DE2056051A1

DE2056051A1 - Multivalente Vaccine und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2056051A1
Application number: DE19702056051
Authority: DE
Inventors: Wilhngboro N J Vella. Philip Peter (V St A)
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1969-11-14
Filing date: 1970-11-13
Publication date: 1971-05-27
Also published as: NL7015493A; FR2073358A1; AU2183370A; GB1270918A; FR2073358B1

Description

MuItivalente Vaccine und Verfahren zu ihrer Herstellung

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung multivalenter Vaccinen, insbesondere ein mit Hehrfachinfektion eines ELnzellen-Kultursystems mit mehr als einem Virus arbeitendes Verfahren zur Erzeugung multivalenter Virusvaccinen, insbesondere zur Herstellung einer zur Bekämpfung virusinduzierter Erkrankungen des Atmungstraktes wirksamen Vaccine, sowie die hierbei erhaltenen, neuen Vaccinen·

Die Bedeutung von Vaccinen für die Bekämpfung von Virus-Infektionen ist vertraut. Von der lechnik der Vaccineerzeugung her vertraut ist auch die ausserordentliche Kostspieligkeit in Form von Arbeits- und Materialaufwand und Qualitätskontrolle bei Jeder Ernte virusinfizierter Fluide. Da eine gegebene Vaccine für eine gegebene Infektion spezifisch ist, hat die Prophylaxe von Viruserkrankungen zur Entwicklung monovalenter Viurspools oder Vaccinen mit den diese begleitenden hohen Kosten und der Notwendigkeit

109822/2055 " ¹ "

12539

meh.rfach.er Injektionen zum Schütze jedes Patienten geführt. Zur teilweisen Milderung des Problems hat die Industrie gewisse multivalente Vaccinen entwickelt, die einfach ui-'schungen einzeln für sich erzeugter, verträglicher Vaccinen darstellen und die sich in Form einer Eininjektions-Zubereitung verabreichen lassen und doch Schutz gegen eine Anzahl verschiedener Virusinfektionen ergeben. Diese ruultivalenten Vaccinen haben eine Verminderung der Verpackungskosten und Lockerung des Zwangs, jede Komponente getrennt in einer Einzelinjektion zu verabreichen, also eine iiehrf achinj ekiiion durchzuführen, erbracht, tragen aber nur sehr wenig zur Senkung der Produktionsgesamtkosten der Einzelkomponenten oder der Endkosten für den Verbraucher bei.

Das wichtige Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in dem Einsatz eines Einzellen-Kultlirsystems zur gleichzeitigen Replikation verschiedener Viren, so dass im Zuge eines einzigen Erntevorgangs eine multivalente Vaccine bei wesentlich gesenkten Kosten anfällt.

Diese Kostensenkung ist schon bei Verabreichung multivalenter Vaccine gegen die ernsten Erkrankungen, wie Poliomyelitis, Mastern, Röteln, Humps, usw., sehr bedeutungsvoll, aber noch wichtiger' für die Behandlung vorherrschender Erkrankungsbestände, die gewöhnlich im Hinblick auf eine geringe Sterblichkeitsrate als unwichtig angesehen werden, z. B. Erkrankungen des Atmungstraktes bei Kindern. Die Zahl der Todesfälle ist gering, aber die Erkrankung tritt häufig auf. Etwa 40 % aller respiratorischen Krankheiten bei Kindern unter 5 Jahren stehen mit dieser Verursachungsart in Zusammenhang. Erkrankungen des Atmungstraktes sind nicht das Ergebnis eines Einzelerregers, sondern ergeben sich vielmehr in Zusammenhang mit'mehreren verschiedenen viren, wie dem Respiratorischen Synzytial-Virus (HSV), den Influenza-Viren, den Parainfluenza-Viren, den lüiino-Viren, den Coryza-Viren, den Adeno-Viren, den pleuropneumonie-

109 8 22/2055 - ² "

12559

artigen Organismen (PPLO) usw. Hieraus ist ersichtlich, dass man zur Bekämpfung von Erkrankungen des Atmungstraktes einer lioihe monovalenter Vaccinen oder multivalenter.Vaccine bedarf. Auf Grund der'Seltenheit von !Todesfällen und der hohen Kosten von nach bekannten Methoden hergestellten monovalenten oder multivalenten Vaccinen jedoch kennt man bisher noch keine Entwicklung einer wirksamen Vaccine gegen die Erkrankungen des Atmungstraktes.

