CS202545B2 - Method of preparing living vaccine from influenza virus for nasal application - Google Patents

Method of preparing living vaccine from influenza virus for nasal application Download PDF

Info

Publication number
CS202545B2
CS202545B2 CS75669A CS66975A CS202545B2 CS 202545 B2 CS202545 B2 CS 202545B2 CS 75669 A CS75669 A CS 75669A CS 66975 A CS66975 A CS 66975A CS 202545 B2 CS202545 B2 CS 202545B2
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
strain
virus
influenza
atcc
attenuated
Prior art date
Application number
CS75669A
Other languages
English (en)
Inventor
Julien Peetermans
Michele Lobmann
Jean-Marie Prevost
Emil Vascoboinic
Original Assignee
Rit Rech Ind Therapeut
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rit Rech Ind Therapeut filed Critical Rit Rech Ind Therapeut
Publication of CS202545B2 publication Critical patent/CS202545B2/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/70—Multivalent vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

. Vynález se týká způsobu přípravy živé vakciny z chřipkového viru pronasální podání, obsahující jako aktivní složku oslabený, ustálený kmen viru chřipky typu B, popřípadě oslabený, ustálený kmen viru chřipky typu A podávatelné nasálně a způsobu . přípravy zmíněné vakcíny z oslabeného, ustáleného viru chřipky. » ·
Bylo prokázáno, že ochrana proti virovým infekcím dýchacích cest souvisí s lokální imunitou respirační sliznice. Tento aspekt byl zpracován v poslední době formou přehledného referátu Rossenem se sp. (Progr. Med. Vi^OjL. 1971, . 13, 194)‘.\V posledních létech bylo učiněno několik pokusů o indukci imunity proti chřipce nasální aplikací Zaktivovaných vakcín (viz . například: Waldman se sp. ·: Nátuře, 1968, 218, 594; JPMA 1969, 207. 520; WHO Bull. 1969, 41, 543). Výsledky byly nejednotné,, bylo to patrně zaviněno nedostatečnou stimulací imunitního systému Zaktivovanými antigeny· (TyreH· se sp.: J. Hyg. 19'70-, 68, 359).
Živé vakcíny viru chřipky typu . B jsou známé, poskyyuuí však variabilní stupeň ochrany. Četné pokusy o’redukci pathogenních vlastností viru byly provedeny například sériovými pasážemi na vejcích (viz například P. P. SmoooOtntsev, Proč. . Symposium on acu.te respirátory Diseases, Zagreb 1969, 391-404) nebo s využitím nízko teplotních mmu-ant (P. · M. Davenpprt se sp. · Proč. Symposium on Live Influenza Vaacines, Zagreb 1971, 105-113). .
V literatuře jé též popsána rekombinace kmenů viru chřipky typu B (viz například E. D. Kilbourne: Progr. Med. Virol. 2, 79-126, 11963). ‘
Jak je uvedeno například G. ·C. Schildem se sp. : Brit. Med. J. 4, 127-31, 197.3, antigenní variace jeho povrchových antigenů je jednou z nejdůležitějších chaaaktteístik viru chřipky a vlastnootí, která přináší četné problémy při pokusech o kontrolu chřipky vakcinací.
Předložený vynález přináší oslabené, ustálené kmeny viru chřipty typu B, cenné pro vakcínové použití nebo způsob jejich přípravy, vyznačující se tím, že virulentní kmen viru chřipky typu В se oslabí natolik,· žetse získá oslabený a vakcínový kmen chřipkového viru typu B, zmíněný oslabený a vakcínový kmen se rekombinuje s izolátem chřipkového viru typu В a rekombinant,mající alespoňj jeden znak vlastnosti oslabeného rodičovského kmene, o který se nepodílí s druhým rodičovským kmenem a antigenní skladbu druhého rodičovského kmene, se izoluje selektivním tlakem. Selektivním tlakem se zde rozumí každá selektivní činnost prováděná virocidem a dovólující přežití virů, které mají jeden nebo více zvláštních dědičných fakto. rů, zatímco viry, které nemají tyto faktory, se eliminují.
Oslabený a vakcínový chřipkový kmen typu В je zvláště kmen uváděný zde také jako Brigit (uložený v americké sbírce typových kultur, 12301 Parklawn Driwe, Rockville Md 20852 pod depositním číslem ATCC VR786) a byl získán pasážováním chřipkového kmene B/Russia/69/ATCC VRT90 v allantoické dutině kuřecích zárodků v přítomnosti vepřového séra až po izolaci oslabeného vakcínového kmene chřipkového viru typu В s následujícími vlastnostmi:
- je zcela resistentní vůči sérovým inhibitorům,
- vykazuje pozitivní znak AÓS (allantoic on shell), (titrace na allantoické membráně na skořápce je popsána S. · Fazekasem, St. Grothem a D. O. Whitem: J. Hyg'. 56. 151-62, 1958),.
- v testech provedených na fretkách je antigenní bez vedlejších účinků,
- vykazuje při 60 °C pozitivní hemagglutininovou thermosensitivitu,
- vykazuje při 30 °C nestabilní hemagglutinaci ovčích erythrocytů.
V uvedeném způsobu přípravy rekombinační stupeň se provádí v kterémkoliv .známém růstovém substrátu chřipkového viru typu B, tj., materiálu kuřecích zárodků nebo na tkáňové kultuře ledvin hovězího plodu, zvláště v allantoické dutině kuřecích zárodků. Rekombinaci lze provést s kterýmkoliv Žádaným izolátem viru typu B, zvláště s novým izolátem B/Hong Kong/5/72 (ATCC VR79I) nebo B/Hong Kong/8/7/73 (ATCC VR792)./
Takto získané rekombinované kmeny.mohou být klonovány nebo podrobeny několika dilučním pasážím, aniž by byla měněna podstata vynálezu.
