NO750295L

NO750295L -

Info

Publication number: NO750295L
Application number: NO750295A
Authority: NO
Inventors: J Peetermans; M Lobmann; J-M Prevost; E Vascoboinic
Original assignee: Rit Rech Ind Therapeut
Priority date: 1974-02-04
Filing date: 1975-01-30
Publication date: 1975-09-01
Also published as: AT338416B; ZA75248B; DD116474A5; FR2259616B1; IE42043B1; FI750260A; DK141926B; JPS50107122A; DK9775A; AU7734675A; CA1047922A; ATA76675A; LU71784A1; NL7501028A; IL46446A; CS202545B2; GB1439742A; ES434384A1; CH596316A5; IE42043L

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrorer fremstilling av vevende influensavirus-vaksiner for nasal tilforsel, idet vaksinene som aktiv bestanddel omfatter en svekket stabil type B influensavirus-stamme og eventuelt en svekket stabil type å influensavirus, som kan tilfores ad nasal vei.

Beskyttelse mot virus-respirasjonsinfeksjoner har vist seg å

ha en sammenheng. med nærvær av en lokal immunitet i respirasjons-slimhinnen. Dette forhold har Rossen et al. nylig redgjort for (Progr. Med. Virol. 1971, 1,3, 194).

I de senere år er det blitt gjort adskillige forsok på å

fremkalle immunitet overfor influensa ved nasal tilforsel av inaktiverte vaksiner (se f.eks.: Waldman et al. Natore, 1968,

218, 594s Jarna 1969, 207, 520*\ M0 Bull. 1969, 41, 543,). Resultatene var imidlertid usikre og dette kan muligens skyldes

den utilstrekkelige stimulering av iramunitetssysternet med det inaktiverte antigen (Tyrrell et al. J. Hyg. 1970, 68, 359).

Det kjennes levende influensa type B virusvaksirier, men disse

gir vidt forskjellige beskyttelsesgrader, og det er gjort tallrike forsok på å redusere virusets patogenieitet, f.eks. ved serieoverforsler til egg (se f.eks. A.A. Smorodintsev, Proe. Symposium onAcute respiratory Diseases, Zagreb 1969, 391-404) eller ved å anvende lavtemperaturmutanter (F. M Davenport et al. Proe. Symposium on Live Influenza Vaccines, Zagreb 1971, 105-113).

Rekombinasjon av influensa type B virusstammer er også nevnt i litteraturen (se f.eks.S&D« Kilbourne i Progr. Med. Virol. 5, 79-126, 1963).

Som angitt av f.eks. G.C. Schild et al. i Brit. Wed, J. 4, 127-131, 1973>er antigeniske variasjoner i dets overflate-antigener en av influensavirusets mest viktigste egenskaper dg en egenskap som gir mange problemer i forbindelse med influensa-kohtrollen ved vaksinasjon.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer svekkede stabile influensa type B virusstammer, som er verdifulle for vaksinasjons-anvendelse, ved hjelp av en fremgangsmåte som omfatter svekkelse av en virulent influensa type B virusstamme, inntil der fås en svekket og vaksinasjonsinfluensa type B virusstamme, rekombinering av nevnte svekkede og vaksinasjonsstamme med et influensa type B virusisolat og ved selektivt trykk isolering av en rekombinant med minst en for den svekkede moderstammes egenskaper, som ikke deles av den annen møderstamtea og den antigeniske sammensetning av den annen moderstamme*

Den svekkede type B influensastamrae 6g vaksinasjonsstamme er mer spesielt en stamme, som heri betegnes som Brigit-stammen (deponert i Amerivan Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville Md 20852 under deponeringsnummer ATCC VR 786), og som er blitt oppnådd ved å overf6re influensa B/Russland/69 stammen (ATCC VR790) til allantoinhulen i befruktede honseegg

i nærvær av svineseraca• inntil der derfra isoleres en svekket og vaksinasjons-influensatype B virusstamme, sbms er fullstendig motstandsdyktig overfor serurainhibitorer, - har en positiv AOS (allantoic on shell) merkeegenskap (titrering på "allantoic raembrane on shell" er beskrevet av S. Pazekas de St. Groth og D. 0 White i J. Hyg. 56; 151-162, 1958).

er antigenisk uten bivirkninger på fritter (ildere).

- fremviser positiv hemagglutinin-termosensitivitet ved 60°C - fremviser ustabil hemagglutinasjon av rode blodceller fra sauer ved 30°C.

Ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte gjennpmfpres rekombinasjonstrinnet i et hvilket som helst i teknikken kjent substrat til å akseptere vefesten av influensa type B viitus, f.eks. befruktet honseegg-materiale eller okséfoster-nyrevev-kultur, spesielt allaftcfoin-hulrommet i befruktede hdnseegg. Rekombinasjonen ican gjeai.u>mfores med en hvilken som helst onsket type B virus isolat, spesielt et hittil ukjent isolat så som B/Song Kong/5/72 (ATCC VR791) isolatet eller B/Hong Kong/ 8/73 (ATCC VR792) isolatet.

De således oppnådde rekorabinatstammer kan naturligvis klones eller underkastes adskillige fortynningsoverfdrsler uten at

det vesentlige ved den foreliggende oppfinnelse derved modifiseres.

Rekombinantene oppnådd i henhold til.^oppfinnelsen fra Brigit-stammen (ATCC VR786) med enten B/S5I</5/72~ (ATCC VR 7 91) eller B/HK/8/73- (ATCC VR792) isolatet er blitt tilskrevet henhv. influensatypé B virus R 22 stamme- (ATCC VR788), R 5 stamme-

(ATCC VR787) og R 75 stamme- (ATCC VR789) betegnelsen.

Virusrelcombinantsts oppnådd ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er'iiska patogene, immunogene og verdifulle for fremstilling av influensa type B levende virusvaksine, idet det for dette anvendes en hvilken som helst teknikk, som er kjent for fremstilling og/eller stabilisering av levende influensavirus-vaksine. Den foreliggende oppfinnelse angår fdlgelig fremstilling av svekkede influensa type B virusvaksiner som inneholder minst en slik influensa type B rekombinant.

Ved denne utforelsesform omfatter oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en svekket influensavirus-vaksine, hvor man lar en influensa type B virusstamme oppnådd ved hjelp av den ovenfor beskrevne fremgangsmåte utvikle seg i befruktede honseeggs allantoin-hulrom i et tidsrom som er tilstrekkelig til å tillate vekst av en stor mengde av nevnte virus, og hoster det resulterende virusmaterial.

De således oppnådde svekkede influensavirusvaksiner tilfores topisk.i nesesvelgromraet i en effektiv doseerihet (d.v.s. minst 10 7EH>50 virus), idet nevnte tilforsel eventuelt gjentas hvis og når det er nddvendig.

For vaksinasjonsbruk holdes viruset fortrinnsvis i frysetorret form, og vaksinen tilo^sedes på bestilling ved tilsetning av enten vann eller et annet farmasøytisk fortynningsmiddel eller produkt som kan anvendes for fremstilling av neaepreparater, såsom dråper eller sproytepreparater. I vaksinen kan naturligvis inngå et stabiliserende middel, som f.eks. pepton, sukrose eller andre kjente stabilisatorer..

Ved en annen utforelsesform for oppfinnelsen kan den ved den -ovenfor beskrevne fremgangsmåte oppnådde influensa type B virus stamme forenes med influensa type A virus vaksiner som kan tilfores ad nasal vei.

Den,foreliggende oppfinnelse vedrorer således en fremgangsmåte for fremstilling av en levende in^luensavirus-vaksine for nasal tilfdrsel, hvor den virksomme bestanddel omfatter minst en effektiv mengde av en svekket influensatypé B virusstamme rekombinant, hvor man i et substrat, som er kjént for å akseptere vekst av influensattype B virus, f.eks. embryonerte h5nseegg eller oksefoster-nyrevevskultur og•fortrinnsvis befruktede honseeggs allantoinhulrora, rekombinerer en svekket og vaksinestamme av influensa type B virus, f-røks. influensa type B virus Brigit-stamme (ATCC VR786), med et influensa type B virusisolat, f.eks. B/fcK/5/72 (ATCC VR791) isolatet eller B/HK/8/73 (ATCC VR792) isolatet, ved seléktivttrykk isolerer en rekombinant, f.eks. Influensa type B virus R 22 stammen (ATCC VR788) eller R 75 stai-vuen (ATCC VR789) eller R 5 stammen (ATCC VR787), med minst en asr den svekkede moderstammes raerke-egenskaper, som ikke deles av den annen raoderstamme, og den annen moderstammes antigeniske sammensetning tillater nevnte rekombinant å utfelle seg i befruktede honseeggs allantoin-hulrom, og om onsket dertil tilsetter én stabilisator, f.eks. pepton eller sukrose, og frysé*6rrer blandingen.

