DK141926B - Fremgangsmåde til fremstilling af en svækket influenzavirusstamme. - Google Patents

Description

(11) FREMLÆGGELSESSKRIFT 1926 DANMARK <6” lntcl·3 CA " «„»«i;« §(21) Ansøgning nr. 97/75 (22) Indleveret den 1 6· Jan. 1975 (23) Løbedag 16. Jan. 1975 (44) Ansøgningen fremlagt og „ fremlæggelsesekrlftet offentliggjort den 21· JU1. I you DIREKTORATET FOR t ^ Λ u . .

PATENT-OG VAREMÆRKEVÆSENET <30> Prioritet begæret fra den

4. feb. 1974, 439176, US

(71) RECHERCHE ET INDUSTRIE THERAPEUTIQUES R.I.T., rue du Tilleul, 13, B-T320 Genval, BE.

(72) Opfinder: Julien Peetermans, avenue Herman, 6, 1330 Rixensart, BE: Mi5*1 chele Lobmann, rue de Morimont, 30, 1341 Ceroux-Mousty, BE: Jean-Marie PrevosT, avenue Paul Hymans, 6, 1200 Bruxelles, BE: Emil Vascoboi= nlc, avenue des Eperviers, 90, 1150 Bruxelles, BE.

(74) Fuldmægtig under sagene behandling:

Firmaet Chas. Hude.

(54) Fremgangsmåde til fremstilling af en svækket influenzavirusstamme.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af en svækket influenzavirusstamme, der er værdifuld til vaccineanvendelse ved nasal administration, ved hvilken en svækket influenzavirusstamme rekombineres med et influenzavirusisolat^og er ejendommelig ved det i kravets kendetegnende del anførte.

Beskyttelse mod virusrespirationsinfektioner har vist sig at have en sammenhæng med nærværelsen af en lokal immunitet i respirationsslimhinden. Dette forhold har Rossen et al. for nylig redegjort for 141926 2 (Progr. Med. Virol. 1971, 13, 194) .

I de senere år er der blevet gjort adskillige forsøg på at fremkalde immunitet overfor influenza ved nasal applikation af inaktiverede vacciner (se f.eks.: Waldman et al. Nature, 1968, 218, 594; Jama 1969, 207, 520; WHO Bull. 1969, _41, 543). Resultaterne var imidlertid uholdbare, og dette kan muligvis skyldes den utilstrækkelige stimulering af immunitetssystemet med det inaktiverede antigen (Tyrrell et al. J. Hyg. 1970, 6j3, 359) .

Der kendes levende influenza type B virusvacciner, men disse giver vidt forskellige beskyttelsesgrader, og der er blevet gjort talrige forsøg på at reducere virusets patogenicitet, f.eks. ved serieoverførsler til æg (se f.eks. A. A. Smorodintsev, Proc. Symposium on Acute respiratory Diseases, Zagreb 1969, 391-404) eller ved at anvende lavtemperaturmutanter (F. M. Davenport et al. Proc. Symposium on Live Influenza Vaccines, Zagreb 1971, 105-113).

Rekombination af influenza type B virusstammer er også nævnt i litteraturen (se f.eks. E. D. Kilbourne i Progr. Med. Virol. 5, 79-126, 1963).

Som angivet af f.eks. G.C. Schild et al. i Brit. Med. J. _4, 127-131, 1973, er antigeniske variationer i dets overfladeantigener én af influenzavirusets allervigtigste egenskaber og en egenskab, som giver mange problemer i forbindelse med influenzakontrollen ved vaccination.

Formålet med opfindelsen er at forbedre fremstillingen af svækket influenzavirusstamme,der er værdifuld til vaccineanvendelse ved nasal administration,og som kan opnås ved rekombination af en svækket virusstamme med et virulent virusisolat ved at forbedre trinet til isolering af en passende rekombinant.

Når to vira får lov til at rekombinere, indeholder mediet til slut en blanding af forskellige vira, som er hver af moderviraene plus ikke blot én enkelt rekombinant, men en række rekombinanter. Ifølge den kendte teknik elimineres moderviraene fra mediet den ene, (dvs. den svækkede), ved tilsætning af et specifikt antiserum og den anden, (dvs. den patogene), på grund af, at den har dårlig vækstevne, men rekombinanterne er stadig til stede, og de isoleres (dvs. dones) ved 141926 3 hjælp af slutfortyndingsmetoden. Spørgsmålet er så at vælge en re-kombinant, som er et velegnet emne til vaccinefremstilling.

