JPH0634712B2 - 肝炎ｂウイルスに対する単クローン性抗体産生ハイブリツドマ細胞系 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、肝炎Ｂ表面ウイルス（ＨＢｓＡｇ）に対する
単クローン性（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ）抗体を分泌する
新規なハイブリツドマ細胞系に関する。

連続的に二次培養できる新規な細胞系の開発は、近年に
おいて研究の重要な領域である。このような細胞系の１
つの特定の用途は抗体の製造にあり、そして体細胞交雑
（すなわち、細胞融合）の導入は純粋な単クローン性抗
体を製造できる研究器具を提供した。抗体分泌細胞を骨
髄腫細胞と融合し、そして生ずる抗体分泌性ハイブリツ
ドに組織培養でクローンを発生させることによって、特
定の抗体を分泌できる安定なハイブリツド単クローン性
細胞系を生成し、選択できることが発見された。こうし
て、単クローン性細胞系において、純粋な単特異性抗体
が１つのもとの抗体分泌細胞から生ずるので、前記特異
性抗体の製造を確保することができる。

純粋な単特異性抗体を製造する能力は抗原の精確なスク
リーニング、精製に、そして治療／予防の用途に、明ら
かに大きい実用性があり、そして本発明はこれらの技術
を肝炎Ｂウイルスの感染に関連して使用することに関す
る。

急性および慢性の肝炎Ｂ感染の診断は、患者の血液中の
ＨＢｓ抗原の検出に依存する。これは、一般に、ポリス
チレンビーズ上へ吸収されたウサギまたはウマの抗ＨＢ
ｓ血清を利用する放射線免疫検定により行われてきた。
患者の血清中のＨＢｓ抗原は固相の抗体へ結合し、次い
で放射線標識した抗ＨＢｓをさらに使用することにより
検出できる。肝臓中のＨＢｓ−Ａｇを検出する他の技術
は、二重層免疫蛍光を用いる。しかしながら、この技術
はウサギにおいて抗血清を増大する一次手順を含み、そ
して抗体は高価な、時間を要するアフイニテイクロマト
グラフイーにより精製する。

ＨＢｓ抗原を検出するための放射線検定技術の使用は、
輸血サービスに関連してよく確立されているが、病院の
患者のスクリーニングに一般に広く実施されてきていな
い。病院内の感染の危険を防ぐためにこれが明らかに望
ましいということは別にして、とくに肝炎ウイルスの保
菌者である産科の患者の同定はきわめて重要である。な
ぜなら、保菌者の母親の同定により、出産直後の乳児に
超免疫グロブリンを投与し、こうして肝炎の発現および
慢性保菌者の危険をかなり減少できるからである。

肝炎Ｂウイルスの感染のためのスクリーニングおよびこ
の疾患の可能な処置の増加は、大量の入手容易な高品質
の抗ＨＢｓ血清を必要とする。新規なハイブリツド単ク
ローン性細胞系が今回見出され、これらをＲＦ−ＨＢｓ
−１と表示する。これらは培養において安定であること
が示され、肝炎Ｂ表面抗原に対する単クローン性抗体を
分泌する。その上、この細胞系は液体窒素中に貯蔵し、
それから回収することができ、こうして純粋な肝炎Ｂ表
面抗原に対する純粋な抗原の入手容易な供給物を提供す
る。

したがって、本発明は、肝炎Ｂ表面抗原に対する単クロ
ーン性抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢ
ｓ−１を提供する。この単クローン性抗体は、他の免疫
材料を含まない実質的に純粋な形態である。

本発明の上記単クローン、それゆえ単特異性（ｍｏｎｏ
ｓｐｅｃｉｆｉｃ）抗体は、培養上澄液から、あるい
は、以後示すように、マウスの腹水症の流体または血清
から回収できる。それらの各々はＨＢｓ−Ａｇに対する
活性を示し、マウスのＩｇＧ₁高分子量鎖（ｈｅａｖｙ
ｃｈａｉｎ）およびマウスのＫ低分子鎖（ｌｉｇｈｔ
ｃｈａｉｎ）に対して増大したウサギの抗血清により
沈殿するが、マウスのＩｇＧ₂ａ、ＩｇＧ₂ｂ、ＩｇＭま
たはＩｇＡあるいはマウスのλ低分子鎖に対するウサギ
の抗血清により沈殿しない。こうして、単クローン性抗
体は、ＨＢｓＡｇ（ａｄおよびａｙ）の主要なサブタイ
プと反応するＩｇＧ_1(K)マウス免疫グロブリンであり、
そして細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、を培養することによっ
て製造できる。

