JPS6229972A - ウサギモノクロ−ナル抗体産生方法およびその中で用いられる細胞系ならびにそれによつて産生される抗体 - Google Patents
ウサギモノクロ−ナル抗体産生方法およびその中で用いられる細胞系ならびにそれによつて産生される抗体Info
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- JPS6229972A JPS6229972A JP61103732A JP10373286A JPS6229972A JP S6229972 A JPS6229972 A JP S6229972A JP 61103732 A JP61103732 A JP 61103732A JP 10373286 A JP10373286 A JP 10373286A JP S6229972 A JPS6229972 A JP S6229972A
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
発明９茸甲一
本発明は、モノクローナルウサギ抗体ならびにモノクロ
ーナルウサギ抗体の産生方法に関する。
ーナルウサギ抗体の産生方法に関する。
本発明は、モノクローナル抗体産生能力のある新規ウサ
ギーウサギ融合細胞ならびに該融合細胞の作製方法にも
関する。さらに、本発明は、免疫処置されたウサギから
の抗体産生性細胞と融合してモノクローナル抗体を産生
ずる融合細胞を作製する能力のある新規ウサギ細胞系お
よびこの新規ウサギ細胞系の作製方法に関する。
ギーウサギ融合細胞ならびに該融合細胞の作製方法にも
関する。さらに、本発明は、免疫処置されたウサギから
の抗体産生性細胞と融合してモノクローナル抗体を産生
ずる融合細胞を作製する能力のある新規ウサギ細胞系お
よびこの新規ウサギ細胞系の作製方法に関する。
抗体とは、動物の免疫系から産生されて、動物を異種物
質から保護する複雑な分子である。抗体は、動物の免疫
系を刺激する異種物質を動物に注入することによる動物
の免疫処置によって一般に得られる。特別な異種物質に
対して産生される抗体は、実際には、該異種物質上の種
々の抗原決定基を認識する幾つかの異なる抗体（多クロ
ーン性抗体）の不均一混合物である。多クローン性抗体
の使用には数多くの問題が付随している。多クローン性
抗体は有用性が限定されている。さらに、多クローン性
抗体は、異なる抗原埃応性を有する抗体を相方に完全に
分離することがほとんど不可能でありかつ最も慎重に精
製した抗体分画でも１種より多くの物質と反応するｆＩ
Ｉ能牲がある。
質から保護する複雑な分子である。抗体は、動物の免疫
系を刺激する異種物質を動物に注入することによる動物
の免疫処置によって一般に得られる。特別な異種物質に
対して産生される抗体は、実際には、該異種物質上の種
々の抗原決定基を認識する幾つかの異なる抗体（多クロ
ーン性抗体）の不均一混合物である。多クローン性抗体
の使用には数多くの問題が付随している。多クローン性
抗体は有用性が限定されている。さらに、多クローン性
抗体は、異なる抗原埃応性を有する抗体を相方に完全に
分離することがほとんど不可能でありかつ最も慎重に精
製した抗体分画でも１種より多くの物質と反応するｆＩ
Ｉ能牲がある。
コーラ−、ミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ旧１
ｓｔｅｊｎ） 。
ｓｔｅｊｎ） 。
不一チ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ） 、２５６，４９５−９
７ （１９７５）の独創的研究中には、マウス骨髄腫細
胞を免疫処置されたマウスからのｌ１１ｍ細胞と融合し
て均一なモノクローナル抗体を産生ずる細胞糸を得る方
法を駄初に記載Ｌ７ている。適当な細胞糸から細胞融合
技術によって銹導されるハイブリドーマ細胞系からのモ
ノクロ−１ル抗体の産生もラットおよびヒトについて記
載されている。これらの棟のおのおのに於て、免疫処置
されたマウスまたはラットまたはヒ１からのリンパ様細
胞と融合させることができる骨髄腫細胞系が存在し、た
。得られたハイブリドーマ細胞は、マウスまたはラット
またはヒトがそれで免疫処置されていた免疫源に対して
モノクローナル抗体を産生じた。
７ （１９７５）の独創的研究中には、マウス骨髄腫細
胞を免疫処置されたマウスからのｌ１１ｍ細胞と融合し
て均一なモノクローナル抗体を産生ずる細胞糸を得る方
法を駄初に記載Ｌ７ている。適当な細胞糸から細胞融合
技術によって銹導されるハイブリドーマ細胞系からのモ
ノクロ−１ル抗体の産生もラットおよびヒトについて記
載されている。これらの棟のおのおのに於て、免疫処置
されたマウスまたはラットまたはヒ１からのリンパ様細
胞と融合させることができる骨髄腫細胞系が存在し、た
。得られたハイブリドーマ細胞は、マウスまたはラット
またはヒトがそれで免疫処置されていた免疫源に対して
モノクローナル抗体を産生じた。
モノクローナル抗体の使用は、免疫処置された動物の抗
血清中に見いだされる多クローン性抗体の使用に付随す
る多くの問題の幾つかを回避する。
血清中に見いだされる多クローン性抗体の使用に付随す
る多くの問題の幾つかを回避する。
ハイフリドーマはクローニングすることが可能であるの
で、またハイブリドーマ細胞系は不滅であるので、モノ
クロ−ナル抗体の単一特異性および永久自用竹が保酊Ｉ
−される。
で、またハイブリドーマ細胞系は不滅であるので、モノ
クロ−ナル抗体の単一特異性および永久自用竹が保酊Ｉ
−される。
多種の抗原に対する免疫応答は主としてつ号ギで研究さ
れ７おり、ウサギは＾い親和性と広い特異４１１の抗体
を産４ｔすることが知られている。従って、基礎的１ｉ
ａｒ究ならびに工業的操作および医学的操作ではしばし
ばウサギ抗体が用いられる。
れ７おり、ウサギは＾い親和性と広い特異４１１の抗体
を産４ｔすることが知られている。従って、基礎的１ｉ
ａｒ究ならびに工業的操作および医学的操作ではしばし
ばウサギ抗体が用いられる。
他の種に於目るように、４ｔきている動物が産／、ｌＦ
するウサギ抗血清中に存在する抗体の不均一性と十分に
特徴づりられた抗体の眼定された有用性とが、標準化さ
れた診断的試験および治療操作に於てつ４＋−ギ抗体４
さらに使用するための主要な問題となっている。残念な
がら、−１−述した種とは対照曲番こ、融合細胞の作製
に使用するための潜在的なウナギ１４髄腫親細胞系は入
手できない。
するウサギ抗血清中に存在する抗体の不均一性と十分に
特徴づりられた抗体の眼定された有用性とが、標準化さ
れた診断的試験および治療操作に於てつ４＋−ギ抗体４
さらに使用するための主要な問題となっている。残念な
がら、−１−述した種とは対照曲番こ、融合細胞の作製
に使用するための潜在的なウナギ１４髄腫親細胞系は入
手できない。
１９７４年に、Ｊ、Ｊ、 コリンズ（，１，Ｊ。
Ｃｏ１１ｉｎｓ ） ら、Ｐ、、Ｎ、Ａ、Ｓ−、，７上
、 ２６０−ｆｉ３（１９７３）およびＡ、Ｄ、ス１
、ロスベルブ（Ａ、 Ｄ、 Ｓｔｒｏｓｂｅｒ
ｇ ） ら 、 、ｊ）、 ｈｊ、
Ａ、 Ｓ、、 。
、 ２６０−ｆｉ３（１９７３）およびＡ、Ｄ、ス１
、ロスベルブ（Ａ、 Ｄ、 Ｓｔｒｏｓｂｅｒ
ｇ ） ら 、 、ｊ）、 ｈｊ、
Ａ、 Ｓ、、 。
７１．２６３−６５ （１９７４）はシミアンウィルス
４０ （ＳＶ４０）による脾臓細胞の生体外形質転換
によって得られる、ＴＲ３Ｃ−１と呼ばれる安定な抗体
産生性でしかも抗体非選択性ウサギ細胞系の作製を報告
した。１９８１年に、ペチ１− ・：＋スカス（１’ｅ
ｔｉｔ −Ｋｏｓｋａｓ ）ら−、ｆｏｒ −４２−１
ｍｍｕｎｏｌ ；、１１． ３８８−９２ （１
９８１）はｉ’ ＲＳ Ｃ−１１１１胞糸の突然変異を
ひき起こすための＋１．０２％エナルメチルスルホネー
＋（１４）１ｓｔＩ）の使用を記載した。Ｂ Ｍ Ｓ
Ｆへの基ｎ後、６−チオクアニン合有媒質中で選択を行
い、アミノプテリンに対して感受性であり、’ｌ” Ｒ
Ｓ Ｃ−１−８と呼ばれる、安定なヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルＩ・フンスフェフーゼ欠失牲（
ＨＧ ｌ） ＲＴ−）突然変異体細胞系を得た。このＴ
ＲＳ Ｃ−１−８細胞系を、種々の抗原で免疫処置さ
れたウサギからのリンパ腺リンパ細胞との細胞融合実験
に用いた。融合細胞はｉυられたが完全な免疫グ「１プ
リンも活性抗体も産生し、２（かった。
４０ （ＳＶ４０）による脾臓細胞の生体外形質転換
によって得られる、ＴＲ３Ｃ−１と呼ばれる安定な抗体
産生性でしかも抗体非選択性ウサギ細胞系の作製を報告
した。１９８１年に、ペチ１− ・：＋スカス（１’ｅ
ｔｉｔ −Ｋｏｓｋａｓ ）ら−、ｆｏｒ −４２−１
ｍｍｕｎｏｌ ；、１１． ３８８−９２ （１
９８１）はｉ’ ＲＳ Ｃ−１１１１胞糸の突然変異を
ひき起こすための＋１．０２％エナルメチルスルホネー
＋（１４）１ｓｔＩ）の使用を記載した。Ｂ Ｍ Ｓ
Ｆへの基ｎ後、６−チオクアニン合有媒質中で選択を行
い、アミノプテリンに対して感受性であり、’ｌ” Ｒ
Ｓ Ｃ−１−８と呼ばれる、安定なヒポキサンチン−グ
アニン−ホスホリボシルＩ・フンスフェフーゼ欠失牲（
ＨＧ ｌ） ＲＴ−）突然変異体細胞系を得た。このＴ
