DE2504373A1 - Attenuierte influenza-b-virus- rekombinante, verfahren zu ihrer herstellung und influenza-b-virus-lebendvaccine - Google Patents
Attenuierte influenza-b-virus- rekombinante, verfahren zu ihrer herstellung und influenza-b-virus-lebendvaccineInfo
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Description
RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES, R.I.T.
Genval, Belgien
" Attenuierte Influenza-B-Virus-Rekombinante, Verfahren zu
ihrer Herstellung und Influenza-B-Virus-Lebsndvaccine "
Priorität: 4. Februar 1974, V.St.Ä. , Nr. 439 176
Der Schutz gegen Virusinfektionen des Respirationstraktes setzt
eine antivirale Immunität in der Schleimhaut des Respirationstraktes voraus; vgl. Rossen et al., Progr. Med. Virol,, Bd. 13
(1971), S. 194.
Seit einiger Zeit wurden Versuche unternommen, durch nasale Applikation von inaktivierten Vaccinen eine Immunität gegen
Influenza zu erzeugen; vgl, z.B. Waldman et al. , Nature, Bd. 218 (1968), S. 594; JAMA, Bd. 207 (1969), S. 520; WHOBuIl.,
Bd. 41 (1969) , S. 543. Die Ergebnisse waren jedoch widersprechend;
dies beruhte vermutlich auf einer ungenügenden Stimulation des Immunitätssystems durch das inaktivierte Antigen;
vgl. Tyrrell et al., J. Hyg., Bd. 68 (1970), S. 359.
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Influenza-B-Virus-Lebendvaccineη sind bekannt, doch sind sie von
stark unterschiedlicher Schutzwirkung μ Es wurden zahlreiche
Versuche unternommen, beispielsweise durch Reihenpassagen auf Bruteiern (vgl. z.B. A.A. Smorodintsev, Proc. Symposium on
Acute Respiratory Diseases, Zagreb 1969,S,391 bis 404) oder unter Verwendung von Tieftemperaturmutanten (vgl.
F.M. Davenport et al., Proc. Symposium on Live Influenza Vaccines, Zagreb 1971, S. 105 bis 113), die Pathogenizität
des Virus zu vermindern.
Auch die Rekombination von Influenza—B-Virus stammen wurde in
der Literatur beschrieben; vgl. z. B. E.D, Kilbourne, Progr.
Med. Virol., Bd. 5 (19Ö3)» S. 79 bis T26.
Wie beispielsweise von G.C. Schild et al., Brit. Med. J.,
Bd. h (1973), S. 127 bis 131, gezeigt wurde, sind Variationen
der Oberflächenantigene des Influenzavirus eine"seiner wichtigsten
Eigenschaften. Zahlreiche Schwierigkeiten bei der Bekämpfung von Influenza durch Schutzimpfung ergeben sich, hieraus.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, stabile Influenza-B-Virenstämme
sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu schaffen, die sich als Impfstämme zur Herstellung von Influenza-Lebendvaccinen
(impfstoffe) eignen. Diese Aufgabe wird' durch die Erfindung gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist somit eine attenuierte Influenza-
einem
B-Virus-Rekombinante, die aus' attenuierten und zur Herstellung
B-Virus-Rekombinante, die aus' attenuierten und zur Herstellung
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Γ 25O4373 π
_ 3 —
Stamm eines Impfstoffes geeigneten Influenza-B-Virenr'und einem Influenza-B-Virus-Isolat
hergestellt %*orden sind. Mindestens
eine Merkmaleigenschaft (Marker) der Rekombinante stammt vom
attenuierten Elternstamm, die sich vom anderen Elternstamm biologisch
und antigenetisch unterscheidet.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der
attenuierten Influenza-B-Virus-Rekombinante, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß man in einem üblichen, zur Vermehrung von Influenza-B-Viren geeigneten Substrat attenuierte und zur Herstellung
eines Impfstoffes geeignete Influenza-B-Viren mit einem Influenza-B~Virus-Isolat rekombiniert und durch Selelctionsdruck
eine Rekombirßnte isoliert, bei der mindestens eine Merkmaleigenschaft vom attenuierten Elternstamm stammt, die
sich vom anderen Elternstamm biologisch und antigenetisch unterscheidet.
Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Impfstoff aus einem Impfstamm, der eine attenuierte Influenza-B-Virus-Rekorabinante
mit mindestens einer Merkmaleigenschaft des attenuierten Elternstammes enthält, die sich vom anderen Elternstamm biologisch
und antigenetisch unterscheidet. "."--"
Der erfindungsgemäße Impfstoff wird nach folgenden Grundschritten hergestellt:
a) Attenuierung des Trägerstatnmes, eines Influenza-B-Virus;
b) Rekombination mit einem frisch isolierten Epidemie-Stamm
einer Influenza-3-Virusepidemie;
L 509 832/1007 J
c) Vermehrung des Rekombinaiten-InipfStammes zur Herstellung
von Impfstoff (Lebendvaceine).
Zu a)
Zu a)
Der erfahrensgemäß eingesetzte attenuierte Stamm von Influenza-B-Viren
wird aus einem virulenten Influenza-B-Virusstamm durch
Serienpassagen hergestellt, bis man eine so weitgehende Attenuierung
und EinheitIichlceit des Influenza-B-Virus erhält, das
sich jetzt zur Herstellung eines Impfstoffes eignet. Ein solcher Influenza-B-Virus-Stamm ist der Stamm Brigit, der bei der American Type Culture Collection, Rockville, V.St.A,, unter der Nummer
ATCC VRJ86 hinterlegt ist. Dieser Stamm wurde durch Passieren
von Influenza-B-Virus-Stamm Rußland/69 (ATCC VR 790) in der
Allantoishöhle von Bruteiern in Gegenwart von Schweineserum
hergestellt, bis ein attenuierter Stamm von Influenza-B-Vinj.s
erhalten wurde, der gegenüber Serumlnliibitoren vollständig resistent
ist, ein positives AOS-Merkmal (AOS = Chorioallantoismembran
an der Schale; die Titration auf der Chorioallantois- ' membran an der Schale ist von S. Fazekas de St. Groth und D.O.
