JPS5812258B2 - ナマジヤクドクデンセンセイウシビコウキカンエンウイルスワクチンルイノセイゾウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は伝染性牛鼻腔気管炎（ＩＢＲ）ウイルスの遺伝
的に安定な非病原性株の生産とこれを含む弱毒性ウイル
スワクチンの製造法に関する。

別のＩＢＲ生ウイルスワクチンが公知であるがこのワク
チンは動物の内部器官中でウイルスの増殖を妨げないた
め著るしい残余病原性があり、例えば妊娠した雌牛の流
産の原因となる。

本発明者らは（ａ）伝染性牛鼻腔気管炎ウィルスの温度
感受性（ ｔｓ ）変異株の誘導と分離及び（ｂ）得ら
れたｔｓ株の異種細胞培養液中での系列継代を組み合わ
せて、両操作を一定の条件下で行なうと伝染性牛鼻腔気
管炎ウイルスの遺伝的に安定な非病原性株が得られ、こ
れはワクチンとして用い、あるいは製造するのに特に適
しており前記ＩＢＲウィルスワクチンの病原性を持たな
い事を見出した。

本発明のワクチンの更に有益なことはその投与経路にあ
る。

事実、本発明のワクチンを鼻内に投与すると、ワクチン
を構成するＩＢＲウィルス株は生体すなわち動物の内部
器官の暖い温度で著るしく増殖することなくただ局部的
にその動物の上気道内で増殖するだけである。

本発明によるワクチン製造の為に有用な非病原性ＩＢＲ
ウイルス株を調製するにはＩＢＲウイルス株を直接臨床
例から分離するか、ＩＢＲウイルス株を例えばアイ・エ
ヌ・アール・ブイ（ＩＮＲＶ，ベルギー国、ブラッセル
）のＩ ＢＲ第３ ７ ６ ０号を出発株として３０〜
３２℃（±１℃）で、一次牛腎臓（ＰＢＫ）細胞培養の
ような組織培養により数代継代培養して得る。

本発明の方法は伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスの温度感受
性変異株の誘導及び分離をし、前記温度感受性株を完全
な弱毒化が得られるまで異種細胞培養で系列的に継代す
ることから成る。

さらに詳しくは、伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスをｐＨ
４〜５にて亜硝酸水性緩衝液と接触させて温度感受性変
異株を誘導する。

亜硝酸水性緩衝液は亜硝酸の酢酸緩衝液が好ましく、反
応液中の亜硝酸及び酢酸イオンの濃度は各々ＩＮ及び１
／４Ｎで、接触を１〜１５分間持続する。

例えばｐＨ４．６（±０．１）、室温で１０分間接触を
持続する。

次いで、得られた温度感受性変異株を伝染性牛鼻腔気管
炎ウイルス増殖に適した公知の組織培養中で継代して分
離する。

例えば一次牛胎児腎臓（ＰＦＢＫ）細胞培養中で３０℃
（±１℃）、１０〜２０日間、好ましくは１４日（±１
日）間、１継代培養して分離することができる。

次いで更に、この分離株を完全に弱毒化するまで異種細
胞培養中で継代培養する。

例えば一次ウサギ腎臓（ＰＲＫ）細胞培養中で３０〜３
７℃（±１℃）にて５〜１５回、好ましくは、３７℃（
±１℃）にて週１０回、ワクチンとしてまたはワクチン
製造用に用いられ５るまで継代培養する。

本発明方法でえられる伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスの遺
伝的に安定な非病原性株は、本出願人がＩＢＲ−ＲＬＢ
１０６として保存しており、そのサンプルは書面での
要求があればいつでも与える。

゛本発明の方法においては、異種細胞培養中での一連の
継代培養の各々の期間にはとくに限定はなく、ウイルス
の生長が確実に行なわれ、そのウイルスを集めつぎの継
代培養を行なうために他の細胞培養に接種し５る程度で
充分である。

むしろ、継代培養の期間を不当に延長することは好まし
くなく、各継代培養について、最長１週間が本発明の目
的に好適である。

かくしてえられるウイルスは、出発株の病原性ＩＢＲウ
イルス株に対する免疫性は実質的に失つておらず、それ
らは温度感受性、非病原性であり、伝染性牛鼻腔気管炎
ウイルスワクチンとして、あるいはそれから公知のワク
チン製造技術および安定剤を用いてそのワクチンを製造
するために有用である。