ＲＳ Ｃ−１−８細胞系を、種々の抗原で免疫処置さ
れたウサギからのリンパ腺リンパ細胞との細胞融合実験
に用いた。融合細胞はｉυられたが完全な免疫グ「１プ
リンも活性抗体も産生し、２（かった。
従って、本発明の目的は、免疫処置されたウサギからの
ｈ体産住セＬｌｔｌ胞と融合し７て、モノクローナルウ
サギ抗体を産生ずる能力のある融合細胞を４ト成するこ
とができる安定なウサギ親細胞糸を作製するこＪであイ
）。本発明のもう１つの目的は、融合細胞系を作製する
ことおよびモノクローナルウサギ抗体を産生することで
ある。さらに本発明のもう１つの目的は、該安定親細胞
系および該融合細胞系の作製方法を開発することである
。
ｈ体産住セＬｌｔｌ胞と融合し７て、モノクローナルウ
サギ抗体を産生ずる能力のある融合細胞を４ト成するこ
とができる安定なウサギ親細胞糸を作製するこＪであイ
）。本発明のもう１つの目的は、融合細胞系を作製する
ことおよびモノクローナルウサギ抗体を産生することで
ある。さらに本発明のもう１つの目的は、該安定親細胞
系および該融合細胞系の作製方法を開発することである
。
舒の簡隼７４′鋭泗
安定な親ウサギ細胞系の作製方法が開発された。
Ｔｐ−３とりばれるこの新規細胞系はウサギ融合細胞か
ら誘導された。Ｗ＄臓細胞を初めにＳＶ４０で形質転換
させ、次にＥＭＳＦ７′処理して、ＨＧＰＲＴ−１極度
にヒポキサン千ン、アミノプテリン、チミジンＩＡＴ＞
感受性、迅速増殖性、非抗体分泌性連続細胞系を作製し
た。
ら誘導された。Ｗ＄臓細胞を初めにＳＶ４０で形質転換
させ、次にＥＭＳＦ７′処理して、ＨＧＰＲＴ−１極度
にヒポキサン千ン、アミノプテリン、チミジンＩＡＴ＞
感受性、迅速増殖性、非抗体分泌性連続細胞系を作製し
た。
ＴＰ−３細駒は免疫処置されたウサギからの抗体産仕性
細駒と融合して、ＨＡ ′Ｆ不感受性でありかつ広範り
１１のハブテンおよび抗原にり・１′１−イ）ウサギモ
ノクローナル抗体を産生ずる新規のウサギ−ウサギ融合
細胞を作製する。
細駒と融合して、ＨＡ ′Ｆ不感受性でありかつ広範り
１１のハブテンおよび抗原にり・１′１−イ）ウサギモ
ノクローナル抗体を産生ずる新規のウサギ−ウサギ融合
細胞を作製する。
モノクローナル抗体は、多クローン性抗体が現在用いら
れているどんなオ股でも用いられることができる。従っ
て、モノクローナル抗体は、イムノアッセイ、受動免疫
に、ならびに数多くの病気の診断才ヌよび治療に使用さ
れるはすである。
れているどんなオ股でも用いられることができる。従っ
て、モノクローナル抗体は、イムノアッセイ、受動免疫
に、ならびに数多くの病気の診断才ヌよび治療に使用さ
れるはすである。
好工旦駐害−椎態様の詳細な説瞥
ＴＰ−３細胞系および融合細胞の作製方法ならびにモノ
クローナル抗体の産４ニカ法およびキュラクタリセーシ
ョンは、一般に゛下記の工程からなる。
クローナル抗体の産４ニカ法およびキュラクタリセーシ
ョンは、一般に゛下記の工程からなる。
Ａ。ウサギ脾臓細崎をＳＶ４０で形質転換させ、次いで
細胞をＥ Ｍ Ｓ Ｆに暴露することによって突然変異
を起こさせることによるＴＰ−３細胞系の作製６ＥＭＳ
Ｆに縣罷後、細胞を種々の特性で選択する。得られた細
胞系はＨａ Ｐ ＲＴ−１ＨＡ Ｔに対して極度に感受
Ｉ＋１、迅速増殖性で、復帰突然変異体のレベルが極め
て低くかつ連続的に増ｈ〜する。
細胞をＥ Ｍ Ｓ Ｆに暴露することによって突然変異
を起こさせることによるＴＰ−３細胞系の作製６ＥＭＳ
Ｆに縣罷後、細胞を種々の特性で選択する。得られた細
胞系はＨａ Ｐ ＲＴ−１ＨＡ Ｔに対して極度に感受
Ｉ＋１、迅速増殖性で、復帰突然変異体のレベルが極め
て低くかつ連続的に増ｈ〜する。
Ｒ，ウナギの免疫原による免疫処置。任意の既知免疫原
を用いることができる。免疫処置スケジ、−ルおよび抗
原濃度は、適当に初回抗１東刺激を受けた抗体産生性細
胞の有用な量を作製するよろなものでなければならない
。これらの免疫処置方法（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ）は、
一般に公知であるか、あるいは既知の原理を用いて案出
することができ、かつ免疫）東によって異なる。
を用いることができる。免疫処置スケジ、−ルおよび抗
原濃度は、適当に初回抗１東刺激を受けた抗体産生性細
胞の有用な量を作製するよろなものでなければならない
。これらの免疫処置方法（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ）は、
一般に公知であるか、あるいは既知の原理を用いて案出
することができ、かつ免疫）東によって異なる。
Ｃ３免疫処置されたつ隼ギからの抗体産生性細胞含有す
ンパ様組織の除去および単一細胞懸濁液の作製。これＣ
）の技術は公知である。
ンパ様組織の除去および単一細胞懸濁液の作製。これＣ
）の技術は公知である。
Ｄ、適当な融合ＩＷ油剤の使用による、免疫処置された
ウサギからの抗体産生性細胞と’Ｉ” Ｐ −３細胞と
の融合。融合のための好ましい細胞比は、ＴＰ−３細胞
１個につき抗体産ｌｔ性細胞約１０個である。奸才しい
融合促進剤はポリエチレングリコ１−ル１５（１１）（
ＰＥＧ）であるが、技術士公知の伯の融合促進剤を使用
してもよい。
ウサギからの抗体産生性細胞と’Ｉ” Ｐ −３細胞と
の融合。融合のための好ましい細胞比は、ＴＰ−３細胞
１個につき抗体産ｌｔ性細胞約１０個である。奸才しい
融合促進剤はポリエチレングリコ１−ル１５（１１）（
ＰＥＧ）であるが、技術士公知の伯の融合促進剤を使用
してもよい。
ｌ−、、融合細ＩＩＩＩｌ混合物のＨＡＴ含自含油培地
希釈および培養。ＨＡ Ｔ含有培地は未融合′ｒ ｐ
−３細胞を支持しないので、Ｔ Ｐ−３細胞は死滅する
。
希釈および培養。ＨＡ Ｔ含有培地は未融合′ｒ ｐ
−３細胞を支持しないので、Ｔ Ｐ−３細胞は死滅する
。
未融合の抗体産生性細胞は有限回数しか分裂しないので
、あるＭＪｌｔｌ旧多ば４：殖しなくなる。融合細胞は
、ＴＰ−３親細胞の不死性能と抗体産生性親細胞のＨＡ
Ｔ含有培地中でのｄ：存能力とを有するので生殖し続
ける。細胞濃度を統針的に計算して一定数の細胞をおの
おのの別個の容器に隔離し、得られたクローンが申−融
合細胞から由来することを口■能とする。
、あるＭＪｌｔｌ旧多ば４：殖しなくなる。融合細胞は
、ＴＰ−３親細胞の不死性能と抗体産生性親細胞のＨＡ
Ｔ含有培地中でのｄ：存能力とを有するので生殖し続
ける。細胞濃度を統針的に計算して一定数の細胞をおの
おのの別個の容器に隔離し、得られたクローンが申−融
合細胞から由来することを口■能とする。
Ｆ、既知のスクリーニング試験による各容器中の＃−，
澄液の評価。融合細胞を含む容器（容器内での検知でき
る細胞ＬＩ［によって１拠づ＆Ｊられる）からの十澄液
を、ＩｇＧ免疫グロブリンが存在するかとうかを測定す
るためおよび眩免疫原に対する抗１京が存在するかどう
かを測定するため試験した。免疫原にり１する抗体が検
知されたならば、抗体を公知の方法でさらにキャラクタ
リセーションする。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンを検
出する試験方法だけを用いたが、他のクラスの免疫グ１
′７プリンの検出ブ１法は公知であり、本発明をＩｇＧ
クラスのモノクローナル抗体に限定するつもりはない。
澄液の評価。融合細胞を含む容器（容器内での検知でき
る細胞ＬＩ［によって１拠づ＆Ｊられる）からの十澄液
を、ＩｇＧ免疫グロブリンが存在するかとうかを測定す
るためおよび眩免疫原に対する抗１京が存在するかどう
かを測定するため試験した。免疫原にり１する抗体が検
知されたならば、抗体を公知の方法でさらにキャラクタ
リセーションする。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンを検
出する試験方法だけを用いたが、他のクラスの免疫グ１
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クラスのモノクローナル抗体に限定するつもりはない。
ＩｇＭ、 ＩｇＡ、 ＩｇｌＥ、またはＬＢＩ’）
ククスのモノクローナル抗体も産生することが可能であ
か）、これらの抗体は本発明の部分であると意図してい
る。
ククスのモノクローナル抗体も産生することが可能であ
か）、これらの抗体は本発明の部分であると意図してい
る。
〔）、限界希釈法による融合細胞の選択およびクローニ
ング。
ング。
Ｈ，選択されかつクローニングされた細胞の連続細駒培
養中−・の導入。
養中−・の導入。
■、モノクローナル抗体の産生。所望の融合細１が選択
されかつクローニングされたならば、この所望の融合細
胞を、適当な培地中で適当な時間、仕体外培養した後、
上澄液から所望の抗体を回収することによって、抗体を
産生させることができる６適当な培地および適当な培養
時間は、既知であるか、あるいは容易に決定することが
できる。別法では、融合細胞を照射されたウサギまたは
ヌートマリスに注入し、適当なインキュベーション時間
後、宿主の血流および腹欣浸出液中で所望の抗体を産生
させることが１１能であるはずである。
されかつクローニングされたならば、この所望の融合細
胞を、適当な培地中で適当な時間、仕体外培養した後、