White in J. Hyg., Bd. 56 (1958), Seiten I5I bis 162 beschrieben)
besitzt, eine antigene Wirkung ohne Nebenwirkungen bei Frett-·
chen zeigt, eine positive Hämagglutinin-Thermöempfindlichkeit bei 60 C und eine instabile Hämagglutination von Schaferythxozyten
bei 30 C zeigt.
Zu b)
Zu b)
Die erfindungsgemäßo Rekombination kann in jedem Substrat durchgeführt
werden, das zur Vermehrung von Influenza-B-Viren geeignet ist, beispielsweise in Bruteiern oder fetalen Kälbernieronzellkulturen,
insbesondere in der1 Alltintoishöhle von Bruteiern
L -J
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(Chorioallantoismembran). Die Rekombination läßt sich mit jedem Influenza-B-Virus-Isolat, insbesondere einem neuen Isolat,
wie dem Influenza-B-Virus Stamm Hongkong/5/72 (ATCC VR791)oder
Stamm Hongkong/8/73 (ATCC VR792) durchführen. Zu c)
Die erhaltenen neuen Rekombinanten der Erfindung sind das Ausgangsmatei-ial
für den Impfstoff der Erfindung. Die Rekombinanten können klonisiert oder weiteren Passagen ohne Änderung ihrer
G-rundeigenschaften unterworfen werden.
Rekombinanten der Erfindung aus dem Stamm Brigit (ATCC VR786)
mit dem Influenza-B-Virus Stamra Hongkong/5/72 (ATCC VR791)
oder Hongkong/8/73 (ATCC VR792) vmrden als Influenza-B-Virus
Stamm R 22 (ATCC VR788), Stamm R 5 (ATCC VR787) bzw. Stamm R 75
(ATCC VR789) bezeichnet und hinterlegt.
Die Virusrekombinanten der Erfindung sind nicht pathogen und
immunogen; sie sind geeignet für die Herstellung einer Influenza-B-Virus-Lebendvaccine,
wobei die üblichen Methoden der Herstellung und Konservierung von Influenza-Lebendvaccinen benutzt
werden können. Vorzugsweise erfolgt die Vermehrung in der Allantoishöhle
von Bruteierno
Dementsprechend betrifft die Erfindung auch attenuierte Influenza-B-Virus-Lebendvacc.inen,die
mindestens eine Influenza-B-Virus-Rekombinante
und gegebenenfalls einen Stabilisator enthalten.
Zur Herstellung der Lebendvaccine wird die attenuierte Influenza-B-Virus-Rekombinante
der Erfindung in der Allantoishöhle von
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Bruteiern vermehrt, anschließend wird das Virusmaterial geerntet, gegebenenfalls mit einem Stabilisator versetzt und gefriergetrocknet.
Zur Herstellung der Vaccine wird das gefriergetrocknete Material vor dem Gebrauch durch Zusatz von Wasser
oder einem anderen Suspendiermittel zur Herstellung von Präparaten für die nasale Applikation, wie Tropfen oder Sprays, verdünnt.
Als Stabilisatoren können übliche Verbindungen verwendet werden, beispielsweise Pepton oder Rohrzucker. Gegebenenfalls
kann die Lebendvaccine der Erfindung noch mit einer nasal verabfolgbaren
Influenza-A-Virus-Vaccine kombiniert werden.
Die Influenza-Lebendvaccinen können lokal in den Nasen-Rachen-
7 raum in einer Dosis von mindestens 10 EID1.. verabfolgt werden
(EID = egg infectious dose). Die Verabfolgung kann gegebenenfalls mehrmals wiederholt werden.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Eine Probe von Influenza-B-Virus Stamm Rußland/69 (ATCC VR79O)
wird zur Reinigung drei Endverdünnungspassagen auf speziellen Bruteiern unterworfen, die frei von pathogenen Erregern sind
(SPF-Bruteier), Eine Probe der letzten Passage wird als Einsaatmaterlal
zur Herstellung eines Versuchsansatzes verwendet, der frei von für Geflügel pathogenen Erregern, z, B. Geflügel-Leukose-Virus,
und empfindlich gegenüber Seruminhibitoren 1st. Das Virus zeigt gegenüber Menschen einen Restpathogenität,
50983271007
— 1 —3 —5 —7 Verschiedene Verdünnungen, nämlich 10 , 10 , 10 und 10
des Einsaatmaterials in physiologischer Kochsalzlösung werden
mit sterilem normalem Schweineserum unterschiedlicher Konzentration (unverdünnt, 25 0Io und 5 0Jo) vermischt, das vorher 15 Minuten im siedenden Wasserbad erhitzt, homogenisiert und 30 Minuten
bei 1000 g zentrifugiert wurde. Der die·Seruminhibitören
enthaltende Überstand wird für die weitere Stufe verwendet, bei der die Virus-Serum-Gemische zunächst 1 Stunde bei 37 "C
inkubiert und sodann jeweils 0,2 ml des Gemisches in die Allantoishöhle
von Bruteiern verimpft werden, die 8 bis 11 Tage bei
37 C vorbebrütet und durchleuchtet wurden. Es werden lediglich Eier mit lebenden Embryonen beimpft. Sodann werden die Brüteier
24 bis 96 Stunden weiter bebrütet. Danach werden die Eier durchleuchtet« Hierauf werden die Embryonen durch Abkühlung.