De følgende eksempler illustrer den foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 1.

En prove av influensastammen B/Russland/69 (ATCC VR790) underkastes tre terminale fortynningsover for sier på spesifikke patogenfri egg til rensing. En prove fra den siste overførsel anvendes som basis for fremstillingen av en forsøksporsjon, som viser seg å vare fri for fugle- eller fj@rferepatogeniske mid&er, og folsomme overfor serumirihibitorer, og. sam fremviser restpatogenicitet overfor mennesker. «Forskjellige fortynninger 13 5 7 (d.v.s. 10"* , 10"* , 10" og 10*" ) av viruspodematerialet eller virusbasismaterialet i normalt saltvann blandes med forskjellige konsentrasjoner av sterilt normalt svineserum (ufortynnet, 25% og 5%), som på forhånd var holdt 15 minutter i et kokende vannbad, homogenisert og sentrifugert ved 2000 omdreininger pr. minutt i 30 minutter. Den overliggende væske anvendes til det ytterligere trinn, som består i å inkubere virus/serum-blandingene ved 37°C i 1 time for podning av 0,2 ml porsjoner av nevnte blanding i befruktede honseeggs allåntoænhulromå idet eggene på forhånd er inkubert i 8-11 dager ved 37°U og gjennom-lyst (kun overlevende egg podes).

Eggene inkuberes derpå ytterligere i et tidsrom fra 20-96 timer.

Etter avslutning av denne inkubasjonsperiode gjennomlyses eggene, og overlevende egg avkjøles til 4°C. Allantoinvaesken fra hver serie overlevende egg isoleres særskilt og avproves for nærvær av influensavirus ved hj^lp av hemagglutinasjonsmetoden. Det hostede virus dannet ved hjelp av podestoffet fra den høyesjte virusfortynning i nærvær av den høyeste serurakonsentrasjon, som viser hemagglutin«i4ajoasakti vi tet (d.v.s. virusf ortynning 106

og serurakonsentrasjon på 25%) anvendes til den annen overførsel gjennomført under de samme betingelser.

Det gjennomføres i alt 5 overførsler som beskrevet ovenfor.

Det etter 5 overfor sier hostede virus fremstilt ved hjelp av podestoffet fra den høyeste virusfortynning (d.v.s. IO"<6>) i nærvær av det ufortynnede serum, fremviste hemagglutinasjons-aktivitet og er motstandsdyktig overfor seruminhibitorer.

Tre ytterligere overførsler ved terminal fortynning gjennomføres i fravær av serum for å klone den oppnådde motstandsdyktige mutant og etterprøve stabiliteten aV motstandsdyktighetskarakteren. Det ved hver^av disse tre overførsler høstede virus er motstandsdyktig overfor normale seruminhibitorer. Viruset ved

den siste dverførselkonsentrasjon benevnt "Brigit" og deponert vedATCC under deponeringsnummeret VR 760 anvendes som podestoff ved fremstillingen av en viruspodnirx._, spor sjon. De høstede a3]antoénvæsker oppsamles derpå og forenes, sterilitet og sikkerhet bestemmes, hvoretter det blandésfmed peptosa til oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 5% pepton. 0,5 mi av virussuspensjonen fordeles i 3 ml prøveglass og frysetørres til oppnåelse av «Drigit-stammeporsjonen (ATCC VR786).

Egenskaper in vitro.;og vivojgor det modifiserte virus ( BrJgit- stammen).

1) Inhibi£ormotstandsdyktighet.

Por bestemmelse av motstandsdyktighet overfor de inhibitorer som finnes i normalt oppvarmet dyreserum (på forhånd oppvarmet til 75°C il time) ble serie-dobbeltfortynninger av de oppvarmede sera dannet med 4 hemagglutineringsenheter av moderstammen og det modifiserte virus. Etter 1 times inkubasjon ved rom- . temperatur ble rode blodceller fra høns tilsatt og resultatene notert. Resultatene viser en fullstendig motstandsdyktighet for podningsporsjonen og for forsøksporsjoner fremstilt ut fra denne podningsporsjon. I den foreliggende beskrivelse betegnes denne egenskap som "positiv".

2) Antigenicitet og fravær av bivirkninger.