また、本明細書では、さらに２つの単クローン性抗体Ｉ
およびIIを産生し得るさらに２つのハイブリドーマ細胞
系ＩおよびIIが説明される。これら抗体は特にアツセイ
系において、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体と結合して用いるこ
とができるＨＢｓ−Ａｇに対する単クローン性抗体を示
している。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびIIは、ハイブリツド
マ（ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）細胞系である。これらの細胞
系は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６，２９２（１９７６）の方法に
従い、濃縮した肝炎Ｂ表面抗原（ＨＢｓＡｇ）およびＨ
ＡＴ感作マウス骨髄腫（ｍｙｅｌｏｍａ）細胞系（Ｐ３
−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１）で前もって免疫した、Ｂａ
１ｂ／ｃマウスからの脾細胞を融合することによって製
造されたものである。これらの融合した細胞系の３種を
用いるクローン発生することにより、それぞれＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１、ＩおよびIIと表示するハイブリツドマ単クロ
ーン性細胞系が単離された。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびIIの各々は、大きさ
および形状の両方が親ＮＳ１骨髄腫と形態学的に類似
し、平均大きさが１３μｍである細胞のかなり均一な個
体群として現われる。それらの各々は、培養において球
形で現われ、中央に位置する核を有し、そして核体積に
等しいか、それより大きい、大きな細胞質領域をもつ。
ＲＦ−ＨＢｓ−１は親系統（ｐａｒｅｎｔａｌ ｌｉｎ
ｅ）と異なる。ＲＦ−ＨＢｓ−１は、親系統に似て固体
の基層、たとえば、ガラスまたはプラスチツクへ部分的
に結合するが、この表面から激しい攪拌により分離され
ることができ、トリプリシン化またはＥＧＴＡによる処
理を必要としない。それはまた攪拌培養容器内で懸濁培
養物として生長する。Ｉは生長して部分的に基層へ結合
し、二次培養のためにトリプシン化を必要とするが、II
は静止懸濁培養物として生長し、培養物を希釈し、たと
えば、１：１０に希釈することにより通過を行う。細胞
はそれぞれ14.6時間、10.7時間および9.2時間の２倍時
間を有し、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地（下を参照）中で生長
し、各々の２〜３日の間隔の養分供給を必要とし、ＲＦ
−ＨＢｓ−１について２〜３日、Ｉについて３〜４日、
そしてIIについて２〜３日の間隔の二次培養を必要とす
る。

ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびIIの
各々は、抗体を分泌し、そして連続培養において少なく
とも３カ月間抗体を分泌し続ける。

したがって、また、本発明はＲＦ−ＨＢｓ−１と表示す
るハイブリツドマ細胞系を提供し、それらは肝炎Ｂ表面
抗原に対する単クローン性抗体を分泌し、細胞系は好ま
しくは他の細胞物質を含まない、実質的に純粋な形態で
存在し、そして、さらに、本発明は、この細胞系と前記
細胞系を維持できる栄養培地とを含有する組成物を提供
する。ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびIIに適当な培地は炭
素源、窒素源、必要に応じて、ビタミン類および／また
は無機塩類を含有し、このような培地の一例は胎児の子
牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０、たとえば、ＲＰ
ＭＩ−ＦＣＳ（下を参照）である。

ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１の製造におい
て、Ｂａｌｂ／ｃマウスを、最終抗原濃度0.7mg/mlにお
いて、完全フロイントのアジユバント（ＣＦＡ）で１：
１に希釈した精製ＨＢｓの0.2mlの腹腔内注射により免
疫する。（使用したＨＢｓ抗原（サブタイプ ａｄｗ）
はＨＢｓ抗原陽性血清から、塩化セシウム密度勾配遠心
分離により精製した）。４週間後、マウスをＨＢｓ抗原
／ＣＦＡ混合物の0.2mlをさらに注射して増強した。６
週間後、固相放射免疫により決定して、ＨＢｓ抗原に対
する抗体の最高の力価を与えたマウスを、ＣＦＡ中のＨ
Ｂｓ抗原の0.2mlI.P.注射でさらに増強し、この最後の
増強後５日で殺し、脾を切除した。

脾を、１０％Ｖ／Ｖの胎児子牛血清、２ミリモルのグル
タミンおよび各１００ＩＵのペニシリンおよびストレプ
トマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（ＲＰＭ
Ｉ−ＦＣＳ）中で３７℃、pH7.2および２ｇ／の重炭
酸ナトリウム濃度において、細片にくだき、そして生ず
る懸濁液を滅菌した１０mlの注射器に数回おだやかに出
し入れした。単一細胞懸濁液を未分離の数個の残留塊り
からデカントし、そして細胞を血清不含ＲＰＭＩ−１６
４０中で２回洗い、１５００ｇで５分間遠心分離した。
洗浄した細胞ペレツトをＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁
した。

マウスの骨髄腫の半合流培養物Ｐ₃−ＮＳ１／１−Ａｇ
４−１（すなわち、１０％Ｖ／Ｖの胎児子牛血清、２ミ
リモルのグルタミン、１００ＩＵのペニシリン、１００
μｇのストレプトマイシンおよび２×１０^-5モルの８−
チオグアニンを補充し、重炭酸塩／ＣＯ₂で緩衝したＲ
ＰＭＩ−１６４０培地中で３７℃において連続培養状態
に維持した、生長の活性段階の細胞の培養物）を、それ
らの培養容器から、おだやかなトリプシン化により分離
し、そして４００ｇの遠心分離により血清不含ＲＰＭＩ
−１６４０中で２回洗浄した。洗浄した細胞をＲＰＭＩ
−１６４０中に再懸濁し、デカンテーシヨンした。

交雑を行うために、全脾細胞個体群を骨髄腫細胞と、丸
底の滅菌した１０mlの遠心分離器の管中で、１０対１の
脾細胞対骨髄腫細胞の比で、混合し、１５００ｇの遠心
分離により共ペレツト化した。上澄液を除去後、ＲＰＭ
Ｉ−１６４０中のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１
５００の４０％（Ｗ／Ｗ）の３７℃に予備加温した溶液
の１mlを細胞ペレツトに加え、細胞とおだやかに混合し
た。細胞−ＰＥＧ混合物を３７℃で正確に７分間保温
し、次いでＰＥＧ溶液を、ＰＥＧ濃度が0.5％（Ｗ／
Ｗ）以下になるまで、等体積のＲＰＭＩ−１６４０の反
復添加により、徐々に希釈して細胞を分離した。この懸
濁液を１５００ｇで遠心分離し、細胞ペレツトをおだや
かに再懸濁し、血清不含ＲＰＭＩ−１６４０中で２回洗
浄し、１０００ｇで再懸濁した。洗浄した細胞ペレツト
を１mlのＲＰＭＩ−ＦＣＳ中におだやかに再懸濁し、３
７℃で２時間培養し、次いで細胞をＲＰＭＩ−ＦＣＳ中
１×１０⁶細胞／mlで、２４×２mlの多数のくぼみの組
織培養平板中に分配し、３７℃で５％ＣＯ₂／９５％空
気雰囲気中で培養した。