. der Eier auf ^C (12 Stunden) getötet. Die Allantoisflüssigkeit -wird gewonnen und der Titer an Influenzaviren mittels des-Hämagglutiiiatioilstests
nach Sallc bestimmt. Das Virus dieser
Ernte — erhalten aus dem Inoculum der höchsten. VirusVerdünnung
(1O~ ) in Gegenwart der höchsten Serumkonzentration (25 /°) und
mit einer hämagglutinierenden Aktivität - wird für eine zweite Passage unter den gleichen Arbeitsbedingungen verwendet.'
Insgesamt werden fünf Passagen auf die vorstehend beschriebene
Weise durchgeführt.
Das nach fünf Passagen geerntete Virusmaterial, das vom
Inoculum der höchsten Virusverdünnung, "nämlich 10 ,.in Gegenwart
des unverdünnten Serums erzeugt wurde, zeigt hämagglutiniorende Aktivität . und ist gegenüber Seruminhibitören beständig.
509832/1007 '
Zusätzlich werden drei weitere Endverdünnungspassagen in Abwesenheit
von Serum durchgeführt, um die erhaltene resistente Mütänte zu klonisieren und die Stabilität der Eigenschaft der
Resistenz gegenüber Seruminhibitoren zu prüfen» Das in jeder dieser drei Passagen geerntete Virusmaterial ist gegenüber den
Inhibitoren von normalem Serum restistent0 Das Virusmaterial
auf der letzten Passagestufe, das als Stamm Brigit bezeichnet und bei der American Type Culture Collection unter der Nummer
ATCC VR786 hinterlegt wurde, wird als Inoculum zur Erzeugung ■
von Einsaatmaterial verwendet. Die geernteten Allantoisflüssigkeiten
werden vereinigt und auf ihre bakterielle Stex-ilität
und'Sicherheit (safety-test) untersucht. Die Allantoisflüssigkeit
wird mit Pepton bis zu einer Endkonzentration von 5 cl° versetzt.
Jeweils 0,5 ml der Virensuspension des Stammes Brigit werden in 3 ml fassenden Gläschen abgefüllt und gefriergetrocknet.
In-vitro- und in-vivo-Eigenschaften des modifizierten Virus .
(Stamm Brigit)
1) Inhibitorenbeständigkeit
Zur Untersuchung der Beständigkeit gegen Inhibitoren des normalen
erhitzten Tierserums (1 Stunde auf 75 C) werden zweifache Verdünnungsreihen (ganzzahlig logarithmische Verdünnungsreihe zur Basis 2) des erhitzten Serums mit vier hämagglutinierenden
Einheiten des Elternstammes und des modifizierten Virus vermischt. Nach einstündigem Irikubieren bei Raumtemperatur werden
Htthnererythrozyten zugegeben und die Ergebnisse registriert. Die Ergebnisse zeigen eine vollständige Resistenz des Einsaat-
509832/1007
~ 9 ■*
materials gegenüber Seruminhibitoren und der aus diesem Einsaat
material erzeugten Versuchsansätze. Diese Eigenschaft wird-als
"positiv" bezeichnet.
2) Antigenität und Abwesenheit von Nebeneffekten
7 ft
Eine Gruppe von zwei Frettchen wird mit 10 -IO eIdcq ^es Stammes Brigit (ATCC VR786) intranasal infiziert. Die Temperatur
der Tiere wird täglich während 8 Tagen post infectionem registriert.
Es wurde kein signifikanter Temperaturanstieg beobachtet (Maximaltemperatur 39,6 C). Eine zweite Gruppe von 2
ri O
Frettchen wird mit 10 '-10 EID150 des Ausgangsstammes des Influenza-B-Virus
Rußland/69 (ATCC VR790) intranasal infiziert. Zwei Tage nach, der Infektion zeigen die Tiere eine Temperatur
von 40,2°C; Hämagglutinations-Hemmungsversuche zeigten, daß der modifizierte Stamm bei Frettchen eine Immunitätsantwort
lh Tage nach der intranasalen Infektion erzeugte. Die Serumantikörpertiter
bei den infizierten Tieren waren sehr hoch (1/256) im Gegensatz zur nicht infizierten Kontrollgruppe
3) Verhältnis von EID50Z(AOS)ID50 (AOS-Merkmal)
Das gleiche Inoculum wird an Bruteiern sowie am Chorioallantoisinembran-der-Schale-System
titriert. Das EIDr„/(AOS) ID.. -Ver-
bü oO
hältnis für den Stamm Brigit- (ATCC VR786) beträgt <102'5. Ein
Verhältnis von <1O2'5 wird als "positiv" bezeichnet.
4) Hämagglutinin-Thermoempfindlichkeit ■
Der Hämagglutinationstest wird an infizierter Allantoisflüs-
509832/1007
sigkeit durchgeführt, die 1 Stunde bei 6O0C inkubiert wurde.
Nach dieser Behandlung hat der Stamm Brigit (ATCC VR786) seine hämagglutinierende Aktivität vollständig verloren. Diese
Thermoempfindlichkeit wird als "positiv" bezeichnet.
5) Hämagglutinat ions test mit Schaf-erythrozyten bei 3O°C
Ein Hämagglutinationstest wird mit Schaferythrozyten bei 4 C und 3O°C durchgeführt. Das Hämagglutinationsbild bei 4°C ist
normal, während bei 30 C eine rasche Elution erfolgt, so daß keine eindeutige Hämagglutination beobachtet wurde. Bei der
Prüfung 20 Stunden nach Beginn des Versuchs ist die Hämagglutination vollständig verschwunden. Diese Eigenschaft
wird als "instabil' bezeichnet.
