JPS60115530A - 単クローン性抗G3m(21)抗体 - Google Patents

単クローン性抗G3m(21)抗体

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JPS60115530A
JPS60115530A JP58222943A JP22294383A JPS60115530A JP S60115530 A JPS60115530 A JP S60115530A JP 58222943 A JP58222943 A JP 58222943A JP 22294383 A JP22294383 A JP 22294383A JP S60115530 A JPS60115530 A JP S60115530A
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antibody
mouse
hybridoma
producing
cells
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Kazumasa Ishikawa
石川 和正
Shiyou Fukahori
深堀 承
Yoshinobu Miyashita
宮下 佳展
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Fujifilm Wako Pure Chemical Corp
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  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、単りローン性抗G :4 m (21)抗体
・に20種頻以上のGm抗原が見出されている。このG
m型は、血液の遺伝標識のうち、個人識別、刹子鑑定、
集団遺伝学において最も有用々ものであり、最近では、
疾患とGmの関係が注目されている。しかしながら、血
球凝集阻止反応に頼るGm型判定は、ヒト由来の特異抗
Gm血清や、各種Gm抗原を担ったIgGである廂球感
作用抗り抗体の入手が非常に回部であるため、実検に広
く利用されていない。ノー近、Gm型判定ルーティーン
化の為、ヒト由来の抗血清に代わるウザギ抗Gm抗血清
の作製が試みられたが、抗血清の作製に多大の時間と費
用を要し、まだ、抗、原となる秒々のGm型のヒト血清
の収集が困難であるため、抗血清の再生産卵力に限界が
あり、壕だ、抗血清の抗体価が低く、特異性にも間頭が
残る為、実用イしには到っていhい。そこで、木発明者
らは、特異的で、かつ抗体価が高く、しかも再生産が容
易カ抗Gm抗体を得るべく、ノ・イブリドーマによって
産生される増りローン性抗Gm抗体の作製について鋭意
研究を重ねた結果、単りローン性抗G3m(2J)抗体
、及びこれを産生ずるノ・イブリドーマを創製するに到
った。本発明で得られた抗体の特異性と抗体価を調べた
結果を表1に示す。
本発明の抗体は、03m(21)を欠くGm標準血清存
在下では、03m(21)をもっ抗り抗体で感作された
赤血球と強く凝集し、その抗体価は、抗体を含むマウス
腹水の希釈倍数で表わした場合、1 : 16,384
という大きな値を示した。まだ、03m(21)を含む
標準血清存在下では、本発明の抗体と、03m(21)
をもつ抗り抗体で感作された赤血球との凝集は完全に阻
止された。
この結果は、本抗体がGm(21)に特異的に反応し、
Gm(1)、Gm(2)、Gm(3)、Gm(5)、G
m(13)、Gm(15)、Gm(16)とは反応しな
いことを証明した。
本発明のj′^;休即ち、単りローン性抗G 3 m 
(21)抗体を産生するハイブリドーマの作製方法は通
常、下記の5工程よりなる。
1 抗原の島1製 2、免疫 3 細胞融合 4、抗体ylハイブリドーマの選択 5、 単クローン化 本発明に用いる免疫抗原は、G m (21)をもつ正
常ヒトnu 7*から得たIgG3を使用する。1gG
3は生理食塩水或いに緩衝液などに溶解し、マウス又は
ラット1匹あたり1回に] )1りから300μ2を投
与するのが好寸しい。免疫は数回に分けて行うが、初回
免疫はアジ−パントと共に行うことが一般的である。ア
ジ−パントとしてはフロイントアジ−パント、水酸化ア
ルミなどが使用される。免疫は1〜3週間の間隔で行い
、初回以外はアジ−バットを使用せず、緩衝液、生理食
塩水などに溶解し、腹腔内或いは静脈内に投与するのが
好適である。
免疫動物としては、細&1.融合に使用する腫瘍細胞株
によって決められるが、一般にはラノし、マウスが多く
用いられる。マウスの中でも免疫グロブリンを産生じな
い腫瘍細胞株の頗立されているBALB/eがよく用い
られる。
最終免投後2〜4日後に、リンパ節或いは、肺臓を摘出
し、得られるリンパ球を細胞融合に供する。
−ツバ細胞i1)合に使用される腫瘍細胞株としては、
免疫グロブリンを産生し々いP3−X63−8AZ−U
l やP3−NS−1などが使用される。細胞融合時に
はリッパ球を腫瘍細胞の5〜20倍量多く用いる。
細胞融合には、HVJ(センダイウィルス)或いは、ポ
リエチレングリコール(PEG)を用いて行うが、一般
には増張いの便利なPEGの平均分子−i: 1,00
0〜s、oooの40〜60%溶液を使用する。融合を
促進する為に、コルヒチン、ジメチルスルポキンド、ポ
リーL−アルギニン等を添加することもあるが必須では
kい。
フィーダー細胞としては、同系のラット或いはマウスの
胸腺細胞、牌細j胞等が用いられ、濃度と(2ては0.
5〜2 X 1 o6/meとなるように添加する。
抗体産生ハイブリドーマの選択は、細胞融合後数週間後