したがって、本発明は、伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスの
温度感受性変異株を誘導、分離し、ついでこの温度感受
性株を異種細胞培養に、完全に弱毒化するまで継代培養
させてえられる少なくとも１種の伝染性牛鼻腔気管炎ウ
イルスを含む伝染性牛鼻腔気管炎の生ウイルスワクチン
ならびに該ワクチンの製造方法に関する。

前述のととく、本発明は、前記のごとくしてえられた温
度感受性、非病原性の伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスを、
伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスが生育しうる公知の細胞培
養、たとえば牛細胞系培養または一次牛細胞培養、さら
に好ましくは一次牛胎児腎臓（ＰＦＢＫ）細胞培養にそ
、３７℃（±１℃）を超えない温度、好ましくは３０〜
３２℃（±１℃）の範囲で、該ウイルスが大量に生育す
るに充分な時間培養させ、ついで該ウイルスを収集する
ことからなる非病原性の伝染性牛鼻腔気管炎の生ウイル
スワクチンの製法に関する。

ここで得られた伝染性牛鼻腔気管炎生ウイルスワクチン
を最少１０４．２ＴＣＩＤ５ｏ（組織培養感染投与量５
０％）、好ましくは１ ０ ＴＣＩＤ５ｏの投与単位
で鼻咽腔に局所的に投与する。

ワクチンとして使用するには該ウイルスは凍結乾燥状態
で保存するのが好ましく該ワクチンを水あるいは他の点
滴薬やスプレーのような当該分野公知の鼻腔用薬調製用
の希釈液又は組成物を加えて即座に復元する。

以下に実施例を挙げ本発明を更に具体的に説明するがこ
れは本発明の範囲を限定するものと解すべきでない。

実施例 １ 一次牛腎臓（ＰＢＫ）組織培養中で１２回系列継代後、
典型的な臨床例からＩＢＲウイルス株を分離して得た病
原性、伝染性牛鼻腔気管炎（ＩＢＲ）ウイルス株ＩＢＲ
第３７６０号を一次牛胎児腎臓組織培養中で４３回系列
継代し、最終継代の表面を集菌して１０６．５ＴＣＩＤ
５０／ｍｌを含むウイルス懸濁液を得る。

このウイルス懸濁液１ｍｌを０．５ｍｌのＩＭ酢酸／酢
酸ナトリウム緩衝液（６ｙの氷酢酸を蒸溜水で１００ｍ
ｌとし、１３．６Ｓ’の酢酸ナトリウムをｉ００ｍｌの
蒸溜水に溶した溶液３倍量と混合して調製する。

両液は１２１℃、３０分間殺菌する。）中０．５１１Ｌ
ｌの４Ｍ亜硝酸ナトリウム水溶液と混合し最終ｐＨを４
．６とする。

この混合液を室温で１０分間反応し、次いでＩＮ水酸化
ナトリウムを攪拌しながら滴下しｐＨを７．５（±０．
５）に上げて反応を停止させる。

ｐＨの調整はワクチン懸濁液中のフェノールレッド指示
薬の変色に従う。

こめ溶液を直ちにリン酸緩衝食塩水（ＮａＣｌ＝８ｇ、
ＫＣＩ ０． ２ ｇ，Ｎａ２ＨＰＯ４１．１５ｇ、Ｋ
Ｈ２ＰＯ４０．２Ｆを蒸溜水で８００ｍｌとし、１００
ｍｌの蒸溜水中にＭｇＣｌ２・６Ｈ２０を溶かした溶液
と混合、次いで１００ｍｌの蒸留水に０．１ｇのＣａＣ
１２を溶した溶液と混合、これを滅菌濾過し、最終ｐＨ
を７．２〜７．４とする。