Rekombinanty získané podle tohoto vynálezu z kmene Brigit (ATCC 7R786) buč s izolátem B/HK/5/72 (ATCC VR79D, nebo s izolátem Β/ΗΚ/Θ/73 (ATCC VR792) byly určeny jako kmen chřipkového viru typu В R 22 (ATCC VR788), kmen R 5 (ATCC VR787) a kmen R 75 (ATCC VR789).
Rekombinanty viru získané způsobem přípravy podle vynálezu jsou nepathogenní, imunogenní, cenné pro přípravu živé.vakcíny chřipkového viru typu В za použití kteréhokoliv známého postupu přípravy živé vakcíny chřipkového viru a/nebo její stabilizace. V důsledku toho se vynález týká také oslabené vakcíny chřipkového viru typu, obsahující alespoň jeden zmíněný rekombinant chřipky typu В a způsobu přípravy zmíněné vakcíny z tohoto rekombinantu.
V souhlase s tímto, vynález se týká způsobu přípravy vakcíny z oslabeného chřipkového viru; vyznačujícího se tím, že kmen chřipkového viru typu B, získaný výše uvedeným postupem se nechá růst v allantoické dutině kuřecích zárodků po dostatečnou dobu umožňující růst velkého množství viru a získání rezultujícího virového materiálu.
Takto získané vakcíny oslabeného viru chřipky se aplikují místně v nosohltanu v účinné dávkovači' jednotce (tj. alespoň 10 ΕΙΏ^θ viru)^ zmíněné podání se v případě potřeby opakuje.
Pro vakcínové využití se udržuje vir s výhodou ve formě lýofilizátu a vakcína se rekonstituuje v případě potřeby přidáním vody nebo jiného farmaceutického rozpouštědla nebo směsi, známých pro přípravu nasálních preparátů, jako jsou kapky nebo spray. Vakcínové forma může samozřejmě obsahovat stabilizátor,jako je například pepton, cukr a další známé používané látky. ' ’
V souhlase s jiným znakem vynálezu, kmen chřipkového viru typu B, získaný výše popsaným postupem, může být kombinován s vakcínou chřipkového viru typu A, aplikovatelnou nasálně.
Vynález se tedy týká způsobu přípravy živé vakcíny z chřipkového viru pro nasální podávání, jejíž aktivní složka obsahuje alespoň účinné množství rekombinantu oslabeného kmene chřipkového viru typu B, vyznačující se tím, že se rekombinuje ve známém růstovém substrátu chřipkového viru typu B, tj. v kuřecíph zárodcích nebo v tkáňové kultuře z ledvin hovězího plodu, s výhodou v allantoické dutině kuřecích zárodků/oslabený a vakcínový kmen chřipkového viru typu B, tj. kmen Brigit chřipkového viru typu В (ATCC VR786) s izolátem chřipkového viru typu B, tj. s izolátem B/HK/5/72 (ATCC VR791) nebo s B/HK/8/73 (ATCC VRT92) a rekombinant, tj. kmen chřipkového viru typu В R 22 (ATCC VR788) nebo kmen R 75 (ATCC VR789) nebo kmen R 5 (ATCC VR787)>mající alespoň jeden znak vlastnosti oslabeného rodičovského kmene, který nesdílí s druhým rodičovským kmenem a antigenní skladbu druhého rodičovského kmene, se izoluje selektivním tlakem, zmíněný rekombinant se ponechá růst v allantoické dutině kuřecích zárodků a je-li to třeba, přidá se stabilizátor a směs se zlyofilizuje.
Následující příklady vynález ilustrují, aniž by jej omezovaly.
Přikladl
Vzorek kmene chřipky,B/Russia/69 (ATCC VR790) se podrobí třem konečným, dilučriím pasážím s cílem přečištění na vejcích prostých specifických pathogenů. Vzorek poslední pasáže se použije jako, inokulum pro přípravu pokusné šarže, která byla shledána prostou pathogenních ptačích činidel a citlivou vůči sérovým inhibitorům a vykazující residuální pathogeni—1 —3 —5 -7 tu pro člověka. Různé koncentrace (tj. 10 , 10 , 10 ' a 10 ') inokulačního virového materiálu v solném roztoku se mísí s různými koncentracemi sterilního vepřového séra (neředěného, 25 % a 5 %)', vystaveného předtím po dobu 15 minut teplotě vroucí vodní lázně, homogenizovaného a odstředěného při 2 000 ot./min. po dobu 30 minut. Filtrát se použije pro další stupeň, který spočívá v inkubaci směsi vir,· sérum 1 hodinu při 37 °C před inokulaci 0,2 ml této směsi do allantoické dutiny vajec s kuřecími zárodky předtím inkubovaných po 8 až 11 dní při 37 °C a filtrovaných přes svíčku (inokulována byla pouze přežívající vejce). Vejce se potom inkubují dále po dobu pohybující se mezi 24 a 96 hodinami.