Ifølge den kendte teknik undersøges rekombinanterne for en eller flere egenskaber og valget sker på basis af resultaterne fra disse undersøgelser. Ifølge opfindelsen derimod anbringes rekombinanterne under forhold (dvs. selektivt tryk), som er valgt således, at kun rekombinanterne, som udviser passende egenskaber, vil udvikle sig: Udvælgelsesbetingelserne er bestemt ved hjælp af de specifikke egenskaber for hver modervirus i forhold til den anden modervirus.

Fordelen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er i væsentlig grad at begrænse antallet af rekombinanter, som skal undersøges yderligere, og at isolere de mest velegnede rekombinanter direkte.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer rekombination af en svækket vaccine-influenza type B virusstamme med et influenza type B virusisolat og isolering ved selektivt tryk af en rekombinant med mindst en mærkeegenskab af den svækkede moderstammes egenskaber, som ikke deles af den anden moderstamme og det antigene materiale af den anden moderstamme.

Det ovenfor anvendte udtryk "virusisolat" betyder enhver vild pato-genisk stammevariant, som findes i verden og derpå isoleres.

Den svækkede type B influenzastamme og vaccinestamme er mere specielt en stamme, der heri betegnes som Brigit-stammen (deponeret i American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville Md 20852 under deponeringsnummeret ATCC VR786), og som er blevet opnået ved at overføre influenza B/Rusland/69 stammen (ATCC VR790) til den allantoiske hulhed i embryonerede æg i nærværelse af svine-serum, indtil der derfra isoleres en svækket vaccineinfluenzatype B virusstamme, som: - er fuldstændig modstandsdygtig overfor seruminhibitorer, - har en positiv AOS (allantoic on shell) mærkeegenskab (titrering på "allantoic membrane on shell" er beskrevet af S. Fazekas de St. Groth og D. O. White i J. Hyg. 56; 151-162, 1958), idet nævnte AOS-mærkeegenskab heri skal defineres som forholdet af den æginfi- 141926 4 cerende dosis i 50% af de podede æg til den inficerende dosis i 50% af de podede allantoiske membraner på skal, dvs. EIDgg/(AOS) ID™, idet nævnte AOS mærkeegenskab betragtes som positiv, når -3° 2 5 nævnte forhold er mindst 10 ' , - er antigenisk uden bivirkninger på fritter

- udviser positiv hæmagglutinin termosensitivitet ved 60°C

- udviser ustabil hæmagglutination af røde blodceller fra får ved 30°C.

Influenzavirusrekombination og valg af rekombinanter kan sammenfattes som følger, idet skemaet kan anvendes til enhver rekombination og ethvert rekombinant valg. Fra teknikken er det kendt, at overfladeantigenerne (dvs. neuraminidase og hemagglutinin) bestemmer serotypen af stammen.

Reaktanter S tarme I Stanrne II

I_I

Trin rekarbination i-i-1-1-1-1

Udbytte Virus I X rekombinanter Y rékarbinanter Z rekonbinanter Virus II

med overflade- ned overflade- med ét overf laantigener af antigener af deantigen af I

virus I virus II og det andet overfladeanti- I _,__l_951135 ?__1

Trin behandling med anti-I serum _i_

i I

' Udbytte Y rekombinanter med virus II

overfladeantigenerne af stamme ΓΕ

Af dette skema fremgår det, at det altid er nødvendigt at have en behandling med et antiserum for samtidigt at eliminere I moderstammen og rekombinanterne, som er antigenisk beslægtede med I.

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er stamme I ATCC VR-786 stammen, stamme II er stammeisolatet, og det ovennævnte skema må kompletteres med det følgende.

5 U1926

Reaktanter Y rekcrrfoinanter med virus stamme II (dvs.

overfladeantigenerne stamreisolatet) af stamme II (dvs. s tammeisolatet) 1-1--1

Trin Selektivt tryk til tilladelse til

Brigit virustype kulturvsdcst (eksemplerne er vsdcst på AOS, hemag-glutininteimosensitivitet, behandling i nærværelse af normal serum)

Udbytte Y rekcnbinanter med overfladeanti generne af stamreisolatet og mindst et mærke af Brigit (dvs. vaicst på AOS og/eller vækst i nærværelse af normal serum, hvilket betyder modstandsdygtighed overfor normale serumirihibitorer).

Ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde gennemføres rekombinationstrinnet i et hvilket som helst i teknikken kendt substrat til at acceptere væksten af influenza type B virus, f.eks. embryoneret hønseægmateriale eller foetal bovin nyrevævkultur, specielt embryone-rede hønseægs allantoiske hulhed. Rekombinationen kan gennemføres med en hvilken som helst ønsket type B virusisolat, specielt et hidtil ukendt isolat såsom B/Hong Kong/5/72 (ATGC VR791) isolatet eller B/Hong Kong/8/73 (ATCC VR792) isolatet.

De således opnåede rekombinantstammer kan naturligvis blive klonet eller underkastet adskillige fortyndingsoverførsler,uden at det væsentlige ved den foreliggende opfindelse derved modificeres.

Rekombinanterne opnået ifølge denne opfindelse fra Brigit-stamraen (ATCC VR786) med enten B/HK/5/72- (ATCC VR791) eller B/HK/8/73-(ATCC VR792) Isolatet er blevet tilskrevet henholdsvis influenzatype B virus R 22 stamme-(ATCC VR788), R 5 stamme-(ATCC VR787) og R 75 stamme-(ATCC VR789) betegnelsen. Stammerne Rj-, R22 og Ry^ er hidtil ukendte.

Virusrekombinanterne opnået ved hjælp af fremgangsmåden Ifølge den foreliggende opfindelse er ikke-patogene, immunogene og værdifulde til fremstilling af Influenza type B levende virusvaccine, idet der dertil anvendes enhver teknik, der kendes til fremstilling og/eller stabilisering af levende influenzavirusvaccine.

Fremgangsmåden til fremstilling af en sådan svækket influenzavirusvaccine fås ved, at man lader en influenza type B virusstamme op- 141926 6 nået ved hjælp af den ovenfor beskrevne fremgangsmåde udvikle sig i embryonerede hønseægs allantoiske hulhed i et tidsrum, som er tilstrækkeligt til at tillade vækst af en stor mængde af nævnte virus, og udvinder det resulterende virusmateriale.

De således opnåede svækkede influenzavirusvacciner administreres to-pisk i næsesvælgrummet i en effektiv dosisenhed (dvs. mindst 10 EIDj-q virus), idet nævnte administration eventuelt gentages hvis og hvor, det er nødvendigt.

Til vaccinationsbrug holdes viruset fortrinsvis i frysetørret form, og vaccinen tilberedes til brugen ved tilsætning af enten vand eller et andet farmaceutisk fortyndingsmiddel eller -produkt, som kan anvendes til fremstilling af næsepræparater, såsom dråber eller sprøjtepræparater. I vaccinen kan der naturligvis indgå et stabiliseringsmiddel, såsom f.eks. pepton, sucrose eller andre kendte stabilisatorer.

Ifølge en anden udførelsesform for vaccinen kan den ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde opnåede influenza type B virusstamme forenes med influenza type A virusvacciner, der kan administreres ad nasal vej.

Fremgangsmåde til fremstilling af en levende influenzavirusvaccine til nasal administration, hvor den virksomme bestanddel omfatter mindst en effektiv mængde af en svækket influenzatype B virusstamme rekombinant, fås ved dyrkning i et substrat, der er kendt for at acceptere vækst af influenza type B virus, f.eks. embryonerede hønseæg eller foetal bovin nyrevævskultur og fortrinsvis embryonerede hønseægs allantoiske hulhed. Til fremstilling af den til vaccinen anvendte rekombinant rekombinerer man en svækket vaccineinfluenza type B virusstamme ATCC VR786 (Brigit-stamme) med et influenza type B virusisolat, f.eks. B/HK/5/72 (ATCC VR791) isolatet eller B/HK/8/73 (ATCC VR792) isolatet, ved selektivt tryk isolerer en rekombinant, f.eks. influenza type B virus R 22 stammen (ATCC VR788) eller R 75 stammen (ATCC VR789) eller R 5 stammen (ATCC VR787), med mindst én af den svækkede moderstammes mærkeegenskaber, som ikke deles af den anden moderstamme, og den anden moderstammes antigeniske sammensætning, tilladerat nævnte rekombinant dyrkes på embryonerede hønseægs allantoiske hulhed, og om ønsket dertil 7 141926 sætter en stabilisator, f.eks. pepton eller sucrose, og frysetørrer blandingen.

De følgende eksempler illustrerer, men begrænser på ingen måde den foreliggende opfindelse.