Eine Probe von Influenza-B-Virus~Stamm Hongkong/5/72
(ATCC VR791), dessen Hämagglutinin verschieden ist von dem des Stammes Brigit (ATCC VR786) wird in die Allantoishöhle von
10 bis 11 Tage alten Bruteiern in einer Menge von 0,2 ml pro Ei verimpft und drei Serienpassagen unterworfen. Am Ende der
dritten Passage wird eine Virensuspension mit einem Titer von
10 EID,-n/ml erhalten. Jeweils 0,2 ml der unverdünnten Suspension
werden in die Allantoishöhle von SPF-Bruteiern verimpft. Nach 2stündiger Inkubation bei 33 C werden jeweils 0,2 ml
einer Virensuspension des Stammes Brigit. (ATCC VR786) mit
7 5
einem Titer von 10 ' EID5o/ml in die gleichen Bruteier verimpft.
Sodann werden die Bruteier 16 Stunden bei 33°C bebrütet.
Danach wird die Allantoisflüssigkeit.geerntet.
509832/1007
Jeweils 0,25 ml des Kaninchenantiserums gegen den Stamm Brigit,das
1 Stunde auf 56°C vorerhitzt wurde, werden mit dem gleichen Volumen normalen Serumsjvermischt. Jeweils 0,25 ml dieses Serumgemisches
werden zur geernteten Allantoisflüssigkeit gegeben. Dieses Gemisch wird sodann 1 Stunde auf 37 C erwärmt. Bruteier
werden mit 0,2 ml des inkubierten Gemisches (2 Eier für jedes Gemisch) beimpft und 48 Stunden bei 33 C inkubiert. Sodann
wird die Allantoisflüssigkeit der beimpften Eier geerntet, in
Bruteiern passiert . (0,2 ml/Ei) und 72 Stunden bei'33 C inkubiert.
Für jede Probe v/erden 2 Eier verwendet. Nach 72stündiger
Inkubation wird die positive Allantoisflüssigkeit geerntet und. auf Hämagglutinatiön von Schaferythrozyten, Serotyp gegen
Anti-Brigit-Serum und gegen Anti-Influenza-B-Virus Stamm Hongkong/5/72 Serum, Resistenz gegen unspezifische Seruminhibitoren
und Wachstum in Bruteiern und auf der Chorioallantoismembran auf der Schale (AOS) untersucht. Eine der so erhaltenen
Virensuspensionen, die wie aus Tabelle I hervorgeht,-den Serotyp eines Elternstammes Hongkong/5/72 ,das Infektionsbild
im AOS-System und das Seruminhibitormerkmal des Stammes Brlglt
besitzt, wird als Stamm R 22 (ATCC VR788) bezeichnet,
und zur MassenVermehrung zwei Passagen auf Brütelern unterworfen.
Die geerntete Allantoisflüssigkeit mit der Virusrekombinante R 22 wird mit. Pepton bis zu einer Endkonzentration von
5 % versetzt und gefriergetrocknet.
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| Stamm. | Se Bri git |
rotyp B/HK/ 5/72 |
Inhibi- torbe- ständig- keit |
EID50/ (AOS)ID50 |
Hämagglu- tinin- Thermo- empfind- lichkeit |
I Hämaggluti- j nation von Schaferythro zyten bei 30Oc j |
| Brigit B/HK/5/72 Rekom- binante R 22 (ATCC VR 788) |
+ | + + |
+ + |
+ + |
+ | instabil t stabil j stabil |
Beispiel 3
Gleiche Volumina einer Suspension von Influenza-B-Virus
Stamm Brigit (ATCC VR786) und des Stammes Hongkong/8/73 (ATCC VR792) mit einem Titer von jeweils 1O7'5 EID5 /ml werden
vermischt und 72 Stunden bei 4 C vorinkubiert. Sodann wird das Gemisch in die Allantoishöhle von zwei SPF-Bruteiern in einer
Menge von 0,2 ml/Ei verimpft. Nach 16-stündiger Bebrütung bei 33 C wird die Allantoisflüssigkeit geerntet und 30 Sekunden mit
einem Branson-Somicator Typ Power Supply 1-22 bei maximaler Leistung
behandelt.
Die geernteten Allantoisflüssigkeiten unverdünnt und In einer
— 1 —2 ο
Verdünnung von 10 und 10 werden J Stunde bei 37 C mit unterschiedlichen
Verdünnungen von Kaninchen anti serum gegen den Stamm
Brigit umgesetzt, das vorher 30 Minuten auf 56°C erhitzt wurde«
Die erhaltenen Gemische werden auf das Chorioallantoismembranauf-der-Schale-System
vorimpft und 72 Stunden bei 37°C inkubiert.
- J
509832/1007
Die Proben der letzten positiven Virusverdünnung (1O"~ ) werden mit 1 bis 7 numeriert.. .
Die Infektions- und Neutralisationstiter durch das Kanlnchenantiserum
gegen den Stamm Brigit im AOS-System werden sodann für die sieben Proben und für die beiden Elternstämme verglichen»
Diejenigen Proben, die durch das . Kaninchsnantiserum nicht neutralisiert werden und die einen (AOS)ID -Titer aufweisen,
der mindestens gleich dem des Stammes Brigit (ATCC VR786) ist, werden bei der höchsten positiven Verdünnung geerntet. Diese
-4 ■
einzelnen Ernten werden auf 10 verdünnt und einmal in SPF-Bruteiern passagiert.
einzelnen Ernten werden auf 10 verdünnt und einmal in SPF-Bruteiern passagiert.