Das Verfahren gemäss der Erfindung findet somit seinen wertvollsten Einsatz bei der Herstellung einer multivalenten Vaccine gegen die Viren, die gewöhnlich im Zusammenhang mit Erkrankungen des Atmungstraktes auftreten.

Plan ist allgemein der Ansicht gewesen, dass die Infektion einer Zelle mit einem Virustypus eine gleichzeitige Infektion der gleichen Zelle mit einem von diesem verschiedenen Virus ausschliessen könnte. Diese Theorie ist untersucht worden und hat sich als nicht allgemeingültig erwiesen. Eine multiple Infektion von Zellen ist untersucht worden und hat sich als mit bestimmten Viren möglich erwiesen.

Nach dem Verfahren gemäss der Erfindung wird ein Zellkultursystem, das ein spezifisches Virus-Wachstum zu tragen bzw. unterhalten vermag, wie Nierenzellenkulturen vom afrikanischen Grünaffen oder ähnliche bekannte Systeme, mit zwei oder mehr verträglichen Viren inoculiert, wie dem respiratorischen Synzytial-Virus und dem Parainfluenza-Virus der Typen 1, 2 und 3» dem Viruserreger der infektiösen Bronchitis j den Influenza-Virus-Stämmen A , Ap und B und Organismen wie Plycoplasma pneumoniae.

Nach in der üblichen V/eise, d. h. etwa 6 bis 25 Tage bei 28 bis. J8⁰ C, durchgeführter Inkubation erntet man den Inhalt der Kulturflaschen nach bekannten Methoden und iso-

- 3 -1 G 9 6 2 2: / 2 0 5 5

liert die Virus-Komponenten nach als für die jeweils beteiligten Viren wirksam "bekannten Methoden und setzt die anfallenden, konzentrierten und gereinigten Materialien in wässrigen Vaccinen'oder in Vaccinen des Adjuvanstyps ein.

Beispiel 1

Gleichzeitige Infektion von Grünaffennieren-Primä.rkulturen mit bestimmten Myxo-Viren

Nieren-Primärzellkulturen vom afrikanischen Grünaffen (AGlIK) wurden mit verschiedenen Kombinationen des respiratorischen Synzytial-Virus ("I ml; 1 χ 10 '^ Virus teilchen/ ml), Parainfluenza-Virus Typ 1 ( 1ml; 1 χ 10 '' Virusteilchen/ml), Parainfluenza-Virus Typ 2 (1 ml; 1 χ 10 '' Virusteilchen/ml) und Parainfluenza-Virus Typ 3 (1 ^ml> 1 χ 10^'' Virusteilchen/ml) inoculiert.

Die Virusinocula wurden 2 Std. der Adsorption an der Zellkultur überlassen und dann die Zellkulturen mit Medium 199 (ohne Serum) überschichtet. Die Zellkulturen wurden bei 36° C in stationärer Lage inkubiert; 10 Tage später wurden die Viren geerntet, mit Formaldehydlösung (EndkoJizentration 1 : 4-000) inaktiviert, an Kaliumaluininiunisulfat (8 mg/ml) adsorbiert und zur Antigenbewertung Meerschweinchen injiziert. Die serologischen Untersuchungsergebnisse (Serumneutralisation oder Hämagglutinationshemmung) nennen die Tabelle I und II.

109822/2055

Tabelle I

Antikörper-Ansprechen beim Hänagglutinations-Heirimurrgstest von Meerschweinchen auf einzeln für sich oder In Kombination gezüchtete Parainfluenza-Viren !Typ 1, 2 und 3 ;■'

HH⁺⁺⁺^-Titer einzelner Meerschweinchen mit Indektion unverdünnten Materials

09822/	Virus agen s	P3	Antigene aus multipler Infektion der Zellplatte	4-3 ,
Ni O	PJ	P 3	nein'	5²
cn	Ρα η	RS	nein	43
	PI H	RS	da	24
	PI H		nein	43.
	2i π	P3	da	316
VJi		P3	. nein	68
I	P1 -	RS	nein	6
	P1 ■	RS	da	32
	PI -	P 3	nein	24
	Pi ■		da	316
			nein	147
	P" ·	nein	237
	P" ■	.da