）に対し＋４℃（±１℃）で５時間透析する。

このリン酸緩衝食塩水は亜硝酸アニオンが除去されるま
で数回とりかえる。

１試料の力価を測定しウイルスストックを−７０℃で保
存する。

力価測定は１希釈につき２本の試験管を用い、一次牛胎
児腎臓組織培養中非許容温度（３９℃／±１℃）で試験
管終点希釈法により行なう。

２週間培養した後力価を記録し−７０℃で保存している
試料をＩＴＣＩＤ５０／０．２ｍｌになるように希釈す
る。

この希釈試料０．１ｍｌ試験管を使用して２８本の一次
牛胎児腎臓組織培養試験管に接種し、許容温度（３０℃
、±１℃）で培養する。

７〜１７日間の種々の培養期間の後、１０本の接種試験
管は典型的なＩＢＲ細胞変性効果を示し、これに１〜１
０の標示をして−７０℃に保存する。

この１０本の陽性試料の二連力価測定を許容温度（３０
℃）と非許容温度（３９℃）で行なう。

許容及び非許容温度間の力価に著るしい差を現わす試料
は更に限界希釈継代によりクローン（ Ｃｌｏｎｅ ）
する。

この様にして陽性の試験管を試料Ａ６の １０−５希釈に貯め、ＲＬＢ１０５と標示する株の懸濁
液を得る。

得られたＲＬＢ１０５株を敏感な子牛で試験すると、こ
の株はいくらか残余病原性を示し、鼻内接種後わずかに
鼻の排泄が観察される。

次いでＲＬＢ １ ０ ５株を一次ウサギ腎臓細胞培養
で次の様にｉｏ回継代する。

特に病気のない群から由来する３〜６週令のウサギを腎
臓提供動物として用いる。

この腎臓を無菌状態の下にとり出し、細切した腎臓組織
をリン酸緩衝食塩水（ＮａＣ１８ｇ， ＫＣＩ Ｏ．
２Ｐ、Ｎａ２ＨＰ０４１． １ ５ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４
０．２ｇを蒸溜水で８００ｍｌとし、ＭｇＣｌ２− ６
Ｈ２０を１００ｍｌの蒸溜水に溶かした溶液と混合し、
次いでＣａＣｌ２０．１２を１ ０ ０ｍｌの蒸溜水に
溶かした溶液と混合、これを滅菌濾過して最終ｐＨを７
．２〜７．４とする。

）で洗滌しトリプシンの緩衝食塩水溶液（２．５ｇ／ｌ
）でトリプシン処理し、この混合物を３７℃で１０分間
攪拌する。

その後、液を流し出し、同容の新しいトリプシン溶液で
置換する。

次いで組織が排出するまで攪拌しながらトリプシン処理
を続ける。

液中に懸濁する細胞を時々除去した後ｉ０００ｒ，ｐ，
ｍ．で遠心分離し、細胞沈澱物を約２０００００細胞／
ｍｌとなるように増殖培地（ウイルスを遮断した子牛血
清１０％、１００単位のペニシリンＧナトリウム、１
０ ０ｍｃｇ／ｍｌのストレプトマイシン硫酸塩で補足
したイーグルの基礎培地）に懸濁する。

この細胞懸濁液の１ｍｌ試料を滅菌試験管に接種し、３
７℃、４〜５日間培養する。

この最初の培養期間の終りで増殖培地を除去し無ガンマ
ウイルス遮断の子牛血清２％のみを含むイーグル基礎培
地１．５ｍｌで各試験管を置換する。

ここで得られたＲＬＢ１０５ウイルス懸濁液の各０．２
ｒｕｌを１０本の試験管に接種し３７℃で３〜５日間の
種々の期間で培養する。

このウイルスの増殖は典型的な細胞変性効果で明らかに
なり、約５０％の細胞に前記細胞変性効果が現われたと
ころで新しい一次ウサキ腎臓組織培養にこのウイルスの
系列継代な行なう。

その後表面液を集菌しこの０．２ｍｌの試料を次の継代
の接種液として使用する。

最終継代の表面液を集菌し貯めておき容量比１：２にＦ
Ｇ溶液として知られる安定化溶液（カシトン（ Ｃａｓ
ｉｔｏｎｅ ） ６ ０ ｔ、シュークロース１００Ｖ
、第２リン酸ナトリウム（Ｍ／１５）７５ｍｌ、第１リ
ン酸カリウム（Ｍ／１５）２５ｍｌ、グルタミン酸１カ
リウム２０ｇを蒸溜水で４．２５１としたもの。

）で希釈しこの混合牲な凍結乾燥してＩＢＲウイルス株
ＩＢＲ．ＲＬＢ１０６を得る。

ＩＢＲ株ＩＢＲ．ＲＬＢ１０６のｔｓ性 異なった温度のウイルス増殖の力価測定をした。

この結果を３９℃（±０．５℃）の臨界温度を示す第１
表に総括する。

第１表にはＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株と親株間に生ずる差
が示されＩＢＲ．ＲＬＢ １ ０ ６株が低漏出性が示
されている。

ＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株のｔｓ性の安定性を次の如＜
ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏで示す。

（ａ） ｉｎ ｖｉｔｒｏ ＩＢＲ．ＲＬＢｌ０６株を一次牛胎児腎臓細胞培養中、
３０、３８及び３９℃で継代する。

結果を第２表に総括するこれでは３０及び３８℃での９
継代を通じてｔｓ性が安定に残ってい令が３９℃では２
継代後この株が増殖しなかった事が示されている。

（ｂ） ｉｎ ｖｉｖｏ ＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株を３〜４月令の雌子牛（中部ベ
ルギーで飼育）に通過したこのワクチン接種した動物の
鼻から再分離し、許容温度（３５及び３７℃）及び非許
容温度（３９℃）で力価測定をした。

結果を第３表に示す。第３表に示した力価の比較ではＩ
ＢＲ． ＲＬＢ １ ０ ６株のｉｎｖｉｖｏ通過後のｔｓ性の
安定性を示している。

実施例 ２ 牛胎児腎臓を無菌状態下でとり出し、細切しリン酸緩衝
食塩水（ＮａＣｌ８ｇ，ＫＣｌ Ｏ．２ｇ、Ｎａ２ＨＰ
Ｏ４１． １ ５ ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ｇを蒸溜
水で８００ｍｌとし、蒸溜水１００縦中に ＭｇＣｌ２・６Ｈ２０ を溶解した溶液と混合し、次い
で蒸溜水１００ｍｌ中にＣａＣｌ２０．１ｇを溶解した
溶液と混合、これを滅菌濾過して最終ｐＨを７．２〜７
．４とする。

）で洗滌しトリプシン（２．５ｇ／ｌ）の緩衝食塩水溶
液でトリプシン処理し、この混合物を３７℃で１０分間
攪拌する。

その後液を流し出し、同容量の新しいトリプシン溶液で
置換する。

次いで組織が排出するまで攪拌しながらトリプシン処理
を続ける。

液中に懸濁する細胞を時々除去した後１ ０ ０ ０
ｒ，ｐ，ｍ，、５分間遠心分離し、細胞沈澱物を約２０
００００細胞／ｍｌとなるように増殖培地（ウイルスを
遮断した子牛血清１゛０％、ラクトアルブミン氷解物０
．５％、酵母エキス０．１％，５０ｍｃｇ／ｍｌのネオ
マイシン硫酸塩で補足したハンクの塩基性塩溶液）に懸
濁する。

細胞懸濁液の１ｍｌ部を５００ｃｍ３ルーフラスコに接
種し３７℃、４〜５日間培養する。

この最初の培養期間の終りで増殖培地を除き細胞単層を
維持培地（ラクトアルブミン氷解物０．５％、酵母エキ
ス０．１％、トリプトースリン酸ブロス０．１％、ネオ
マイシン硫酸塩５０ｍｃｇ／ｍｌを含むイーグルの塩基
性塩溶液から成る。

）で２回洗滌する。各牛胎児腎臓細胞培養フラスコに約
２．１６６Ｔ Ｃ Ｉ Ｄ５ｏ／７ｄを含む伝染性牛鼻
腔気管炎ウィルスＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株蒸溜水懸濁液
１ｍｌを接種する（すなわち多重度指標０．１にて）。

維持培地（前記洗滌培地と同組成）を各フラスコに加え
３５℃で大量のウイルスが増殖するのに充分な期間培養
する（すなわち、典型的なＩＢＲ細胞変性効果が明らか
になる様に少なくとも３〜４日間）。

その後、表面液を集菌し貯めて、容量比１：２にＦＧ溶
液（カシトン（ Ｃａｓｉｔｏｎｅ ） ６ ０ ｔ、
シュークロース１００ｇ、第２リン酸ナトリウム（Ｍ／
１ ５ ） ７ ５ｍｌ，第１リン酸カリウム（Ｍ／１
５ ） ２ ５ｍｌ，グルタミン酸１カリウム２０グ
を蒸溜水で１ｌとする。