Eine dieser Virensuspensionen, die den Serotyp und die Hämagglutinin-Thermoempfindlichkeit
des Hongkong/8/73-Stammes und das EIDj. /(AOS)ID -Verhältnis des .Stammes Brigit zeigt, wird als
Stamm R 5 (ATCC VR787) bezeichnet.
In Tabelle II sind die Eigenschaften der Rekombinante R 5 und
der Elternstämme zusammengefaßt.
509832/1007
Stamm
Brigit
Serotyp
B/HK
8/73
8/73
(AOS)ID
Hämagglutinin-Thermoempfindlichkeit
Brigit
B7HK/8/73
B7HK/8/73
Rekombinante R 5
(ATCC VR787)
(ATCC VR787)
Die Rekombinante R 5 wird zwei Endverdünnungspassagen in SPF-Bruteiern
unterworfen, um eventuell vorhandene für Geflügel pathogene
Erreger abzutrennen. Sodann wird das Virusmaterial in einer weiteren Passage in SPF-Bruteiern massenvermehrt. Die geerntete
Allantoisflüssigkext wird bis zu einer Endkonzentration von 5 c/o mit Pepton als Stabilisator versetzt und gefriergetrocknet.
Ausgehend von dem in Beispiel 1 gefriergetrockneten Virusmaterial
des Stammes Brigit. (ATCC VR786)als Einsaatmaterial für die Vaccineproduktion wird eine weitere Passage in der Allantoisflüssigkeit
einer weiteren Reihe von Bruteiern durchgeführt, die 3 Tage bei 35°C bebrütet werden.
Danach wird die Allantoisflüssigkeit geerntet, vereinigt, auf Sterilität und Sicherheit untersucht, bis zu einer Endkonzentration
von 5 % mit Pepton als Stabilisator versetzt und in ml fassende Glasgefäße bis zu einem Titer von mindestens
509832/1007
- 15 - 2b04373
10 EID abgefüllt. Sodann wird das Produkt gefriergetrocknet
und die Glasgefäße werden dicht verschlossen . ·
Diese Passagestufe wird als Impfstoff verwendet. Zur Verabfolgung
der Vaccine wird der Inhalt eines Glasgefäßes mit
0,5 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung oder 5prozentiger
Rohrzuckerlösung versetzt und in Tropfen in die Nasenlöcher gegeben.
Die mit Pepton versetzte Allantoisflüssigkeit kann auch in
größere Glasgefäße"abgefüllt werden, um größere Mengen an Vaccine
zu erhalten.
Schutzimpfung mit dem attenuierten Influenza-B-Virus
(Stamm Brigit)
Klinische Versuche wurden an 46 freiwilligen Versuchspersonen mit einem Vorvaccinations-HI-CHämagglutinationshemmung) Titer
von höchstens 32 gegen Influenza B-Virus durchgeführt. Jeder Versuchsperson wurde die Vaccine in einem Abstand von 8 oder
14 Tagen zweimal intranasal verabfolgt. Bei jeder Verabfolgung wurde den Versuchspersonen eine Viruskonzentration von
7 5
10 ' EID50 des Stammes Brigit (jedes Nasenloch 5 Tropfen der frisch mit 5prozentiger wäßriger Rohrzuckerlösung hergestellten Vaccine) gegeben. Serokonversion wird an 40 Versuchspersonen (87 %) beobachtet. Es wurden nur milde klinische Reaktionen, nämlich Nasenlaufen oder verstopfte Nase; während 1 bis 2 Tagen beobachtet. Bei Versuchen mit Versuchsgruppen wurde keine übertragung von Influenza-Vaccine-Virus beobachtet. Es wurde eine Virusisolierung von Nasen- und Rachenabstrichen ve'r-
10 ' EID50 des Stammes Brigit (jedes Nasenloch 5 Tropfen der frisch mit 5prozentiger wäßriger Rohrzuckerlösung hergestellten Vaccine) gegeben. Serokonversion wird an 40 Versuchspersonen (87 %) beobachtet. Es wurden nur milde klinische Reaktionen, nämlich Nasenlaufen oder verstopfte Nase; während 1 bis 2 Tagen beobachtet. Bei Versuchen mit Versuchsgruppen wurde keine übertragung von Influenza-Vaccine-Virus beobachtet. Es wurde eine Virusisolierung von Nasen- und Rachenabstrichen ve'r-
509832/1007
sucht, jedoch blieben die Proben nach zwei Passagen in Bruteiern negativ.
Beispiel 5
Ausgehend von dem in Beispiel 2 hergestellten gefriergetrockneten Stamm R 22 (ATCC VR788) als Einsaatmaterial für die Virusmassenvermehrung
wird eine weitere Passage in der Allantoisflüssigkeit einer anderen Reihe von Bruteiern durchgeführt,
die 3 Tage bei 35°C bebrütet werden.
Die Allantoisflüssigkeit wird geerntet, vereinigt", auf bakterielle
Sterilität und Sicherheit geprüft, bis zu einer Endkoiizenträtion
von 5 °/° mit Pepton als Stabilisator vorsetzt und. in
7 3 ml fassende Glasfläschchen bis zu einer Dosis von 10 EJDD„
abgefüllt. Sodann wird das Produkt gefriergetrocknet, und die Glasfläschchen werden dicht verschlossen.
Diese Passagestufe . wird als Impfstoff ; verwendet. Zur Verabfolgung
der Vaccine wird der Inhalt eines Glasfläschchens mit
0,5 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung oder 5prozentiger
wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt und in die Nasenlöcher eingetropft.
Die mit Pepton versetzte Allantoisflüssigkeit kann auch in
größere Glasgefäße abgefüllt werden, um größere Mengen an Vaccine zu erhalten.
