von 1 : 2 mit einer unter der Bezeichnung FG-Lösung bekannten Stabilisierlösung verdünnt,

x) ■ ,

die aus 60 g Gasitone, 100 g-Rohrzucker, 75 nil m/15 dibasischem Natriumphosphat, 25 ml m/15 monobasischem Kaliumphosphat, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur Herstellung von 4,25 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser besteht. Das Gemisch wird gefriergetrocknet, wobei der IBR-Virusstamm IBR RLB 106 erhalten wird. ' ·

. Kr. G259 . ■ " - " .

^x'Produkt/der Difco-LabOratorien, Detroit, Michigan, V.St.A.

Ts-Charakter des IBR-Stammes IBR RLB 106·: ■ ...

Das Viruswachstuiri bei verschiedenen Temperaturen wird durch Titration bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden

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Tabelle I zusammengestellt, aus der hervorgeht, daß die Temperatür, bei der der Virustiter auf weniger als 1/100 erniedrigt ist,. 39 C (_+ 0,5. C) beträgt. Die Ausbeutedifferenz zwischen dem Stamm IBR RLB 106 und dem Ausgangsstamm ist ebenfalls in Tabelle I an- · gegeben und zeigt das geringe Restwachstum des Stammes IBRRLB 106.

Tabelle I

Stamm IBR RLB 106 IBR 3760	Virusausbeute, TCID™ (ausgedrückt in Iog₁₀/0,l ml)	bei 39°C
bei 30⁰C	0,75 5,75
5,75

Die Stabilität des ts-Charakters des Stammes IBR RLB 106 wird in

vitro und in vivo wie nachstehend beschrieben gezeigt:

(a) in vitro:

Der Stamm IBR RLB 106 wird in primären fötalen Rindernieren-(FPBK)-Zellkulturen bei 30, 38 und 39°C passagiert. Die in ' der nachstehenden Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß der ts-Charakter .während 9 Passagen bei 30 und 38°C stabil bleibt, wohingegen der Stamm bei 39°C nach 2 ,Passagen nicht mehr wächst.

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Tabelle II

Temperatur ■ der Passagen	Passage ■Ri>.	Virustiter, TCID <-q (in Iog₁₀/O,l mi bei erlaubter (30 G) und unerlaub ter (39 ^G) Temperatur	39⁹O ■ ·	Differenz im Virus— titer bei ⁵SO₁ ⁰G und ■ 39⁰C
3O°C . 39°C	1 3 :9 1 3 9 . 1 . 3	3Q⁰G	40,5 - <o,5 <O,5 40,5 <0,5 <0,5 <ö\|-5 0	^5,25 ?^;+,25' ^,75 >A >i,75 >3,25 ^0,25 0
5,75 5,25 .... ." 2,50 ■ ' 2,25 3,75 0,75 0

(b) in vivo: .

Der Stamm IBR RLB 106 wird in 3 bis K Monate alteir v/eiblieheri Kälbern (Rasse "Mitt_el-Belgien") passagiert .und aus de-r Nase der geimpften Tiere wieder isoliert. Sodann ward der Stamm bei erlaubter (35 und 3?°C) und unerlaubter (39°C) * Temperatur titriert. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt. -

.' . Tabelle III

Nummer des Kalbs	Tag der VJie- derisolierung nach, dem Impfen	Herkunft des wieder-: isolierten Virus	Virustite drückt ir 35⁰G	?r TGID ι log-,Q/Q,l 37°C ^:	(ausge- . ml) bei 39°C
72	10 ·	-Nr-ab striche	rib	4,7	o
74	9	N.-abstriche	nb	Λ,3 ·	0,3
88	6	Nr-abstriche	nb	4,5	0,2
2	.5	Ns-muscheln	>,3	nb .	1,5
1	5	Νϊ-muscheln	5,5	nb	1,2
2	5	Mandel	5	nb	0
5'	6	Ny-m'uscheln	^, 25	. nb	0

nb = nicht bestimmt

N.- = Nasen-4098 28/1Ö92

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Der Vergleich der in tabelle III angegebenen; fiter: zeigt" die . Stabilität des ts-Charakters des Stammes IBR IiIiB 106 naeh der in vivo-Passage. ·