Po skončené inkubaci se provede filtrace na svíčce a přežívající vejce se ochladí na x 4 °C. Allantoické tekutina ze všech sérií přežívajících vajec se izoluje odděleně a testuje hemagglutinační methodou na přítomnost viru chřipky. Izolovaný vir, produkovaný inokulem největšího virového ředění, v přítomnosti největší sérové koncentrace, vykazující hemagglutinační aktivitu (tj. virové zředění 10_í>, sérová koncentrace 25 %) se užije pro druhé pasážování provedené za stejných pracovních podmínek.
Postupem uvedeným výše se provede celkem 5 pasáží.
Vir, izolovaný po 5 pasážích, produkovaný inokulem největšího zředění viru (tj. 10”°) v přítomnosti neředěného séra, vykazuje hemagglutinační aktivitu a je resistentní vůči sérovým inhibitorům.
Tři další pasáže při konečném zředění se provádějí v nepřítomnosti séra s cílem klonovat resistentní mutantu a stabilizovat její resistentní charakter. Vir získaný z každé těchto tří pasáží je resistentní vůči inhibitorům normálního séra. Vir poslední pasážové hladiny pojmenovaný Brigit” a deponovaný v ATCC pod depositním číslem VR786, se užije jako inokulum pro přípravu šarže virového inokula. Získané allantoické tekutiny se shromáždí a slijí, otestují na sterilitu a bezpečnost, smísí s peptonem, až se dosáhne konečná koncentraci 5 % peptonu. Objem 0,5 ml virové suspenze se naplní do 3 ml lahviček, lyofilizujě se a získá se šarže Brigit kmene (ATCC VR786).
Charakteristiky modifikovaného viru (Brigit kmen) in ·vitro a in-vivo: ..
1) Inhibitorová resistence' s * ' .·
Pro hodnoceni resistence vůči inhibitorům, přitomrým v normálním, ohřátém- ·živočišném séru (ohřátém předtím 1 hodinu na 75 °C), sériová dvojnásobná zředění ohřátých , ·sér byla · smíchaná se 4 he^e^^gil^ttinační^mi jednotkami · rodičovského· kmene a· . modifikovrnéht viru. Po in, kubaci po dobu 1 hodiny za normální teploty, byly přidány kuřecí erythrocyty ·a výsledky hodnoceny. · Výsledky ukazují, úplnou resistenci u inokulační šarže i u pokusných šarží z inokulační šarže · připravených. V předložené speecfikaci je eeaeo charakter uváděn jako pozZtivní. .
2) Antigenita a ntpřítoonost vedlejších účinků .
Skupina · dvou fretek byla inokulovina nasálně s 10?-10® EID^q Brrgit kmene (ATCC VRR86·).
Teplota zvířat kontrolována denně · po dobu 8 dní p.i. Nebyl zaznamenán žádný význačn^ší . vzrůst teploty (maximální teplota 39,6 °C). Druhá skupina dvou fretek byla inokulována nasálně 10?-10®· EID^q · rodičovského kmene B/Ruusia/69 (ÁTCC VR790). Dva dny po inokulaci vylkázaXa zvířata teplotu 40,2 °C. Testy, týkající se·inhibice atmoriiuUinact ukázaly, že , mo o dekovaný kmen indukoval antigenní reakci u fretek: 14 dní po nasální inokulaci byly titry sérových protilátek očkovaných zvířat velmi vysoké (titr: 1/256) proti hodnotí konnrolní, neočkované skupiny (tit^?: <11/8).
3) Poměr E^/UOS)]^ (AOS znak) ' . . .
Totéž inokultm se titruje na kuřecích Zárodcích a v systému allantoicki memmrána na skořápce. (Strace na rllanetické membráně · na · skořápce je popsána S. Faztkasto, St. Grotilem a D. O. · Wh tem: J. Hyg. 5) 151-62, 195B.,) · Poměr EID^q/C AOSJID-q pro Brigit kmen (ATCC' VR786) byl na^zen ^1°2 . V předložené speccfikaci je poměr 410214 uváděnjato pozitivní. ,
4) Hemoggluuenační eatroozettittvitr ·
HeeoggluUinační test byl prováděn v infikované allantoické dutině, inkubované 1 hodinu při 60 °C. Po tomto zásahu ΒτΊ.β±^ kmen (ATCC VR786) ztratil zcela htInoaiiuUinrční vlastnost. Tato th^mass^^^i^ je zde označována jako pozitivní.
5) Hemoggluuenaδní test s ovčími eryeaascyey při 30 °C
Heeoggluuenační test byl proveden s ovčími eryearocyey při 4 a 30 °C.
vzorky při 4 °C byly normminí, zatímco při 30 °C docházelo k rychlému vylučování, takže nebylo možné pozorovat jasnou aemariiuUinační hranííci. Pozorováním po 20' hodinách po začátku testu bylo zjištěno, že htmariiuUinact zcela zmizela. Tento charakter je zde · označovin jako nestabilní.
Přřklad2
Vzorek kmene B/HC/5/72 (ATCC VR791) viru chřipky typu B; jehož aemargiuUinin se liší od kmene Brigit (ATCC VRR78), se inokuluje v rllattsické dutině vajec s kuřecími zárodky, starými 10 až 11 dní (inokul um: 0,2 ml/vejce), podrobí se třem pasážím, aby se získalo · poddtatné mn^žtví viru. Na konci pasáže se ztató vir^ov1 suspenze, jejíž titr ·oíioovíí1 W®
EID-q/diI. Odp^d^ící mužství (0,2 m.) neředěné virové suspenze se inokuluje v SPF г11гпetické dutině (prosté specifických paehtienů) kuřecích zárodků. Po inkubaci po dobu 2 hodin při 33 °C se inokuluje do stejrý^ vajec Brigm kmen sus^n^ (ATCC VR786) s ^toem · l0?'4 EID^/oI. Vejce se pak inkubuuí po 16 hodin pří. 33 °C a získájí se allantoické ^kuHny.