）として知られる安定化溶液で蕪釈する。

許容温′度（３０℃）及び非許容温度（３９℃）におけ
るウイルスカ価測定は出発株ＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株の
ｔｓ性が保たれている事を示している。

得ちれた調製物は１０６．２ＴＣＩＤ５０／ｍｌを含む
。

この調製物を各々１０５．２ＴＣＩＤ５ｏ又はその倍数
を含む様にガラス薬瓶に分注し該薬瓶を凍結乾燥し、密
封して単又は倍数投与量を構成する。

１投与量につき１ｍｌの水を加えて復元した後、該ワク
チンを鼻点滴薬又はスプレーとして動物に投与する。

該ワクチンのｈ性 第４表に示した様に得られたワクチンのｔｓ性試ｉ験で
はＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株のｔｓ性に何の差異も示さな
かった。

≦得られたワクチンの実験 （ａ） ワクチン接種計画 該ワクチンを中部ベルギーで飼育した３〜４月令の血清
陰性雌牛４区中３区に投与した。

第４区の動物は対照とした。

第５表にワクチン接種計画を詳記する。

（ｂ） 鼻から再分離したウイルス 第５表のワクチン接種計画に従いワクチン接種後分離し
たウイルスの力価を第６表に示す。

これ等はｌｏｇ１ｏＴＣＩＤ５ｏ／０．１ｍｌで表わし
てある。

全陰性試料を一次牛胎児腎臓（ＰＦＢＫ）細胞で継代し
たが３７℃、７日間培養期間後も陰性であった。

第５表のワクチン接種計画に従いワクチン接種１個月後
感染した後分離した感染ウイルスの力価を第７表に示す
。

これ等はｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／０．１ｍｌで表わし
てある。

全陰性試料を一次胎児腎臓（ＰＦＫ）細胞で継代したが
３７℃、７日間培養後も陰性であった。

第７表Ｑ結果ではワクチン接種動物の鼻中で感染ウイル
スの増殖はかなり弱められる事を示している。

（ｅ） ワクチン接種後の血清転化 所゛定のウイルスー血清希釈法により血清中和試験を行
なった。

血清中和試験の結果を第８表に示す。

これでは１０〜ＩＯＯＴＣＩＤ５０に対し最少５０％の
試験管を完全に防御する相互の希釈として表わしてある
。

（ｄ） 症候学 第５表のワクチン接種計画に従いワクチン接種後、全動
物を毎日つぎの点を観察した：午前８〜９時に体温渭宛
；血液学的試験；鼻の分泌物；臨床試験。

感染後（ワクチン接種後１ケ月に行なった。

）同じ試験を行なったがこれでは全動物から鼻及び膣の
分泌物をとった。

第９表に結果を総括する。

（ｅ） ワクチン接種動物の鼻から再分離したウイルス
のｔｓ性 第１０表に示した様にワクチン接種動物の鼻から再分離
したウイルスのｔｓ性の試験ではＩＢＲ．ＲＬＢ１０６
株のｔｓ性に何の差異も示さなかった。

得られたワクチンを以下に関して試験した。

（ａ）無害性、（ｂ）鼻接種後の組織分布、（ｅ）抗原
性及び最少ワクチン接種量、（ｄ）接触動物への伝染性
ゎ（ａ） 無害性 フリージアン（ Ｆｒｉｅｓｉａｎ）酪牛を飼育した３
〜４週令の血清陰性雌牛で試験をし、未希釈の血清はＩ
ＢＲウイルスＳＴ２１９３株の５０ＴＩＣＤ，ｏに対す
る血清中和試験では陰性であった。

ワクチンの２ｍｌ投与単位（力価：ｌ０６．２ＴＣＩＤ
５０／ｍｌ ）を鼻孔に投与した３頭の動物の体温を５
日間毎日記録したが正常であった。

しかし対照として使用した病原性ＩＢＲウイルスＳＴ２
１９３株のウイルス調製品（調製品のウイルスカ価：１
０５．５ＴＣ工Ｄ５０／ｍｌ）の２ｍｌを投与した他の
２頭の体温は上昇した。

（ｂ） 組織分布 無害性試験に用いた動物を犠性にし（動物１、２及び４
は接種後５日、動物５および６は接種後６日）、次の第
１１表に示した器官を無菌状態下でとり出した。