- P2 -r
r ?2 +
h F2 +
h P2 +
12
i- P2 +
f P2 +
* !£ +
f P2 +

τ P2' +
• Pl τ

320⁺⁺), 320, 160, 160, 160, 80, 80, 40, 10 320, 80, 80, 40, 20 160, 80, 40, 10, 10 40, 40,-40, 40, 40

320, 320, 320, 160,

160, 160", 160, 80, 20 ' ·

160, 160, 20, <1O,<1O 160, 40, 40, 20, 20 80, 80, 80, 40, <1O

640, 320, 320, 320, 160, 160-, 160, 160, 320, 320, 320, 320,

x-n"cigen-Verdünnung, die Antikörperbildung bei 50 % der Tiere stimuliert (d. h. Serur^ior.versionsraten von 50 %)
Kehrwert der Seruiaanfangsverdünnungen

12559 . 6

In Tabelle I sind in der Spalte "Virusagens" die Antigenkomponenten der Vaccine (Virusinfektionsverinögcn inaktiviert) genannt, die Meerschweinchen intramuskulär injiziert wurde. P1, P2 und P3 bezeichnen Parainfluenza-Virus des Typs 1, 2 bzw. 3, wobei in jedem Falle durch Unterstreichung einen der Virusagentien das Jeweilige Agens angegeben ist, für das die Antigenitat geprüft wurde. Z. B. wurden in jedem i'alle bei den Werten der ersten waagerechten Tabellenzeile die von Meerschweinchen gegenüber P1 entwickelten HII- Tit er untersucht.

Die zweite Tabellenspalte beschreibt die Quelle der multivalenten Vaccine. Die Bezeichnung mit "ja" bedeutet die Isolierung aus einem Einkulturmedium, wie in Beispiel 1 beschrieben, und mit "nein" die Zubereitung aus drei gesonderten Vaccinen.

n bedeutet eine Serumkonversionsrate von 50 %, d. h. die Vaccineverdünnung, welche bei 50 % der injizierten Tiere ein feststellbares Antikörper-Ansprechen induziert, und wird als Kehrwert der Verdünnung ausgedrückt.

Die letzte Spalte zeigt die bei den einzelnen Meerschweinchen erhaltenen Antikörper-Titer bei der Hämagglutinations-Hemmung.

Wie Tabelle I zeigt, wurden die antigenen Eigenschaften der jeweiligen Virusagentien durch die Multipelinfektions-Technik im Vergleich mit denjenigen von in Einzelkulturen gezüchteten und zu Injektionszwecken vereinigten Virusagentien nicht beeinträchtigt.

i BAD ORIGINAL

r. 6 -109822/2055

!Tabelle II

Serumneutralisations-Antikörperansprechen von Heerschvieinchen auf einzeln für sich _oder in Kombination mit dem/n genannten Parainfluenca-Virus-Typ(en) gezüchtetem. S3-Virus (hii¹ Hr. 2)

Virusagens/tien

ES₊ Para 2

RS + Para 1 + Para 2

ES + Para 1 + Para 2

Multiple
Infektion
der Zellplatte

nein
da
ja
nein

CH₁-Q

237 ?37

48

Gruppenpoolserura-giter (AIi)⁺* '

Vaccine 10°

Verdünnung '

56 28 20

+ ) Serumlconversionsrate 50 %, d. h. Vaccineverdünnung, die "bei 50 % der injizierten (Eiere ein feststellbares Antikörper-Ansprechen induziert.

++) AM = Arithmetisches Mittel des Antikörpertiters

Alle Viruserntematerialien wurden vor der Injektion mit Aluminiumkaliumsulfat (Alum) aufgeschlämmt.

12539 £

Beispiel 2

Silmultaninfektion von Grünaffenni er en-Primärz ellkultür en mit bestimmten Myxo-Viren (MIi¹ Nr. 6)

Es wurde eine gleichzeitige Infektion von AGMK-Primärzellkulturen mit Parainfluenza-Virus Typ 1 , 2 und 3 durchgeführt. Die infizierten Zellkulturen wurden in stationärer Lage bei 32° C inkubiert und die replizierte Viren enthaltenden, der Zellkultur Überschichteten Nährfluide bzw. -flüssigketen 2 und 3 Wochen nach Infektion geerntet. Die drei Viren enthaltenden Proben wurden mit den zwei der Viren entsprechenden Antisera neutralisiert und auf das Infektionsvermögen des dritten Virus in AGHK-Primärzellkulturen titriert. Das Infektionsvermögen gemäss Tabelle 111 zeigt, dass die Implikation aller drei Viren unabhängig davon gleich gut ablief, ob diese den Zellkulturen einzeln oder in Kombination inoculiert wurden.