Eksempel 1

En prøve af influenzastammen B/Rusland/69 (AICC VR790) underkastes tre terminal fortyndingsoverførsler på specifikke patogenfri æg til rensning. En prøve fra den sidste overførsel anvendes som basis for fremstillingen af en forsøgsportion, der viser sig at være fri for fugle- eller fjerkræpatogeniske midler, og følsomme overfor serum-inhibitorer, og som udviser restpatogenicitet overfor mennesker. Forskellige fortyndinger (d.v.s. ΙΟ”·*", 10”^, 10-^ og 10“^) af viruspo-dematerialet eller virusbasismaterialet i normalt saltvand blandes med forskellige koncentrationer af steril normal svineserum (ufor-tyndet, 25$ og 5$)»forud i 15 minutter holdt i et kogende vandbad, homogeniseret og centrifugeret ved 2000 omdrejninger per minut i 30 minutter. Den overliggende væske anvendes til det yderligere trin, som består i at inkubere virus/serum-blandingeme ved 37°C i 1 time før podning af 0,2 ml portioner af nævnte blanding i embryonerede hønseægs allantoiske hulhed, idet æggene forud er inkuberet i 8-11 dage ved 37°C og gennemlyst (kun levende æg podes) .

Æggene inkuberes derpå yderligere i et tidsrum varierende fra 20-96 timer.

Efter denne inkubationsperiodes afslutning gennemlyses æggene, og levende æg afkøles til 4°C. Den allantoiske væske fra hver serie levende æg isoleres særskilt og afprøves for nærværelsen af influenzavirus ved hjælp af hæmagglutinationsmetoden. Den udvundne virus dannet ved hjælp af podestoffet fra den største virusfortynding i nærværelse af den højeste serumkoncentration,spm viser hæmagglutina-tionsaktivitet (d.v.s. virusfortynding 10“6 og serumkoncentration på 25$),anvendes til en anden overførsel gennemført under de samme betingelser.

Der gennemføres i alt 5 overførsler som beskrevet ovenfor.

Den efter 5 overførsler høstede virus fremstillet ved hjælp af podestoffet fra den største virusfortynding (d.v.s. 10“^) i nærværelse af den ufortyndede serum udviste hæmagglutinationsaktivitet og er modstandsdygtig overfor seruminhibitorer.

141926 8

Tre yderligere overførsler ved terminal fortynding gennemføres i fraværelse af serum for at klone den opnåede modstandsdygtige mutant og efterprøve stabiliteten af modstandsdygtighedskarakteren. Den ved hver af disse tre overførsler høstede virus er modstandsdygtig overfor normal seruminhibitorerne. Viruset ved den sidste overførselkoncentration benævnt "Brigit" og deponeret ved ATCC under deponeringsnummeret VR786 anvendes som podestof ved fremstillingen af en viruspodningsportion. De høstede allantoiske væsker opsamles derpå og forenes, sterilitet og sikkerhed bestemmes, hvorefter der blandes med pepton til opnåelse af en slutkoncentration på 5$ pepton. 0,5 ml af virussuspensionen fordeles i 3 ml hætteglas og frysetørres til opnåelse af Brigit-stammeportionen (ATCC VR786).

In vitro og in vivo egenskaber for den modificerede virus (Brigit-stammen]_.

1) Inhibitormodstandsdygtighed

Til bestemmelse af modstandsdygtigheden overfor inhibitorerne, som findes i normal opvarmet dyreserum (forud opvarmet til 75°C i 1 time) blev seriedobbeltfortyndinger af de opvarmede sera blandet med 4 hæmagglutineringsenheder af moderstammen og den modificerede virus. Efter 1 times inkubation ved stuetemperatur blev røde blodceller fra høns tilsat og resultaterne noteret. Resultaterne viser en fuldstændig modstandsdygtighed for podningsportionen og for forsøgsportioner fremstillet ud fra denne podningsportion. I den foreliggende 'beskrivelse betegnes denne egenskab som "positiv".

2) Antigenicitet og fraværelse af bivirkninger

En gruppe på 2 fritter blev podet nasalt med 10-10 EID^Q af Brigit-stammen(ATCC VR786). Dyrenes temperatur blev taget daglig i 8 dage efter podning. Der blev ikke konstateret nogen signifikant temperaturstigning (højeste temperatur 39,6°C). En anden gruppe på 2 fritter blev podet nasalt med 10^-10® EID^q af B/Rusland/69 moderstammen (ATCC YR790). To dage efter podningen havde dyrene temperaturer på 40,2°C. Hæmagglutinationsinhibitionsprøver godtgjorde, at den modificerede stamme inducerede et antigenisk svar i fritterne: 14 dage efter nasalpodningen var serumantistoftiteme meget høj blandt de podede dyr (titer: 1/256) i modsætning til den upodede kontrolgruppe (titer: < 1/8).