融合後２４時間において、各フラスコ中の培地の半分を
ＨＡＴ培地（１×１０^-4モルのハイポキサンチン、４×
１０^-7モルのアミノプテリンおよび1.6〜１０^-5モルの
サイミジンを補充したＲＰＭＩ−ＦＣＳ）で置換した。
これらの培養物を、新しいＨＡＴ倍地で、このように、
最初の３日間毎日、その後２〜３日の間隔で、補充して
ＨＡＴ培地中で生長する能力をもつ雑種細胞を確実に選
択した。

ＨＡＴ培地をＨＴ培地（ＲＰＭＩ−ＦＣＳ＋ハイポキサ
ンチンおよびサイミジン）で段階的に置換し、これは融
合後第４０日において開始し、次いで融合後第５２日に
おいてＲＰＭＩ−ＦＣＳ中の生長に適合した。

雑種培養からの上澄液を、くぼみが１００個の細胞より
多い生長を示すとすぐに、ＨＢｓ抗原に対する抗体につ
いて評価した。ただ１つの培養くぼみが抗体産生細胞を
含有したが、他の培養くぼみは事実生きているハイブリ
ツド細胞を含有していた。

次いで、この１つの培養くぼみからの抗体産生雑種細胞
を、免疫しないＢａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞の供給
（ｆｅｅｄｅｒ）層上へもとの培養物を限界希釈し、Ｒ
ＰＭＩ−ＦＣＳ中の９６×0.2mlの複合皿中で雑種を生
長させることによって、初めクローン発生させた。生長
はクローン発生計画の開始時にハイブリツド細胞を含有
することが確認された１６のくぼみにおいて行われ、そ
してこれらから細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１を、ＨＢｓ抗原
に対する単クローン抗体を分泌する安定なハイブリツド
細胞系を提供するものとして、選択した。この細胞のク
ローンを引き続いて２回再クローン発生を行い、その結
果１００％の抗体産生クローンが得られた。

Ｉと表わされるハイブリツドマ細胞系の製造において、
生まれてから６週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウスを、アフ
イニテイ精製ＨＢｓＡｇ（サブタイプａｙ）で、完全フ
ロイントのアジユバント（ＣＦＡ；0.2ml／マウス）中
の２０μｇのＨＢｓＡｇの腹腔内注射により、免疫し
た。２週間後、ＣＦＡ中の５μｇのＨＢｓＡｇのI.P.注
射をさらに行ってマウスを増強し、血清抗ＨＢｓＡｇの
最高の力価を与えるマウスを、さらに２週間後生理的食
塩水中の５μｇのＨＢｓＡｇのI.P.注射により増強し
た。最後の増強後３日において、マウスを殺し、脾を切
除した。この時間において、マウスは１：１０００の血
清抗ＨＢｓ−Ａｇ力価を有した。（すべての抗ＨＢｓＡ
ｇ測定値を“ＡＵＳＡＢ”比−免疫測定（アボツト・ラ
ボラトリーズ）により決定し、そしてこの規格における
抗体の力価を最大結合の５０％を与える希釈として与え
る）。

免疫したマウスからの脾細胞を、ＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で
３７℃、pH7.2および2.0ｇ／の重炭酸ナトリウム濃度
において解離した。全脾細胞個体群を血清不含培地（Ｒ
ＰＭＩ−１６４０）で２回洗い、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａ
ｇ４−１マウス骨髄腫細胞と１０：１（脾細胞：骨髄腫
細胞）の比で混合し、ペレツトにし、ＲＰＭＩ−１６４
０中の４０％（Ｗ／Ｗ）ポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）１５００の１ml中に懸濁した。７分間の保温後、Ｐ
ＥＧを細胞からＲＰＭＩ−１６４０の徐々の添加により
おだやかに希釈した。細胞懸濁液をＲＰＭＩ−１６４０
中で１回洗い、１５００ｇで遠心分離し、次いで３mlの
ＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で２時間保温し、次いで細胞を２×
10⁶細胞／くぼみで２mlの培養くぼみ中にプレート（ｐ
ｌａｔｅ）した。すべての作業は３７℃で実施した。

細胞を３７℃でＲＰＭＩ−ＦＣＳ中で５％ＣＯ₂／９５
％空気雰囲気で一夜培養し、次いで各培養くぼみ中の培
地の半分をＨＡＴ培地で置換した。培養物に新らしいＨ
ＡＴ培地を、このようにして、最初の３日間１日の間隔
で、次いで２〜３日の間隔で供給して、ＨＡＴ感作骨髄
腫細胞からハイブリツド細胞を選択した。融合後ほぼ３
週間で、ハイブリツド細胞をＲＰＭＩ−ＦＣＳ培地へ導
入した。

はじめプレートした１６８のくぼみのうちで、１４８は
ハイブリツド細胞を生長させ、それらのうちで４つは抗
ＨＢｓＡｇ活性の生成を示した。これらの４つのうち
で、融合後２０日で現われた１つのハイブリツド培養物
はＨＢｓＡｇに対する抗体を産生しつづけた。この細胞
系を３回クローン発生させ、生ずる抗体分泌クローンの
１つはＩと表示する細胞系である。