- 8 109822/2055

12539

Tabelle III

Simultaninfektion von AGMK-Primärzellkultüren mit Para-

influenza-Virus Typ 1, 2 und 3

Virus agens	Inoculum	Para 1	Erntetag	Kehrwert (log^) des Virustiters/ml
1		Para 2	14	4,7
2		Para 3	■ 14	6,7
3	•	+ 2+3	14	6,7
1	Para 1	+ 2+3	14	4,7
2	Para 1	+ 2+3	14	6,2
3	Para 1	Para 1	14	7,2
1		Para 2	21	6,2
.2		Para 3	. 21	*3,7*
3		+ 2+3	21	4,7
1	Para. 1	+ 2+3	21	3,7 ■
2	Para 1	+ 2+3	21	6,7
3	Para 1	21	6,2

In 'fabelle III nennt die Spalte "Virusagens" den Para-

influenza-Virus-Typ, für den das Infektionsvermögen bestimmt wurde. Die Spalte "Inoculum" nennt den bzw. die bei der Inoculierung der Zellkulturen eingesetzten Virustyp(en) und die nächste Spalte in i'orm der Zahl der lage nach der Virusinfektion den Zeitpunkt, zu dem die der infizierten Zellkultur überschichteten Nährflüssigkeiten gesammelt wurden.

109822/2055

12539 JO

Beispiel 5

Multivalente Vaccine mit einem Gehalt an respiratorischen Synzytialvirus und Parainfluenza-Virus Typ 1 ? 2 und t> nach multipler Infektion gegebener Zellkulturen

Nierenzellen-Primärkulturen (8 Tage alt) vom afrikanischen Grünaffen· wurden mit jeweils 2 ml des respiratorischen Synzytial-Virus und Parainfluenza-Virus Typ 1, 2 und *> beimpft, wobei jedes Inoculum ungefähr gleiche Anzahlen an infektiösen Teilchen (bestimmt durch vorherige Titration auf Infektionsvermögen) enthielt.

Das Minimalinoculum wird gleichmässig über der Zellplatte dispergiert und in stationärerer Lage 2 Std. bei J6° G irikubiert. Nach der Virusadsorptionsphase gibt nan zu Jeder ilasche 100 ml Medium 199» mit Natriumbicarbonat auf pH 7 »6 eingestellt und enthaltend 50 bis 100 Einheiton an Nemoycin/ml, hinzu. Me virushaltigen, den Zelikultüren überschichteten Nährflüssigkeiten werden 7 his 14 Tage nach Inoculation geerntet und in einer Zentrifuge (Bauart DeLaval, 12 000 U/Min. » 18 500 χ g) bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 900 ml/Min, geklärt. Der geklärte Pool wird mit Formaldehyd (1 : 4000) 6 Tage bei J6° (J inaktiviert und bei geeigneten g-Werten (ungefähr 70 000 bis 85 000 x g), Strömungsgeschwindigkeiten (2 1/Std. bei · Sharpies) und Dichtegradienten (Natriumbromid oder saccharose) durch eine Ultrazentrifuge der Bauart Sharpies und bzw. oder Zonen-Ultrazentrifuge geführt. Das gereinigte Konzentrat wird direkt als Vaccine wässrigen Typs eingesetzt oder mit Adjuvansmaterial vereinigt, welches das Antikörper-Ansprechen auf die vorliegenden Agentien verstärkt. Jede Dosis der anfallenden Vaccine enthält 1 χ 10^ ^is 1 χ 10¹¹ Virus-Ieilchen/Stamm. .

BAD - 10 -

109822/2055

12559

Unbcr Anwendung in wesentlichen der Arbeitsweise von Beinpiel 5? aber unter Ersatz der dort verwendeten. Viraliriocula durch die in Tabelle IV genannten Inoculagruppeii wurden die nachfolgenden multivalenten Vaccinen hergestellt, die sich als wirksam zur Verhinderung der ebenfalls in der Tabelle genannten Erkrankungsbestände erwiesen.