Beispiel 2 . . . ..,■

Fötale Rindernieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt, zerkleinert und in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. (Diese Losung besteht aus S g KaCl, ' 0,2 g KGl, 1,15 g Ha₂HPO₄ und 0,2 g KH^PO^ in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer lösung von0*1 g MgCIo·6HpO in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit; einer Lösung von 0,1 g CaCl₀ in 100 ml destilliertem V/asser." Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert $ der EndpH-Wert liegt zwischen 7,2 und 7,4·.) Die gewaschenen, zerkleinerten Nieren v/erden mit einer Lösung von Trypsin (2,5 g/Liter) in gepufferter physiologischer Kochsalzlösung trypsinisiert. Das Gemisch wird 10 Hinuten bei 37 C ohne Unterbrechung gerührt. Die Flüssigkeit wird dann abgegossen und durch dasselbe Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die in der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zeit zu Zeit entfernt und dann 5 Minuten bei 1000 UpK zentrifugiert. Das Zellsediment wird in einem Wachstumsmedium (Hanks basische Salzlösung, die mit 10 Prozent auf Virus geprüftem Kalbsserum, 0,5 Prozent Lactalbuminhydrolysat, 0,1 Prozent Hefeextrakt und 50 meg Neomycinsuifat pro ml versetzt ist) so suspendiert, cloß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

Aliquote Teile von 1 ml der Zellsuspension werden in Roux-Kolben (500 cm )" gegeben und 4 bis 5 Tage bei 57°c' inkubiert. Am Ende

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dieser ersten Inkubationsperiode wird das V/achsturnsmedium entfernt und die Zell-Mono.schicht zweimal-"mit einem Erhaltungsmedium gewaschen, das aus Eagles boaischer Salzlösung besteht, die 0,5 Prozent Lactalbuir.inhydrolysat, 0,1 Prozent Hefeextrakt,

■ .. xV
0,1 Prozent Tryptooephosphat-Bruhe und 50 meg !Neomycinsulfat "pro ml enthält. Jeder Kolben mit fötaler Ilindernieren—Zellkultur wird mit 1 ml einer Suspension des infektiösen IMmler-Rhirtotrecheibis-Virusstarnmes IBS RLB 106 in destilliertem 'iasser inokuliert. Die Suspension· enthält etv/a 2 . 10⁶ iCID_CQ/ml' (d.h. beim Kultiplizitätsindex von 0,1-). Jeder. Kolben wird mit Hrhaltung-smedium mit derselben Zusammensetzung wie das vorstehend zum Waschen verwendete· Medium vernetzt. Die Kultur wird bei 55⁰C- während einer solchen Zeitspanne, inkubiert, die zum Wachsen einer großen Virusmenge ausreichend ist, d.h., mindestens 3 bis 4- Tage, wiesich mittels des typischen IBR-eytopathogenen Effekts ergibt. -

^J Produkt der Difco-Laboratorien, Detroit. iJichigan, V.St.A. Die überstehenden Flüssigkeiten -werden dann geerntet, vereinigt und im Volumverhältnis 1 : 2 mit einer unter der Bezeichnung FG-Lösung bekannten Stabilisierlösung verdünnt. Diese Lösung besteht aus 60 g Casitone, 100 g Rohrzucker, 75 ^ml ^m/15 dibasischein Natriumphosphat, 25 ml m/15 monobasischem Kaliurnphosphatr, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur Herstellung einer Lösung von 1" Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser-, .