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Schutzimpfung mit der Vaccine aus dem attenuierten Influenza-B-Virus-Stamm R 22
Material und Versuchsmethodik ·
Sechs freiwillige Versuchspersonen mit einem HI-Antikörpertiter von höchstens 32 wurden für den Versuch ausgewählt. Zwei
Versuchspersonen dienten zur Kontrolle. Die sechs Versuchspersonen erhielten in einem Abstand von 11 bis 14 Tagen zweimal
die frisch hergestellte Vaccine in einer Menge von 5 Tropfen pro Nasenloch und in einer Dosis von 10 ' EID1--.
Blutproben zur Antikörperbestimmung wurden am Tag der Schutzimpfung und 10 bis 14 Tage nach der ersten Impfung und 14 Tage
nach der zweiten Schutzimpfung entnommen. Nasale Waschungen zur lokalen Antikörperbestimmung wurden 14 Tage nach der zweiten
Schutzimpfung durehgeführt.
Es wurden keine Symptome festgestellt.
Nasalabstriche wurden am 3. und 6. Tag bei den sechs Versuchspersonen
durchgeführt. Sämtliche Proben blieben nach zwei Blindpassagen
in Bruteiern negativ.
Fünf der sechs Versuchspersonen entwickelten Serum- und/
oder lokale Antikörper in der Nasenschleiirihaut«
509832/1007
Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
| Versuchs person |
Serumtiter (HI) vor der Impfung |
Serumtiter (HI) nach der zweiten Impfung |
lokale Anti körper vor ler Impfung (SN) |
-lokale Anti körper nach der zweiten Impfung - (SN) |
| 1 | 32 | 32 | <2 | 24 |
| 2 | 8 | 8 | <2 | 2-4 |
| 3 | 32 | 64 | <2 | 12 |
| 4 | 8 | 32 | <*■■ | C2 |
| 5 | <8 | <8 | Ub | Wo |
| 6 | <8 | 16 | Nb | Nb |
Nb = nicht bestimmt
Ausgehend von dem in Beispiel 3 erhaltenen gefriergetrockneten Virusmaterial Stamm R 5 (ATCC VR787) als Einsaatmaterial für '
die Massenvermehrung wird eine v/eitere Passage in der Allantoisflüssigkeit
einer anderen Reihe von Bruteiern durchgeführt, die 3 Tage bei 35°C bebrütet werden.
Die Allantoisflüssig-lceit wird geerntet, vereinigt, auf bakterielle
Sterilität und Sicherheit geprüft, mit Pepton als Stabilisator
bis zu einer Endkoiizentration von 5 °/o versetzt und in
3 ml fassende Glasgefäße bis zu einer Dosis von mindestens
7
10 EID„_ abgefüllt. Sodann wird das Produkt gefriergetrocknet, und die Glasgefäße werden dicht verschlossen.
10 EID„_ abgefüllt. Sodann wird das Produkt gefriergetrocknet, und die Glasgefäße werden dicht verschlossen.
Diese Passagestufe wird als Impfstoff verwendet« Zur Verabfol-
509 8 32/1007
gung der Vaccine wird der Inhalt eines Glasgefäßes mit 0,5 ml
Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung oder 5prozentigor wäßriger Rohrzuclcerlö sung versetzt und tropfenweise in die Nasenlöcher
gegebenο
Die mit Pepton stabilisierte Allantoisflüssigkeit kann auch
in größere Glasgefäße abgefüllt werden, um größere Vaccinemengen herzustellen.
Eine Dosierungseinheit der in Beispiel 4 hergestellten gefriergetrockneten
Vaccine des Stammes Brigit ATCC VR786 wird mit einer Dosierungseinheit einer attenuierten Influenza-A-Virus-Lebendvaccine
Stamm Alice (ATCC VR776) in 0,5 ml einer 5prozentigen wäßrigen Rohrzuckerlösung versetzt. Die erhaltene bivalente
Vaccine wird zweimal in einem Abstand von 14 Tagen tropfenweise in die Nasenlöcher gegeben.
Klinische Versuche wurden an 22 freiwilligen Versuchspersonen
\Vorvaccinations-/
mit einem''HI-Titer (HI = Hämagglutinationshemmung) von höchstens 64 gegen Influenza A- oder B-Viren durchgeführt. Jede Versuchsperson erhielt zweimal in einem Abstand von 8 bis 14 Tagen intranasal 10 ' EID1. des Stammes Brigit und
mit einem''HI-Titer (HI = Hämagglutinationshemmung) von höchstens 64 gegen Influenza A- oder B-Viren durchgeführt. Jede Versuchsperson erhielt zweimal in einem Abstand von 8 bis 14 Tagen intranasal 10 ' EID1. des Stammes Brigit und
7 5
10 ' EID50 des Stammes Alice.
10 ' EID50 des Stammes Alice.
Serokonversion wurde bei 8O % der Versuchspersonen gegen
Influenza-A-Viren und zu 73 % gegen Influenza-B-Viren beobachtet.
Es wurden nur milde klinische Reaktionen festgestellt» Ferner
509832/1007.
Γ Π
- 20 -
wurde keine übertragung des Influenza-Vaccine-Virus beobachtet.
Beispiel 8
7 5
Eine Dosierungseinheit (10 ' EIDc0) der in Beispiel 5 hergestellten gefriergetrockneten Vaccine des Stammes R 22 (ATCC VR788) wird mit einer Dosierungseinheit (1O7/5EID ) der attenuierten Influenza-A-Virus-Lebendvaccine Stamm Alice (ATCC VR776) in 0,5 ml einer 5prozentigen wäßrigen Rohrzuckerlösung versetzt. Die erhaltene bivalente Vaccine wird in einem Abstand von 14 Tagen zweimal tropfenweise in die Nasenlöcher verabfolgt. Serokonversion für beide Komponenten (Virus Typ B und A) wird 16 Tage nach der zweiten Verabfolgung beobachtet.