T a b. e 1 1 e IV

Beispiel	Inocula	Erkrankung
4-	Eß, Para 1, Para 2, Para 3i M. pneumoniae	"rcup, Bronchiolitis, Pneumonie
5	ilS, Para 1, Para 2, H. pneumoniae	Group, Bronchiolitis, Pneumonie
6	BS, Para 1, Para 2	Croup, Bronchiolitis, Pneumonie
7	HS, Para 1, Para 2, Infektiö" se Bronchitis*)	Croup, Bronchitis, Bronchiolitis, Pneumonie
8	Para 1, Para 2, Para J	Group
9	Influenza-Virus-Stämme (A1, A2, B)	Influenza

*) Infektiösbronchxtis-"artiges" Virus beim Henschen.

BAD ORIGINAL

109822/2055

Claims

Ij5. November I970 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer multivalenten Vaccine,. dadurch gekennzeichnet, dass man Virusagentien in einem Einzellen-Kulturmedium gleichzeitig kultiviert und das Produkt einem medizinisch akzeptablen Medium einverleibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die für respiratorische Erkrankungen verantwortlichen Agentien einsetzt.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Virusagentien aus der Gruppe

a) respiratorisches Synzytial-Virus,

b) Parainfluenza-Viren,

c) Influenza-Viren Stamm A und B,

d) infektiösbrönchitis-"artiges" Virus und

e) Hycoplasma pneumoniae einsetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als infektiöse Agentien respiratorisches Synzytial-Virus und Parainfluenza-Virus Typ Λ , 2 und $ einsetzt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als infektiöse Agentien respiratorisches Synzytial-Virus, Parainfluenza-Virus Typ 1 und 2 und M. pneumoniae einsetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als infektiöse Agentien respiratorisches Synzytial-·

Virus, und Parainfluenza-Virus Typ 1 und 2 einsetzt.

- 12 -

109 8 2 2/2055

12539 .43

7· Verfahren*nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als infektiöse Agentien respiratorisches Synzytial-Virus, Parainfluenza-Virus Typ 1 und 2 und Infektiöse-Bronchitis-Virus einsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als infektiöse Agentien Parainfluenza-Virus 0?yp 1, 2 und 3 einsetzt.

9· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als infektiöse Agentien Influenza-Virus Stamm A und B einsetzt.

τ 13 -109822/2055

10. Hultivalente Vaccine, erhalten durch gleicl^c-i ti;;c Kultivierung von infektiösen Agentien ±:, cinc.i ^i :\- zellen-Kulturmedium und Einverleibung des anfaiicden Produktes in einem medizinisch akzeptablen '.Träger.

11. Vaccine nach Anspruch 10, gekennzeichnet durcn für . respirator!sehe Erkrankungen verantwortliche Agen-

tien als infektiöse Agentien.

12. Vaccine nach Anspruch 10, gekennzeichnet durcxi Agen tien aus der Gruppe

a) respiratorisch.es Synzytial-Virus,

b) Parainfluenza-Viren,

c) Influenza-Viren Stama A und B,

d) infektiÖsbronchitis-"artiges" Virus und

e) Mycoplasma pneumoniae
als infektiöse Agentien.

1J. Vaccine nach Anspruch. 10, gekennzeichnet durch

respirator!sches Synzytial-Virus und Parainfluenza-Virus Typ 1, 2 und .3 als infektiöse Agentien.

14. Vaccine nach Anspruch 10, gekennzeichnet durcn respiratorisches Synzytial-Virus, Parainixuenza-Virus Typ 1 und 2 und ΓΊ. pneumoniae als infektiöse Agentien.

15· Vaccine nach Anspruch 10, gekennzeielmet durch

respiratorisches Synsytial-Virus, und i^jarainfiuex.:a-Virus Typ 1 und 2 als infektiöse Agcntie:-.

16. Vaccine nach Anspruch 10, gekennaeichnet, dux'ch

respiratorisches Lynzytial-Viruc, ' xarai.'.^uei^a-Virus Typ 1 und 2 und Infektiöso-üronchitic-^irus

- 14 - BAD ORIGINAL

109822/2055

als infektiöse Agentien.

· Vaccine nach Ansprach 10, gekennzeichnet durch, x-^i-o-

influenza-Virus ^rüyp 1, 2 und J ^aJ-ß inxektiüno A[cei>• tien.

18. Vaccine nach Anspruch 10, gekennzeichnet durch Influenza-Virus Starara A und B als infektiöse Agentien.

BAD ORIGINAL 109822/20E5