Die Virustitration bei -'erlaubter (30⁰C) und unerlaubter (39°C) Temperatur zeigt, daß. der ts-Charaki;or des 'als Ausgangs stamm dienenden Stammes IBR RLB 106 erhalten "bleibt. Der TCID,

5C

des erhaltenen Präparats beträgt 10^'"""._

" ' S 2

Das Präparat v/ird in Glasampullen verteilt, die entweder 10^'

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_n oder Vielfache davon enthalten. Der Inhalt der Ampullen wird gefriergetrocknet. Die Ampullen i^erden abgeschmolzen und -,-, enthalten entweder Einfach— oder Vielfachdosen. Nach der Wiederherstellung durch Zugabe von 1 ml V/asser pro Dosis wird die Vakzine dem Tier als Nasentropfen oder als Sprühmittel verabreicht.

Ts-Charakter der Vakzine:

Aus der nachstehenden Tabelle IV ist ersichtlich, daß sich boi der Prüfung des ts-Charakters der wie vorstehend erhaltenen Vakzine kein Untex'schied gegenüber dom ts-Charakter des Stammes

IBR TiLB 106 ergibt.

Tabelle IV

Vakzine

Stamm

IBR RLB 106

Virustiter, TCID™ (ausgedrückt in log-^/0',1 ml) bei

37°C

5,5

38°c

5,7

39°C 0,5. 0,5

Experimentelle Prüfung der erhaltenen Vakzine:. ·

(a) Impfschema:

Die Vakzine wird 5 von 4 seronegativen 3 bis ¹V ilonate alten weiblichen Kälbern (Rasse "Kittel-Belgien!¹) verabreicht; das vierte Tier dient als Kontrolltier. In Tabelle V sind die Einzelheiten'des ImpfSchemas "zusammengestellt.

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	V	Tabelle V	X	6^5	Infektions-	2362067
		inokulierte Dosis in TCID₁-Q	X	6,5	in
Kummer . - CL Θ Sⁱ -"i"t el JitiS" ♦-, ϊ ■ Ϊ- ■ ^r ■ -·*	Impfweg	OJ.	X	6,5	in	Dosis- der inoku lierten Infek tion
	.■ in, -_F	' 2	—		in > '	2 χ 6,7
74	in	■ 2		in	•2 χ 6,7
" "88 *"^:	in			2 χ 6,·? ^?
85	—	Ix 6,7

in, = intranasal

(b)^! Vßederi'äoTierung des "Virus aus der'Käse: ' _f In der nachstehenden Tabelle VT sind die Titer des nach der Impfung gemäß dem in Tabelle V angegebenen Impf schema isolierten Virus zusammengestellt. Die Virustlter sind in log,,-, TCIDc-r/0,1 ml ausgedrückt. * ""-.--

. ' Tabelle VI

Nummer . des Kalbs	Her— ku-nft des Isolats	>4	1.	2.	3	Virus, abgesondert am 6. 7V 8. 9. 10 Tag nach der Impfung	A, 8	3	,5	3,5	4	,8	2,	«	13	. 14.	0	20.	28.
72	Nase ■	>4	,8	>4,8	>4	,8	4,6	1	;6	3,6	2	,7	P	2	1	,5	0	0	0
74	Nase	4	,8	>4,8	4		4,2	0	,5	0	0		0	5	0		O	0	O
■ 88	Nase	,0		4	4	,2	0			0			0		0	0
85.	.Nase		O	0					0		0	0

Sämtliche negativen Proben werden-ϊη primären fötalen Rindernieren-(PBJ?K)-Zellen subpassagiert und bleiben nach" 7tägiger Inkubation bei 37 C negativ. ...

In der nachstehenden Tabelle VII sind die Titer des Infektions^- virus, ausgedrückt in log₁₀ TGiD₅₀/0,1 ml, zusammengestellt, das ncich der einen-I-Tonat nach der Impfung gemäß dem in Tabelle V

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angegebenen Impfschema vorgenommenen Infektion isoliert wird.