En gruppe på 2 fritter ble podet nasalt med 10 7 - 10 8 EID50av Brigit-stammen (ATCC VR786). Dyrenes temperatur blé tatt daglig i 8 dagér.pd. Det ble ikke konstatert noen signifikafrt temperaturstigning (hoyeste temperatur 39,6°C). En annen gruppe

7 8'

på 2 fritter ble podet nasalt med 10 - 10 EID^q av B/Russlånd/69 modérstammen (ATCC VR790). To dager etter podingen hadde dyrene temperaturer på 40,2°C. Hemagglutinasjonsinhibisjoirsprdver godtgjorde at den modifiserte stamme induserte et antigenisk svar i frittenes 14 dager etter nasalpodingen var serumanti-/stoff-titerne meget hoyde blandt de podede dyr (titer: 1/256) i csotsetning til den upodede kontrollgruppe (titer: <^ 1/8).

3 ) _^Forholdet_EIDgg/j[AOs2 IDg- e-_(AOS_mer keegenskagl^

Det samme podestoff titreres på befruktede egg og på det såkalte "allantoic membrane on shell"-system (titrering på "allantoic membrane on shell" er beskrevet av S. Fazekas de St. Groth og. D. ?. White i J. Hyg. 56, 151-162, 1958). EID5Q/(AOS)ID50-forholdet for Brigit-stammen (ATCC VR 786) viste seg å væré ^10 '" f . I den foreliggende beskrivelse betegnes et forhold

y2 5

på 10 ' som "positivt".

4) Hemagglutinin-termosensitivitet.

Hemagglutinasjonsbestemmelse ble gjennomfort på infisert; allantoinvssske inkubert i 1 time ved 60°C. Etter en slik behandling føadde Brigit-stammen (ATCC VR786) fullstendig mistet sin hemagglutineringsegenskap. Denne termosensitivitet betegnes heri som "positiv". 5) lemagglutinasjonsprove_med rode blodceller fra sauer ved3J°C.

En hemagglutinasjonsprove ble gjennomfort ved rode blodceller fra sauer ved 4°C og 30°C. Hemagglutinasjonsmonsteret ved 4°C var normalt, mens det ved 30°C var en hurtig elusjon, slik at

i

det ikke ble iakttatt noen avgrenset hemagglutinasjon. Ved undersøkelse 20 timer etter forsøkets begynnelse var hemagglutina-sjonen fullstendig forsvunnet. Det ved egenskaper betegnes heri som "ustabil".

ÉKSEMBBL 2 .

En prove type B influensavirus-stamme B/HK/5/72 ATCCVR791),

hvis hemagglutinasjon er forskjellig fra Brigit-stammens

(ATCC VR786), podes i 10-11 dager gamle befruktede eggs ailantoin hulrom (podestoffs 0,2 ml/egg), og underkastes 3 overførsler for å oppnå en vesentlig virusmengde. Etter den tredje overførsels avslutning fås en Virussuspensjon hvis titer er 10 8EID50/ml. Porsjoner (0,2 ml) av den ufortynnede suspensjon podes i spesifikke patogenfri (SPF) befruktede eggs

ailantoin hulrom. Etter inkubasjon i 2 timer ved 33°C podes porsjoner (0,2 inl) av en suspensjon av Brigit-stamme (ATCC VR786) med en titer på 10 7 ' 5EID50/ml i de samme egg. Eggene inkuberes deretter i 16 timer ved 33°C og allantoinvæskene høstes »

Porsjoner (0,25 ml) av anti-Briglt-stamme serum type kaninserum, på forhånd oppvarmet til 56°C i 1 time, blandes med det samme : volum normalt serum. Porsjoner (0,25 ml) av denne serumblanding tilsettfes til de høstede allantoinvæsker. Denne blanding holdes derpå i 1 time ved 37°C. Embryonerte egg podes med 0,2 ml av den inkuberte blanding (2 egg til hver blanding) og inkuberes i 48 timer ved 33°C. Allantoinvæskene fra hvert podet egg høstes, overføres til befruktede egg (0,2 ml pr. egg) og inkuberes i

72 timer ved 33°C, idet det anvendes 2 egg til hver prøve. Etter 72 timers inkubasjonsperiode hostes de positive allantoin-vsesker og disse undersøkes på: - Hemagglutinasjon av røde blodceller fra sauer

- serotype modi anti-Brigit-serum og mot anti-B/i5K/5/72-serura.