に血球凝集阻止反応などにより、培養液中の抗体産生ス
クリーニングを行い、これを選択−f ル。ハイブリド
ーマを得たならば次にクローニングを行うが、クローニ
ングの方法としては。
F A CS (Fluorescent Activ
ated Ce1l 5ortcr)を用いプζす、5
oft Agarを用いて:IV」ニーを拾い上げる方
法、一般によく用いられる阻岑酊釈d、などがある。ど
のカメ去を用いてもクローニング(42回以上繰返し、
完全に単一クローンとする。
又、このような工程を経て得らhだハイブリドーマを用
いて、単りo −ン性抗G 3 r++ (21)抗体
を作製する方法としては、in vitro法、1nv
ivo法のいずれでもよいが、in vivo l去の
力が抗体価がはるかに高いので望捷し、い。
次に実施例により本発明のハイブリ下−マ及び単クロー
ン性抗体の作製方法について詳細に述べる。
実施し1]1 草りローン性抗G 3 m (21)抗体を産生するハ
イブリドーマの作製方法 1、抗原の調製 Gm(1,,21)型の正當ヒ+−nn njから、:
35係飽和硫安で粗グロブリンを沈殿させ、それをI)
EAEセルローローラムクロマトグラフィーで楯製し、
IgGを得だ。さらに、それをプロティンAのカラムク
ロマトグラフィーで精製し、IgG3を得て、これを抗
原とした。
2、免疫 抗1)”A’、 100μ2にフロイントΦコンプリー
ト・アジュバントを添加して、B A L B / c
マウスの腹腔内に注射した。その後、10日間隔でリン
酸緩衝液に俗解した抗原100μ2を腹腔内に2回L1
射した。
3細胞融合 最終免疫よ、す4日後、免役マウスの肺臓を摘出し、単
−糺)胞の浮遊液上しだ。このI X 10”個の肺細
胞とi x i o7個の8−アザグアニン耐性・V!
 vllljiJllllliffl N S −1ト
ラ50 % ホIJ x −f−L/ 7 りI)コー
ル(平均分子i4’、 6.000 )を用いて融合さ
せた。融合さぜた細胞に、フィーダー細胞として同系マ
ウスの胸腺細胞を加えて、牛胎児血清を15% f b
 RP M I 1640 培地ニR4サセ、24穴絹
織培養プレートに分注した。24時間後、培養r+=上
消の半分をl−4A T培地(ヒポキサンチン1×i 
o−’ M、、アミノブチリ/4\10〜7N1.チミ
ジン1.6x10−’M))こ交換し7/ξ。、111
11胞%ji! OIJt、12日口重で、2〜31」
間隔で同様tζ培?、・液交換6・?工つだ。その鏝、
3〜51−1間隔で13回、11′r培地(HA T培
地から−)′ミノプテリンを除いたもの)で培養液交櫓
を行った。
4、抗体産生ハイブリドーマの選択 細胞融合後3週間目に血球凝集l511止反工り1、に
より、培養液中の抗体産生スクリーニングを1sつだ。
′まス、マイクロフロキュレーションスライドの穴に、
各りの培養液上清を1滴と、G m 棲準血tIIi1
滴を加えて混合した後、さらに、G3m(21)をもつ
抗り抗体で感作l−だ赤血球の0.2係il J液をl
l〆j加えた。スライドを振り混ぜなから、室MiM−
1・で、30分〜2時間反応させノζ後、赤血球凝り・
の有無を観察した。全培養液上清のうち、++ft、 
1つのものが、G3m(21)を含まないG m 4+
!+ ?f/−面t?hイfイ:。
下で感作赤血球を凝集させ、かつG 3m (21)を
含む枦準血清存在下で用いた揚台1./+;\作赤血球
の凝集か[壜止された。ゲ″って、この培養静上清中に
に1、抗G3m(21)抗体が含まれていることが位(
認された。そこで、この抗体を産生しプこ)・イフリド
ーマを選択し7だ。
5単クローン化 選択された・・イブリトーマを、限界希釈法によりクロ
ーン化し、96穴組織培養プレートに分注し、牛胎児血
清を15係含むRPIVI11640培地で培養した。
クローン化は2度行っ/ζ。
実施例 2 1弔クロ一ン性抗体の作製 (a) in v−itro法 ・・イブリト−マを牛胎児血清を15係音むR1)IV
I J 1.640培地で培養し、その培養液上清を得
だ。
(b) in vivo法 B A I、B / Cマウスに予め(移植の7−14
 El前)、プリメタン(2,、6、10、14−テト
ラメチルベンタテカン)を注射した。次に抗体を産生す
るハイブリドーマクローンをマウス1匹当た9、約I 
X 107jl#l、肋腔内に注射することにより移植
した。移植し・、7〜14II 1口こ、+1g水を採
取した。
2、化クローン性抗体の!1!「異(4,のf1’fl
(n2とマウス腹水中の抗対価の測定 単りローン44↑抗体を1(むマ1゛ノス1lj)水を
段階W、釈し、マイク■コフロギコレーンっ(ンスライ
トの穴にこ’c (7) l i+4 ト、G 111
4? 準」r11清111i4i を加エテ混合し、さ
らにG 3 m (21)をもつ抗I〕抗体で感作した
赤血球の0.2%浮遊液を1滴加えた。スライドを振り
混ぜながら、:30分〜2時間反応さぜだ後、赤血球の
、凝集の有無を観、察しだ。その結果は表1に>j’e
すとおりである。即ち、G 3 m (21)を含まな
いGm l界′準血清存在下で、希釈1音数1 : 1
6,384まで感作赤血球を凝集させ、かつ03m(2
1)を含むG m標穂血711N存在下では、感作赤血
球の凝集が完全に阻止された。従って、この化クローン
性抗体はGm(21)に特異的に反応し2、G m(]
)、Gm(2) 、Gm(3) 、G m (5) 、
Gm(1コ4) 、Gm(15)、Gm(16)とは反
応しなイコとが証明された。壕だ、マウス)復水の抗イ
+仲(d、1 : 16,384であった。
特許出願1人 和光純薬工業株式会社