	Her kunft d.es Isolats	V	ir; 1	Tabelle	,7	?r in d 3	VII	t	nacl 7	ι der 8	Infe 9	kt-	ion, ' 13	0
Nummer des Kalbs	Nase	2		ι st it ί 2	,7	3,7	er Zei 6		0	0	0		0	C
72	Rase	5	,5	1	,5	4,7	0		o ·	0	0		0	0
74	Nase	75	,7	>5	>⁷	3	0		0	0	0		0	0
88	Nase	>5	,7	3	>5,7	1,5		A ·	2 .	2	,2	0
85					>5,7

Rinder Sämtliche negativen Proben werden in primären fötalen/nic-ccn-(PFK)-Zellen subpassagiert und bleiben nach 7tägiger Inkubation bei 37 C negativ. Die in Tabelle VII ..zusaßm'ongestell tjn . Ergebnisse zeigen, daß das Wachstum des Infektionsvirus'In dor Nase der geimpften Tiere beträchtlich vermindert ist .·

(c) Serokonversion nach der Impfung:

Der Seroneutralisationstest wird nach der konstanten. Virus-Serum-Verdünnungstechnik durchgeführt. Die Ergebnisse der Seroneutralisation sind in der nachstehenden Tabelle VIII zusammengestellt und ausgedrückt als die reziproken Werte der Verdünnung, für die mindestens 50 Prozent der Röhrchen voll- ■ ständig gegen 10 bis 100 TCID₁-Q geschützt sind.

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BAD ORIGINAL

Tabelle VIII

Nummer des Kalbs	Wochen O	nach 2	ler Im 3 ·	pfung .. 4	Wochen nach d 2	er Infektion 4
72	O	2 .	2	4	16	8 ■
74	0	2	4	4	>32	32
88 .	0	0	<2	2	>32	>32
85	■ o.	0	0	0	2	2

(d) Symptomatik: ..-"-.

Nach der gemäß dem in· Tabelle- V angegebenenen Impf schema durchgeführten Impfung werden täglich folgende Beobachtungen an den Tieren vorgenommen: ' ■

die Temperatur v/ird morgens zwischen 8 und 9 Uhr gemessen; hämatologische Untersuchung;
Nasenabstriche;
klinische Untersuchung.

Nach'der einen Monat nach der Impfung vorgenommenen Infektion werden dieselben Untersuchungen durchgeführt, wobei jedoch von sämtlichen Tieren Nasen- und Vaginaabstriche· gemacht v/erden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt.

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Tabelle IX

Nummer	Zeit	Nach der	Impfung	0	Nach der	Zeit	■ Infektion	Genital
des	(Tage)			0		(Tage)	•	symptome
Kalbs	mit			0		mit
	einer	Atmungs-	Genital	0	Infek-	einer	Atmungs
	Temp.	synptome	symptome		tions-	Temp.	symptome
	»59,6⁰C				v.'eg	0		0
						0		0
72	O		.			0		0
74-	O	O		in	6	O	leichte
88	O	0		in		0	Leukorrhoe
85	O	0		in		0
		0		in		beträcht	nach der
				ivag		licher	Infektion;
						3iteraus-	beträcht
						fluß aus	licher
					der Käse	Vaginal aus-
					nach 6	fluß 7 Ta
					und 7 Ta	ge nach
					gen	der Infek
						tion

in = intranasal
ivag =" intravaginal

(e) Ts-Charakter des aus der Nase der geimpften Kälber v/iedex^%-isolierten Virus:

V/ie in Tabelle X angegeben, ergibt die Prüfung des ts-Charakters des aus der Ease der geimpften Kälber vriederisolierten Virus keinen Unterschied gegenüber dem ts-Charakter des »Stammes IBR RLB 106.