Odpovídající množství (0,25 ml) králičího séra sérotypu anti-BrigiVtaieoe, ohřátého předtím 1 hodinu na 56 ’°C 'se smíchá·se · stejným objemem normálního séra. Odpovídající množství (0,25 · ml) této směsi sér še přidá ' k 'získarým · allanOoicýým tekutině. Směs se udržuje po' dobu 1 hodiny při 37 °C. Vejce' · s kuřecími zárodky se invkulují 0,2 mL iikubační sm^í^i (2 vejce na každou směs) a inkubují po dobu 48 hodin při 33 °C, · Z každého inokulovjniého vejce se získají alljitvicCé tekutiny, pasážují v kuřecích zárodcích. (0,2 ml na 1 vejce) a ^kubuj po dobu 72 hodin · pří 33 °C za pouští 2 vajec pro každý vzorek. Po · 72 hodinách inkubace · se získají pozztivií ... al·ljntoicCé tekutiny a vyšetřuj na:
- hej^m^^u^na! ovčích · erythrocytů,
- sérotyp proti anti-Brigit séru a proti anti-B/HV5/72 séru,
- resistecce proti nespecifickým · sérovým inhibioorům, .
- růst ve vejcích .a na AOS (^Ιε^^ί^ά membrána na skořápce).
Jedna z takto získaných virových suspenzí, která má, jak je ukázáno v následníci tabulce · I, ·sérotyp jednoho z rodičů (B/HM5/72) a · infekční znaky v · AOS systému a sérový ichibitorový znak·Brigit kmene je nazván R 22 (ATCC VR788) a podroben 2 pasážím na kuřecích zárodcích, aby ·byla ·získána podstatná mnoosiví · rekombinantu viru R 22} získaná allaitvicCé tekutina je doplněna peptonem až do konečné koncentrace 5 % a lyofiliovvána’. '
T a b u 1 k · a ’ 1 ‘
* Kmen Sérotyp Inhibitor resistecce EID50/ (AOS)ID50 . Hemmaglujinační thermosensi tivita Hemmagiu uinac e ovčích erythrocytů při 30 °C
Brigit • B/НМ 5/72
Brigit + - + + ‘ , + · nestabilní
B/HK/5/72 - + ’ • ( - - - . stabilní .
гeCob^l^na^t - + + - stabilní '
R 22 (ATCC
VR788)
P ř í k 1 a d · 3
Slejcé objemy suspenze Brigit kmene (ATCC VR786) chřipky typu B a •B/Hong Kong/8/73
kmene (ATCC VR792) (titr každého je·10',? ЕИ50/ь1) se smíc^l^e^jí a přediikul^i^;jí po dobu 72
hodin při 4 °C. Směs se potom užije k·inokulaci v allaitoické dutině SPF kuřecích · zárodků (0,2 ml na 1 vejce). Po 16 hodinách inkubační doby · při 33 °C se allaitoické tekutiny izolují a soni^mí po dobu 30 vteřin.
Izolované tekutiny·neředěné a ředěné na hodnoty 10 a 10 se ponechaa! reagovat po dobu 1 hodiny při 37 °C · s různě zředěrým králičím sérem sérotypu arti-Brigit kmene, které bylo předtím zahřáto po dobu 30 minut na teplotu 56 °C. RezMlní! směsi se očk^í na alleil0oickéb systému a inku^uj po dobu 72 hodin při 37 °C. Vzorky posledního pozitivního virového ředění (10“2) se číslují 1 až 7. ,
Titry icfěkčcooti a neutralizace aiti-Brigit sérem v AOS systému pro uvedených 7 vzorků se porovnej se dvěma rodičovskými ^kmeny.
Vzorky, které nejsou neutralizovány acti-Brigit sérem a které výkazu;)! (AOS)IDgO titr alespoň ekvvvalenticí Brigit kmenu (ATCC VR7íB6) se izolují při největším pozitivním zředění.
Tyto jednotlivé, získané vzorky se zředí na 10“^ a í 1x na SPF vejcích.
Jedna z těchto virových suspenzí, vykající sérotyp a · hembagiutiniclovvu therbooseiitivitu kmene B/Hong Kong/8/73 a EHD5q/(A0S)ID50 poměr Brigit kmene, je označena R 5 (ATCC VR777). .
V následující tabulce II jsou shrnuty charakteristiky re.kombinmYtu R 5 a srovnány 8 týmiž .u rodičů Brd-git (ATCC VJR786) a B/HK8/73 . (ATCC ’ VR792). . . t
T a b u 1 k a I I. . · . -
Kmen Λ Sérotyp EID5a/(AOO)lD5a ’ HeInbgglutinační
Brigit 8/73 tuetbossrsiíd.vi'ta
Brigit + - . +. + .
B/HK8/73 . - . + -
^komb^ani R 5 (ATCC VR787) - + + · -
Rekombbnant R 5 je_podrpben dvěma'limioovarým . zředěrým pasážím (v SPF kuřecích zárodcích), aby bylo eliminováno jakékoliv eventuálně Škodlivé . ptačí agens a další pasáži, aby bylo získáno podstatné množssví rekombihantu ' viru R 5. Získaná allentoická tekutina je doplněna peptctnem do finální koncentrace 5 % a lyofilizována.