141926 9 3) Forholdet EID^q/(AOS)ID^q (AOS mærkeegenskab)

Det samme podestof tltreres på embryonerede æg og på det "allantoic membrane on shell"-system (titrering på "allantoic membrane on shell" er beskrevet af S. Fazekas de St. Groth og D. P. White i J. Hyg.

56, 151-162, 1958). EID^0/(AOS)lD^0-forholdet for Brlgit-stammen (ATCC VR786) viste sig at være ^ lO^**’. I den foreliggende beskri- 2 5 velse angives et forhold på 10 som "positivt".

4) __Hæmagglutininthermosensitlvltet Hæmagglutinationsbestemmelse blev gennemført på inficeret allantoisk væske inkuberet i 1 time ved 60°C. Efter en sådan behandling havde Brigit-stammen (ATCC VR786) fuldstændig mistet sin hæmagglutinerings-egenskab. Denne thermosensitivitet betegnes heri som "positiv".

52__Hæmagglutinatlonsprøve medrøde blodceller fra får ved 30°C

En hæmagglutinatlonsprøve blev gennemført med røde blodceller fra får ved 4°C og 30°C. Hæmagglutinationsmønsteret ved 4°C var normalt, hvorimod der ved 30°C var en hurtig eluering, 'således at der ikke blev observeret nogen afgrænset hæmagglutination. Yed undersøgelse 20 timer efter forsøgets begyndelse var hæmagglutinationen fuldstændig forsvundet. Denne egenskab betegnes heri som "ustabil".

Eksempel 2

En prøve type B influenzavirusstamme B/HK/5/72 (A!ECC VR791), hvis hæmagglutination er forskellig fra Brigit-stammens (ATCC VR786), podes i 10-11 dage gamle embryonerede ægs allantoiske hulhed (podestof: 0,2 ml/æg) og underkastes 3 overførsler for at opnå en væsentlig virusmængde. Efter den tredie overførsels afslutning fås en vi-

Q

russuspension, hvis titer er 10 EID^/ml. Portioner (0,2 ml) af den ufortyndede suspension podes i specifikke patogenfri (SPF) embryonerede ægs allantoiske hulhed. Efter inkubation i 2 timer ved 33°C podes portioner (0,2 ml) af en suspension af Brigit-stamme (ATCC VR786) med en titer på ΙΟ^^ΕΙΏ^/πΟ. i de samme æg. Æggene inkuberes derpå i 16 timer ved 33°C,og de allantoiske væsker høstes.

141926 ίο

Portioner (0,25 ml) af anti-Brigit-stamme serum type kaninserum, forud opvarmet til 56°C i 1 time,blandes med det samme volumen normal serum. Portioner (0,25 ml) af denne serumblanding tilsættes til de høstede allantoiske væsker. Denne blanding holdes derpå i 1 time ved 57°C. Embryonerede æg podes med 0,2 ml af den inkuberede blanding (2 æg til hver blanding) og inkuberes i 48 timer ved 33°C. De allantoiske væsker fra hvert podet æg høstes, overføres til embryonerede æg (0,2 ml pr. æg) og inkuberes i 72 timer ved 33°C, idet der anvendes to æg til hver prøve. Efter 72 timers inkubationsperiode høstes de positive allantoiske væsker,og disse undersøges for: - Hæmagglutination af røde blodceller fra får - serotype mod anti-Brigit-serum og mod anti-B/HK/5/72-serum - modstandsdygtighed overfor ikke-specifikke seruminhibitorer - vækst i æg og på AOS (allantoic on shell).

En af de således opnåede virussuspensioner, der som angivet i den følgende tabel I, har serotypen af én moderstamme (B/HK/5/72) og infektionsmønsteret i AOS-systemet og seruminhibitormærkeegenskaben af Brigit-stammen,tilskrives "R 22" betegnelsen (ATCC YR788) og underkastes 2 overførsler på embryonerede hønseæg for at opnå en væsentlig mængde R 22 rekombinantvirus, og den høstede allantoiske væske suppleres med pepton indtil en slutkoncentration på 5i» og frysetørres .