IIと表わされるハイブリツドマ細胞系の製造において、
生まれてから６週間の雄のＢａｌｂ／ｃマウスを、アフ
イニテイ精製ＨＢｓＡｇ（サブタイプａｄ）で、完全フ
ロイントのアジユバント（ＣＦＡ；0.2ml／マウス）中
の２０μｇ ＨＢｓ−Ａｇの腹腔内注射により免疫し
た。３週間後、マウスをＣＦＡ中の５μｇのＨＢｓＡｇ
の追加のI.P.腹腔内注射により増強し、血清抗ＨＢｓＡ
ｇの最高の力値を与えたマウスをさらに１０日間後生理
的食塩水中の５μｇのＨＢｓＡｇのI.P.注射により増強
した。最後増強後５日において、マウスを殺し、脾臓を
切除した。この時間において、マウスは１：７０００の
血清抗ＨＢｓＡｇ力価を有した。

次いで、手順は免疫マウスからの脾細部の解離から、交
雑細胞の２×１０⁶細胞／くぼみにおける２mlの培養く
ぼみ中への３７℃におけるプレイテイング（ｐｌａｔｉ
ｎｇ）まで、ハイブリツドマ細胞系Ｉの製造において用
いた手順と同一であった。また、培養および選択の条件
はその手順と同一であり、そして初めプレートした１４
４のくぼみのうちで、１２９はハイブリツド細胞を生長
させ、それらのうち５つは抗ＨＢｓＡｇ活性を生成し
た。これらの５つのうちで、融合後１５日で現われた１
つのハイブリツド培養物はＨＢｓＡｇに対する抗体を生
成した。この細胞系は３回クローン発生させ、生ずる抗
体分泌クローンの１つをIIと表示する細胞系である。

本発明のほかの面は、ハイブリツドマ細胞系ＲＦ−ＨＢ
ｓ−１、を栄養培地中で培養することからなる、前記細
胞系の増殖法にある。また、この増殖法は、培地から分
離できる本発明の抗体を製造する１つの手段を表わす。
本発明の細胞および細胞ＩおよびIIのための適当な栄養
培地は炭素源、窒素源、必要に応じて、ビタミン類およ
び／または無機塩類を含有し、たとえば、胎児子牛血清
を、たとえば、培地に基づいて約１０重量％の量で補充
した、ＲＰＭＩ−１６４０である。前述のＲＰＭＩ−Ｆ
ＣＳはとくに適する。細胞を生長させるとき、適当な初
期濃度はＲＦ−ＨＢｓ−１について１×１０⁵細胞／m
l、細胞系Ｉについて１×１０⁵細胞／ml、そして細胞系
IIについて２×１０⁵細胞／mlである。これらの濃度
は、望ましくは、それぞれ１×１０⁶細胞／ml、２×１
０⁶細胞／mlおよび３×１０⁶細胞／mlを超えてはならな
い。

本発明の細胞系または細胞系Ｉまたは細胞系IIを栄養培
地中で培養することに加えて、細胞系の各１つをマウス
中に移植して腹水腫瘍を定着させることもできる。これ
は、一般に、たとえば、４×１０⁵〜１×１０⁶細胞／マ
ウスをプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチル
ペンタデカン）で初回抗原刺激を受けた（ｐｒｉｍｅ
ｄ）Ｂａｌｂ／ｃマウスに腹腔内注射することによって
実施する。また、腹水腫瘍の定着は、プリスタンの初回
抗原刺激を受けないマウスにおいても達成することがで
き、この場合、ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞を増殖するとき、
１×１０⁶〜２×１０⁶細胞／マウスを注射すべきである
が、細胞系Ｉおよび細胞系IIについての細胞／マウスの
最小値は４〜５×１０⁵である。また、細胞系は皮下注
射により固形腫瘍として生長させることができる。

次いで、ハイブリツドマにより分泌された単クローン性
抗体は、腹水症の流体またはマウスの血清から回収する
ことができ、そして細胞系を増殖しかつＲＦ−ＨＢｓ−
１から抗体を製造するこの方法は本発明のさらにほかの
面を表わす。単クローン性抗体を得るこの手段は、抗体
の収量が、たとえば、細胞の塊状培養から得られる収量
よりも１０倍程度に多くあることができるという利点を
提供する。マウス中で細胞を生長させるのに通常約２〜
３週間を要する。

本発明の抗体は、前述のような源から精製しないで使用
できるが、好ましくは使用前に精製する。たとえば、ア
フイニテイクロマトグラフイーにおいて使用するセフア
ロースへ結合すべき抗体は一般に硫酸アンモニウム沈殿
により精製するが、ヨード化すべき抗体またはビオチン
接合すべき抗体は一般に蛋白質Ａ精製を行う。

本発明のハイブリツドマ細胞または細胞系ＩまたはII
は、たとえば、２０％のＦＣＳを含有するＦＣＳ補充Ｒ
ＰＭＩ−１６４０培地中に、たとえば、５×１０⁶細胞
／ml以上において、凍害防御物質として１０％のジメチ
ルスルホキシドを用いて、液体窒素中で凍結することに
より貯蔵できる。凍結速度は好ましくは＋４０℃〜−１
００℃の間で１〜２℃／分に制御し、そして凍結した細
胞は液体窒素の冷蔵庫内で−１００℃以下、たとえば、
−１７０℃で貯蔵できる。

細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１、により産生される単特異性抗
体は、肝炎Ｂウイルスに感染された患者の精確なスクリ
ーニング試験を提供することにおいて、とくに価値があ
る。これらの抗体は、細胞物質または血清の中のＨＢｓ
Ａｇの存在を検出するとき、たとえば、免疫蛍光顕微鏡
法または免疫電子顕微鏡法を用いる、測定系において使
用できる。定量的測定は固相放射測定法により実施する
ことができ、そしてＲＦ−ＨＢｓ−１抗体はＨＢｓＡｇ
分子上に比較的高い頻度で現われる抗原キピトープ（ｅ
ｐｉｔｏｐｅ）を認識するので、これに関して有用であ
る。しかしながら、本発明によるとくに有用な固相放射
測定系は他の単クローン性抗体とＲＦ−ＨＢｓ−１との
組み合わせを用いる。