上澄液から所望の抗体を回収することによって、抗体を
産生させることができる６適当な培地および適当な培養
時間は、既知であるか、あるいは容易に決定することが
できる。別法では、融合細胞を照射されたウサギまたは
ヌートマリスに注入し、適当なインキュベーション時間
後、宿主の血流および腹欣浸出液中で所望の抗体を産生
させることが１１能であるはずである。
夾施阿−」
ＴＰ−３Ｉｌｌ胞糸の作製
ＴＰ−３細胞系のウサギ脾臓細飽から誘導した。
Ｊ、Ｊ、コリンズ（Ｊ、Ｊ、Ｃｏ１１＋ｎｓ ）ら、Ｐ
、Ｎ、Ａ、Ｓ、。
、Ｎ、Ａ、Ｓ、。
７１、 ２６０−６２（１９７４）の方法を用い、ウサ
ギ１１臓細胞をＳＶ４０で形質転換させてＴ ＲＳ Ｃ
−１細胞糸を作製した。この細胞を（１，０２％＋２．
ＭＳＦに暴純することによってＴ）？５Ｃ−１細胞系の
突然変異を達成させた。ＥＭＳＦへの暴露後、６−チオ
グアニン含有培地中で選択を行って安定なＨＧ Ｐ Ｒ
ｉ’−突然変異体細胞系を得た。この細胞を、ＨＡ ′
Ｔ”に対する極度の感受性、復帰突然変異体レベルが低
いことおよび１０％胎児ウシ而清（Ｆｅ２）を含むＲ）
） Ｍ Ｉ １６４０組織培養培地〔ベーリンガーマン
ハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）から
導入）中での迅速増殖能力でさらに選択した。
ギ１１臓細胞をＳＶ４０で形質転換させてＴ ＲＳ Ｃ
−１細胞糸を作製した。この細胞を（１，０２％＋２．
ＭＳＦに暴純することによってＴ）？５Ｃ−１細胞系の
突然変異を達成させた。ＥＭＳＦへの暴露後、６−チオ
グアニン含有培地中で選択を行って安定なＨＧ Ｐ Ｒ
ｉ’−突然変異体細胞系を得た。この細胞を、ＨＡ ′
Ｔ”に対する極度の感受性、復帰突然変異体レベルが低
いことおよび１０％胎児ウシ而清（Ｆｅ２）を含むＲ）
） Ｍ Ｉ １６４０組織培養培地〔ベーリンガーマン
ハイム（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）から
導入）中での迅速増殖能力でさらに選択した。
か＜Ｌ、−（ｉ巽４）Ｉ！された′ｒ ｐ −３細Ｍ包
を連続培養に導入した。この”ｌ” ｌ） −３細胞の
培養を、細胞増殖が過１番に激Ｌ２＜なったとき、１０
％ＦＣ３を含むＩＩ鼾なＲＰ Ｍ ｌ １ｆｉ４０中に
既知数の細胞を入れることＧ、′″、、１って 、次培
養に分割した。′ｒ’ ｌ） −３細胞は、連続培養中
、数年後も安定のま＼であった。
を連続培養に導入した。この”ｌ” ｌ） −３細胞の
培養を、細胞増殖が過１番に激Ｌ２＜なったとき、１０
％ＦＣ３を含むＩＩ鼾なＲＰ Ｍ ｌ １ｆｉ４０中に
既知数の細胞を入れることＧ、′″、、１って 、次培
養に分割した。′ｒ’ ｌ） −３細胞は、連続培養中
、数年後も安定のま＼であった。
試験は、′ＵＩ）−３細抱糸が数年間の連続培養期間中
ずっと一ノサギの４１Ｆ質を保持することを不した。
ずっと一ノサギの４１Ｆ質を保持することを不した。
′１゛Ｉ）−！目ｌｌ１１表向）では、依然としてウサ
ギＢ −ミクｒ１グロブリンが検出可能であり、かつ制
御Ｑ！酵素で消化されに１” Ｉ）−３のｒｌＮＡの７
ガロ一スゲ月川での゛市気泳＠Ｉ＋ｉ１、同様に消什１
された＋Ｆ’帛なウリ′ギＩＩ Ｎ八と同し７パターン
を与える。さらに、ウサギｒ’ｌ Ｎ Ａの（１７）ツ
パｉ′Ｍ伝了とのみパイプリダイビーショ゛／を行う特
異的Ｄ Ｎ Ａの使用はＴ Ｉ）−３ｍ１１１Ｈｈ１Ｍ
＋１ Ｎ Ａとハイプリダイセージランを行う。
ギＢ −ミクｒ１グロブリンが検出可能であり、かつ制
御Ｑ！酵素で消化されに１” Ｉ）−３のｒｌＮＡの７
ガロ一スゲ月川での゛市気泳＠Ｉ＋ｉ１、同様に消什１
された＋Ｆ’帛なウリ′ギＩＩ Ｎ八と同し７パターン
を与える。さらに、ウサギｒ’ｌ Ｎ Ａの（１７）ツ
パｉ′Ｍ伝了とのみパイプリダイビーショ゛／を行う特
異的Ｄ Ｎ Ａの使用はＴ Ｉ）−３ｍ１１１Ｈｈ１Ｍ
＋１ Ｎ Ａとハイプリダイセージランを行う。
勿論、′１゛１）−３細ｌ包糸の細胞はｃノサギ肺臓細
胞の了ｆ系である。
胞の了ｆ系である。
′ＦＰ−３細胞糸の試＊ｌは、１９８５年３月２７１１
に、米国メリーラン１川、ロックビルのアノリカン タ
イプ カルチャー コレクション「＾ｍｅｒ＋ｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （
ＡＴＣ（’） ’）に寄託された。この＃＠Ｍω糸の寄
託蕃勺は（′、Ｔ目７目子８７６１、った。
に、米国メリーラン１川、ロックビルのアノリカン タ
イプ カルチャー コレクション「＾ｍｅｒ＋ｃａｎ
ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ （
ＡＴＣ（’） ’）に寄託された。この＃＠Ｍω糸の寄
託蕃勺は（′、Ｔ目７目子８７６１、った。
Ｔ１・−３１１１Ｉｌｉｆ！Ｉ糸の細胞を、後でよ句詳
ｔＭＪζ、−説明するように、種々Ｏ）抗原で免疫処置
されたウサギからのリンパ球と融合させて、４−ノ））
１７一リル抗体産牛能力のある融合細胞を作製１．た。
ｔＭＪζ、−説明するように、種々Ｏ）抗原で免疫処置
されたウサギからのリンパ球と融合させて、４−ノ））
１７一リル抗体産牛能力のある融合細胞を作製１．た。
害萼例−？−
ウサギを免疫処置する方法
１、−ンル−（・リツンーリ−ど一〆１（４逸］昏グＹ
背：ノルトリフ。
背：ノルトリフ。
チリン（Ｎ ’ｒ）を、１−シフ［７ヘキシルー３−（
２−モルホリノユチル）−カルボジイミ１−ノド−ｐ−
ｔ・ルエンスルホネ−１・（７Ｐル１′リツチ（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ ） Ｃ，１０，６４＋１−２３を用いてスク
パノニル化ウシ血清アルブミン（ＳＢＳＡ）にカップリ
ングさせた。カップリング後、５Ｒ５Ａ−ＮＴを］Ｏｍ
Ｍ燐酸塩緩ｉｋ 食ｍ水（Ｐ Ｂ Ｓ） 、ｐＨ７，４
に、濃度１．０■７’＋１で溶解した。次に、この溶液
１．０＋５ｌｆ６：’＄容量のコンプリー１・ フロイ
ント −？ジー１八ンｌ−（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｅ
ｕｎｄ’ｓ＾ｄｊｕｖａｎｔ （ＣＦ Ａ ） ）中に
乳化し２、得られたエマルション４数匹のウサギのおの
おのの名車部位に皮肉注射した。１５日後、１．Ｏｗ／
＋ｎｌ濃度の５ＢＳＡ−ＮＴ１．Ｏｍｌを等容）Ａのイ
ンコンプリー１・ フロイント−アジュバン１ （Ｉｎ
ｃｏＩｌｐｌｅｔｅ ｌ’ｒｅｕｎｄ、ｓ Ａ＋１ｊ
ｕｖａｎｔ （Ｉ ｌ’ Ａ ）１中に乳化Ｌ７、青
ら］またエマルションを、各つ４Ｊ′ギの１つの部（つ
に皮１゛注射し７た。１ｊ…間浅、Ｆ、ｌ、ｉＳＡ試験
（（友達のｒｃＬｌｓＡ試騒・の説明参照）を行うごと
によ−、て・す→」４−の多りｒ：Ｉ−ン竹抗体応答を
評（面した。６力１月扱オン、Ｊ：びｉ’ Ｐ−３細ｌ
ｌ旬との１前合の３１−１前に、ウサギ番ニア ０．５
ｍＩＰ Ｂ Ｓ 、、ｐＨ７、４中０５）ｔｒｙ ：’
ｈ Ｂ Ｓ八−Ｎ Ｔの静脈内ブーヌター注射を行った
。
２−モルホリノユチル）−カルボジイミ１−ノド−ｐ−
ｔ・ルエンスルホネ−１・（７Ｐル１′リツチ（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ ） Ｃ，１０，６４＋１−２３を用いてスク
パノニル化ウシ血清アルブミン（ＳＢＳＡ）にカップリ
ングさせた。カップリング後、５Ｒ５Ａ−ＮＴを］Ｏｍ
Ｍ燐酸塩緩ｉｋ 食ｍ水（Ｐ Ｂ Ｓ） 、ｐＨ７，４
に、濃度１．０■７’＋１で溶解した。次に、この溶液
１．０＋５ｌｆ６：’＄容量のコンプリー１・ フロイ
ント −？ジー１八ンｌ−（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｐｒｅ
ｕｎｄ’ｓ＾ｄｊｕｖａｎｔ （ＣＦ Ａ ） ）中に
乳化し２、得られたエマルション４数匹のウサギのおの
おのの名車部位に皮肉注射した。１５日後、１．Ｏｗ／
＋ｎｌ濃度の５ＢＳＡ−ＮＴ１．Ｏｍｌを等容）Ａのイ
ンコンプリー１・ フロイント−アジュバン１ （Ｉｎ
ｃｏＩｌｐｌｅｔｅ ｌ’ｒｅｕｎｄ、ｓ Ａ＋１ｊ
ｕｖａｎｔ （Ｉ ｌ’ Ａ ）１中に乳化Ｌ７、青
ら］またエマルションを、各つ４Ｊ′ギの１つの部（つ
に皮１゛注射し７た。１ｊ…間浅、Ｆ、ｌ、ｉＳＡ試験
（（友達のｒｃＬｌｓＡ試騒・の説明参照）を行うごと
によ−、て・す→」４−の多りｒ：Ｉ−ン竹抗体応答を
評（面した。６力１月扱オン、Ｊ：びｉ’ Ｐ−３細ｌ
ｌ旬との１前合の３１−１前に、ウサギ番ニア ０．５
ｍＩＰ Ｂ Ｓ 、、ｐＨ７、４中０５）ｔｒｙ ：’
ｈ Ｂ Ｓ八−Ｎ Ｔの静脈内ブーヌター注射を行った
。
２、！ニーじＷ四１１０）仁−！−イノ１グ子面坑訓１
−リ（Ｂ ｊ−％、ｇ） ｔ：工↓／２ｊロ貨Ｊハ乳
：濃度’ Ｏ／’ ＩＴ／＋ｎｌのＨＲＳへｇの正常食
塩水溶液を等容量のＣＦ八で乳化し７か。次に１、τの
エマルシュ１ン１、Ｏｍｌを数匹の１’７４トギのおの
おのの多重部４１′Ｆに皮肉注射した。１５［］扱、Ｉ
ＦＡと等容量のｐＨ７、４、？１ｌｌｌ’ １． Ｏｎ
ｒ ／ ｍｌのＴ（１３Ｓ八ｇのｐＢｓｆｇ液とのエマ
ルション１．（１７を各ウサギの１つの部位に皮下注射