Eine Dosierungseinheit (10 ' EIDc0) der in Beispiel 5 hergestellten gefriergetrockneten Vaccine des Stammes R 22 (ATCC VR788) wird mit einer Dosierungseinheit (1O7/5EID ) der attenuierten Influenza-A-Virus-Lebendvaccine Stamm Alice (ATCC VR776) in 0,5 ml einer 5prozentigen wäßrigen Rohrzuckerlösung versetzt. Die erhaltene bivalente Vaccine wird in einem Abstand von 14 Tagen zweimal tropfenweise in die Nasenlöcher verabfolgt. Serokonversion für beide Komponenten (Virus Typ B und A) wird 16 Tage nach der zweiten Verabfolgung beobachtet.
Eine Probe des Influenza-B-Virus Stammes Hongkong/5/72
(ATCC VR791) dessen Hämagglutinin verschieden ist von dem des Stammes Brigit wird in die Allantoishöhle von 10 bis 11 Tage
alten Bruteiern in einer Menge von 0*2 ml pro Ei verimpft und
zur Massenvermehrung drei Passagen unterworfen. Am Ende der
dritten Passage wird eine Virensuspension mit einem Titer von 10 EIDrn/ml erhalten. Jeweils 0,2 ml der unverdünnten Virensuspension
werden in die Allantoishöhle von SPF-Bruteiern verimpft. Nach 2-stündiger Bebrütung bei 33 C werden jeweils
0,2 ml einer Virensuspension des Brigit-Stammes (hergestellt gemäß Beispiel 1) mit einem Titer von 10 ' EID /ml in die
gleichen Eier verimpft. Sodann werden die Eier 16 Stunden bei
509832/1007
33°C bebrütet. Hierauf wird die Allantoisflüssigkeit geerntet.
Jeweils 0,25 ml des Kaninchenantiserums gegen den Stamm Brigit, das
vorher 1 Stunde auf 56°C erhitzt wurde, werden mit dem gleichen Volumen normalen Serums vermischt. Jeweils 0,25 ml dieses Serumgemisches
werden mit der geernteten Allantoisflüssigkeit vermischt. Das Gemisch wird 1 Stunde auf 37°C erwärmt. SPF-Bruteier werden mit
0,2 ml des Gemisches beimpft und 48 Stunden bei 33°C bebrütet. Hierauf wird die Allantoisflüssigkeit der Eier geerntet, jeweils
0,2 ml werden in SPF-Bruteier verimpft und 72 Stunden bei 33 C bebrütet. Für jede Probe werden zwei Eier verwendet. Nach
72stündiger Bebrütung wird die positive Allantoisflüssigkeit geerntet und auf Hämagglutination gegen Schaferythrozyten,
Serotyp gegen Anti-Brigit-Serum und gegen Anti-B/HK/5/72-Serum
sowie Vermehrung in Bruteiern und auf dem Chorioallantoismembran-auf-der-Schale-System
(AOS-System) untersucht.
Eine, der erhaltenen Virensusp ens ionen, die den Serotyp des
Hongkong/5/72-Elternstammes und .das Infelcfcio;Sitätsbild des
Brigit-AusgangsStammes im AOS-System zeigt, wird als Stamm R
(ATCC VR789) bezeichnet. Die Rekombirante R 75 wird zur Massenvermehrung
zwei Passagen in SPF-Bruteiern unterworfen,,
In Tabelle IV sind die Eigenschaften der Recombinante und der
Ausgangsstamme zusammengefaßt.
5 0 9 8 3 2/1007
| Stamm | Serotyρ | B/HK/ 5/72 |
EID / | Hämaggluti- | Hämaggluti- |
| Bri git |
(AOS) ID5O |
nin-T.hermo- empfindlich- keit |
nation von Schaferythro zyten bei |
||
| - | 3O°C | ||||
| Brigit | + | + | + | instabil | |
| B/HK/5/72 | - | -■ | - | stabil | |
| Rekomb inante | + | ||||
| R 75 | — | + | — | stabil |
Beispiel 10
Die in Beispiel 9 erhaltenen vereinigten Allantoisflüssigkeiten
werden auf bakterielle Sterilität und' Sicherheit geprüft, bis zu einer Endkonzentration von 5 °/o mit Pepton als Stabilisator
versetzt und in 3 ml fassende Glasgefäße bis zu einer Dosis
ry
von mindestens lO'EID- abgefüllt. Sodann wird das Produkt gefriergetrocknet,
und die Glasgefäße werden dicht verschlossen. Diese Passagestufe wird als Impfstoff verwendet. Zur Verabfolgung
der Vaccine wird der Inhalt eines Glasgefäßes mit 0,5 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung oder 5prozentiger
wäßriger Rohrzuckerlösung versetzt und tropfenweise in die Nasenlöcher gegeben.