ＨＢｓ−Ａｇを認識する他の抗体は、ＨＢｓ−Ａｇ上に
低い頻度で存在するエピトープに対して高い親和性をも
ち、一緒に固相として、後の実施例において説明するよ
うに、ＨＢｓ−Ａｇを検出する放射測定法に、ＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１抗体と組み合わせて、使用できる。ＩおよびII
抗体からなる固相はＨＢｓＡｇの一工程放射測定法に応
用できる（下の実施例７はこれらの２種類の抗体がそれ
らの間ですべてのＨＢｓ−Ａｇ分子をいかにして認識す
るかを明らかにする）が、この固相にＲＦ−ＨＢｓ−１
抗体を加えると、それは二工程測定法において使用する
とき保護物質として作用する。なぜなら、ＲＦ−ＨＢｓ
−１抗体は、他の２つの単クローン抗体よりもＨＢｓＡ
ｇに対して親和性が低いが、それ自体すべてのＨＢｓＡ
ｇ分子を認識し、こうして抗原の固相への定着を確実に
するからである。これらの単クローン性抗体を用いる固
相放射測定系において、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体はすべて
のＨＢｓＡｇ分子を認識するばかりでなく、また分子上
に高い頻度で存在するＨＢｓＡｇのエピトープを認識す
るという事実のため、測定において他の２つの抗体より
も高い計数値を、単独で、あるいは組み合わせで、与え
るので、放射標識したトレーサーとして使用することが
好ましい。放射測定においてすべての３種の単クローン
性抗体を使用するときの支持は、競争結合の研究（下の
実施例４参照）により提供され、これらの研究はＩまた
はII抗体のいずれもがＲＦ−ＨＢｓ−１抗体のＨＢｓＡ
ｇへの結合を妨害しないことを証明している。

こうして、本発明のＲＦ−ＨＢｓ−１より得られた単ク
ローン性抗体を使用することによる好ましい診断法は、
ヒトまたは動物から採取した血清試料を、二工程におい
て固相の形態でＲＦ−ＨＢｓ−１、ＩおよびII抗体と一
緒に培養し、固相を洗浄し、そしてそれをトレーサーと
して放射標識したＲＦ−ＨＢｓ−１抗体とともに培養す
るか、あるいは一工程測定において固相の形態でＩおよ
びII抗体、およびトレーサーとして放射標識ＲＦ−ＨＢ
ｓ−１抗体とともに培養することからなる。これらの測
定系の各々において、固相は好ましくは抗体を被覆した
プラスチツクまたはガスの支持体からなる。この支持体
は、たとえば、ポリスチレンの、ビーズ、棒または管の
形であることがとくに好ましい。また、本発明は、これ
らの被覆した支持体、たとえば、ビーズを提供し、さら
に、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体、ＩおよびII抗体で被覆した
またはＩおよびII抗体単独で被覆したプラスチツクまた
はガラスの支持体、たとえば、ビーズ、棒または管を含
有する第１容器と、放射標識物質を結合したＲＦ−ＨＢ
ｓ−１抗体を含有する第２容器とかなる診断キツトを提
供する。（これらの測定系において、ＲＦ−ＨＢｓ−１
抗体を２つの単クローン性抗体ＩおよびIIと一緒に使用
する代わりに、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を抗体Ｉおよび抗
体II以外のＨＢｓ−Ａｇを認識する１種または２種以上
の他の単クローン性抗体と一緒に使用できる。） 別の測定法は、放射標識物質を使用する代わりに、一般
にＲＦ−ＨＢｓ−１抗体に結合する、たとえば、酵素標
識物質またはビオチン標識物質を用いることができる。
さらに、ＨＢｓ−Ａｇに対する赤血球凝集測定に、ＲＦ
−ＨＢｓ−１抗体の１種またはそれ以上を使用できる。

また、固相、たとえば、臭化シアノゲン活性化セフアロ
ーズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）４Ｂ（ＣｎＢｒ−Ｓ４Ｂ；
スウエーデン国ウツプサラ所在の、フアーマシア・フア
イン・ケミカルズ）へ結合した本発明の細胞系から得ら
れた単クローン性抗体を、ワクチンの製造に使用するた
めに精製された形態でＨＢｓ−Ａｇを製造する目的で、
あるいは患者に与えるべき物質からＨＢｓ−Ａｇを除去
する目的で、ＨＢｓ−Ａｇを、たとえば、ヒトまたは動
物の物質から除去するために使用できる。こうして、ま
た、本発明の細胞系からの単クローン性抗体は、生物学
的試料をＲＦ−ＨＢｓ−１抗体と固相において接触させ
て抗原を抗体に結合させ、引き続いて所望の精製された
物質を固相から分離することからなる、生物学的試料か
ら肝炎Ｂ表面抗原を単離する方法に利用することができ
る。

また、本発明の細胞系からのＲＦ−ＨＢｓ−１抗体は、
抗体を患者へ直接に投与する抗ウイルス剤としての臨床
的応用において、価値がある。単クローン性抗体は患者
の処置において肝炎Ｂウイルスを担持する役割をもつこ
とができ、そして細胞上の受容体部位へのウイルスの結
合を阻止することによりウイルスの感染性を中和するこ
とができ、またウイルスの食作用および細胞内消化を促
進することができる。潜在的には、超免疫ガンマグロブ
リンのための基質として、これに関連して、これらの単
クローン性抗体を使用すると、従来の血清を用いる場合
における、大量の非特異性免疫グロブリンと少量の特異
性抗体の生成を、回避することができる。ＲＦ−ＨＢｓ
−１抗体は、ＨＢＶ担体における耐性を、ＨＢｓ−Ａｇ
への結合およびそれをより免疫原性とすることにより、
破壊する作用をすることもできる。