BAD QRiQiNAL

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Tabelle X

- - -	2; ei träum nach der Impfung, jTage	Titer,ausgedr	ückt bei	in 38°	"¹⁰⁹IO C	TCID₅₀ 39°	/0,1ml G
Kalb 72	10 -	4,7		4,	5 "	0
Kalb 74	f 9	4,3		3,	3	0,	3
Kalb 88	6	4,3		4,	3	■■■ 0,	2
IBR RLB 106	.. —	4,3.			3	0,	5

_ Die erhaltene Vakzine wird wie nachstehend beschrieben auf (a) Unschädlichkeit ' "'·.-" . .

(bj Verteilung im Gewebe nach nasaler Inokulation

, (c) Antigenwirkung und minimale Impfdosis-Cd) übertragung auf Kontakttiere r . geprüft.

(a) Unschädlichkeit:

Der Versuch v/ird an 3 bis 4 V/ocheh alten, seronegativen, v;eiblichen Kälbern (Rasse "Friesisches Milchvieh") vorgenoin-. men, für die die unverdünnten Sera .im Seroneutrali.sationstest gegen 50 TGID₅₀ des"IBR-VirusStammes ST 2193 negativ sind.

Die Temperatur von 3 Tieren, denen eine Vaksine-Dosiereinheit von 2 ml (Titer: 10⁶'² TGID^/ml) in das Nasenloch verabreicht worden war, wird täglich während 5 Tagen gemessen und als normal befunden, während bei 2 anderen Tieren, die als . Kontrolltiere dienen, und 2 ml eines virus-präparats des pathogenen IBR-VirusStammes ST 2193 (Virustiter des Präparats:

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ICK¹-? TCIDc₀/ ml) erhalten hatten, ein Temperaturanstieg

festgestellt wird." .

(b) Verteilung im Gewebe:

Die für die Unschädlichice it sprüfung benutzten Tiere werden
getötet und zwar die Tiere 1, 2 und 4- fünf Tage nach der
Inokulation und die Tiere 5 und 6 sechs Tage nach der Inokulation. Die in der nachstehenden Tabelle XI aufgeführten

Organe werden unter aseptischen Bedingungen entnommen. Die

freiem Organe werden dann in Eagles Medium mit 2 Prozent /"-globulin^ Kalbsserum im Verhältnis von 1 g Gewebe pro 2 ml suspendiert. Diese 'Suspension wird 2 Minuten einer Ultraschallbehandlung unterworfen und anschließend IO Hinuten bei 2000 UpM zentrifugiert ♦ Der überstand wird in den in Tabelle XI' angegebenen Verdünnungen in sekundäre fötale Rindernieren-Kulturen mit
0,2 ml/Röhrchen gegeben_?und pro Verdünnung werden 3 Röhrchen angesetzt. ' ■

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Tabelle XI

entnommene Organe

Verdünnungen

Nervensystem: Hirn
- Kleinhirn
Zerebrospinalflussigkeit
.Atmungssystem: NasenmuseheIn
Lunge: 7 Lappen
Unterkieferlymphknoten
Lymphknoten der Ohrspeichel
drüse '
suprapharyngale Lymphknoten
Lymphknoten des Atlas
costo-zervikale Lymphknoten
i-ronchiallymphknoten
Genitalsystem: gesamtes Genitalsystem
retrorriarnmare
Lymphknoten
Milz . .
heparinisiertes Blut
Mandeln
Kehlkopf: Schleimhaut und_i#die ersten beiden
■ Ringe der Luftröhre

10° bis 10"²
10° bis 10~²
10° bis 10~²
10"¹ bis 10~⁵
10° bis ΙΟ""⁴"
10° bis 10~⁵
-10° bis 10~⁵
10° bis 10"⁵
10^J bis 10 -^J
10° bis 10~⁵
10° bis 10"^
10°' bis 1O~²
10° bis 1O"⁵
1O^U bis 10. ^
10° bis 10"²
1.0° bis 10~⁴ .
10° bis 10"^