Klinische Versuche wurden an 24 freiwilligen Versuchspersonen durchgeführt. Jede Versuchsperson erhielt zweimal in einem Abstand
von 11 bis 14 Tagen intranasal die frisch hergestellte Vaccine mit dem Stamm R 75 (ATCC VR789). Den Versuchspersonen
509832/100 7
- 23 -
werden 5 Tropfen der Vaccine pro Nase in jedes Nasenloch in
physiologischer Kochsalzlösung mit einer Viruskonzentration
7 8
von 10 ' EIDj-- verabfolgt. Die serologischen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.
von 10 ' EIDj-- verabfolgt. Die serologischen Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengefaßt.
| Tabelle V | 256 | Serumtiter (HI) nach | |
| Versuchs | Serumtiter (HI) vor der | 16 | der zweiten Impfung |
| person | Impfung | 16 | ■ 256 |
| L 1 |
<4 | 32 | |
| 2 | 16 | ,32 | |
| 3 | 8 | 32 | |
| 5 | <4 | 32 | |
| 9 | <4 | 32 | |
| 13 | 16 | - 16 | |
| 23 | 4 | 64 | |
| 25 | 16 | 64 | |
| 27 | 4' | 32 | |
| 28 | 16 | 64 | |
| 29 | 8 | . 32 | |
| 30 | 8 | ' 64 | |
| 32 | 128 | 128 | |
| 35 | 8 | 32 | |
| 36 | 64 | 1 28 | |
| 37 | 4 | 16 | |
| 40 | 16 | >256 | |
| 43 | 64 | 16 | |
| 47 | 4 | 32 | |
| 49 | 4 | 64 | |
| 59 | <4 | 64 | |
| 63 | 64 | ||
| 65 | 16 | ||
| 66 |
Serokonversion (vierfache Zunahme des HI-Titers) wird bei 75 % der Versuchspersonen beobachtet, die vor der Impfung einen
HI-Titer von «== 16 aufwiesen.
Beispiel -11
Suspensionen von Influenza-B-Viren Stamm R 75 (ATCC VR789) und
Influenza-A-Viren Stamm Alice (ATCC VR776) werden vermischt/
bis zu einer Endkonzentration von 5 % mit Pepton als Stabilisa-
L -I
509832/100 7
- 2k -
tor versetzt und in 3 ml fassende Glasgefäße bis zu einer
7
Konzentration von mindestens 10 EID für jedes Virus gefüllt.
Konzentration von mindestens 10 EID für jedes Virus gefüllt.
Sodann wird das Gemisch gefriergetrocknet, und die Glasgefäße werden dicht verschlossen. Zur Herstellung der Vaccine wird der
Inhalt eines Gefäßes mit 0,5 ml Wasser oder physiologischer Kochsalzlösung oder 5prozentiger wäßriger Rohrzuckerlösung
versetzt und tropfenweise in die Nasenlöcher verabfolgt.
509832/1007
Claims (11)
- rfj Attenuierte Influenza-B-Virus-Rekombinante, hergestellt aus einem attenuierten und zur Herstellung eines Impfstoffes geeigneten Influenza-B-Viren-Stamm und einem InfIuenza-B-Virus-Isolat, wobei die Relcombinante mindestens eine Merkmaleigenschaft des attenuier.ten Elternstammes besitzt, die sich vom anderen Elternstamm biologisch und antigenetisch unterscheidet.
- 2. Rekombinante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der attenuierte Elternstamm das Influenza-B-Virus Stamm Brigit (ATCC VR786) ist.
- 3. Rekombinante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombinante das Influenza-B-Virus Stamm R 22 (ATCC VR788) ist.
- 4. Rekombinante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombinante das Influenza-B-Virus Stamm R 5 (ATCC VR787> ist.
- 5. Rekombinante nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Rekombinante das Influenza-B-Virus Stamm R 75 (ATCC VR789) ist.
- 6. Verfahren zur Herstellung der Rekombinante nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einem üblichen, zur Vermehrung-von Influenza—B—Viren geeigneten Substrat attenuierte und509832/1007zur Herstellung eines Impfstoffes geeignete Influenza-B-Viren mit einem Influenza-B-Virus-Isolat rekombiniert und durch Selektionsdruck eine Rekombinante isoliert, bei der mindestens eine Merkmaleigenschaft vom attenuierten Elternstamm stammt, die sich vom anderen Elternstamm biologisch und antigenetisch unterscheidet.
- 7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als attenuierte Influenza-B-Viren Viren des Stammes Brigit (ATCC VR786) verwendet.
- 8. Verfahren nach Anspruch 6 und 7» dadurch gekennzeichnet, daß man die Rekombination in der Allantoishöhle von Bruteiern durchführt.
- 9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Influenza-B-Virus-Isolat Viren des Stammes Hongkong/8/73 (ATCC VR792) verwendet und als Rekombinante den Stamm R 5 (ATCC V&787) isoliert.
- 10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Influenza—B—Virus—Isolat Viren des Stammes Hongkong/5/ 72 (ATCC VR791) verwendet und als Rekombinante den Stamm R 22 (ATCC VR788) isoliert.
- 11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Influenza-B-Virus-Isolat Viren des Stammes Hongkong/5/ 72 (ATCC VR791) verwendet und als Rekombinante den Stamm R 75509832/100712, Xnfluenza-B-Virus-Lebendvaccine, gekennzeichnet durch
einen Gehalt an einer attenuierten Influenza—B-Virus-Rekombinante gemäß Anspruch 1, gegebenenfalls einer attenuierten Influenza-A-Virus-Lebendvaceine und gegebenenfalls Pepton oder
Rohrzucker als Stabilisator,13* Lebendvaccine nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das attenuierte Influenza-A-Virus der Stamm Alice (ATCC
VR776) ist.lh, Vei-faliren zur Herstellung der Influenza-B-Virus-Lebend-,vaccine nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man eine attenuierte Influenza-B-Virus-Rekombinante gemäß Anspruch 1
nach üblichen Methoden vermehrt und konserviert,15· Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Vermehrung in der Allantoishöhle von Bruteiern durchführt .16, Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lebendvaccine mit Pepton oder Rohrzucker als Stabilisator versetzt.509832/1007
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