こうして、本発明のほかの面は、ＲＦ−ＨＢｓ−１単ク
ローン性抗体と、製薬学的に許容しうる不活性担体また
は希釈剤とからなる製薬学的組成物である。治療的およ
び／または予防的使用のため、この組成物は固体または
液体の形態であることができ、そして常法により非経口
的または経口的に投与できる。こうして、この組成物
は、注射可能な溶液あるいは錠剤、カプセル剤、溶液ま
たは懸濁液の形態であることができる。

単クローン性細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１は、C.N.C.M.（Co
llection Nationale de Culture de Microorganisms、
パリ市パスツール研究所）に、それぞれ、１９８０年３
月２６日に寄託され、受入れ番号Ｉ−１１７が付され
た。

本発明を、次の実施例によりさらに説明する。

実施例１ 細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１の試験管内培養 ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞を、５〜２０％（Ｖ／Ｖ）の胎児
子牛血清を補充したＲＰＭＩ−１６４０培地に、１×１
０⁵細胞／mlで種づけした。細胞の生長速度はすべての
培地において本質的に同一であった（14.6時間±2.5の
倍加時間）が、生長時間は１５％および２０％の胎児子
牛血清において長くした。

１×１０⁵細胞／mlの種まき密度は最適な生長に対して
好ましいが、これより低い密度を用いることができ、そ
の場合生長時間は長くなる。二次培養は２〜３日ごとに
行うべきである。

実施例２ 細胞系の生体内培養 ２Ａ：ＲＦ−ＨＢｓ−１ 生まれてから６週間のＢａｌｂ／ｃマウスの２０匹に、
0.5ＭＬのプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメ
チル−ペンタデカン）の腹腔内注射により第１日目と第
７日目に初回覆原刺激を与えた。第１４日目において、
各マウスに１×１０⁶の生きている雑種種ＲＦ−ＨＢｓ
−１細胞を腹腔内に移植した。移植後１０日において、
すべてのマウスは多量腫瘍生長の徴候を示した。これら
を殺し、腹水症の流体を１９ゲージの針で集めた。腹水
症の流体を２０００ｇで遠心分離し、ＲＦ−ＨＢｓ−１
抗体を含有する透明な上澄液を集め、−２０℃で貯蔵し
た。

２Ｂ：細胞系Ｉ Ｂａｌｂ／ｃマウスに、Ｉ型の細胞の移植前に、１週間
で２回の0.5mlのプリスタンの腹腔内注射により、初回
抗原刺激を与えた。次いで、各マウスに４×１０⁵の生
きているＩ型の細胞を移植し、腹水腫瘍を生成させた。
２０〜２５日後、マウスが腹水流体の最大収量を生じた
とき、マウスを殺し、腹水流体はほぼ２０mg/mlの蛋白
質を含有し、それらのうち１５０μｇ／mlは純粋なＩ抗
体であることがわかった。

２Ｃ：細胞系II Ｂａｌｂ／ｃマウスに、II型の細胞の移植前に、１週間
で２回の0.5mlのプリスタンの腹腔内注射により、初回
抗原刺激を与えた。次いで、各マウスに５×１０⁵の生
きているII型の細胞を移植し、腹水腫瘍を生成させた。
１５〜２０日後、マウスは腹水流体の最大の収量を与
え、この流体は１８０μｇ／mlのII抗体を含有すること
がわかった。

実施例３ ポリスチレンビーズのＲＦ−ＨＢｓ−１単ク
ローン性抗体および単クローン性抗体ＩおよびIIによる
被覆 ポリスチレンビーズを単クローン性抗体で、腹水流体の
形態において、種々に希釈度でpH9.6の重炭酸塩緩衝液
（0.015モルのＮａ₂ＣＯ₃：0.035モルのＮａＨＣＯ₃）
中で、攪拌しながら２０℃において１時間保温し、次い
で同じ抗体−緩衝液混合物中で４℃において１６時間保
温することにより、被覆した。次いでビーズを洗浄し、
室温において、２００μの¹²⁵Ｉ−ＨＢｓ−Ａｇ（ア
ボツト・ラボラトリーズ）とともに４時間保温して、最
適の被覆条件を決定した（下表１参照）。

この実施例において使用した被覆緩衝液のpHは9.6が最
適であることがわかった。さらに、ビーズをＲＦ−ＨＢ
ｓ−１を含有する単クローン性抗体の組み合わせで被覆
するとき、抗体を通常ビーズへ一緒に加える。なぜな
ら、ビーズへ単クロン抗体を順番に加えると改良が得ら
れないからである。

ビーズを、抗体でいったん被覆すると、蒸留水で３回洗
い、吸収パツド上で遠心分離により乾燥できる。これら
のビーズは−２０℃において少なくとも３カ月間安定で
ある。

実施例４ ＨＢｓ−Ａｇの認識 細胞系ＲＦ−ＨＢｓ−１により産生された単クローン性
抗体は、ＨＢｓＡｇのａｄおよびａｙサブタイプに対し
て共通であり、かつ次の競争結合の研究により証明され
るように、Ｉ抗体およびII抗体が認識するＨＢｓＡｇの
エピトープと異なる、エピトープを認識する。