Tabel I

Stamme Serotype Irihibi- EID,-n/ Hæmagglu- 30°C røde

Bri- B/HK/ tormod- (δos) fininther- fåre-blodceller git 5/72 stands- J mosensiti- hæmagglutina- ____dygtighed XJJ50 vitet__tion_

Brigit + - + 4- + ustabil B/HK/5/72 - + - - - stabil

Rekombi- nant + + + - stabil R 22

(ATCC

VR788) ___ _ _

Eksempel 3 141926 11

Ens voluminer af en suspension af influenza virus stammen type B "Brigit" (ATCC VR 786) og stammen B/Hong Eong/8/73 (ATCC VR792) (hvis titer hver er 10^’^ EID^/ml) blandes og forinkuberes i 72 timer ved 4°C. Blandingen podes derpå i to SPE embryonerede ægs allantoiske hulhed (0,2 ml pr. æg). Efter en inkubationsperiode på 16 timer ved 33°C høstes de allantoiske væsker? og der lydbehandles (30 sekunder).

De høstede væsker i ufortyndet tilstand og fortyndet til ΙΟ-·*· og 10"2 får lov til at reagere i 1 time ved 37°C med forskellige opløsninger af anti-Brigit-stamme serotype kaninserum, forud opvarmet til 56°C i 30 minutter. De resulterende blandinger podes på "allantoic on shell"-system og inkuberes i 72 timer ved 37°C. Prøverne fra den sidste positive virusfortynding (lCT ) nummerede 1 til 7.

Infektionstitere og neutralisation ved hjælp af anti-Brigit-serum i AOS-systemet sammenlignes derpå for de 7 prøver og for de to moderstammer.

Prøverne, som ikke neutraliseres ved hjælp af anti-Brigit-serum,og som udviser en (AOS)ID^q titer,som er mindst lig med Brigit-stammens (ATCC VR786),høstes ved den største positive fortynding.

Disse forskellige portioner fortyndes til 10“^ og overføres én gang i SPE-æg.

En af disse virussuspensioner, som viser serotypen og B/Hong Kong/8/72 stammens hæmagglutininthermosensitivitet og Brigit-stammens EID^^/ (AOS)IDfjQ-forhold, får "R 5" betegnelsen (ATCC VR787).

I den følgende tabel II er sammenfattet egenskaberne af rekombinant R 5,og der sammenlignes med egenskaberne for Brigit (ATCC VR786) og B/HK/8/73 (ATCC VR792) moderstammerne.

gabel II

12 U1926

Stamme Serotype EID,-0/ Hæmagglutinin

Brigit B^HK/ (A0S)ID^q thermosensitivitet

Brigit +-+ + B/HK/8/73 -+

Rekombinant R 5 . - + + (AICC VR787) R 5 rekombinanten underkastes to begrænsede fortyndingsoverførsier (i SPE embryonerede hønseæg) for at eliminere eventuelt fugle- eller fJerkræ-adventivmiddel til sidst og én yderligere overførsel for at opnå en væsentlig mængde R 5 rekombinantvirus. Den høstede allantois-ke væske suppleres med pepton indtil en slutkoncentration på 5$ og frysetørres.

Eksempel 4

Med den frysetørrede R 22 stamme (ATCC VR788) opnået i eksempel 2 ’ som podningsportion til vaccineproduktion i stor målestok gennemføres en yderligere overførsel i den allantoiske væske af et andet sæt embryonerede hønseæg, der inkuberes ved 35°C i 3 dage.

De allantoiske væsker høstes, forenes, sterilitet og sikkerhed afprøves, blandes med pepton som stabilisator for at nå en slutkoncentration på 5fo pepton og fordeles i 3 ml hætteglas for at opnå en doseringsenhed (d.v.s. mindst 10^ EID^q virus). Produktet frysetørres, og hætteglassene lukkes eller tilstoppes tæt.

Dette overførselsniveau anvendes som vaccinecharge. gil vaccineadministration tilberedes indholdet af 1 hætteglas ved at tilsætte 0,5 ml vand eller saltvand eller en 5$ sucroseopløsning og administrationen sker som dråber i næseborene.

Alternativt distribueres peptonpræparatet med de allantoiske væsker i større hætteglas for at opnå virusdoseringsenhedsmængden flere gange til fremstilling af tilsvarende multidosisvaccinepræparater.

141926 13

Vaccination med den svækkede type B Influenzavaccine R 22 stamme Materiale_og metoder

Seks frivillige med en HI antistoftiter på under eller lig 32 blev valgt til forsøget. To personer blev udtaget til kontrol. De seks personer fik med 11 til 14 dages mellemrum 2 administrationer af den på bestilling fremstillede vaccine R 22 stamme. Til hver administration fik alle personerne 5 dråber af vaccinen per næsebor (io7’5eid50).

Blodprøver til antistofbestemmelse blev taget på vaccinationsdagen og på den tiende til fjortende dag efter den første podning og på den fjortende dag efter den anden administration. Næsevaskevæsker til lokal antistofbestemmelse blev udtaget den fjortende dag efter den anden podning.