Die in der nachstehenden Tabelle XII zusammengestellten Ergebnisse zeigen, daß, außer für ein Isolat mit.niedrigem ■ Titer aus der Zerebrospinalflussigkeit, in den inneren Geweben der mit dem Stamm IBR RLB 106 (Tiere 1, 2 und 5) inokulierten Tiere kein Virus festgestellt wird, während in den mit dem virulenten Virus inokulierten Ti'eren (Kontrolltiere M- und 6) das virulente Virus aus verschiedenen Stellen des Körpers oder aus den unteren Atemwegen isoliert werden kann,

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Tabelle XII

Organe	retromammare Lymphknoten	Titer drückt	in den in TO:	1	2	4	5	6 t
	Unterkieferlymphknoten	Organen, ausge- LD^/g Organ	O	O	O	0	0
	Lymphknoten der Ohrspeicheldrüse	Kummer des Tieres ·	O ,	O	O	0	0
suprapharyngalo Lymphknoten	O	O	O	0	0
Lymphknoten des Atlas	O	nt	0	0	0
costo-zervikale Lymphknoten	O	nt	0	0	0
Mandeln	O	O	0,75	O	0,75
Schleimhaut des Kehlkopfes und der beiden ersten Ringe der Luftröhre	O	2	.1,5	0	1,75
Nasenmuscheln	O	O	>5,5	0	5,25
Kleinhirn	5,25	5,25	6,25,	5,5	5,5
Hirn ■	O	0	0	0	0
Zerebrospinalflüssigkeit	O	0	O	O	O
Lunge: Diaphragma links	O	0,75	0	0	C
Spitze rechts	O	ο	0	0	0
Teil links vom Herzen	O	ό	5,25	C	0
Spitze links	O	0	1,5	0	ö
Diaphragma rechts	O	O	1,5	0	0
Teil rechts vom Herzen	O	O	O	O	O
Zwischenstück	O	O	0	O	0
Bronchialiymphknoten	O	O	1,5	0	0
Milz	O	O	0,75	0	0
Genitalorgane	O	0	0	0	0
heparinisiertes Blut	O	O	0	0	0
O	O	O	O	O

nt = nicht getestet

Eine Blind-Subpassage des unverdünnten, vereinigten Materials aus den.Lungen negativer Tiere (ilr. 1, 2, 5 und. 6) wird in

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sekundären fötalen Nierenzellen durchgeführt, wobei negative Ergebnisse; erhalten werden. .-. .

(c) Äntigeiv/irkung und minimale Impf dosis:

Der -Versuch wird -mit -52 etwa 3 Monate alten Tieren (Rasse "'" ''Mittel-Belgien¹¹) durchgeführt: 29 Tiere werden intranasal \ (10 mit einer ΙΟ⁶*² TCnW-Dosis, 10 mit einer 10⁵'² TGID₅₀--Do.sis und 9 mit einer W"*² TCID₅₀-DoSiS) geimpft, und 23 Tiere dienen als Direktkontakt-Kontrolltiere. Die serologische Prüfung wird durch Seroneutralisation unter Verwendung der konstanten Virus-(30 bis 50 TCID₅₀)/Seruii-Verdünnungs- ' technik durchgeführt: Die erste Lösung ist unverdünnt. Das Volumverhältnis von Serum : Virus beträgt "2 : 1. Die Serum-Virus-Gemische werden 1 Stunde bei 37⁰C inkubiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XIII zusammengestellt.

Tabelle XIII ' .

Gruppe	Dosis	Anzahl der Tiere mit sion und Gesamtzahl ten Tiere	nach 4 V/ochen	Serumkonver- der geteste-
-		nach 3 Wochen	10/10
geimpfte Tiere	-.-■. ίο⁶·²	10/10	1/4-
Eontrolltiere	" - -	0/5	10/10
geimpfte Tiere	io5»2	10/10	1/10
Kontrolltiere		0/10	V5
geimpfte Tiere		"5/9-	0/7
Kontrolltiere	■ ■ " " — -	0/8
	nach 6 Wochen
	10/10 - -
	2/5
	10/10
	1/10
	.8/9 Ζ
	- 1/8

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2362087

In der nachstehenden Tabelle XIV sind die Ergebnisse der 6 Wochen nach der Impfung durchgeführten Titerprüfungcn zusammengestellt.

