JPH044871A - ヒトモノクローナル抗体分泌細胞の作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 従来肢土 モノクローナル抗体は単一の抗原に非常に高い特異性を
持って結合することのできる・抗体として、様々な分野
で応用されている。これらのモノクローナル抗体のほと
んどはマウス由来のハイブリドーマが分泌するマウス抗
体である。したがって、感染症等の治療時にこのような
マウスモノクローナル抗体を投与すると、マウス抗体が
人体にとって異物であるため、抗マウス抗体によるアナ
フィラキシ−等の副作用が心配される。ヒトモノクロー
ナル抗体の投与には、このような問題点がないため、ヒ
トモノクローナル抗体分泌細胞の樹立が多くの研究者に
よって試みられている。

しかし多くの場合、これらの試みは成功していない。ヒ
トモノクローナル抗体分泌細胞を樹立するための障害と
なる問題点はふたつある。

まず第一は、目的としている抗原を認識している抗体を
分泌するヒトリンパ球を得るのが困難なことである。担
癌患者あるいは感染症から回復した患者からのリンパ節
、末梢血等のリンパ球は、癌抗原や、細菌、ウィルス等
に感作されているので、目的の抗体が患者の病因と関連
がある場合には、このようなリンパ球を利用できる。ま
た、ボランティアにワクチンを接種して感作することも
場合によっては可能である。しかし、広範な抗原物質に
対してヒトモノクローナル抗体を作製する場合、患者を
スクリーニングしたり、抗原を人体に投与するのは困難
である。

第２は、抗体分泌ヒトリンパ球を不死化する方法である
。ハイブリドーマ法は、ヒト−ヒトハイブリドーマ法も
、マウス−ヒトハイブリドーマ法も、リンパ球あたりの
ハイブリドーマで出現率が最大でも、リンパ球１０４あ
たり１個である。もともと免疫操作ができないヒトリン
パ球を１０８個得たと仮定すれば、得られるハイブリド
ーマは１０４個である。生体に存在する抗体のバリエー
ションは１０６〜１０８と考えられている。したがって
、目的のヒト抗体を分泌するハイブリドーマを１／１０
’以上の確率で樹立するのは実際的には極めて困難であ
る。

これに対して、Ｅｐｓ　ｔｅ　ｉｎ　−Ｂａｒｒウィル
ス（ＥＢＶ）をリンパ球に感染させて不死化する方法は
、リンパ球１０２個につき１個程度の形質転換細胞が得
られると考えられるため、目的の抗体を分泌する細胞が
得られる確率が高い。長板ら（特開昭６２−１０７７８
６号公報）は、多数の形質転換Ｂ　’Ｊンバ芽球様細胞
（ＢＬＣ）ライブラリーを作製し、これをスクリーニン
グすることによって、目的の抗体分泌ＢＬＣを含む細胞
集団を選択後、クローニングによって、抗体分泌ＢＬＣ
クローンを樹立している。

しかし、ＥＢＶ形質転換ＢＬＣの抗体分泌能は低く、不
安定であり、またＢＬＣはクローニングが難しい欠点が
ある。本発明者らはこれまで必要に応して、健常人より
得たリンパ球をＥＢＶで形質転換し、目的とする抗原を
認識する抗体分泌ＢＬＣをスクリーニングし、これをマ
ウスミエローマ細胞と融合することによって、抗リシン
ＩｇＭ分泌ハイブリドーマ、抗ジフテリア毒素ＩｇＭ分
泌ノへイブリドーマ、抗ネオカルチノスタチンＩｇＭ分
泌ハイプリドーマ等を取得している。しかし必要の都度
リンパ球を得、形質転換を行い、スクリーニングするの
は煩雑である。そこで−担形質転換をしたＢＬＣが、各
々どのような抗原を認識する抗体を分泌しているかをあ
らかじめ調べ、しかる後細胞を凍結保存しておけば、必
要に応じて保存株を用いて細胞融合を行うことができ、
このことにより簡便でかつ効率の良いヒトモノクローナ
ル抗体分泌細胞の取得が可能なことを見出し、本発明を
なすに至った。

しよ゛と　る 本発明は、抗原でリンパ球提供者を免疫操作することな
く、提供者がもともと持っている自然抗体分泌細胞を選
択するとともに、この細胞の抗体分泌能と増殖能を改善
する方法を提供するものである。