Příkladě ‘
Vychází se z lyofilizátu získaného v příkladu 1 (tj. Brigit kmene, ATCC VR786) jako inokula. pro přípravu vakcíny ve velkém měěítku, další.pasáž se provede v allantoické tekutině další série kuřecích .zárodků, které jsou inkubovány po 3 dny při 35 °C.
Allantoickétekutiny se získají, slijí, otestují na sterilitu a bezpečnost, smísí s peptonem jako staiilizáOoreb, aby se dosáhla konečná koncentrace peptonu 5 % a distribuují se do 3 ml skleněných lahviček, aby se získalo žádané mncoství jednotek viru (tj. alespoň
10' EID^q). Potom se produkt lyofilizuje a lahvičky se dobře uzavřou. ·
Tato hladina pasáže se užije jako šarže vakcíny. Obsah jedné lahvičky se rekonstituuje přidáním 0,5 ml vody,fyziologického roztoku nebo 5 % cukerného roztoku a podává se ve formě kapek do nosních dutin.
Alternativně, preparáty obsahující allantoické tekutiny a pepton se rozdělí do větších’ skleněných lahviček, aby se získala dávkovači jednotka viru odpoovídaící bmltildVvkovýb preparátům vakcíny.
Vvkcinace oslabbeným chřipkovým virem typu В (kmen Brigit) .
Klinické testy byly prováděny na 46 dobrovolnících s předvakcinačním HI titrem (hemaglt^ut^^niači^ií inhibice) proti chřipkovému viru typu B, nižším nebo rovným 32. Každý dobrovolník došita! dvě intranasální podání v rozmezí 8 nebo 14 dnů. Během každé aplikace dostáváli kmen Brigit s konncmrací 10'· EID^q (5 kapek do každého nosního otvoru čerstvě rekonstruované vakcíny v 5% vodném cukerném roztoku). Změny v séru konstatovány u 40 případů (tj. u 87 % případů); pozorovány jenom mírné klinické reakce (rýma nebo ucpaný nos po dobu 1 až 2 dny). V pokusech, v nichž byly k dispozici koi^^roin^ skupiny, nebyl pozorován přenos vakcíny chřipkového viru.Pokusy o izolaci viru z^krčních nebo nosních výtěrů byly neúspěšné, po dvou slepých pasážích na kuřecích zárodcích zůstávaly vzorky negativní . .
P ř í k 1 a d - 5 * '
Vychází se z lyorlizátu R 22 kmene (ATCC VR778), získaného v příkladu 2 jako šaržového inokula pro přípravu vakcíny ve velkém měřítku, další pasáž se provádí v allantoické tekutině další série kuřecích zárodků, které jsou inkubovány po dobu tří dnů při 35 °C.
Allantoické tekutiny se izolují, slijí, otestují na sterilitu a bezpečnost, smísí
S peptonem jako stabilizátorem, aby se dosáhlo konečné koncentrace'5 % peptonu a distribují 7 se do 3 ml skleněných lahviček, aby se získalo žádané množství viru (tj. alespoň 10' EID^q). Potom se produkt zlyofilizuje a lahvičky se dobře uzavřou.
Tato pasážová hladina se užije jako Šarže vakcíny. Obsah jedné lahvičky se rekonstituuje přidáním 0,5 ml vody, fyziologického nebo 5% cukerného roztoku a podává se ve formě kapek do nosních dutin.
Alternativně se preparáty obsahující allantoické tekutiny s peptonem distribují do větších skleněných lahviček, aby se získalo dávkování jednotek viru, odpovídajících multi-dávkovým preparátům vakcíny.
Vakcinace oslabeným R 22 kmenem vakcíny chřipky typu В
Materiál a metody
Pro pokus zvoleno 6 dobrovolníků s protilátkovým HI titrem nižším nebo rovným 32. Dvě osoby užity jako kontrolní, 6 případů dostávalo v И až 14denních intervale.ch dvě podání čerstvě rekonstituované vakcíny, R 22 kmene. Při každém podání dostávaly všechny osoby 5 kapek vakcíny (10^*^ EID^q).
Vzorky krve pro stanovení protilátek byly odbírány v den vakcinace a 10 a 14 dní po prvé inokulaci a 14 dní po druhém podání. Nosní výtěry pro stanovení místních protilátek byly odbírány 14 dní pó druhé inokulaci.
Klinické symptomy 4
Žádné nebyly zaznamenány.
Izolace viru
Nasální .výtěry byly odbírány 3. a 6. den u tří případů. Po,dvou slepých pasážích v kuřecích zárodcích zůstaly všechny vzorky negativní.
Sérologické výsledky a lokální protilátky
U 5 ze 6 dobrovolníků se neobjevily ani sérové, ani. nasální reakce nebo jejich kombinac e. Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce III.
T a b u 1 к а III
Subjekt Sérový titr (HI) Sérový titr (HI) Lokální protilátky Lokální protilátky
před vakcinací po 2. vakcinaci před vakcinací (SN) po 2. vakcinaci (SN)
1 32 32 ' 2 24
2 8 8 2 2-4
3 32 64 2 12
4 8 32 z 2 2
5 8 8 ND ND
6 8 16 ND ND
ND = nebylo stanoveno
202545 8 · .
P Píklad 6 * ' .
Vvyhází se - z lyofilizátu získaného v- příkladu 3 - -(7 5 kmen, ATCC VR787), jako inokula pro přípravuvakcíny ve velkém měřítku, další pasáž se provádí v allantoické tekutině jiné série kuřecích zárodků, které - jsou inkubovány 3 dny při '35 °C. .