- motstandsdyktighet overfor ikke-spesifikke seruminhibitorer

- vekst i egg og på & 0S°(allantoic on shell).

En av de således oppnådde virussuepensjoner, som angitt i den følgende tabell I, bar serotypen av en moderstamme (B/HK/5/72), og infeksjonsmønsteret i AOS-systemet og seruminhibitormerke-egenskapen av Brigit-stammen, tilskrives betegnelsen "R 22"

(ATCC VR788) og underkastes 2 overførsler på befruktede hønse-egg for å oppnå en vesentlig mengde R 22 rekombinantvirus, og den høstede allantoihvæske suppleres med pepton inntil en sluttkonsentrasjon på 5% og frystetørres.

EKSEMPEL 3.

Like stor.e volum av en suspensjon av influensavirus-stammen type B "Brigit" (ATCC VR786) og stammen B/Hong Kbng/8/73 (ATCC VR792)

7 5

(hvis titer hver er 10 ' EID50/ml) blandes og forinkuberes i 72 timer ved 4°C. Blandingen podes derpå i to SPF befruktede eggs ailantoin hulrom (0,2 ml prå egg). Etter en inkubasjonsperiode på 16 timer ved 33°C høstes allantoinvæskene og det foretas lydbehandling (30 sekunder).

-1 De høstede væsker i ufortynnet tilstand og fortynnet til 10 og 1Q~<2>får lov til å reagere i 1 time ved 37°C med forskjellige oppløsninger av anti-Brigit-stamme serotype kaninserum, forut

oppvarmet til 56°C i 30 minutter. De resulterende blandinger podes på "allantoic on shell"-system og inkuberes i 72 timer ved 37 C. Provene fira den siste positive virus for tynning (10"" )

ble nummerert 1 til 7.

Infeksjonstitere og nøytralisering ved hjelp, av anti-Brigit-serum

i AOS-systemet sammenlignes derpå for de 7 prøver og for de to moderstammer.

Prøvene, som ikke nøytraliseres ved hjelp av anti-Brigit-serum,

og som fremviser en (AOS)lDgQtiter, som er minst lik med Brig^t-stammens (ATCC VR786), høstes ved den høgeste positive fortynning.

Disse forskjellige porsjoner fortynnes til 10 og overføres en gang i SPF-egg.

Sn av disse virussuspensjoner, som viser serotypen og B/Hong Kbng/8/73-stammens hemagglutininterraosénsitivitet og Brigit-stammens EID50/(AOS)ID5Q-forhold, får betegnelsen "R 5" (ATCC VR787).

I den følgende tabell II er sammenfattet egenskapene av rekombinanten R 5, og det sammenlignes med egenskapene for Brigit (ATCC VR786) og B/aK/8/73 (ATCC VR792) moderstammene.

R 5-rekombinanten underkastes to begrensede fortynhin<g>soverførsler„'

(i SPF befruktede hønseegg) for å eliminere eventuelt fugle-eller fjærkre-adentivmiddel til sist og, ett ytterligere over-førsel for å oppnå en vesentlig mengde R 5 rek<p>mbinantvirus.

Den høstede allantoinvæske suppleres med pepton inntil en sluttkonsentrasjon på 5% og fry^etosresv

EKSEMPEL 4.

Med de frysetørrede materialer oppnådd i eksempel 1 (d.v.s.

Brigit-stammeiaATeO tfK786) som podestoffporsjon til vaksineproduksjon i stor målestokk gjennomføres en ytterligere overførsel i allantoinvæsken fra den annen gruppe befruktede hønseegg, som inkuberes ved 35°C i 3 dager.

Allantoinvæskene høstes, forenes, sterilitet og sikkerhet av-,

prøves, blandes med pepton som stabilisator for å oppnå en sluttkonåaniirasjon på 5% pepton og fordeles i 3 ral glass for å •7

oppnå en dosejrihgsenhet (d.v.s. minst 10 EID^) av virus.

Produktet frycétørres deretter- og glassene lukkes tett.

Denne ^overførselskonsantrasjon anvendes som vaksinecharge: Til vaksinetilførsel fortynnes innholdet i et glass ved å tilsette 0,5 ml vann eller saltvann eller en 5% sukroseopplosning og tilførselen skjer som dråper i neseborene.