した。融合の３日前に、０、１ ｍｇ ／ ｌｌ１ｌの
抗摩食塩水Ｖａ 液０．５ ＊＋Ｉ’Ｇ−静脈内ブース
ター注射を行った。
−リ（Ｂ ｊ−％、ｇ） ｔ：工↓／２ｊロ貨Ｊハ乳
：濃度’ Ｏ／’ ＩＴ／＋ｎｌのＨＲＳへｇの正常食
塩水溶液を等容量のＣＦ八で乳化し７か。次に１、τの
エマルシュ１ン１、Ｏｍｌを数匹の１’７４トギのおの
おのの多重部４１′Ｆに皮肉注射した。１５［］扱、Ｉ
ＦＡと等容量のｐＨ７、４、？１ｌｌｌ’ １． Ｏｎ
ｒ ／ ｍｌのＴ（１３Ｓ八ｇのｐＢｓｆｇ液とのエマ
ルション１．（１７を各ウサギの１つの部位に皮下注射
した。融合の３日前に、０、１ ｍｇ ／ ｌｌ１ｌの
抗摩食塩水Ｖａ 液０．５ ＊＋Ｉ’Ｇ−静脈内ブース
ター注射を行った。
３、乙火１と！−町二四によ一４免佼基−置−アルブト
ツノロール（ａｌｐ）をＢ Ｓ Ａのような蛋白質にカ
ップリングさせた。カップリングは、Ｓ、チャマット、
Ｊ、ヘービーク、 Ａ、 Ｉ）、ストロスヘルグ（Ｓ、
Ｃｈａｍａｔ、 、Ｊ、 １ｌｏｅｂｅｋｅ ａｎ
〔ｌΔ。
ツノロール（ａｌｐ）をＢ Ｓ Ａのような蛋白質にカ
ップリングさせた。カップリングは、Ｓ、チャマット、
Ｊ、ヘービーク、 Ａ、 Ｉ）、ストロスヘルグ（Ｓ、
Ｃｈａｍａｔ、 、Ｊ、 １ｌｏｅｂｅｋｅ ａｎ
〔ｌΔ。
１５４’１−５２ （］’９８４）中に記載１．でいる
ようにして行った。Ｂ Ｓ Ａ−アルプレノＩ＋−ル（
Ｒ８Δ−ａｌｐ）複合体を、１０ｍＭ ＰＢＳ。
ようにして行った。Ｂ Ｓ Ａ−アルプレノＩ＋−ル（
Ｒ８Δ−ａｌｐ）複合体を、１０ｍＭ ＰＢＳ。
ｐＨ７、４中に、１．０■／（イ）１の濃度に懸濁させ
た。この懸濁液２譚１を等容量のＣＦＡと混合し、次に
、数匹の１′７′＋ギのおのおのの多重部位に皮肉注射
した。１か列後、等容量のＩＦＡで乳化り、た１、０■
／１濃度の抗［１，Ｏｍｌを皮下注射した。融合の３日
曲に、ＩＦＡ中０．５＋ＫｒＲ３Ａ−ａｌｐのブースタ
−注射を行った。ａｌｐに対する多クローン性抗体の存
７トを、ｌ吃Ｌ Ｉ Ｓ Ａ試験（１＆述の１（ＬＩＳ
Ａの詳細な説明参！！４ ）によって試験した。
た。この懸濁液２譚１を等容量のＣＦＡと混合し、次に
、数匹の１′７′＋ギのおのおのの多重部位に皮肉注射
した。１か列後、等容量のＩＦＡで乳化り、た１、０■
／１濃度の抗［１，Ｏｍｌを皮下注射した。融合の３日
曲に、ＩＦＡ中０．５＋ＫｒＲ３Ａ−ａｌｐのブースタ
−注射を行った。ａｌｐに対する多クローン性抗体の存
７トを、ｌ吃Ｌ Ｉ Ｓ Ａ試験（１＆述の１（ＬＩＳ
Ａの詳細な説明参！！４ ）によって試験した。
）１−梅（り唄−Ｈ＋−
’Ｉ’ ｌ） −：）細■（すと免疫処置されたウジ・
＋１１Ｉ臓細胞Ａ′）、−は神経節（Ｉｌｌ ＩＩ旬、
）二の融合免疫処置されたつ４；・ギの肺臓細胞の羊−
細ｌｌ！Ｉ懸濁渣を、＋１１臓中−２絹織培地を注入し
てカプセルを破壊することＧ５）って得た。次に、Ｔ
Ｉ） −３細胞＾脾臓細駒とを、′ｒ ）） −３細胞
１１１７ｔ１につき脾臓細胞］（１７１ｆ＋ｌの１しで
混合した。１（１′個の牌ｙｉ＆細胞につきＲＰ Ｍ
Ｉ １６４ｆ川１４］’１６の濃度で１）ＩｊＧ（メル
クア−１・（Ｍｅｒｋ Ａｒｔ、’） ｆ（（１７４
８９’ｌ ２． Ｏｍｌをｉ余々に添加することに、１
、っ−と融合を達成させた。この融合混合物を、次に、
３７℃にが了１分■旧イン４・ユヘ−１・し、次に、２
５°Ｃに於゛ζ、２（１１）Ｏｒｐｍで１０分間遠心分
離し２ｋ。細胞を、Ｒｌ） Ｍ Ｉ １６４（ｌで１回
洗い、最後に、細１ｌｉＩｉ市度２Ｘ１０６胛臓細胞／
１で、１０％Ｆ ＣＳ含有ＲＰ Ｍ Ｉ １６４（ｌ中
に内゛ｉひ濁させた。
＋１１Ｉ臓細胞Ａ′）、−は神経節（Ｉｌｌ ＩＩ旬、
）二の融合免疫処置されたつ４；・ギの肺臓細胞の羊−
細ｌｌ！Ｉ懸濁渣を、＋１１臓中−２絹織培地を注入し
てカプセルを破壊することＧ５）って得た。次に、Ｔ
Ｉ） −３細胞＾脾臓細駒とを、′ｒ ）） −３細胞
１１１７ｔ１につき脾臓細胞］（１７１ｆ＋ｌの１しで
混合した。１（１′個の牌ｙｉ＆細胞につきＲＰ Ｍ
Ｉ １６４ｆ川１４］’１６の濃度で１）ＩｊＧ（メル
クア−１・（Ｍｅｒｋ Ａｒｔ、’） ｆ（（１７４
８９’ｌ ２． Ｏｍｌをｉ余々に添加することに、１
、っ−と融合を達成させた。この融合混合物を、次に、
３７℃にが了１分■旧イン４・ユヘ−１・し、次に、２
５°Ｃに於゛ζ、２（１１）Ｏｒｐｍで１０分間遠心分
離し２ｋ。細胞を、Ｒｌ） Ｍ Ｉ １６４（ｌで１回
洗い、最後に、細１ｌｉＩｉ市度２Ｘ１０６胛臓細胞／
１で、１０％Ｆ ＣＳ含有ＲＰ Ｍ Ｉ １６４（ｌ中
に内゛ｉひ濁させた。
この融合細胞を、次にＮ ＬＪ Ｎ Ｃフクント組織培
掩プＥ／−１中に一〕′リクオートした（ａｌｉｑｕｏ
ｔｅｄ ）。
掩プＥ／−１中に一〕′リクオートした（ａｌｉｑｕｏ
ｔｅｄ ）。
２１１ＡＩ （７’＋ Ｎ ＩＩ Ｎ （二２４ ’
） エル７ しｌｏ） ％ ’） Ｉルヘ１１を加えた
。細−；すを、＋ （１％Ｃ０２含ｆ４′＃囲気中−（
・、３′に（゛い綴でインキュー＝＞ＬＬ、た。培養開
始１１を第１１１−１ ａ： Ｌ、た。第１．第４．第
′ｌ、第１１Ｈに、ＨＡ Ｔ培１ｔ！＋（１０％Ｆ”
ＣＳお、トひＨＡ１゛を含むＲＰＭ Ｉ Ｉｌｌ４［１
）で培則を部用的に置換することによって培養４−供１
ａシた。
） エル７ しｌｏ） ％ ’） Ｉルヘ１１を加えた
。細−；すを、＋ （１％Ｃ０２含ｆ４′＃囲気中−（
・、３′に（゛い綴でインキュー＝＞ＬＬ、た。培養開
始１１を第１１１−１ ａ： Ｌ、た。第１．第４．第
′ｌ、第１１Ｈに、ＨＡ Ｔ培１ｔ！＋（１０％Ｆ”
ＣＳお、トひＨＡ１゛を含むＲＰＭ Ｉ Ｉｌｌ４［１
）で培則を部用的に置換することによって培養４−供１
ａシた。
”ｒ ｐ −：う細胞ｋｌ極度ぽ１」へ１感受性で、）
１すＨＡＴ含自含油培地増殖しないので、ＩＩ Ａ ’
Ｖ培地は融合＄ｌｌＩ胞を選択する。さらに、使用した
細胞のような低い細胞濃度に於ける細■包の培養は、申
−融合細胞から誘導されろ細胞のクローンが産ルされる
ことをＩｎ１度に１ｊ■能にする。申−・融合８１１１
ｌＩ；４のクローンが得られるこ、！を保献するため
、融合細胞をｌｉｔ、’界希釈によっ（さりζご選ｔＲ
Ｉ−７た。甲−融合細胞から誘導されイ、り１：＋−ン
はモノクローナル抗体を産イ１−する。
１すＨＡＴ含自含油培地増殖しないので、ＩＩ Ａ ’
Ｖ培地は融合＄ｌｌＩ胞を選択する。さらに、使用した
細胞のような低い細胞濃度に於ける細■包の培養は、申
−融合細胞から誘導されろ細胞のクローンが産ルされる
ことをＩｎ１度に１ｊ■能にする。申−・融合８１１１
ｌＩ；４のクローンが得られるこ、！を保献するため
、融合細胞をｌｉｔ、’界希釈によっ（さりζご選ｔＲ
Ｉ−７た。甲−融合細胞から誘導されイ、り１：＋−ン
はモノクローナル抗体を産イ１−する。
得られた融合ｔｌ［Ｉｌｌ包り１１−ンｑンよび号゛）
ｌ）ローンを連結培養中へ導入１．た。細胞培養が激し
、くなりすぎたとき、既知数の細胞を新鮮な１０％Ｆ
ｆｒ、 Ｓ含有ＲＰＭｒ中４７入れることによって、融
合細胞の培養４−細胞培養に細分割（５ｕｈｄｉｖｉｄ
ｅｒｌ） した。
ｌ）ローンを連結培養中へ導入１．た。細胞培養が激し
、くなりすぎたとき、既知数の細胞を新鮮な１０％Ｆ
ｆｒ、 Ｓ含有ＲＰＭｒ中４７入れることによって、融
合細胞の培養４−細胞培養に細分割（５ｕｈｄｉｖｉｄ
ｅｒｌ） した。
ａｌｌ１４．ｒ対するモノクローナル抗体を産／４＝す
る融合細胞Ｉコの試料は、１９８５年４月４日にＡ Ｔ
ＣＣに寄ｉｔｈさ４１／：。この融合細胞系の寄託番
号上ｔ ＨＲ８７７６であった。
る融合細胞Ｉコの試料は、１９８５年４月４日にＡ Ｔ
ＣＣに寄ｉｔｈさ４１／：。この融合細胞系の寄託番
号上ｔ ＨＲ８７７６であった。
最初、得られた融合細胞は付着細胞であった。
融合細胞の、ての付着性は、細胞の犬バッチ増殖を困難
にし、た。！Ｉ’！’、ｌ１７Ａ液中で増殖する融合細
胞を、細胞がプ１／−１に付着しない傾向があるよう番
こ特殊処理された培養プし・−トであるＮ ＩＩ Ｎ
Ｃフィブロプラスト ブリマリア プレー１・（Ｎ Ｕ
Ｎ Ｃｔｉｉｂｒｏｂｌａｓｌ、 Ｐｒｉ＊ａｒｉ
ａ ｐｌａｔｅ ）上で細胞を増殖させることによっ
て選択した。使用した培地は１０％ＦＣ８含有ＲＰＭ
Ｉ １６４０であった。
にし、た。！Ｉ’！’、ｌ１７Ａ液中で増殖する融合細
胞を、細胞がプ１／−１に付着しない傾向があるよう番
こ特殊処理された培養プし・−トであるＮ ＩＩ Ｎ
Ｃフィブロプラスト ブリマリア プレー１・（Ｎ Ｕ
Ｎ Ｃｔｉｉｂｒｏｂｌａｓｌ、 Ｐｒｉ＊ａｒｉ
ａ ｐｌａｔｅ ）上で細胞を増殖させることによっ
て選択した。使用した培地は１０％ＦＣ８含有ＲＰＭ
Ｉ １６４０であった。
！１′！！濁液中で融合細胞系を増殖させることは、細
胞の大バッチ増殖を可能にしたが、照射されたウサギま
たはヌードマウス中への注入および増殖を可能にしなけ
ればならない。融合細胞の大量のまたは動物中での増殖
は、大量のモノクローナル抗体が１７られうることを意
味する。
胞の大バッチ増殖を可能にしたが、照射されたウサギま
たはヌードマウス中への注入および増殖を可能にしなけ
ればならない。融合細胞の大量のまたは動物中での増殖
は、大量のモノクローナル抗体が１７られうることを意