Allantoické.tekutiny se - získají, slijí, otestují na .sterilitu a bezpečnost,-smísí se s peptonem jako stabilZzáoorem, aby se dosáhla konečná koncentrace - 5.% peptonu a distribují . do 3 ml skleněných lahviček, aby se.získalo žádané mtoOžtví jednotek viru (tj. alespoň 10' EIDj0). Směs se potom lyofilizuje, lahvičky zataví nebo - pevně uzavřou.
Tato hladina pasáže se užije jako vakcínová šarže. Pro adninnasraci . vakcíny se obsah jedné lahvičky rekonntituuje přidáním 0,5 ml vody, fyziologického nebo 5% cukerného . roztoku a podává se ve formě kapek do - nosních dutin.’ , Alternativně, preparáty obsahnu^cí allantoické tekutiny a pepton - se distribují do . větších skleněriých lahviček,- aby se - získalo dávkování jednotek viru, odpoovddaících multidávkoiým preparátům vakcíny. Příklad 7
K - jedné dávce vakcíny (Brigit kmen) ATCC VR776), viru - chřipky typu B, připraveného postupem podle příkladu 4, se přidá dávka živého, oslabeného viru chřipky typu A (Alice kmen, ATCC VR776) v 0,5 ml 5% - cukerného vodného roztoku. Takto - získaná bivale^<tní vakcína se podává - jako kapky do. nosních dutin - a podání se po 14 dnech opakuje..
Klinické testy byly provedeny na 22 dobrovoonících maaících předvakcinační HI titr (hemmaginuinační -inhibice) proti viru chřipky - A nebo B, nižší nebo rovný 64. Každý dobrovolník , dostal dvě nasální podání (10?’^ EID^q Brigit kmene a EID^q Alice kmene) s 8 a ^denním intervalem. .
Změny - v séru proti viru chřipky typu A pozorovány u 80 % případů, proti, viru chřipky typu B u 73 %- případů.
Pozorovány jenom mírné klinické reakce. Nepozorován přenos vakcíny viru chřipky. Příklade.
K - jedné -dávce (10?’^ EIDcn) lyofiizoovené vakcíny viru chřipky typu B (7 22 kmen, ATCC
5
VR778), připravené podle příkladu - 5, se přidá jedna dávka (10'*5 eid^q) živého oslabeného viru chřipky typu A (kmen Alice, ATCC VR776) v 0,5 ml 5% cukerného roztoku..
Takto získaná bivalentní vakcína se podává jako kapky do nosních dutin a podání se opakuje o 14 - dní - pozděěi. Změna v séru -pro -oba komppnnnty (typ B a typ A) je pozorována 16 - -dní po druhém podání.’
Příklad 9 -,
Vzorek viru chřipky - typu B kmene B/HK5/72 (ATCC VR791) s odlinrým hemagglutinincm ve srovnání s Brrgit kmenem se inokuluje v allantoické dutině 10 až 11 dní starých vajec s kuřecími zárodky (0,2 ml inokula na 1 vejce) a podrobí se třem pasážím, aby - se získalo podstatné íiožžsví viru. Ke fonci třetí- pasáže se získá virová suspenze, jejíž titr je 10® EID50/m.. část (0,2 ml) neředěné suspenze se- ‘inokuluje v allentoické - dutině SPF vajec a kuřecími zárodky prostých specifických pathžienů); po intobaci po 2 hodinách při 33 °C se inokuluje ve stejných vejcích část (0,2 ml) suspenze kmene Brigit (získaného - v příkladu 1) s ti-treml1 0 KDc^íI.
. . ' . .. ' 9 / . 202545 ·
Vejce se potom inkubují 16 hodin pri-33 °C a získají.se allantoické tekutiny.
t / '' · část (0,25 ml) králičího. séra>, sérotypu kmene an.ti-Brigit, zahřátého předtím · 1 hodinu .. · na 56 °C, se smísí se stejným objemem normmáního . séra. Části (0,25 ml·) této sm^£^:i sér se přidají do získané' allantoické tekutiny. . Směs se potom udržuje 1 .hodinu při 37 °C. SPF vejce s kuřecími zárodky se inokulují 0,2 ml této směsi a inkubují 48 hodin při 33 °C. Allantoické tekutiny každého inkubovaného se izolují, pasážuj v SPF vejcích s kuřecími zárodky (0,2 ml · na 1 vejce) a inkubují 72 hodin . při 33 ' °C,. pouUijí se dvě vejce na jeden vzorek.
Po' 72 hodinách inkubace se izolují·pozitivní allantoické tekutiny a testují se na:
— hemmggiuUinaci ovčích erythrocytů, - — sérotyp proti anti-Brigit séru a proti· anti-B/HK/5/72 séru,’ .
— růst ve vejcích a na AOS (allantoické memibána na .skořápce).
Jedna z takto získaných virových suspenzí, vykazuUící sérotyp B/H//72 rodičovského·kmene a . infekčnost Brrgit rodičovského kmene v AOS systému je nazvána R 75 . (ATCC VR789).
Rekomminant 7 75 je podroben dvěma pasážím v SPF kuřecích zárodcích, aby bylo získáno podstatné mnoožtví rékombínaitu 7 75.
V následnicí tabulce IV je shrnut popis rékombínantu a je porovnán s Brigit a B/HK/5/72 rodiči.