Alternativt distribueres peptonpreparatet av allantoinvæskene i et større glass for å oppnå virusdoséringsenhetsmengden flere ganger til fremstilling av tilsvarende multi-dose-vaksine-preparåter..

Vaksinasjon med den svekkede type B ( Brigit- stamme) influensavirus.

Kliniske undersøkelser ble foretatt på 46 frivillige méd en

prevaksinasjon HI-titer feemagglutinasjonsinhibering) under eller tilsvarende 32 mot influensa B virus. Hver av de frivillige fikk to intranasaltilførsler med 8 eller 14 dagers mellomrom. Ved hver tilførsel fikk personene en viruskonsentrasjon på 10 7 '5 EIDcjq av Brigit-stammen (i hvert nesebor 5 dråper av den på

bestilling fremstilte vaksine i 5% sukroseoppløsning i vann). Seroomdanneise ble iakttatt hos 40 aV personene (d.v.s. 87%). Kun milde ]cliniske reaksjoner (d.v.s. snue eller tilstoppet nese i 1 eller 2 dager) ble konstatert. Ved undersøkelsene, hvor der var en kontrollgruppe, ble det ikke konstatert noen overførsel av influensavaksinevirus. Virusisolering ble forsøkt fra nese. og svelg-vattpinner» men prøvene forble neagative etter tj blindoverførsler i befruktede egg*

EKSEMPEL 5.

Med den frysetørrede R 22 stamme (ATCC VR788) oppnådd i eksempel 2 som podningsporsjon til vaksineproduksjon i stor . målestokk gjennomføres en ytterligere overførsel i allantoinvæsken av et ytterligere sett befruktede hønseegg, som inkuberes ved 35°C i 3 dager.

Allantoinvæskene hostes, forenes, sterilitet, og sikkerhet avprøves, blandes med.pepton som stabilisator for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5% pepton og fordelest 3 ral glass for å oppnå en doseringsenhet (d.v.s. minst 10 7 EID5Qvirus). Produktet frysetørres og glassene lukkes eller feålstoppes tett.

Dette overførselsnivå anvendes som va&åinecharge. Til vaksine-tilførsel tilberedes Innholdet av $ glass ved å tilsette 0,5 ml vann eller saltvann eller en 5% sukroseoppløsning og tilførselen skjer som dråper i.neseborene.

Alternativt distribueres peptonpreparatet med allantoinvæskene

i større glass for å oppnå virusdoseringsenhetsmengden flere ganger for fremstilling av tilsvarende raultidose-vaksine-preparater.

Vaksinasjon med den svekkede type B influensavaksine R 22 stamme.

Materiale_og metoder.

Seks frivillige med HI antistofftiter på under eller lik 32 ble valgt til forsøket. To personer ble uttatt til kontroll. De seks persoøer fikk med 11 til 14 dagers mellomrom 2 tilførsler av den på bestilling fremstilte vaksine R 22 stamme.- Til hver tilførsel fikk alle personer 5 dråper av vaksinen pr. nesebor-de)7'5EID5Q).

Blodprøver til antistoffbestemmelse ble tatt på vaksinasjons-dagen pg på tiende til fjortende dag etter den første podning og på deri fjortende dag etter den annen tilførsel. Keseyaskev-væsker til lokal antistoffbestemmelse ble uttatt den fjortende dag etter den annen podning.

Kliniske symtomer.

Det ble ikke konstatert symtomsr.

Virusisolering.

Heseprover ble samlet på dag 3 og 6 hos de seks personer. Alle prøver forble negative etter to blindoverførsler i befruktede egg.

Serologiske resultater og lokalantistoffer.

Fem av seks frivillige utviklet enten et serum eller nasalsvar eller begge deler

Resultatene er sammenfattet i den følgende tabell III.

EKSEMPEL 6..

Med det fryseteorredematerial oppnådd i eksempel 3 (R 5 stamme, ATCC VR787) som podestof f pors jon til produksjon av vaksine i stor målestokk ble en ytterligere overførsel gjennomfort i allantoinvæsken fra en annen porsjon befruktede hønseegg, som Inkuberes ved 35 o C i 3 dager.

Allantoinvæskene høstes> forenes, sterilitet og sikkerhet avprøves, blandes med pepton som stabilisator for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5% pepton og fordeles i 3 ml glass for å oppnå en doseringsenhet (d.v.s. minst 10 7EID5Q) av virus. Blandingen frysetørres deretter og glassene lukkes eller tilstoppes tett.