Eliniske_symgtomer

Der blev ikke konstateret symptomer.

T±ri_isisoler;irig Næseprøver blev samlet på dag 3 og 6 hos de seks personer. Alle prøverne forblev negative efter to blindoverførsler i embryonerede æg.

Serologiske resultater og lokal (dvs, nasal) antistoffer.

Fem ud af seks frivillige udviklede enten et serum- eller nasalsvar eller begge dele (nemlig 2 for serum, 2 for lokal og 1 for begge, jf. de med x afmærkede tal).

Resultaterne er sammenfattet i den følgende tabel III.

Tallene er de reciprokke værdier af den sidste aktive fortynding af henholdsvis serummet og af nasalvaskevæskerne.

Tabel III

14 141926

Serumanti- Sertmanti-

Person stoftiter (HI) stoftiter (Hl) lokale anti- lokale antistof- før vaccination efter anden stoftiter før titer efter anden vaccination vaccination vaccination _ (SN)_(SN)_ 1 32 32 <2 24 * 2 8 8 <2 2-4 * 3 32 64* <2 12* 4 8 3235 <2 <2

5 <8 <8 ND ND

6 <8 16* ND 'ND

ND = ikke bestemt HI = hæmagglutinationshæmning SN = serumneutralisationstest.

Eksempel 5

Med det frysetørrede materiale opnået i eksempel 3 (R 5 stamme, ATCC VR787) som podestofportion til produktion af vaccine i stor målestok blev en yderligere overførsel gennemført i den allantoiske væske fra en anden portion embryonerede hønseæg,som inkuberes ved 35°C i 3 dage.

De allantoiske væsker høstes, forenes, sterilitet og sikkerhed afprøves, blandes med pepton som stabilisator for at opnå en slutkon-centration på 5fo pepton og fordeles i 3 ml hætteglas for at opnå en doseringsenhed (d.v.s. mindst 10? EID^q) af virus. Blandingen frysetørres derpå, og hætteglassene lukkes eller tilstoppes tæt.

Dette overførselsniveau anvendes som vaccinecharge. Til vaccineadministration fortyndes indholdet i ét hætteglas ved at tilsætte 0,5 ml vand eller saltvand eller en 5% sucroseopløsning,ag administrationen sker som dråber i næseborene.

Alternativt distribueres allantoisk væske/pepton-præparatet i større hætteglas for at opnå virusdoseringsenhedsmængden flere gange til fremstilling af tilsvarende multidosisvaccinepræparater.

IS 141926

Eksempel 6

Til én doseringsenhed (107,5 EID^0) af den frysetørrede influenza type B virusvaccine (R 22 stamme, ATCC VR788) fremstillet som angi-vet i eksempel 5 tilsættes én doseringsenhed (10'EID^q) levende svækket type A influenzavirus (Alice-stamme, ATCC YR776) i 0,5 ml af en 5$> sucroseopløsning.

Den således opnåede bivalente vaccine administreres som dråber i næseborene og administrationen gentages 14 dage senere. Serokonver-sion for begge komponenter (type B og type A) observeres 16 dage efter den anden administration.

Eksempel 7

En prøve af influenza type B virusstamme B/HK/5/72 (ATCC VR791), hvis hæmagglutination er forskellig fra Brigit-stammens, podes i 10 til 11 dage gamle embryonerede hønseægs allantoiske hulhed (podestof: 0,2 ml/æg), og underkastes tre overførsler for at opnå en væsentlig virusmængde. Efter den tredie overførsel opnås en virus-

Q

suspension, hvis titer er 10 EID^0/ml. Portioner (0,2 ml) af den ufortyndede suspension podes i SPE (specifikke pathogenfri) embryo-nerede ægs allantoiske hulhed. Efter inkubation i 2 timer ved 33°C podes i de samme æg portioner (0,2 ml) af en suspension af Brigit-stamme (opnået i eksempel l) med en titer på 107,^EID^0/ml. Æggene inkuberes derpå i 16 timer ved 33°C,og de allantoiske væsker høstes.