混合したサブタイプのＨＢｓＡｇ（ＡＵＳＡＢ：アボツ
ト・ラボラトリーズ）で被覆したポリスチレンビーズ
を、５０μｇ／mlの蛋白質Ａ精製したＲＦ−ＨＢｓ−１
抗体またはＩ抗体或いはII抗体と一緒に、あるいは等し
い力価のＨＢｓ−Ａｇに対するウマの抗血清と一緒に、
室温で一夜保温し、次いで実施例５におけるようにヨウ
素化した（１０００，０００ｃｐｍ）¹²⁵Ｉ−ＲＦ−Ｈ
Ｂｓ−１または¹²⁵Ｉで標識されたＩ抗体と一緒に、室
温でさらに４時間保温した。結果を下表２に記載する。

これらの結果が示すように、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体およ
びＩ抗体の抗体はそれら自体の結合を抑制するが、他の
抗体による結合の抑制は存在しない。他方において、ウ
マの抗血清は、事実、ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体の結合を抑
制した。

実施例５ 放射測定法における細胞系抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を、ＰrowseおよびＪenkin（Immu
nochemistry１５ ４２９−４３６，１９７８）の方法
に従い、蛋白質Ａ−セフアロース（Sepharose）カラム
（フアーマシア・フアイン・ケミカル・スウエーデン国
アツプサラ）からのpH5.5における溶離により、ＲＦ−
ＨＢｓ−１細胞系を移植したマウスからの腹水流体から
精製した。このようにして精製したＲＦ−ＨＢｓ−１抗
体の５μｇを、１５μの合計反応体積の2.5μｇのク
ロラミン（Chloramine）Ｔを用い、４℃で３０秒間保温
して、¹²⁵Ｉ対抗体の等モル比を得ることによって、0.5
ｍＣｉの¹²⁵Ｉでヨウ素化した。（Ｉ抗体およびII抗体
を同様にして精製し、ヨウ素化した。） ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体、Ｉ抗体、II抗体またはこれらの
単クローン性抗体で被覆したポリスチレンビーズ、ある
いはＡusriaIIビーズを、２００μのＨＢｓＡｇ−Ｖ
ｅヒト血清と一緒に、あるいは２０ｎｇ／mlのＨＢｓＡ
ｇを含有する２０μのヒト血清と一緒に、４５℃で２
時間保温し、洗浄し、そして¹²⁵Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１
抗体、¹²⁵Ｉ−抗体または¹²⁵Ｉ−II抗体（ほぼ１００
０，０００ｃｐｍ／測定）と一緒に４５℃においてさら
に１時間保温し、洗浄し、計数した。結果を、ｃｐｍ
（少なくとも２つの試料の平均）として、あるいはＨＢ
ｓＡｇ＋ｖｅ試料およびＨＢｓＡｇ−ｖｅ試料（＋／
−）を用いて得られた計数値の間の比として、表わす。

この表が示すように、最高の＋／−比、それゆえ最高の
感度の測定値は、すべての３種類の単クローン性抗体を
固相において使用し、トレーサーとして¹²⁵Ｉ−ＲＦ−
ＨＢｓ−１を使用したとき、得られた。

実施例６ ＨＢｓＡｇの検知の限界 ＲＦ−ＨＢｓ−１、ＲＦ−ＨＢｓ−２またはＲＦ−ＨＢ
ｓ−４単クローン性抗体、またはそれらの抗体の組み合
わせで、最適濃度で被覆したポリスチレンビーズを、２
００μのＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清または既知量のＨ
ＢｓＡｇを含有する２００μのヒト血清と一緒に４５
℃で２時間保温し、洗浄し、３００μの¹²⁵Ｉ−ＲＦ
−ＨＢｓ−１（２００，０００ｃｐｍ／測定）と一緒に
４５℃でさらに１時間保温した。

結果を下表４に記載する。また、この表４に、ＡＵＳＲ
ＩＡ II ＲＩＡを用いる同様な滴定値のＨＢｓＡｇの
結果を記載する。結果はｃｐｍ（少なくとも２回の実験
の平均）または＋／−比として表わす。

実施例７ ＨＢｓＡｇ陽性試料の検出 ＡＵＳＲＩＡ II ＲＩＡまたはヘパテスト（Ｈｅｐａ
ｔｅｓｔ）（２５３＋ｖｅ；４７−ｖｅ）によりＨＢｓ
Ａｇ＋ｖｅまたはＨＢｓＡｇ−ｖｅであることが示され
た、３００のヒトの血清の試料の２００μｌのアリコー
トを、Ｉ抗体またはII抗体で、あるいはＲＦ−ＨＢｓ−
１、Ｉ抗体およびII抗体の混合物で被覆したポリスチレ
ンビーズと一緒に、４５℃で２時間保温した。洗浄後、
ビーズを¹²⁵Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１（２００，０００ｃ
ｐｍ／測定）と一緒に４５℃でさらに１時間保温し、洗
浄し、計数した。

下表５に示すように、２５３のＨＢｓ−Ａｇ陽性の試料
のうちで、２１９はＩ抗体で陽性であったが、３４は陰
性であった。しかしながら、ＨＢｓＡｇ陽性であるが、
Ｉ抗体と非反応性であることが示された３４試料のすべ
ては、固相としてII抗体を用いて測定したとき、陽性の
値を与えた。同様に、試験した２５３のＨＢｓＡｇ＋ｖ
ｅ試料のうちで、１０は固相として単独で使用したII抗
体で検出されなかったが、これらの１０の試料のすべて
は、固相としてＩ抗体を用いて測定したとき、陽性の値
を与えた。

実施例８ ＨＢｓＡｇについての２工程放射測定 ＲＦ−ＨＢｓ−１、Ｉ抗体およびII抗体で被覆したポリ
スチレンビーズを、５５μｇ／mlのＨＢｓＡｇを含有す
る２００μのヒト血清と一緒に、あるいは２００μ
のＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清と一緒に、２０℃、３７℃
または４５℃において種々な時間保温した。これらのビ
ーズを洗浄し、そして¹²⁵Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１トレー
サーと一緒に２０℃、３７℃または４５℃において追加
の時間保温し、洗浄し、計数した。