Dette overførselsnivå anvendes som vaksinecharge. Til vaksine-tilførsel fortynnes innholdet i et glass ved å tilsette 0,5 ml vann eller saltvann eller en 5% sukroseoppløsning, og tilførselen skjer som dråper i neseborene.

Alternativt distribueres allantoinvæske/peptonpreparatet i større glass for å oppnå virusdoseringsenhetsmengden flere rr<p>mrr ganger for fremstilling av tilsvarende multidosevaksine-preparater.

EKSEMPEL 7.

Doseringsenhet av den frysetorrede influensa type B virusvaksine (Brigit-stamme, ATCC VR786) fremstilt som angitt i eksempel 4 tilsettes en doseringsenhet levende svekket type A influensavirus (Alice-stamme, ATCC VR776) i 0,5 ml av en 5% sukrose-oppløsning i vann. Den således oppnådde kå valente vaksine tilfores som dråper i neseborene og tilførselen gjentas 14 dager senere.

De kliniske undersøkelser ble gjennomført på 22 frivillige personer med en prevaksinasjon HI (hemagglutinasjon Inhibering) titer på under eller lik 64 mot influensa A eller B virus. Hver frivillig fikk to nasal-til førsler (107'5 EID,.-, av Brigit-7 5 3u

stammen og 10 ' E^°5oav Alice-stammen) med 8.til 14 dagers mellomrom.

Seroomdannelse ble iakttatt hos 80% av personene mot influensa type A virus og 73% mot influensa type B virus.

Det ble kun iakttatt milde kliniske reaksjoner. Det ble ikke iakttatt overførsel av influensavaksinevirus.

EKSEMPEL 8.

Til en doseringsenhet (10 7 .' 5 EIDgQ) av den frysetorrede influensa B virusvaksine (R 22 stamme, ATCC VR788) fremstilt som angitt

i eksempel 5 tilsettes en doseringsenhet (10 7 ' 5 EID5Q) levende svekket type A influensavirus (Alice-stamme, ATCC VR776) i 0,5 ml av en 5% sukroseoppløsning.

Den således oppnådde bivalente vaksine xbilføres som dråper i neseborene og tilførselen gjentas 14 dager senane. Seroomdannelse for begge komponenter (type B og type A) iakttas 16 dager etter den annen tilførsel.

EKSEMPEL 9.

En prove av influensa type B virusstamme B/HK/5/72 (ATCC VR791), hvis hemagglutinasjon er forskjellig fra Brigit-stammens, podes i 10 til 11 dager gamle befruktede honseeggs allantoinhulrom (podéstoff: 0,2 ml/egg), og underkastes tre overførsler for å oppnå en vesentlig virusmengde. Etter den tredje overførsel oppnås en virussuspensjon, hvis titer er 10 8EID50/ml. Porsjoner (0,2 ml) av den ufortynnede suspensjon podes i SPF (spesifikke patbgenfri) befruktede eggsallantoinhulrom. Etter inkubasjon i 2 timer ved 33°C podes i de samme egg.porsjoner (0,2 ml) av en suspensjon av Brigit-stamme (oppnådd i eksempel 1) med en titer på 10 7 ' 5EID50/ml. Eggene inkuberes deretter i 16 timer ved 33°C, og ållantoinvaøkeae høstes. ■

PSrsjoner (0,25 ml) av anti-Brigit-starame serotype kaninserum forut oppvarmet i 1 time til 56°C blandes med porsjoner (0,25 ml) av den høstede allantoinvæske. Blandingen holdes deretter i 1 time ved 37°C. Spesifikke patogenfri befruktede egg podes med 0,2 ral av blandingen og inkuberes i 48 timer ved 33°C. Allantoinvæskene fra"hvert podet egg hostes, overføres i spesifikkepatogenfri befruktede egg (0,2 ml pr. egg) og inkuberes i 72 timer ved 33°C under anvendelse av to egg pr. prøve.

Etter de 72 timers inkubasjonsperiode høstes de positive allantoinvassker og det undersøkes pås

- hemagglutinasjon av røde blodceller fra sauer

- serotype mot anti-Brigit-serum og mot anti-B/HK/5/72 serum

- vekst i egg og på AOS (allantoic on shell).