Tabulka IV
Kmen Sérotyp EID50/(AOS) /eemggluUininsvá //mmggiuUinace ovčích
Brigit B//K/5/72 ' _ ID50 thermosensitivita erythrocytů při 30 °C
Brigit + . - · + + ’ nestabilní
В/ШК5/72 - + , - ' - . stabilní
rekombinant - + ·' ' - - · stabilní *
7 75
Př.í.klaao . .. ' . Slité allantoické tekutiny, získané v příkladu 9, jsou otestovány na sterilitu a· bezpečnost, smíseny s peptonem jako staiilisáSoeem s cílem dosáhnout konečnou konneenraci 5 % peptonů a rozděleny do 3 ml skleněných lahviček s cílem připravit dávku viru (tj. alespoň 10^ EID^q). Směs se potom lysOiliiuзe, lahvičky zataví nebo těsně uzavřou.
Tato pasážová hladina se užije jako šarže vakcíny. Před podáním vakcíny se obsah jedné lahvičky rekonnsituuje přidáním'0,5 ml vody nebo fyziologického nebo 5% cukerného roztoku a podává se jako kapky do nosních dutin.
Klinické pokusy byly provedeny na 24 dobrovolnících. Každý dostal v 11 až 14denním intervalu dvě nasální pod&ií čerstvě rekonstruované vakcíny ' kmene 7 75 (ATCC VR779). Při kaž* 7 8 ' dém podáni dootali dobroviSníci virovou konncenraci 10' » ELD^q fyziologického roztoku reksnstiluovaoé vakcíny (5 kapek do . každé nosní · dutiny). . .
' Sér.ologické výsledky jsou shromážděny v následnicí tabulce V.
202545 · 10 '
Tabulka V
PřSpad ’ Sérový titr (HI) před vakcinačS Sérový titr (HI) po.druhé vakcinaci
, 1 , 256 256 ' . ·
2 16 32
. ', · 3 16 32 .
5 . ' ' · <4 32
9 16 32 .
13 <4 32
23 8 16
25 4 4 64
27 . 16 64
28 ’ 4 32
29 16 ' 64
30 4 . ... 32
32 . 16 . 64
35 8 128
36 8 32
37 128 128
40 , 8 16
43 64 <256
47 . 4 . 16
49 16 * 32 ‘
59 64 . 64
63 4 16 .
66 <4 16
Změna v séru'(čtyřnásobný vzrůst · HI titru) byla pozorována·u 75 % případů s předvakcinačním titeem 416.
Pík 1 a dl ,1 ' ·
Suspenze R 75 kmene chřipky typu B (ATCC VR789) a kmen ' Alice chřipky typu A (ATCC VR777), se smísí.s peptonem jako stabilZáátreem·do konečné koncentrace 5 % peptonu a směs ' v · 7 se rozdělí do 3 ml skleněných lahviček, aby obsah každého viru byl alespoň 10’ EID^q. Směs . se lyofilizuje a lahvičky ' se zat^avS nebo pevně uzavřou. Bezprostředně před podáním vakcSny se obsah lahvičky rekonstituuje přidáním 0,5 ml vody, fyziologického roztoku nebo 5½ cukerného roztoku a podává se jako kapky do nosních dutin.

Claims (9)

  1. ’ PŘEDMĚT VYNÁLEZU
    1. Způsob přípravy živé' vakcíny z chřikkového viru pro nasální podávání, jejíž aktivní složka obsahuje alespoň účinné mnnožtvS rekombinantu ,oslabeného kmene chřipkového viru typu B, vyznnčujícS se tím, že se rekombinuje oslabený a vakcSnový kmen chřipkového,viru typu ts v · růstovém substrátu chřipkového viru typu B, jímž je s výhodou matteiál kuřecích zárodků nebo tkáňová'kultura ledvin hovězího plodu a , zejména allantoické dutina kuřecích zárodků, s izolátem chřipkového viru typu B · a selektivním tlakem se izoluje rekombinant, maaící alespoň jeden znak vlastnosti oslabeného rodičovského kmene, který nesdílí s druhým rodičovslýfa kmenem a antigennS skladbu druhého rodičovského kmene a rekombimant se ponechá růst v allantoické dutině kuřecSch zárodká a k viru, je-li to třeba, se přidá stabilizátor a směs se lyofilizuje. . '
    и. 202545
  2. 2. Způsob přípravy podle bodu 1t vyznačující se tím, že oslabený a vakcínový kmen chřipkového viru typu В je kmen Brigit chřipkového viru typu В (ATCC VR7S6).
  3. 3·. Způsob přípravy podle bodu 2, vyznačující se tím, že rekombinace se provádí v allantoické dutině kuřecích zárodků. ' >· _
  4. 4. Způsob přípravy podle bodů 1 a 3, vyznačující se tím, že izolát je B/HK/8/73 izolát (ATCCVR792) a rekombinant je R 5 kmene chřipkového viru typu В (ATCC VR787).
  5. 5. Způsob přípravy podle bodů 1 a 3fvyznačující se tím, Že izolát je B/HK/5/72 izolát (ATCC VR791) a rekombinant je R 22 kmene chřipkového viru typu В (ATCC VR788).
  6. 6. Způsob přípravy podle bodů 1 a 3, vyznačující se tím, že izolát je B/HK/5/72 izolát (ATCC VR791) a' rekombinant je R 75 kmene chřipkového viru typu В (ATCC VR789).
  7. 7. Způsob přípravy podle bodu ý vyznačující se tím, že stabilizátorem je pepton nebo cukr.