Tabelle XIV

Gruppe

Dosis

Anzahl der Tiere mit Seroneutralicationstitern von

4 .und höh ο 3?

geimpfte Tiere Kontrolltiere

geimpfte Tiere 'Kontrolltiere

geimpfte Tiere Kontrolltiere

10

⁶'²

ΙΟ

⁴'²

0
9 ι 7

8 O

1 O

2 O

Nach den Ergebnissen der Tabellen XIII und. XIV erscheint eine Dosis von ltr * als annehmbare Impfdosis.

(d) übertragbarkeit:

Aus Tabelle XIII ist ersichtlich, daß das Vakzinevirus zu. einem geringen Prozentsatz auf Kälber, die sich in direktem Kontakt mit den geimpften Tieren befinden, übertragen v/ird. In den Kontakttieren v/erden jedoch keine Symptome, induziert, und das Vakzinevirus zeigt in diesen Tieren dasselbe Verhalten wie in den geimpften Tieren. Eine Rückumwandlung zur Virulenz wird nicht beobachtet.

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236206?

Beispiel "3

Es wird die in Beispiel 2 beschriebene 'Technik angewendet, wobei Jedoch die geernteten überstehenden Flüssigkeiten, die mit dervorgenannten .Stabilisierlösung verdünnt werden, mit dem RLB 103 temperaturempfindlichen Mutantenstamm von Rinder-Parainfluenza-3-Virus (PI^) ergänzt werden. Dieses Virus ist von K. Zygraich, M. Lobmann und C. Hüygelen in J. Hyg. Camb., Band 70 (1972), Seiten 229 bis 2J4- beschrieben worden. Das Gemisch wird in Glasampullen verteilt, die 10⁶'^ TCID₅₀ an IBR-Virus und 10⁶'^ TGID™ an Rinder-PI^-Virus oder Vielfache jeder dieser Dosen ■ enthalten. Der Inhalt der Ampullen wird gefriergetrocknet, und die Ampullen werden abgeschmolzen. Auf diese Weise werden entweder Einfach- oder Vielfachdo-sen erhalten. Nach der,Wißderherstellung durch Zugabe von 4- bis 5 ml Wasser pro Dosis .wird die Vakzine dem Tier in Form von Tropfen oder als Nasensprühmittel · verabreicht.

Klinische Prüfung: -

Die Prüfung wird an vier spezifisch pathogenfreien, durch Kaiserschnitt geborenen Kälbern durchgeführt und ergibt Seronegativität sowohl .für die IBR- als auch für die Rinder-PI^-Antikörpertypen.

Eine Dosiereinheit der vorstehend hergestellten bivalenten Vakzine wird in die Nasenlöcher jedes Tieres eingebracht.. 3 Wochen nach der Impfung zur serologischen Prüfung entnommene Blutproben zeigen bei jedem Tier Serokonversion, sowohl für das IBR-Virus als auch für das Rinder-PI^-Virus. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle XV zusammengestellt.

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Tabelle XV

Nummer! Serologische Reaktion, ausgedrückt in

des - j
Kalbs !