味する。
免疫処置されたつ号ギからの神経節細胞をも、ウナギ牌
１藏細胞について」二６述したと同じ方法を用いてＴＰ
−３細胞と融合させた。
１藏細胞について」二６述したと同じ方法を用いてＴＰ
−３細胞と融合させた。
免疫処置されたウサギ細胞とり、ＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭ
Ｙ−２細胞との間の融合も、使用した肺臓細胞： Ｌ
Ｉ ＣＲ−ＬＯＮ−）（ＭＹ−２の比が約２５：１であ
る以外は上述と同じ方法を用いて企画された。ＬＩ Ｃ
Ｒ−ＬＯＮ−ＨＭＹ−２は８−アザグアニン抵抗性ヒト
形質細胞腫細胞系であり、Ｋ、Ｍ、パーク（Ｋ、 Ｍ、
Ｂｕｒｋ）らによってＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、
３８．２５０８−２５）３ （１９７８）に、および
Ｐ、Ａ、Ｗ、エドワーズ（Ｐ、＾、Ｗ、Ｅｄｗａｒｄｓ
）らによってネーチャー Ｎａｔｕｒｅ） ＋ ３
（１１）＋２６ロー６７ （１９Ｂ２）に記載されてい
る。ウサギ１ｌｆ１！臓細胞とＬ Ｉ ＣＲ−ＬＯＮ−
ＨＭＹ−２とを融合させようとする企画は不成功で、融
合細胞は得られなかった。従って、スクリーニング試験
の幾つかに於ては、これらの培養の上澄液を陰性対照と
して用いた。
Ｙ−２細胞との間の融合も、使用した肺臓細胞： Ｌ
Ｉ ＣＲ−ＬＯＮ−）（ＭＹ−２の比が約２５：１であ
る以外は上述と同じ方法を用いて企画された。ＬＩ Ｃ
Ｒ−ＬＯＮ−ＨＭＹ−２は８−アザグアニン抵抗性ヒト
形質細胞腫細胞系であり、Ｋ、Ｍ、パーク（Ｋ、 Ｍ、
Ｂｕｒｋ）らによってＣａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、、
３８．２５０８−２５）３ （１９７８）に、および
Ｐ、Ａ、Ｗ、エドワーズ（Ｐ、＾、Ｗ、Ｅｄｗａｒｄｓ
）らによってネーチャー Ｎａｔｕｒｅ） ＋ ３
（１１）＋２６ロー６７ （１９Ｂ２）に記載されてい
る。ウサギ１ｌｆ１！臓細胞とＬ Ｉ ＣＲ−ＬＯＮ−
ＨＭＹ−２とを融合させようとする企画は不成功で、融
合細胞は得られなかった。従って、スクリーニング試験
の幾つかに於ては、これらの培養の上澄液を陰性対照と
して用いた。
実栴例−」−
スクリーニング試験
融合細胞培養からの上澄液を、抗体を検出しかつキャラ
クタリセーシゴンするための幾つかのスクリーニング試
験の１つで試験した。さらに、免疫処１ｌＩＩＩ′され
ノこ＋’７１１−４−に於ける多クローン性抗体の出現
を監視するため、以Ｆに説明するＥＬＩＳＡ試験を用い
た。
クタリセーシゴンするための幾つかのスクリーニング試
験の１つで試験した。さらに、免疫処１ｌＩＩＩ′され
ノこ＋’７１１−４−に於ける多クローン性抗体の出現
を監視するため、以Ｆに説明するＥＬＩＳＡ試験を用い
た。
一随↓Ｊ−≦４戸培養の第１５［］に、融吉細胞培養の
上澄液についてＲ１，ＩＳＡ試験を打つ了 Ｎ ’ｒ（
、”対する抗体が存在するかどうかを測定した。試験は
［記の３１−うに行った。カメル（にａｍｅｌ ）らが
Ｃｌ１ｎ、 ｃｈｅｓｌｌ、 ＋ ２５． １９９７（
１！＋ ７９ ） ｉ、こ記載している方法を用いてリ
ゾ千−ムーノルトリブナリン配合体（１，Ｎ ′ｒ）を
調製し７１：。１ユの１． Ｎ ｉ’を、ポリスチレン
プレート（Ｎ ｔＪ Ｎ ｌ”、ミクロタイター１、
廿９ｆ’ｉ Ｆ ？−３！１４５４ ） ｔＤつ、ｘル
４１’Ｊ’ｆｉｌするためｔご用いた。ウェルを？ｌ＆
１−１− ＋、ため、１０ｒｎＭ Ｔ’１３Ｓ、
ｐＨ？、４中の５ ／’ ｌ？ ／ ｍｌの１、 Ｎ
Ｔ溶液５０メ！７！を各ウコールー、加λた。次に、
プレー１を室温で９０分間インキ、ベー１した。自由吸
＋１７部位をｒ’ Ｂ ８９３％１うＳＡで飽和しまた
。次に、培養上澄液の十ンのおのの０、０５ ＋ｇｌを
ウェルへ加え、プレートを室温で１；（）分間インキュ
ベートした。次に、ベルオキ・−ｌダーゼ６、ニカソブ
リングさせたヤギ抗ウナギ抗体（Ｇ Ａ Ｒ−ベルオキ
ソダーぎ）の適当２／希釈川゛のもの ０． （１５ｍ
ｌを加え、プ１／−１を室温で９０分間・インキ１−＼
−トした。洗浄後、基質２．２−アシノーシー：（−エ
チルベンズ千ヱソ′りニア スルホン酸（Ａ ＨＴ Ｓ
）〔うノグマ（Ｓｉｇｍａ ） Ｒｅｆ、Ａ １８８
８） ０．２ ｍｌを加λ、た。ＮＴに対する抗体の存
在は、４０５ｒ＋ｍ４′於ける吸光度の増加によってポ
された。
上澄液についてＲ１，ＩＳＡ試験を打つ了 Ｎ ’ｒ（
、”対する抗体が存在するかどうかを測定した。試験は
［記の３１−うに行った。カメル（にａｍｅｌ ）らが
Ｃｌ１ｎ、 ｃｈｅｓｌｌ、 ＋ ２５． １９９７（
１！＋ ７９ ） ｉ、こ記載している方法を用いてリ
ゾ千−ムーノルトリブナリン配合体（１，Ｎ ′ｒ）を
調製し７１：。１ユの１． Ｎ ｉ’を、ポリスチレン
プレート（Ｎ ｔＪ Ｎ ｌ”、ミクロタイター１、
廿９ｆ’ｉ Ｆ ？−３！１４５４ ） ｔＤつ、ｘル
４１’Ｊ’ｆｉｌするためｔご用いた。ウェルを？ｌ＆
１−１− ＋、ため、１０ｒｎＭ Ｔ’１３Ｓ、
ｐＨ？、４中の５ ／’ ｌ？ ／ ｍｌの１、 Ｎ
Ｔ溶液５０メ！７！を各ウコールー、加λた。次に、
プレー１を室温で９０分間インキ、ベー１した。自由吸
＋１７部位をｒ’ Ｂ ８９３％１うＳＡで飽和しまた
。次に、培養上澄液の十ンのおのの０、０５ ＋ｇｌを
ウェルへ加え、プレートを室温で１；（）分間インキュ
ベートした。次に、ベルオキ・−ｌダーゼ６、ニカソブ
リングさせたヤギ抗ウナギ抗体（Ｇ Ａ Ｒ−ベルオキ
ソダーぎ）の適当２／希釈川゛のもの ０． （１５ｍ
ｌを加え、プ１／−１を室温で９０分間・インキ１−＼
−トした。洗浄後、基質２．２−アシノーシー：（−エ
チルベンズ千ヱソ′りニア スルホン酸（Ａ ＨＴ Ｓ
）〔うノグマ（Ｓｉｇｍａ ） Ｒｅｆ、Ａ １８８
８） ０．２ ｍｌを加λ、た。ＮＴに対する抗体の存
在は、４０５ｒ＋ｍ４′於ける吸光度の増加によってポ
された。
第１図に、培養上澄液中の抗ＮＴ（ｉ”し体のための１
−２１．ＩＳＡ試験の結果をポす。縦軸に波１４０５ｎ
ｍに於ける溶液の光学密度（（１７））をボし、横軸に
被験りエルの番号を示す。
−２１．ＩＳＡ試験の結果をポす。縦軸に波１４０５ｎ
ｍに於ける溶液の光学密度（（１７））をボし、横軸に
被験りエルの番号を示す。
第１図を見るとわかるように、３５個のウェル中の１４
１因が陽性（斜線バーは陽性ウェルを示す）であり、Ｎ
Ｔに対する抗体を産生する融合細胞が３５個のウェル９
１４個に存在することをボした。試験された３５個のウ
ェルは、これらのウェル中に細胞増殖の存在があったた
めに選ばれたものである。陽性クローンをＨＹＬ−１−
ＨＹＬ−１４と命名した。
１因が陽性（斜線バーは陽性ウェルを示す）であり、Ｎ
Ｔに対する抗体を産生する融合細胞が３５個のウェル９
１４個に存在することをボした。試験された３５個のウ
ェルは、これらのウェル中に細胞増殖の存在があったた
めに選ばれたものである。陽性クローンをＨＹＬ−１−
ＨＹＬ−１４と命名した。
ｂ、 Ｌｌ！ｒａＱ−な吟ｐ、サ−ひユ廿−ＥＬＩ斗
Δ賊１：ボリスチレンＮ ＩＪ Ｎ Ｃミクロタイター
プレートのウェルを適当な濃度のヤギ抗つサギＩｇＧ抗
体１１．０５ ｍｌで被覆した。洗浄後、この被覆ウェ
ルへ、ＮＴで免疫処置されたウサギからの肺臓細胞と融
合させたＴＰ−３細胞の培養からの上澄液０．０５＊１
を加えた。次に、プレートを室温で６０分間・インキュ
ベートシた。さらに、各ウェルへ、Ｇ Ａ Ｒ−ベル」
キシダーゼ（１，０５ｍｌを加えた。室温に於て６０分
間インキュベートした後、０．２■／ｍ１ＡＢＴＳの１
（ｌ ｍＭ Ｐ Ｂ ＳＪＪ？ｆｋ （ｐｌ１７．
４ ） （１，２１を添加し、４０５ｎｍ＆−，於ける
吸光度の増加を監視した。
Δ賊１：ボリスチレンＮ ＩＪ Ｎ Ｃミクロタイター
プレートのウェルを適当な濃度のヤギ抗つサギＩｇＧ抗
体１１．０５ ｍｌで被覆した。洗浄後、この被覆ウェ
ルへ、ＮＴで免疫処置されたウサギからの肺臓細胞と融
合させたＴＰ−３細胞の培養からの上澄液０．０５＊１
を加えた。次に、プレートを室温で６０分間・インキュ
ベートシた。さらに、各ウェルへ、Ｇ Ａ Ｒ−ベル」
キシダーゼ（１，０５ｍｌを加えた。室温に於て６０分
間インキュベートした後、０．２■／ｍ１ＡＢＴＳの１
（ｌ ｍＭ Ｐ Ｂ ＳＪＪ？ｆｋ （ｐｌ１７．
４ ） （１，２１を添加し、４０５ｎｍ＆−，於ける
吸光度の増加を監視した。
ＲＬ Ｉ ＳＡで試験したと同じ３５）１１＋１のウェ
ルからの上澄液のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験の結果を
第２図に示す。３５個のｒ′２エル中２４個が陽性（斜
線バー）であ〃）、３５）１１ｉＩのウェル中の２４個
中でＩｇＧ抗体が融合細胞によって産生されつ＼あるこ
とを示すことがわかった。
ルからの上澄液のサンドイッチＥＬＩＳＡ試験の結果を
第２図に示す。３５個のｒ′２エル中２４個が陽性（斜
線バー）であ〃）、３５）１１ｉＩのウェル中の２４個
中でＩｇＧ抗体が融合細胞によって産生されつ＼あるこ
とを示すことがわかった。
ＮＴに対するＥＬＩＳＡ試験では陽性であるがこのサン