En av de således oppnådde virussuspansjoner, som viser serotypen av B/HK/72 utgangsstammen og infeksjonsraønsteret for Brigit-utgangsstammeniiAOS-systemet, kalles R 75 (ATCC VR789).. Reliombinant R 75 underkastes to overførsler i spesifikke patogenfri befruktede hønseegg for oppnåelse av én vesentlig mengde R 75 rekombinant.

I den følgende tabell IV er rekorabinantens egenskaper sammenfattet og sammenlignet med Brigit- og B/HK/5/72-utgangsstammene.

EKSEMPEL 10.

De forenede allantoinvæslcer oppnådd i eksempel 9 sterilitet- og sikkerhets-prøves, blande<s med pepton som stabilisator for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5% pepton og fordeles i 3 ml glass for å oppnå en doseringsenhet (d.v.s. minst 10 EIDgQ) av virus. Blandingen frysetørres deretter og glassene lukkes eller tilstoppes tett.

Dette overførselsnivå anvendes som vaksinecharge. Til vaksine-tilførsel tilberedesj innholdet av ett glass ved å tilsettte . 0,5 ral vann eller saltvann eller en 5% sukroseoppløsning, og tilførselen skjer som dråper i neseborene.

Kliniske forsøk ble gjennomført med 24 frivillige personer. Hver frivillig person fikk med 11 til 14 dagers- mellomrom 2 nasaltilførsler av den på bestilling fremstilte vaksine R 75-stamme (ATCC VR789). Ved hver tilførsel fikk hver person en viruskonsentrasjon på 10 7 ' &EID^0 av den fremstilte vaksine i saltoppl6sning (5 dråper i hvert nesebor).

De serologiske resultater er sammenfattet i den folgende tabeil V. Serooradannelse (fire ganger forøkelse av HI titer) ble iakttatt hos 75% av personene, som viser en prevaksinal HI titer på 16.

EKSEMPEL 11.

Suspensjoner av influensa type B R 75 stammen (ATCC VR789) og av influensa type A "Alice" stammen (ATCC VR776) blandes, pepton tilsettes som stabilisator for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 5% pepton, og blandiogen fordeles i 3 ml hetteglass for å få

minst $.0 7 EID5Q •av hvert virus. Blandingen frysetorres og

glassene lukkes eller tilstoppes tett. For vaksinetilforsel tilberedes innholdet av ett glass ved å tilsette 0,5 ml vann eller saltvann eller en 5% sukroseopplosning og tilførselen skjer som dråper i neseborene.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en levende influensa virus-vaksine til nasal tilforsel og hvis virksomme bestanddel

-omfatter minst en effektiv mengde av en svekket influensa type B virus-stamme rekombinant, karakterisert ved at man i et substrat, som i teknikken er kjent for å akseptere vekst av influensa type B virus, rekombinerer eh svekket og vaksine-. stamme av influensa type B virus med eia influensa type B virus isolat og ved selektivt trykk isolerer en rékombinat med minst en av den svekkede moderstammes merkeegenskaper, som ikke deles av den annen moderstamme, og den annen moderstammes antigeniske sammensetning, idet man lar nevnte rekombinant utvikle seg i befruktede høn&eeggs ailantoin hulrom, hoster viruset og om ønsket dertil tilsetter en stabilisator og frysetørre blandingen.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som svekket eller seaksinestamme av influensa type B virus anvendes influensa type B virus Brigit-stammen (ATCC VR786).

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at rekombinasjonen gjennomføres i befruktede honseeggs ailantoin hulrom.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at det som isolat anvendes B/HK/8/73 (ATCC VR792) isolatet og at det som rekombinant anvendes influensa type B virus R 5 stammen (ATCC VR 787).

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert v e fl at det som isolat anvendes B/HK/5/72 (ATCC VR791) isolatet og at det som rekombinant anvendes influensa type B virus R 22 stammen (ATCC v ; VR788).

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karaicteriser-t v -. <& d at det som isolat anvendes B/HK/5/72 (ATCC VR791) isolatet <p> g at .det som rekplribinant anvendes influensa type B virus R 75 stammen (A TCC VR789).

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-6, karakterisert ved at det som stabilisator anvendes pepton eller sukker. "

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-7, karakterisert ved at den aktive bestanddel også omfatter en effektiv mengde av en svekket influensa type A virusvaksine, som tilsettes etterhhosting av influensa type B virus rekorabinanten.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 8, karakterisert ved at den svekkede influensa type A virus er influensa type A virus Alice-stammen (ATCC VR776).