Seroneutralisations-Antikörpertiter für IBR-Virus

vor Impfung nach Impfung

O O O O

1 2 2 2

Hämagrrluti nations-Hemmunastiter für

vor Impfung

nach Imnfunrr

64 32 16

Das zuqesetzte P.inder-PI.,-Virus wirkt sich nicht störend auf die IBR-Impfung aus; umqekehrt stört das IBR-Virus nicht die Serokonversion der Tiere für das Rinder-ⁿI₃-Vi.rus. _f

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Claims

latent ä η Sp r ü c h e
Verfahren zlir Herstellung iiiGht-päthogenör ₄ infektiöse if Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamme aus einem päthögenen, in^.·' fektiösen Rinder-Rhinötracheitis·^Virusstamm, d ä d- ü rjö h g e k e η η ζ, e i c h ii e t _§ daß man aus diesem Stamm durch Induktion einen temperäturempfindlichen Kütantenstänm von infektiösem Rinder-Rhinötracheitis^-Virüs hersteULt und isoliert und den Mutäntehstämm so lange Serienpässägen in heterolögen Zelikuitüren unterwirft _s bis vollständige Abschv/ächung ein*- getreteh ist.
2* Verfahren nach Anspruch I^ dadurch gekennzeichnet j daß'man zur induktion eines temperaturerapfihdlichen Mütantenstammes einen infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamm bei einem· pH-V/ert zv;Is6hen 4 und 5 mit einer gepufferten wäßrigen Lösung
Von salpetriger Saure in Kontakt bringt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als gepufferte wäßrige Lösung von salpetriger Säure salpetrige Säure in Acetatpuffer mit .einer Konzentration an salpetriger · Säure und an Acetation/im Reaktionsmedium von 1 η bzw* n/4 einsetzt Und den Kontakt 1 bis 15 Hinuten aufrechterhält.

4. Verfahren nach Anspruch 3_t dadurch gekennzeichnet-, daß man den Kontakt IO (+.1) Minuten bei einem pH-Wert von 4,6 (+ 0,1) bei Raumtemperatur aufrechterhält.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als heterologe Zellkultur eine primäre Kaninchennieren-

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Zellkultur einsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5j dadurch gekennzeichnet, daß man

5 bis 15 Serienpässagen bei Temperaturen _von 30 bis 37°C (± I⁰C) durchführt. ' (
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man 10 Serienpassagen bei 37°C (t I⁰C) durchführt.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man den temperaturerapf indlichen Mutant ens tainm durch eine Passage in einer primären fötalen Rindernieren-Zellkultur isoliert.
9· Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als pathogenen infektiösen Rinderatmungs-Virus-Ausgangsstamm den infektiösen Rinderatmungs-Virusstamrn IBE 3760 ein-'setzt.
10- Verfahren zur Herstellung einer infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Lebendvirusvakzine, dadurch gekennzeichnet, daß man einen nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 9 hergestellten infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamm in einer bekannten, das Wachstum von infektiösem Rinder-Rhinotracheitis-Virus erlaubenden Zellkultur bei einer Temperatur nicht über 37°C (- I⁰C) eine 'für das Wachstum einer großen -Virusmenge ausreichende Zeit inkubiert und das erhaltene Virusmaterial erntet.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Zellkultur eine primäre fötale Rindernieren-ZelBniltur einsetzt.

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12. Verfahren nach Anspruch 10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß "man als infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virusstaram den Stamm IBR SLB 106 einsetzt. '
ο Infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-Lebendvirusvakzine, enthaltend als aktive Komponente einen nach ilnspruch 1 bis 12 hergestellten infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamm.
14. Ausführungsform nach Anspruch I3, dadurch gekennzeichnet, daß der Virusstamm der infektiöse Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamm IBR RLB 106 ist. . ' " ■ ■
15. Polyvalente Lebendvirusvakzine für die Atemwege von Rindern, enthaltend als aktive Komponeiiten einen nach Anspruch 1 bis 10 . hergestellten infektiösen Rinder-Rhinotracheitis-Virusstamm und mindestens eine weitere intranasal verabreichbar'e Lebend-. virusvakzdne für die Atemv;ege von Rindern.
16.. Ausführungsform nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die andere Lebendvirusvakzine für die Atemwege von Rindern ein lebendes Rinder-rParainfluenza-3~Virus ist.

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