ドイッチＥ １． Ｉ Ｓ Ａｉｄ験では陰１４であろ
ウェルは、サンドイッチＥ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ試験で用い
たヤギ抗つサギＩｇＧ抗体では＠ ｉｌｉされないＩｇ
ＭまたはＩｇＡクラスの対ＮＴ抗体を分泌する融合細胞
を含んでいるかも知れない。このサンドインチＥＬＩＳ
Ａ試験では陽性であるがＥＬＩＳ八試験へは陰性である
つエルはＮ Ｔに対して活性のない分泌１ｇＧを含んで
いる。ＥＬ［ＳＡＡ試験サントイ・ノチ［ミ１、 Ｉ
Ｓ Ａ試験の両方に陽性のウェルはＮＴに対するＩｇＧ
抗体を産生ずる融合細胞を含んでいる。
ドイッチＥ １． Ｉ Ｓ Ａｉｄ験では陰１４であろ
ウェルは、サンドイッチＥ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ試験で用い
たヤギ抗つサギＩｇＧ抗体では＠ ｉｌｉされないＩｇ
ＭまたはＩｇＡクラスの対ＮＴ抗体を分泌する融合細胞
を含んでいるかも知れない。このサンドインチＥＬＩＳ
Ａ試験では陽性であるがＥＬＩＳ八試験へは陰性である
つエルはＮ Ｔに対して活性のない分泌１ｇＧを含んで
いる。ＥＬ［ＳＡＡ試験サントイ・ノチ［ミ１、 Ｉ
Ｓ Ａ試験の両方に陽性のウェルはＮＴに対するＩｇＧ
抗体を産生ずる融合細胞を含んでいる。
Ｃ０分緩試１；１のＥｌ、ＩＳＡ試験で確認された１
４１１Ｍの陽ＩＩ融合クローンを眼界希釈法でサブクロ
ーニングした。これらのサブクローンをＨＹ Ｌ 、−
］ ′−〜ｔ（Ｙ ［、、−１４５と命名した。サブク
ローンＨＹＬ−１’はりｌ：１７＋１ＹＬ−１から誘導
されたものであり、１１ｖ１、−２′−はりｌＩ−ンＩ
Ｉ”ｌ川、−２から誘導されたものであり、ｌタト同一
１である。・ジブク「オーフの１澄液を、異なる増殖段
階に於て上記ＥＬＩＳ＾試験によ−、て１、Ｎ′Ｆに幻
する結合の試験を行った。
４１１Ｍの陽ＩＩ融合クローンを眼界希釈法でサブクロ
ーニングした。これらのサブクローンをＨＹ Ｌ 、−
］ ′−〜ｔ（Ｙ ［、、−１４５と命名した。サブク
ローンＨＹＬ−１’はりｌ：１７＋１ＹＬ−１から誘導
されたものであり、１１ｖ１、−２′−はりｌＩ−ンＩ
Ｉ”ｌ川、−２から誘導されたものであり、ｌタト同一
１である。・ジブク「オーフの１澄液を、異なる増殖段
階に於て上記ＥＬＩＳ＾試験によ−、て１、Ｎ′Ｆに幻
する結合の試験を行った。
第；う図に承すよ゛）に、第４Ｈがｌ宅１−、 Ｉ Ｓ
Ａ試験が陽性になろ最初のＥｌであ〃八このＥＬＩＳ
＾試験でボされるよ・１）に、培養の第７日に、８個の
ザブクローンが陽１Ｊト（斜線バー）であった。事実、
培養の７日間中、信号は実際に増加１．た。
Ａ試験が陽性になろ最初のＥｌであ〃八このＥＬＩＳ
＾試験でボされるよ・１）に、培養の第７日に、８個の
ザブクローンが陽１Ｊト（斜線バー）であった。事実、
培養の７日間中、信号は実際に増加１．た。
１！ｌ、！！／ｉ！希着２γＪ一番こよ・ご）→トーノ
汐ローユンク（，１，ヰ命Ｉｌｌ ｉ＼４１）、・抗体
か中−１ｉｔ１！ に細胞かＣ二４馳綽、〜れる細■（
す１．′、１っ７産仕さＡ１イ］千ツク１゛１−ナルｌ
’ｉ：体−（′を釦、イ］ご５長を串見’ ｌ ６ｉｅ
かにす？）。さく７．に、第４１１がｌ’ Ｉ Ｉ
５ＡｉｌＫ験が１（易嗜）Ｉになる＾↓初の１１で沙、
イ、９５−い・）事’）ｚ、ｈ、−の陽性応答が実際Ｃ
′第゛ｌ［１までｆｆＱ加するという事実と４；ｔ：、
）、νＩｌ＋されノコ抗体が実際に融合細胞によって
作られかつ分泌され六・ごとをン１ヌしてい７（、。
汐ローユンク（，１，ヰ命Ｉｌｌ ｉ＼４１）、・抗体
か中−１ｉｔ１！ に細胞かＣ二４馳綽、〜れる細■（
す１．′、１っ７産仕さＡ１イ］千ツク１゛１−ナルｌ
’ｉ：体−（′を釦、イ］ご５長を串見’ ｌ ６ｉｅ
かにす？）。さく７．に、第４１１がｌ’ Ｉ Ｉ
５ＡｉｌＫ験が１（易嗜）Ｉになる＾↓初の１１で沙、
イ、９５−い・）事’）ｚ、ｈ、−の陽性応答が実際Ｃ
′第゛ｌ［１までｆｆＱ加するという事実と４；ｔ：、
）、νＩｌ＋されノコ抗体が実際に融合細胞によって
作られかつ分泌され六・ごとをン１ヌしてい７（、。
ｄ、竹ｑ４’Ｌ−（１）り１１ｊｉＪ、最も陽性でかつ
安定ノコ融合細胞１トフク１−２−ンの２つ（これらを
ＨＹ Ｌ−１５オンコひ’Ｔ（Ｙｌ−１４５と称す）の
培養の１澄液を、２種のハブテン−キャリヤ配合体、Ｒ
Ｓ△−ａｌｐ、１ンよひＴ、ＮＴ、を用いろ１１．ＩＳ
Ａ試験で試験ｔ７か。第４図の結果は、これら２つの融
合細吋包クローンがＮ ′Ｐ４こ女・１する１央い特Ｗ
性を有する抗体を産Ｌ１−することをボしＹい？）（第
４図のＡ部はＨＹ １．、−１ ’の結果をポし、Ｂ部
しよＩＩＹｌ、−１４５の結果をボず）。
安定ノコ融合細胞１トフク１−２−ンの２つ（これらを
ＨＹ Ｌ−１５オンコひ’Ｔ（Ｙｌ−１４５と称す）の
培養の１澄液を、２種のハブテン−キャリヤ配合体、Ｒ
Ｓ△−ａｌｐ、１ンよひＴ、ＮＴ、を用いろ１１．ＩＳ
Ａ試験で試験ｔ７か。第４図の結果は、これら２つの融
合細吋包クローンがＮ ′Ｐ４こ女・１する１央い特Ｗ
性を有する抗体を産Ｌ１−することをボしＹい？）（第
４図のＡ部はＨＹ １．、−１ ’の結果をポし、Ｂ部
しよＩＩＹｌ、−１４５の結果をボず）。
抗体かＮ′ｒに対して特異的であるという事実は抗体が
モノクローナル抗体であるという証拠でもある。
モノクローナル抗体であるという証拠でもある。
ｅ、ＤＥＡＥセルロースクロマトグラフィー：融合細胞
クローンおよびそのサブクローンの培養からの陽性上澄
液をプールした後、ｒ） ＥＡｌ吃−セルロースカラム
上で、０．（１７７５Ｍ ＰＢＳで、ｐＨ６，３に於
てクロマトグラフィーを行った。種々の免疫グロブリン
分画を溶出さ１、溶出分画を、上記のＮＴに対するＥｌ
ｌＳＡｌｌＳ用いて試験し７た。ＩｇＧを有する溶出ピ
ークは抗ＮＴ活性を含んでいたが、他のピークは抗ＮＴ
活性を含んでいなかった。
クローンおよびそのサブクローンの培養からの陽性上澄
液をプールした後、ｒ） ＥＡｌ吃−セルロースカラム
上で、０．（１７７５Ｍ ＰＢＳで、ｐＨ６，３に於
てクロマトグラフィーを行った。種々の免疫グロブリン
分画を溶出さ１、溶出分画を、上記のＮＴに対するＥｌ
ｌＳＡｌｌＳ用いて試験し７た。ＩｇＧを有する溶出ピ
ークは抗ＮＴ活性を含んでいたが、他のピークは抗ＮＴ
活性を含んでいなかった。
融合細胞によって分泌された対Ｎ′Ｆ抗体のすべてが申
−免疫グロブリンクラスであったという事実はこの抗体
がモノクローン性であることをさらに立１ｔｉＥ Ｌ、
ている。
−免疫グロブリンクラスであったという事実はこの抗体
がモノクローン性であることをさらに立１ｔｉＥ Ｌ、
ている。
ｆ、１■”＝）±オニンによる一内在−性欅織−；ＨＹ
Ｌ−１およびＨＹ １．、−１４と呼ばれるクローン
の融合細胞を、１０μＣｉの３１ｉＳ−メチオニンの存
在十で１２時間培養した。ニー澄液をと幻、凍結乾燥し
た後、ドデシル硫酸すＩ・リウム（Ｓ ｒ）Ｓ ）で可
溶化した。このＳ ｒ）Ｓ−ｉｆｉ化物を、ポリアクリ
ルアミドゲル−Ｉ−または酢酸セルロースプレート１−
で電気泳動を行った。電気泳動で、免疫グロブリン領域
中に単一の放射性バンドが検出された。抗体が中−の電
気泳動移動度を有するという事実は、抗体がモノクロー
ナル抗体であることを示す。
Ｌ−１およびＨＹ １．、−１４と呼ばれるクローン
の融合細胞を、１０μＣｉの３１ｉＳ−メチオニンの存
在十で１２時間培養した。ニー澄液をと幻、凍結乾燥し
た後、ドデシル硫酸すＩ・リウム（Ｓ ｒ）Ｓ ）で可
溶化した。このＳ ｒ）Ｓ−ｉｆｉ化物を、ポリアクリ
ルアミドゲル−Ｉ−または酢酸セルロースプレート１−
で電気泳動を行った。電気泳動で、免疫グロブリン領域
中に単一の放射性バンドが検出された。抗体が中−の電
気泳動移動度を有するという事実は、抗体がモノクロー
ナル抗体であることを示す。
ｇ、η−ターイーで一−ダニーの試験；ウサギのＩｇＧ
抗体はアロタイプマーカーと呼ばれる抗原決定基を有す
る。陽性培養からの−Ｌ澄液中へ融合細胞によって分泌
された免疫グロブリンｌ−のつ号ギアロタイブマーカー
（シリーズａおよびｂ）の存在は、ウサギ抗アロタイプ
（Ｆａｂ）’２フラグメン１を用いるミクロＥＬ Ｉ
Ｓ Ａ試験で不された。
抗体はアロタイプマーカーと呼ばれる抗原決定基を有す
る。陽性培養からの−Ｌ澄液中へ融合細胞によって分泌
された免疫グロブリンｌ−のつ号ギアロタイブマーカー
（シリーズａおよびｂ）の存在は、ウサギ抗アロタイプ
（Ｆａｂ）’２フラグメン１を用いるミクロＥＬ Ｉ
Ｓ Ａ試験で不された。
特異的抗アロタイプ曲消を調製し、かつ種々の免疫グロ
ブリン分肉を、ｎＥＡＥセルロ−ス クロマトグラフィ
ーで得た。次に、各免疫グ１１プリン分画にλｌｔ、、
てペプシンによる消化を行って（Ｆａｂ’）２分画を得
た。この（Ｆａｂ ’ ） ２う）画をＮ ＩＪ Ｎ
Ｃミクロタイタープレー１１−に被覆した（１０μｇ／
ｌ）。十澄液中のＩｇＧ−１に於ける種種のアロタイプ
マーカーの存在は、ペルオキシダーゼで標識された特異
的ヤギ抗ウサギＰｃを添加することによってボされた。
ブリン分肉を、ｎＥＡＥセルロ−ス クロマトグラフィ
ーで得た。次に、各免疫グ１１プリン分画にλｌｔ、、
てペプシンによる消化を行って（Ｆａｂ’）２分画を得