次いでこれを無ガンマ牛血清２％を入れたイーグル培地
に組織１ ｇ／２ｍｌの割合で懸濁し、この溶液を２分
間超音波処理した後２０００ ｒ． ｐ．ｍ，、１ ０
分間遠心分離する。

上澄液を第１１表の希釈をし二次牛胎児腎臓組織に゛０
． ２ ｍｌ／試験管、１希釈につき３試験管で継代し
た。

結果は第１２表に総括するように脳脊髄液からの低力価
の１分離物を除いてＩＢＲ．ＲＬＢ１０６株を接種した
動物（動物１、２及び５）の内部組織からは何のウイル
スも分離されなかつたが、有毒ウイルスを接種した動物
（対照動物４及び６）では体の別の部分あやいはより低
い気道から有毒ウイルスが分離できた。

陰性動物（Ａ１、２、５、６）の肺の未希釈貯蔵物のめ
くら継代な二次胎児腎臓中で行なった結果はすべて陰性
であった。

（Ｃ） 抗原性及び最少ワクチン接種量中部ベルギー
で飼育した約３月令の５２頭の動物に試験を行なった＝
２９頭は鼻中にワクチン接種（１０頭は１０６゜２ＴＣ
ＩＤ，。

投与量、１０頭はｌＯ５．２ＴＣＩＤ５０投与量、９頭
は１０４．２ＴＣ工Ｄ，ｏ投与量）及び２３頭は直接接
触対照動物として用いた。

血清学的試験は定ウイルス（３０〜５０ Ｔ Ｃ Ｉ Ｄ５０ ） ／血清希釈法を用いた血清中
和法で行なった：最初の溶液は未希釈である。

血清／ウイルスの容量比は２／１であった。

血清−ウイルス混合物は３７℃で１時間培養した。

結果を次の第１３表に詳記する。ワクチン接種後６週間
の力価のスクリーニングを次の第１４に示す。

第１３表および１４表の結果より１０５．２投与量が許
容されるワクチン投与量範囲と思われる。

（ｄ） 伝染性 第１３表に見られるように該ワクチンウイルスは該ワク
チン接種動物と直接接触する牛の少パーセン斗に伝染し
た。

しかし、接触動物には何の症候も起らず該ワクチンウィ
ルスもワクチン接種動物中のものと同じ動向を示し、有
毒ヘの逆戻りは何ら認められなかった。

実施例 ３ 前記実施例２と同様に安定化溶液で希釈した集菌表面液
を、エヌ・ジグライヒなど（Ｎ！Ｚｙｇｒａｉｃｈ ，
Ｍ．Ｌｏｂｍａｎｎ及びＣ ． Ｈｕｙｇｅｌｅｎ
， Ｊ．ＨＶｇ ． Ｃ ａｍｂ ，第７０巻、２２
９〜２３４頁、１９７２年）記載の牛のパラインフルエ
ンザ３（ｐＩｓ）ウイルスのＲＬＢ１０３温度感受性変
異株で補足し、この混合液をｉＢＲウイルス１０６．５
ＴＣＩＤ，ｏ及び牛ＰＩ，ウイルス１０６．７５ＴＣＩ
Ｄ，。

を含むか各々の倍数を含むガラス薬瓶に分注する。

この薬瓶を凍結乾燥し密封して単一又は多重投与量を含
むようにする。

１投与量につき４〜５ｍｌの水を加えて復元後該ワクチ
ンを動物に点滴薬又は鼻スプレーとして投与する。

臨床試験 帝王切開で得た特に病原体のない牛４頭に試験をし、Ｉ
ＢＲ及び牛ＰＩ３抗体型両方に対し血清陰性である事が
判った。

各動物の鼻孔に前記により得られた二価ワクチンの１単
位投与量を投与した。

ワクチン接種３週間後血清学的試験のために採取した血
清試料は各動物がＩＢＲウイルスと同様牛ＰＩ，ウイル
スに対しても血清転化している事を示した。

結果を次の第１５表に示す。

牛ＰＩ，ウイルスの添加はＩＢＲワクチン接種により干
渉はされずまた逆にＩＢＲウイルそは牛ＰＩ３ウイルス
に対する動物の血清転化によって干渉されなかった。

次に本発明の実施の態様を列挙する。

、（１）病原性伝．染性牛鼻腔気管炎ウイルス株か
ら誘導、せ離した伝染性牛鼻腔気管炎ウィルスの温、度
感受性変異株を異種細胞培！で系烈継代し完全に弱轡化
することケ特徴とする非病厚性伝染性牛鼻腔気管炎ウィ
ルス株の製造方法，、、（２）前記第（１）項に従って
伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスを亜研酸水溶液でｐＨ４〜
５に緩衝して接触し温度感受性変一株を誘導する非病原
性伝染性牛鼻腔気管炎ウィルス株の―填方法。