Portioner (0,25 ml) af anti-Brigit-stamme serotype kaninserum forud opvarmet i 1 time til 56°C blandes med portioner (0,25 ml) af den udvundne allantoiske væske. Blandingen holdes derpå i 1 time ved 37°C. Specifikke pathogenfri embryonerede æg podes med 0,2 ml af blandingen og inkuberes i 48 timer ved 33°C. De allantoiske væsker fra hvert podet æg udvindes, overføres i specifikke pathogenfri embryonerede æg (0,2 ml pr. æg) og inkuberes i 72 timer ved 33°C under anvendelse af to æg pr. prøve. Efter de 72 timers inkubationsperiode udvindes de positive allantoiske væsker, og der undersøges for: 16 1419-28 hæmagglutination af røde blodceller fra får - serotype mod anti-Brigit-serum og mod anti-B/HK/5/72 serum - vækst i æg og på AOS (allantoic on shell).

En af de således opnåede virussuspensioner, som viser serotypen af B/HK/5/72 udgangsstammen og infektionsmønsteret for Brigit-udgangs-stammen i AOS-systemet, kaldes R 75 (ATCC VR789).

Den ovennævnte fremgangsmåde til fremstilling af R 75 er den samme, som anvendtes til fremstilling af R 22. Begge stammer er tilsvarende, for så vidt hæmagglutinationen, serotypen og AOS-markers anvendes. De er ikke desto mindre forskellige vedrørende yderligere egenskaber, f.eks. deres serumreaktion i hamstere som angivet i den følgende tabel.

Antigenicitet af R 22-stamme (ATCC VR788) og R 75-stamme (ATCC VR789) R 22 (ATCC VR788) R 75 (ATCC VR789)

Serum anti- ( <8 ' <8 ’ stofti ter (HI) ( <8 16 i 5 hamstere ( <8 8 ( <8 <8 ( <8 <8

Geometrisk middeltiter ~ " ~ "" ~~ ~ ” „ ' " serumreaktion i % „ 0 40

Tallene i denne tabel viser, at der ikke induceres serumreaktion i hamstere ved hjælp af ATCC VR788-stammen, medens en serumreaktion induceres i 40% af hamstrene, der er inoculeret med ATCC VR789.

Den geometriske middeltiter af serum antistoftitre HI er antilogarith-men af det arithmetriske middeltal af de logarithmiske værdier for de forskellige serum antistoftitre. I dette tilfælde blev de logarithmiske værdier beregnet på basis 2 og tallet "<8" blev taget som "0".

Rekombinant R 75 underkastes to overførsler i specifikke pathogenfri embryanerede hønseæg til opnåelse af en væsentlig mængde R 75 rekombinant .

141926 17 I den følgende tabel IV er rekombinantens egenskaber sammenfattet og sammenlignet med Brigit- og Β/ΗΚ/5/72-udgangsstammerne.

Tabel IV

.Stamme Serotype EID-Q/ Hæmagglutinin 30°C røde fåre-

Bri- B/HK/ ('Λης'ίτπ thermosensiti- blodceller hæ- git 5/72 ^ '50 vitet_ magglutination

Brigit + - + + ustabil B/HK/5/72 + - stabil

Rekombinant + + _ stabil R 75

Eksempel 8

De forenede allantoiske væsker opnået i eksempel 7 sterilitets- og sikkerhedsprøves, blandes med pepton som stabilisator for at opnå en slutkoncentration på 5% pepton og fordeles i 3 ml hætteglas for at opnå en doseringsenhed (d.v.s. mindst IO^EID^q) af virus. Blandingen frysetørres derpå,og hætteglassene lukkes eller tilstoppes tæt.

Dette overførselsniveau anvendes som vaccinecharge. Til vaccineadministration tilberedes indholdet af ét hætteglas ved at tilsætte 0,5 ml vand eller saltvand eller en 5$ sucroseopløsning,og administrationen sker som dråber i næseborene.

Kliniske forsøg blev gennemført på 24 frivillige personer. Hver frivillig person fik med 11 til 14 dages mellemrum 2 nasaladministrationer af den til brugen fremstillede vaccine R 75 stamme (ATCC VR789). Ved hver administration fik hver person en viruskoncentra-tion på 10 ’ EID^q af den fremstillede vaccine i saltopløsning (5 dråber i hver næsebor).

De serologiske resultater er sammenfattet i den følgende tabel V.

Tabel V

18 141926

Person Serumtiter (Hl) før Serumtiter (HI) efter _ vaccination_anden vaccination 1 256 256 2 16 52 3 16 32 5 <4 32 9 16 32 13 8 32 23 <4 16 25 <4 64 27 16 64 28 4 32 29 16 64 30 4 32 32 16 64 35 8 128 36 3 52 37 128 128 40 8 16 43 64 ^256 47 4 16 49 16 52 59 64 64 63 4 64 65 4 64 66 <4 16