た。この（Ｆａｂ ’ ） ２う）画をＮ ＩＪ Ｎ
Ｃミクロタイタープレー１１−に被覆した（１０μｇ／
ｌ）。十澄液中のＩｇＧ−１に於ける種種のアロタイプ
マーカーの存在は、ペルオキシダーゼで標識された特異
的ヤギ抗ウサギＰｃを添加することによってボされた。
洗浄後、Ａ Ｂ Ｔ Ｓを添加し、４０５ｎｍに於ける
吸光度を監視した。
吸光度を監視した。
親細胞のＩｇＧのアロタイプはａｌａｌｂ４ｂ４および
ａｌａ３ｂ４ｂ４であった。融合細胞によって分泌され
るＩｇＧアロタイプはａｌａｌｂ４ｂ４であることが示
された。唯一つのアロタイプが分泌されたという事実は
、分泌された抗体がモノクローナル抗体であることをさ
らに立６Ｉ［するものである。
ａｌａ３ｂ４ｂ４であった。融合細胞によって分泌され
るＩｇＧアロタイプはａｌａｌｂ４ｂ４であることが示
された。唯一つのアロタイプが分泌されたという事実は
、分泌された抗体がモノクローナル抗体であることをさ
らに立６Ｉ［するものである。
２、 Ｈ−町襲Ｆυ（杵Δ入久丈−三Ｚグ試騨−ＨＢ
Ｓ ＡｇのためのＲＩＡ試験を行った。アボット
ラボラトリーズ（＾ｂｂｏｔｔ Ｌａｈｏｒａｔｏ−
ｒｉｅｓ） Ｈ１３３Ａｇスクリーニング試験に用いら
れた方法に従ってビーズをＨＢＳＡｇで標識した。抗体
を含むと推測される培養−上澄液を被覆ビーズへ添加し
、混合物を２５℃に於て１晩中インキユベートした。ビ
ーズを洗浄した後、０．２ｍｌの＋２５） □欅１１ｊ
ｌｉＨＢ Ｓ Ａｇを添加し、２５℃で４時間インキュ
ベーション後、ガンマカウンターで洗浄済みビーズを計
数することによって抗体結合を明らかにした。ＨＢＳＡ
ｇで免疫処置されたつ号ギからの１１１ｗ１ＡＩＩＩＩ
胞と融合させたＴＩ”３細鋪包の培養σ月−澄液のＲＩ
Ａ試験の結果は、第５図に示され、４８個の培養中の９
ＩｌｌＩｌが対１４ Ｂ Ｓ Ａｇ抗体を産生する融合
細胞を含む（斜線バー）ことを示している。
Ｓ ＡｇのためのＲＩＡ試験を行った。アボット
ラボラトリーズ（＾ｂｂｏｔｔ Ｌａｈｏｒａｔｏ−
ｒｉｅｓ） Ｈ１３３Ａｇスクリーニング試験に用いら
れた方法に従ってビーズをＨＢＳＡｇで標識した。抗体
を含むと推測される培養−上澄液を被覆ビーズへ添加し
、混合物を２５℃に於て１晩中インキユベートした。ビ
ーズを洗浄した後、０．２ｍｌの＋２５） □欅１１ｊ
ｌｉＨＢ Ｓ Ａｇを添加し、２５℃で４時間インキュ
ベーション後、ガンマカウンターで洗浄済みビーズを計
数することによって抗体結合を明らかにした。ＨＢＳＡ
ｇで免疫処置されたつ号ギからの１１１ｗ１ＡＩＩＩＩ
胞と融合させたＴＩ”３細鋪包の培養σ月−澄液のＲＩ
Ａ試験の結果は、第５図に示され、４８個の培養中の９
ＩｌｌＩｌが対１４ Ｂ Ｓ Ａｇ抗体を産生する融合
細胞を含む（斜線バー）ことを示している。
試験した４８朋の−１−澄液は、これらのウェル中で細
胞増殖が見られたので選ばれた。
胞増殖が見られたので選ばれた。
ｂ、サン！゛イソチＥ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ試験：ｌＯｍＭ
）） Ｂ Ｓ、、ｐＨ７，４中の適当な希釈に於けるヤ
ギ抗ウサギＩｇＧをＮ ＩＩ Ｎ Ｃポリスチレンブレ
ートのウェルへ添加し、プレートを３７℃に於て６０分
間インキエベー１−１．た。自由吸収部位を、２．５■
／ ｍ ｌのゼラチン−゛ツイーン（Ｔｗｅｅｎ ）の
１０ ｍＭ Ｐ Ｂ ｓｉ液（ｐＨ’７．４ ＞０．
１１で飽和し、次に、ウェルへ０．０５ ｍｌのａｔ胞
培＃−１−澄液を添加し、プレートを３７℃に於て６０
分間インキュベートした。適当な希釈度のＧＡＲ−ペル
オキシダーゼ０．０５＋＊１を添加した後、０．０２■
／ｍ１ＡＢＴｓ基質（１，２＋ｎｌを添加することによ
って抗体結合を明らかにした。ＡＢＴＳの分離を４０５
ｎｍで監視した。
）） Ｂ Ｓ、、ｐＨ７，４中の適当な希釈に於けるヤ
ギ抗ウサギＩｇＧをＮ ＩＩ Ｎ Ｃポリスチレンブレ
ートのウェルへ添加し、プレートを３７℃に於て６０分
間インキエベー１−１．た。自由吸収部位を、２．５■
／ ｍ ｌのゼラチン−゛ツイーン（Ｔｗｅｅｎ ）の
１０ ｍＭ Ｐ Ｂ ｓｉ液（ｐＨ’７．４ ＞０．
１１で飽和し、次に、ウェルへ０．０５ ｍｌのａｔ胞
培＃−１−澄液を添加し、プレートを３７℃に於て６０
分間インキュベートした。適当な希釈度のＧＡＲ−ペル
オキシダーゼ０．０５＋＊１を添加した後、０．０２■
／ｍ１ＡＢＴｓ基質（１，２＋ｎｌを添加することによ
って抗体結合を明らかにした。ＡＢＴＳの分離を４０５
ｎｍで監視した。
結果を第６図に示す。第６図に示されるように、４８１
１１ｄのウェル全部からの上澄液が陽性であり、４８１
１１１１のウェル全部にＩｇＧが存在することを示す。
１１ｄのウェル全部からの上澄液が陽性であり、４８１
１１１１のウェル全部にＩｇＧが存在することを示す。
ＲＩＡ試験結果とサンドイッチＥＬＩＳＡ試験結果とを
組合わせると、融合細胞がＨＢ Ｓ Ａｇに対するＩｇ
Ｇ抗体を産生ずることを示している。
組合わせると、融合細胞がＨＢ Ｓ Ａｇに対するＩｇ
Ｇ抗体を産生ずることを示している。
１０ｍＭ ＰＢＳ、 ｐＨ１，４中０．（１７５■／
ｍｌの濃度に於ける、キーホール リンペット（Ｋｅｙ
ｈｏｌｅ ｌ ｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン−アルプレノ
ロール（Ｋ ＬＨ−ａｌｐ ）配合体０．０５ ｍｌを
Ｎ ＩＪ Ｎ Ｃポリスチレンミクロタイタープレート
のウェルへ添加した。このプレートを室温に於７１８）
間インキュベートした。非特異的固定部位を、１０ｍＭ
ＰＢＳ、ｐＨ７，４中０．２％のゼラチン−ツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ ） ｆａ液０．０５）を添加して飽和
し、プレートを室温に於て１８）間、再びインキヱベー
トした。プレーＬをＰＢＳ−ゼラチン−゛ツイーン（↑
−ｅｅｎ ）で数回洗い、次に、ＰＢＳ−ゼラチン−ツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ ）中の適当な希釈度のＧＡＲ−ペ
ルオキシダーゼ溶液０．０５ｍ１を添加し、ブレートを
室温に於て１８）間インキュバー１・した。プレートを
ＰＢＳで数回洗浄した。次に、］ ＯｍＭ ＰＢＳ、
ｐＨ７，４中０．０２ ｖａｇ／ ＩＩＩ（７）基質
ＡＢＴＳ溶液０．２ｍｌを添加し、４０５ｎｍに於ける
吸光度の変化を測定した。
ｍｌの濃度に於ける、キーホール リンペット（Ｋｅｙ
ｈｏｌｅ ｌ ｉｍｐｅｔ）ヘモシアニン−アルプレノ
ロール（Ｋ ＬＨ−ａｌｐ ）配合体０．０５ ｍｌを
Ｎ ＩＪ Ｎ Ｃポリスチレンミクロタイタープレート
のウェルへ添加した。このプレートを室温に於７１８）
間インキュベートした。非特異的固定部位を、１０ｍＭ
ＰＢＳ、ｐＨ７，４中０．２％のゼラチン−ツイー
ン（Ｔｗｅｅｎ ） ｆａ液０．０５）を添加して飽和
し、プレートを室温に於て１８）間、再びインキヱベー
トした。プレーＬをＰＢＳ−ゼラチン−゛ツイーン（↑
−ｅｅｎ ）で数回洗い、次に、ＰＢＳ−ゼラチン−ツ
イーン（Ｔｗｅｅｎ ）中の適当な希釈度のＧＡＲ−ペ
ルオキシダーゼ溶液０．０５ｍ１を添加し、ブレートを
室温に於て１８）間インキュバー１・した。プレートを
ＰＢＳで数回洗浄した。次に、］ ＯｍＭ ＰＢＳ、
ｐＨ７，４中０．０２ ｖａｇ／ ＩＩＩ（７）基質
ＡＢＴＳ溶液０．２ｍｌを添加し、４０５ｎｍに於ける
吸光度の変化を測定した。
第７図に示すように、ａｌｐで免疫処置されたウサギか
らのｌｌＱ］臓細胞と融合させたＴＰ−３細胞の培養の
上滑液は、４８個のウェル中１１個中にａｌｐに対する
抗体を含んでおり（斜線バー）、これらのウェル中に対
ａｌｐ抗体産生牲融合細胞が存在することを示している
。第７図に於て、Ｔと標識したバーは陰性対照である。
らのｌｌＱ］臓細胞と融合させたＴＰ−３細胞の培養の
上滑液は、４８個のウェル中１１個中にａｌｐに対する
抗体を含んでおり（斜線バー）、これらのウェル中に対
ａｌｐ抗体産生牲融合細胞が存在することを示している
。第７図に於て、Ｔと標識したバーは陰性対照である。
陽性培養の１つをＨＹ １．− Ｌと命名した。
それをクローニングし、連続培養中へ入れた。
この細胞系がＡＴＣａに寄託され、寄託番号ＨＢ ８７
７６を受けたものである。
７６を受けたものである。
ｂ−〒−ジニノー天水丹−乙は碑ｒｌ引欅亀：陽性クロ
ーンを、１０μＣｉの３５８−メチオニンの存在ドで１
２時間培養した。同−条件十で、Ｔ Ｉ） −３細１！
単独をも３５Ｓ−メチオニンで培養した。１澄液をとり
、凍結乾燥した後、Ｓ ｌ−） Ｓで可溶化した。この
Ｓ Ｉ） Ｓ可溶化物を、酢酸セルロースプレーｌ）−
で２４０■に於て４０分間電気泳動させた。陽性クロー
ンの培養中に生成した１−澄液の電気泳動では免疫グロ
ブリン領域内に哨−のｈシ＃Ｊ刊゛バンドが見いだされ
たが、Ｔ Ｉ） −３細胞の培養中に生成した一１澄掖
の電気泳動ではかかるパンＦ′は検ｌｉｔされなかった
。放射性バンドが免疫グロブリン領域内に見いだされた
事実は、培養期間中に細胞が合成した免疫グロブリン中
へ３６８−メチオニンが絹み入れられたことを慈味する
。