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. (1) G 3 m (21)型のヒトIgG3で予め
    免役されたマウスの肺細胞と、マウスの骨髄肺細胞ライ
    ンからの細胞との融合によって形成されたハイブリドー
    マによって産生さg、次の特徴を持つΦ、クロロー性抗
    体。 Gm(21)とめみ弾く反応し、Gm(1)、Gm(2
    )、Gm(3)、G m (5)、G m (13)、
    G m (15)、Gm(16)とは反応しない。
  2. (2)03m(21)型のヒトIgG3で予め免疫され
    たマウスの肺細胞と、マウスの骨髄肺細胞ラインからの
    細胞との融合によって形成され、次の特徴を持つ単クロ
    ーン性抗体を産生ずるハイブリドーマ。 G m (21)とのみ強く反応し、G’m(1)、G
    m(2)、Gm(3)、Gm(5)、G m (13)
    、Gm(15)、Gm(16)とは反応しない。
JP58222943A 1983-11-25 1983-11-25 単クローン性抗G3m(21)抗体 Granted JPS60115530A (ja)

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JPH0459879B2 JPH0459879B2 (ja) 1992-09-24

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60228421A (ja) * 1984-04-27 1985-11-13 Shionogi & Co Ltd モノクロ−ナル抗ヒトIgG抗体およびその製造法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60228421A (ja) * 1984-04-27 1985-11-13 Shionogi & Co Ltd モノクロ−ナル抗ヒトIgG抗体およびその製造法
JPH054075B2 (ja) * 1984-04-27 1993-01-19 Shionogi Seiyaku Kk

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