さらに、本発明はヒトリンパ球、特に健常人末梢血リン
パ球からヒトモノクローナル抗体分泌細胞を簡便でかつ
効率よく実用的に作製する方法を提供するものである。

ｉ　　　″　　るための すなわち、本発明は、ヒトモノクローナル抗体分泌細胞
の作製方法において、ヒトリンパ球をエプスタイン・バ
ー・ウィルスで形質転換した細胞を凍結保存し、マウス
ミエローマ細胞と融合時にこの保存細胞を解凍し、目的
とする抗体分泌細胞を選択し、細胞融合の親株としてマ
ウスミエローマ細胞と細胞融合を行うことよりなるヒト
モノクローナル抗体分泌細胞の作製方法に関する。

本発明におけるヒトリンパ球は、抗原による能動的な免
疫操作を受けていない提供者からの末梢血リンパ球を用
いることが望ましい。これにＥＢＶを感染させることに
よって、多数のＢＬＣを得、この中から目的の抗体を分
泌しているＢＬＣを、スクリーニングした後ＢＬＣを凍
結保存しておく。

次にＢＬＣをマウスミエローマと細胞融合して、目的の
ヒト抗体を分泌するマウスーヒトハイブリドーマを樹立
する。ＢＬＣは凍結保存しであるため、使用時には目的
の抗体を分泌するＢＬＣを解凍して増殖させた後使用す
る。すなわち、本特許はリンパ球提供者の末梢血リンパ
球中に含まれる自然抗体分泌細胞をＥＢＶ感染により増
殖させて、これをマウス−ヒトハイブリドーマとして抗
体分泌を安定化させるものである。そしてこの自然抗体
分泌細胞を凍結保存することによって必要時に保存株を
用いて細胞融合するので簡便でかつ効率のよいヒトモノ
クローナル分泌細胞を得ることができる。

以下、上記ハイブリドーマの作製について説明する。

（１）ヒトリンパ球の形質転換 ヒトリンパ球は、血液又は手術で摘出した組織所属リン
パ節、肺臓などから調製することができるが、本発明で
は末梢血液から得られるリンパ球を用いることが望まし
い。リンパ球の分離は、フィコールパック（ファルマシ
ア社製）を使用した遠心分離法などを例示することがで
きる。このようにして分離したリンパ球をＥＢＶにより
形質転換させる。

ＥＢＶは、これを生産する細胞株から調製するが、一般
的には、マーモセントＢ９５−８株（ＡＴＣＣＣＲＬ１
６１２）が使用される。Ｂ９５−８株を１〜２０％のウ
シ胎児血清（以下ＦＣ３と称する）を含むＲＰＭｌ　１
６４０培地等の適当な培地中で培養し、この上清をその
まま、或いは、滅菌フィルターを通した後ウィルス液と
して使用する。

リンパ球は、そのまま或いはヒツジ赤血球ロゼツト形成
法や抗血清と補体で処理する方法などによってＴ細胞を
除いた後、ＥＢＶを感染させて形質転換する。形質転換
後のリンパ球の培養に用いる培地は、動物細胞の培養に
用いられているものであればどのようなものでも良い。

形質転換には、培地１−当り１０４〜１０７個、好まし
くは、ｌＸＩＯ３〜２Ｘ１０６個の密度にリンパ球を浮
遊させ、培地容量の５〜５０％容量のＥＢＶ含有培養液
を添加してＥＢＶを感染させる。これを９６穴又は２４
穴プレートなどに入れて培養する。培養温度は２５〜４
０°Ｃ１好ましくは３５〜３８°Ｃで、１〜１５％の炭
酸ガス、好ましくは４〜７％の炭酸ガス存在下、湿度９
０％以上の雰囲気下で培養する。

培養開始後、７〜１０日後には形質転換したＢＬＣが増
殖してくる。

ＢＬＣは多数得ることが望ましいが、実際的には、１０
００個のオリゴクローン、好ましくは、１４００個以上
のＢＬＣオリゴクローンが得られることが望ましい。

ＢＬＣはプレートごと、あるいはさらに増殖させてシャ
ーレ等で培養するが、長期間（半年以上）の継代培養は
、ＢＬＣの抗体分泌能を消失させるおそれがあるため、
好ましくない。ＢＬＣは一８０’Ｃ以下で凍結保存する
。凍結培地は通常用いられる保護剤を含むものが利用で
きる。液体窒素（−１９６°Ｃ）中に保存すれば、凍結
時の抗体分泌能を維持したＢＬＣが常時得られる。−８
０°Ｃ付近での保存は、保存中にＢＬＣの生存率が低下
するため、１年以内にとどめたほうが良い。

（２）ＢＬＣの培養上清中に分泌された抗体の分析多数
のＢＬＣの培養上清中に含まれる抗体の分析には、多数
の検体を同時に効率良く測定できる方法を用いる必要が
ある。特に、ＢＬＣが増殖中の場合には、急いで分析を
行う必要がある。この目的のためには酵素免疫測定法（
ＥＬＩＳＡ）、ラテックス凝集反応、赤血球凝集反応、
などの９６穴アツセイプレートを用いる方法や自動分析
機器を用いる方法が適している。