ＨＢｓＡｇについての２工程ＲＦ−ＨＢｓ単クローン抗
体の測定についての好適な保温時間は、こうして次のと
おりである。

単クローン性抗体被覆ビーズを用いる血清の第１保温： 室温において４時間または 室温において１６時間 ＲＦ−ＨＢｓ−１トレーサーを用いる洗浄ビーズの第２
保温： 室温において２時間 実施例９ ＨＢｓＡｇについての一工程放射測定法 Ｉ抗体およびII抗体［腹水流体(ascitic fluid)の１：
２００希釈］で被覆したポリスチレンビーズを、２００
μのＨＢｓＡｇ−ｖｅヒト血清または２０ｎｇ／mlの
ＨＢｓＡｇおよび１０μの¹²⁵Ｉ−ＲＦ−ＨＢｓ−１
（１００，０００ｃｐｍ／測定）と一緒に、２０℃で種
々な時間保温し、洗浄し、計数した。結果をｃｐｍ（２
回の別々の実験の平均）として、あるいはＨＢｓＡｇ＋
ｖｅおよびＨＢｓＡｇ−ｖｅの試料を用いて得られた計
数値の間の比として、表わす。

この実施例におけるようにビーズ、試料およびトレーサ
ーと一緒に保温すると、ビーズと試料を予備保温した場
合よりもすぐれた結果が得られ、そしてこれらの結果は
トレーサーと試料を予備保温した場合得られる結果とほ
とんど異ならない。

この一工程の測定は、抗体が単クローンであり、従来の
抗血清に似ず、抗原性結合部位について完全ではないの
で、可能であり、そして二工程の測定法よりも作業の数
が少ないので、ＨＢｓ−Ａｇについて非常に急速なスク
リーニング法を要する場合、たとえば、輸血センターお
よび血液製品研究所において、使用するのに魅力的な系
である。この測定は２時間以内で実施することができ、
感度の明らかな損失はない。

実施例１０ ＨＢｓＡｇのアフイニテイクロマトグラフイーにおける
ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体、とくに硫酸アンモニウム沈殿に
より腹水流体から精製したこの抗体を、製造業者の示唆
に従いＣｎＢｒ−Ｓ４Ｂ（スウエーデン国アツプサラ所
在のフアーマシア・フアイン・ケミカルズ社）へ結合し
た。ＨＢｓＡｇを含有する１００mlのヒト血清をこのカ
ラムに下向きに通し、この血清からＨＢｓＡｇの98.7％
を除去した。さらに、除去された抗原の１００％は３モ
ルのＫＩを用いてカラムから溶離できる。この抗原はマ
ウスおよびウサギにおいて免疫原性であり、そして全血
清についてのウサギの抗血清に対する免疫電気泳動法に
より、他のヒト血清汚染物質を除去できることが示され
た。

実施例１１ 細胞物質中のＨＢｓＡｇの局在化におけるＲＦ−ＨＢｓ
−１抗体の使用 ＲＦ−ＨＢｓ−１細胞の培養物からの上澄液中のＲＦ−
ＨＢｓ−１抗体を用いて、ＨＢＶ含有ヒトまたはチンパ
ンジーからの肝バイオプシーの凍結部分中、あるいはウ
イルスを含有する細胞中のＨＢｓＡｇを同定した。抗原
−抗体錯体を、蛍光分子へ結合したマウスの免疫グロブ
リンに対するヤギの抗血清で可視化した。さらに、蛋白
質Ａ精製ＲＦ−ＨＢｓ−１抗体をピオチンへ接合した。
この接合は、１mlのpH8.3の重炭酸塩−生理的食塩水緩
衝液（0.1モルのＮａＨＣＯ₃：0.5モルのＮａＣｌ）中
の１mgのＲＦ−ＨＢｓ−１抗体を１mg/mlでＤＭＳＯ中
に溶けた９０μｇのビオチンスクシンイミドと一緒に２
０℃で４時間保温することによって、行った。４℃でリ
ン酸塩緩衝生理的食塩水に対して一夜透析した後、ＲＦ
−ＨＢｓ−１抗体−ビオチン接合体を、アビジン−フル
オロクローム(avidin-fluorochrome)またはアビジン−
フエリチン(avidin-ferritin)と組み合わせて使用し
て、ＨＢｓＡｇをそれぞれ免疫蛍光顕微鏡法および免疫
電子顕微鏡法により可視化した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジヨージ・ジヤノシイ イギリス国ミドルセツクス・ハロウ・トウ イフオードロード24 (72)発明者 ホワード・クリストフアー・トマス イギリス国ロンドン・エヌダブリユー11・ オークウツドロード103 (56)参考文献 特開 昭56−73029（ＪＰ，Ａ) 特開 昭53−44620（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．256，495〜497 Ｐ（1975) Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．Ｉ, 1242〜1243Ｐ（1977)

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単ク
   ローン性抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−Ｈ
   Ｂｓ−１。
2. 【請求項２】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単ク
   ローン性抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−Ｈ
   Ｂｓ−１を、その栄養培地中で培養することを特徴とす
   る前記細胞系の試験管内増殖方法。
3. 【請求項３】パスツール研究所に受託番号ＣＮＣＭ−Ｉ
   −１１７として寄託された肝炎Ｂ表面抗原に対する単ク
   ローン性抗体を分泌するハイブリツドマ細胞系ＲＦ−Ｈ
   Ｂｓ−１をマウスに移植して腹水腫瘍を定着させること
   を特徴とする前記細胞系の生体内増殖方法。