ーンを、１０μＣｉの３５８−メチオニンの存在ドで１
２時間培養した。同−条件十で、Ｔ Ｉ） −３細１！
単独をも３５Ｓ−メチオニンで培養した。１澄液をとり
、凍結乾燥した後、Ｓ ｌ−） Ｓで可溶化した。この
Ｓ Ｉ） Ｓ可溶化物を、酢酸セルロースプレーｌ）−
で２４０■に於て４０分間電気泳動させた。陽性クロー
ンの培養中に生成した１−澄液の電気泳動では免疫グロ
ブリン領域内に哨−のｈシ＃Ｊ刊゛バンドが見いだされ
たが、Ｔ Ｉ） −３細胞の培養中に生成した一１澄掖
の電気泳動ではかかるパンＦ′は検ｌｉｔされなかった
。放射性バンドが免疫グロブリン領域内に見いだされた
事実は、培養期間中に細胞が合成した免疫グロブリン中
へ３６８−メチオニンが絹み入れられたことを慈味する
。
このことはまた、陽性クローンが抗体合成性およびＪｈ
ｅ択先であることを示すものである。
ｅ択先であることを示すものである。
第１図は、ノルトリプチリン（ＮＴ）で免疫処置された
ウサギからの肺臓細胞と融合したＴＰ−３細胞の培養の
１澄液中の抗ノルトリブチリン抗体の酵素免疫測定（Ｅ
ｌ、ｌ５Ａ）の結果をボし、第２図Ｃ１、ＮＴで免疫処
置されたウサギからのＩ’ｌｌ臓細胞店融合したｉ”
Ｐ −３細胞の培養の上澄液中のウサギＩｇＧｂ’＋、
体のサンＩ゛イソチ１ＩＩｖ素免疫測定（（ｊントイソ
チｌシ１．ｌ５Ａ）の結果を示し、第３図し１、培養の
第３Ｈ（Ａ）、培養の第５日（［０，、培養の第ＥｉＥ
（（Ｃ）、培養の第７８（１１）に於０る、幾つかの陽
性融合細胞ナブクローンの−１，澄液中のｌ）’ｌ：
Ｎ Ｔ抗体のＥＬ、ＩＳＡＳＡ試験果をボし・ 第４図は、２つの異なるハプテン−キャリヤ配合体を用
いて、ＮＴで免疫処置されたウサギからの１ＩｌＩｔ臓
細飽と’ｆ’ Ｐ −３細胞との融合からの最も陽性の
融合細胞クローンの２つの培養からの上滑液の特胃性の
ためのＲＴ、、 Ｉ Ｓ Ａ試験の結果をボし、第５図
は、免疫処置されたウナギからの肺臓細胞と融合した′
Ｉ″ｐ −３細胞の培養の上澄液中の抗ヒ］・１３型肝
炎ウィルス表面抗原（［Ｂ Ｓ Ａｇ）抗体のラジオイ
ムノアッセイ （ＲＩＡ）の結果を不し、第６図は、、
ＨＢＳＡｇで免疫処置されたウサギからの肺臓細胞と融
合したＴ ｆ） −３細胞の培養の［−澄液中のウサギ
ＩｇＧ抗体のサンドインチｌ尤１． Ｉ ＳＡ試験の結
果を示し、 第７Ｍは、免疫処置された肺臓細胞と融合したＴＰ−３
細胞中のアルプレノロール（ａｌｐ ）に対する抗体の
だめのＦ、Ｌ［ＳＡ試験の結果を示す。
ウサギからの肺臓細胞と融合したＴＰ−３細胞の培養の
１澄液中の抗ノルトリブチリン抗体の酵素免疫測定（Ｅ
ｌ、ｌ５Ａ）の結果をボし、第２図Ｃ１、ＮＴで免疫処
置されたウサギからのＩ’ｌｌ臓細胞店融合したｉ”
Ｐ −３細胞の培養の上澄液中のウサギＩｇＧｂ’＋、
体のサンＩ゛イソチ１ＩＩｖ素免疫測定（（ｊントイソ
チｌシ１．ｌ５Ａ）の結果を示し、第３図し１、培養の
第３Ｈ（Ａ）、培養の第５日（［０，、培養の第ＥｉＥ
（（Ｃ）、培養の第７８（１１）に於０る、幾つかの陽
性融合細胞ナブクローンの−１，澄液中のｌ）’ｌ：
Ｎ Ｔ抗体のＥＬ、ＩＳＡＳＡ試験果をボし・ 第４図は、２つの異なるハプテン−キャリヤ配合体を用
いて、ＮＴで免疫処置されたウサギからの１ＩｌＩｔ臓
細飽と’ｆ’ Ｐ −３細胞との融合からの最も陽性の
融合細胞クローンの２つの培養からの上滑液の特胃性の
ためのＲＴ、、 Ｉ Ｓ Ａ試験の結果をボし、第５図
は、免疫処置されたウナギからの肺臓細胞と融合した′
Ｉ″ｐ −３細胞の培養の上澄液中の抗ヒ］・１３型肝
炎ウィルス表面抗原（［Ｂ Ｓ Ａｇ）抗体のラジオイ
ムノアッセイ （ＲＩＡ）の結果を不し、第６図は、、
ＨＢＳＡｇで免疫処置されたウサギからの肺臓細胞と融
合したＴ ｆ） −３細胞の培養の［−澄液中のウサギ
ＩｇＧ抗体のサンドインチｌ尤１． Ｉ ＳＡ試験の結
果を示し、 第７Ｍは、免疫処置された肺臓細胞と融合したＴＰ−３
細胞中のアルプレノロール（ａｌｐ ）に対する抗体の
だめのＦ、Ｌ［ＳＡ試験の結果を示す。
Claims (20)
- （１）細胞がヒポキシキサンチン−グアニン−ホスホリ
ボシルトランスフェラーゼ欠失性、ヒポキシキサンチン
−アミノプテリン−チミジン感受性、迅速増殖性、非抗
体分泌性であることを特徴とする、ＴＰ−３と呼ばれか
つ培養ＣＲＬ８７６１としてＡＴＣＣに寄託された連続
的ウサギ細胞系およびそのクローンおよびサブクローン
。 - （２）連続的、ヒポキシキサンチン−グアニン−ホスホ
リボシルトランスフェラーゼ欠失性、ヒポキシキサンチ
ン−アミノプテリン−チミジン感受性、非抗体分泌性、
迅速増殖性ウサギ細胞系およびそのクローンまたはサブ
クローンからなることを特徴とする生物学的純粋細胞培
養。 - （３）ウサギ脾臓細胞をシミアン・ウィルス（Ｓｉｍｉ
ａｎ−Ｖｉｒｕｓ）４０で形質転換させ、形質転換した
細胞をエチル−メチルスルホネートで処理し、 処理された細胞を選択し、かつ選択された細胞を、増殖
が連続的であるように培養することからなることを特徴
とする特許請求の範囲第（１）項記載の細胞系の作製方
法。 - （４）抗体産生性ウサギ細胞を特許請求の範囲第（１）
項記載のウサギ細胞系と融合させ、かつ 該融合した細胞を選択すること からなることを特徴とするウサギ−ウサギ融合細胞の作
製方法。 - （５）該融合細胞をクローニングし、かつ 該クローニングされた細胞を、増殖が連続的であるよう
に培養すること をも含むことを特徴とする特許請求の範囲第（４）項記
載の方法。 - （６）抗体産生性ウサギ細胞が脾臓細胞であることを特
徴とする特許請求の範囲第（４）項記載の方法。 - （７）抗体産生性ウサギ細胞が脾臓細胞であることを特
徴とする特許請求の範囲第（５）項記載の方法。 - （８）特許請求の範囲第（４）項記載の方法で産生され
るウサギ−ウサギ融合細胞。 - （９）特許請求の範囲第（５）項記載の方法で産生され
るウサギ−ウサギ融合細胞。 - （１０）特許請求の範囲第（６）項記載の方法で産生さ
れるウサギ−ウサギ融合細胞。 - （１１）特許請求の範囲第（７）項記載の方法で産生さ
れるウサギ−ウサギ融合細胞。 - （１２）ウサギを免疫原で免疫処置し、 該ウサギからの抗体産生性細胞を特許請求の範囲第（１
）項記載の細胞糸と融合させて融合細胞を作製し、 該融合細胞を選択し、 該選択された細胞を培養し、かつ 該培養された細胞が分泌する抗体を収集すること からなることを特徴とするウサギモノクローナル抗体の
産生方法。 - （１３）抗体産生性細胞がウサギ脾臓細胞であることを
特徴とする特許請求の範囲第（１２）項記載の方法。 - （１４）免疫原がノルトリプチリンであることを特徴と
する特許請求の範囲第（１３）項記載の方法。 - （１５）免疫原がヒトＢ型肝炎表面抗原であることを特
徴とする特許請求の範囲第（１３）項記載の方法。 - （１６）免疫原がアルプレノロールであることを特徴と
する特許請求の範囲第（１３）項記載の方法。 - （１７）免疫原に対して特異的なウサギモノクローナル
抗体。 - （１８）免疫原がノルトリプチリンであることを特徴と
する特許請求の範囲第（１７）項記載のウサギモノクロ
ーナル抗体。 - （１９）免疫原がヒトＢ型肝炎表面抗原であることを特
徴とする特許請求の範囲第（１７）項記載のウサギモノ
クローナル抗体。 - （２０）免疫原がアルプレノロールであることを特徴と
する特許請求の範囲第（１７）項記載のウサギモノクロ
ーナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/730,346 US4859595A (en) | 1985-05-03 | 1985-05-03 | Method for preparing rabbit monoclonal antibodies, the cell lines used therein and the antibodies produced thereby |
| US730346 | 1985-05-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6229972A true JPS6229972A (ja) | 1987-02-07 |
Family
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Family Applications (1)
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| JP (1) | JPS6229972A (ja) |
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-
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- 1986-05-06 JP JP61103732A patent/JPS6229972A/ja active Pending
Also Published As
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|---|---|
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