  8. 8. Způsob přípravy podle bodu 1, vyznačující se tím, že aktivní složka zahrnuje také účinné množství vakcíny z oslabeného chřipkového viru typu A, které se přidá po získání rekombinantu chřipkového viru typu B.
  9. 9. Způsob přípravy podle bodu 8, vyznačující se tím, že .oslabený chřipkový vir typu A je kmen Alice chřipkového typu A (ATCC VR776).
CS75669A 1974-02-04 1975-02-03 Method of preparing living vaccine from influenza virus for nasal application CS202545B2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US43917674A 1974-02-04 1974-02-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CS202545B2 true CS202545B2 (en) 1981-01-30

Family

ID=23743623

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS75669A CS202545B2 (en) 1974-02-04 1975-02-03 Method of preparing living vaccine from influenza virus for nasal application

Country Status (21)

Country Link
JP (1) JPS50107122A (cs)
AT (1) AT338416B (cs)
BE (1) BE824970A (cs)
CA (1) CA1047922A (cs)
CH (1) CH596316A5 (cs)
CS (1) CS202545B2 (cs)
DD (1) DD116474A5 (cs)
DE (1) DE2504373A1 (cs)
DK (1) DK141926B (cs)
ES (1) ES434384A1 (cs)
FI (1) FI750260A (cs)
FR (1) FR2259616B1 (cs)
GB (1) GB1439742A (cs)
HU (1) HU170522B (cs)
IE (1) IE42043B1 (cs)
IL (1) IL46446A (cs)
LU (1) LU71784A1 (cs)
NL (1) NL7501028A (cs)
NO (1) NO750295L (cs)
SE (1) SE424503B (cs)
ZA (1) ZA75248B (cs)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2588918A (en) * 1947-11-07 1952-03-11 William T Graham Mechanism for raising and lowering plow frames relative to the ground wheels
JPS6042209B2 (ja) * 1974-05-31 1985-09-20 北里研究所（社団法人） インフルエンザウイルスの新鮮分離株を発育鶏卵へ短期間で順化させる方法

Also Published As

Publication number Publication date
NL7501028A (nl) 1975-08-06
IL46446A (en) 1978-01-31
CA1047922A (en) 1979-02-06
FR2259616A1 (cs) 1975-08-29
DD116474A5 (cs) 1975-11-20
ES434384A1 (es) 1976-12-01
GB1439742A (en) 1976-06-16
FI750260A (cs) 1975-08-05
AT338416B (de) 1977-08-25
IE42043B1 (en) 1980-05-21
BE824970A (fr) 1975-07-30
AU7734675A (en) 1976-07-15
DK141926C (cs) 1981-01-19
ZA75248B (en) 1976-01-28
LU71784A1 (cs) 1975-06-24
ATA76675A (de) 1976-12-15
DK9775A (cs) 1975-09-29
NO750295L (cs) 1975-09-01
CH596316A5 (cs) 1978-03-15
SE7500549L (cs) 1975-08-05
JPS50107122A (cs) 1975-08-23
DE2504373A1 (de) 1975-08-07
SE424503B (sv) 1982-07-26
IE42043L (en) 1975-08-04
HU170522B (cs) 1977-06-28
DK141926B (da) 1980-07-21
FR2259616B1 (cs) 1980-01-04
IL46446A0 (en) 1975-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6919084B2 (en) Duck pneumovirus and corresponding vaccines
US4530831A (en) Infectious Bursal Disease vaccine
US4009258A (en) Influenza vaccine containing a recombinant, antigenically hybridized virus and method of using the same
Atanasiu et al. Rabies neutralizing antibody response to different schedules of serum and vaccine inoculations in non-exposed persons: Part 3
US5807551A (en) Method to provide artificial passive immunity in birds
US4302444A (en) Vaccines for immunizing egg-laying birds against Egg Drop disease, preparation of said vaccines, and method of use of said vaccines
HU189222B (en) Process for preparing a new vaccine against infectious bronchytis
IE51122B1 (en) Infectious-bronchitis vaccines for poultry,combined infectious-bronchitis vaccines,process for preparing such vaccines,method for preventing infectious bronchitis,and infectious-bronchitis virus strains
AU705186B2 (en) Multivalent bovine coronavirus vaccine and method of treating bovine coronavirus infection
US3953592A (en) Live influenza virus vaccines and preparation thereof
JP3945842B2 (ja) 弱毒性ニューカッスル病ウイルスワクチン
US20120107354A1 (en) Viral vaccine and process for preparing the same
Minbay et al. An experimental study of the pathogenesis of fowlpox infection in chickens
US3962423A (en) Live influenza type B virus vaccines and preparation thereof
CS199569B2 (en) Method of producing vaccine against influenza
MXPA96003124A (en) Vaccine against the newcastle beni disease virus
CS202545B2 (en) Method of preparing living vaccine from influenza virus for nasal application
EP0009277B1 (en) Combined vaccine active against newcastle disease and egg production drop caused by adeno-like viruses, process for preparing it, adeno-like and newcastle disease virus strains
Crick The vaccination of man and other animals against rabies
US3769400A (en) Process for the manufacture of a live vaccine against the infectious bursitis of chickens
US4554158A (en) Modified live sendai virus vaccine for administering through an aerosol and method of producing the same
JPS62201573A (ja) 家禽用インフルエンザワクチン
JPS6244528B2 (cs)
El-Zanaty et al. VACCINATION AGAINST PARAMYOVIRUS TYPE 1
RU2259844C1 (ru) Вирус-вакцина против ньюкаслской болезни птиц