（３）前記第（２）項による典硝酸水溶液による緩衝が
酢酸緩衝液中、亜硝酸及び酢酸イ、オンの濃度各各ＩＮ
及び１／４Ｎであり、又接触を１〜５分間持続する非病
原性伝染性牛鼻腔気管炎ウイルー ス株の製造法。

（４）前記第（３｝項による接触
をｐＨ ．４．６（±０．１）、室温で１０（±１）分
間持続する非病原坤隼染性±鼻腔気管炎ウイルス株の製
造法。

（５）前記第（１）〜第（４）項の何れによる異種細胞
培養が一次ウサギ腎臓細胞培養である非病原性伝染性牛
鼻腔気管炎ウィルス株の製造昧。

（６）前記第（５）項による系列継代の回数は５〜１、
５で、継代温度は３０〜３７℃（±１℃）である非病原
性伝染性牛鼻腔気管炎ウイルス株の製造法。

（７）前記第（６）項による系列継代回数が１０で、温
度が３７℃（±１℃）である非病原性伝染性牛鼻腔気管
炎ウイルス株の製造法。

（８）前記第（１）〜鳳力項の何れによる温度感受性変
異株も一次牛胎免腎臓細胞培養中１回継代により分離す
る非病原性伝染性牛鼻腔気管炎ウイルス株の製造法。

（９）前記第（ｌト第（８）項の何れによる出発病原性
伝染性牛呼吸器ウ１イルス株も伝染性牛呼吸器ウイルス
ＩＢＲ第３ ７ ６ ０，−７７ある非病原性伝染性牛
鼻腔気管炎ウイルス株の製造法。

（１０）前記第（１）〜第（９）項の何れかにより当該
分野公知の伝染性牛鼻睦気管炎ウイルス増殖に適した細
胞培養中、３７℃，（±１℃）以下で該ウイルスが大量
に増殖する充分な期間培養して得られた伝染性牛鼻腔気
管炎ウイルス株を集菌する事から成る伝染性手鼻腔気管
炎生ウイルスワクチンの製造法。

（１１）前記第（１１項ｋよる細胞培養が一次牛胎児腎
臓細胞培養である伝染性牛鼻腔気管炎生ウイルスワクチ
ンの製造法。

（１２）前記第αＯ）及び第αυ項の何れによる伝染性
牛鼻腔気管炎ウイルス株がＩＢＲ．ＲＬＢ１０６ウイル
ス株である伝染性牛鼻腔気管炎牢ウイルスワクチンの製
造法。

（１３） 前記第（１）〜部響の何れかによる方法で得
られた伝染性牛鼻腔気管炎ウイルス株と最少他の１種の
鼻内投与可能な牛呼吸器生ウイルスワク１チンを混合し
てなる．多両牛呼吸器生．ウイルスワクチンの製造法。

（Ｉ４）前記第Ｃ１３項による他の牛呼吸器生ウイルス
が生牛パラインフルエンザ３ウイルスである多価牛呼吸
器生ウイルスワクチンの製造法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 病原性伝染性牛鼻腔気管炎ウィルス株から誘導、分
   離した伝染性牛鼻腔気管炎ウィルスの温度感受性変異株
   を異種細胞培養で継代し、完全に弱毒化して得られる非
   病原性伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスを集菌することを特
   徴とする生弱毒伝染性牛鼻腔気管炎ウィルスワクチン類
   の製造法。 ２ 病原性伝染性牛鼻腔気管炎ウィルス株から誘導、分
   離した伝染性牛鼻腔気管炎ウイルスの温度感受性変異株
   を異種細胞培養で継代し、完全に弱毒化して得られる非
   病原性伝染性牛鼻腔気管炎ウイルス株と他の鼻内投与可
   能な牛呼吸器生ウイルスワクチンを混合してなるワクチ
   ン類。