主な抗原の特定は、ＢＬＣの凍結前に実施しておくこと
が望ましいが、抗原特定前に、いったんＢＬＣを凍結し
ておき、必要に応して、細胞を融解し、アッセイしても
良い。

（３）細胞融合に用いる親株の取得 一般的なハイブリドーマ作製用親株のほとんどは、８−
アザグアニン、或いは６−チオグアニン耐性でアミノプ
テリン存在下で死滅するＨＡＴ（ヒボキサンチン、アミ
ノプテリン、チミジン）感受性株であるが、本発明で使
用するＢＬＣは、ＨＡＴ培地中でも生育するため、細胞
融合親株には他の選択マーカーを付与することが必要と
なる。

細胞融合親株としては、ＨＡＴ感受性でかつウアバイン
耐性を持つ細胞が適する。この親株をＢＬＣと融合し、
ＨＡＴ及びウアバインを含む培地で培養すると、細胞融
合株のみが生育し、親株およびＢＬＣとも死滅するため
容易に融合細胞のみを選択できる。

このような、細胞融合親株は、マウスミエローマ細胞Ｓ
Ｐ２を用いて作製する。すなわち、１μ台のウアバイン
存在下でＳＦ３を培養し、生存細胞を、さらに段階的に
、１００μ門のウアバインを含む培地に移して培養し、
ウアバイン耐性株を得る。この株をハイプリドーマ親株
として使用し得る。

（４）親株とＢＬＣの細胞融合 まず目的とする抗原がすでに特定されているＢＬＣを用
いる場合は、その凍結オリゴクローンを融解し、それ以
外の場合には適当数（１０〜１００）のＢＬＣクローン
を融解し、目的とする抗体が含まれるクローンをスクリ
ーニングする。

細胞融合を行うに当り、親株とＢＬＣの比率を１：１０
〜１０：１、好ましくは２：１〜１：２の割合で混合す
る。細胞融合にあたっては、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）又はセンダイウィルスを用いる方法のいずれで
も使用し得る。或いは、電気融合法等の物理的な方法も
採用可能である。

融合操作終了後、細胞を９６穴或いは２４穴プレートに
２Ｘ１０’／ＩＩＪｌ以下でまき込んで培養を行う。こ
のようにしてまいた細胞培養ウェルに５〜１０μＭウア
バイン、　１００μＭヒポキサンチン、０．４μＭアミ
ノプテリン及び１６μＭチミジンを含む培地（０−ＨＡ
Ｔ培地）を加え、２〜３日毎に半量交換し、細胞を選択
培養する。

細胞生育ウェル上清中の抗体をＥＬＩＳＡ等の方法で分
析し、所望する細胞の生育ウェルを選択する。

（５）　　ハイフリドーマのクローニング上記（４）に
記載した手順で選択して得られた抗体を分泌するハイプ
リドーマのうちから、生育の速いハイブリドーマを選ぶ
ためにクローニングを行う。クローニングにあたっては
、限界希釈法、ソフトアガー平板法、フィブリンゲル平
板法、セルソーターによる細胞分画法が例示できる。

このようにして得たヒト抗体産生マウス−ヒトハイプリ
ドーマは、次の細胞生物学上の特性を有する。

細胞由来：マウス−ヒトハイプリドーマ形　状　二球形 表面付着性：培養器に弱く付着する性質を有する。

以下に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１ ヒト抗体分泌Ｂリンパ芽球様細胞（ＢＬＣ）集団の作製 健常人の上腕静脈より末梢血を採取した。血液をリン酸
緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２倍希釈し、遠心管（ファ
ルコン２０９５　）に予め分注しておいたフィコールパ
ック（ファルマシア）上に重層した。

これを１　、８００回転で４０分間遠心し、フィコール
パンクと血漿の界面に沈鋒したリンパ球（末梢血リンパ
球、ＰＢＬ）を採取し７た。

ＰＢＬをＰＢＳで２回洗浄した後形質転換に用いた。Ｅ
ＢＶはマーモセットＢ９５−８株の培養上清に含まれる
ものを用いた。

Ｂ−９５−８株を１０％牛脂児血清（Ｆｅ２、大日本製
薬）を含むＲＰＭ１１６４０培地で培養した。　培養上
清を０．４５μＭのフィルター（マイレクスＨＡ、ミリ
ボア）で濾過し、使用まで一８０°Ｃに保存した。

上記ＰＢＬＩＸＩＯ’個を遠心し、その上清を除いたペ
レフトにＥＢＶを含む培養上清１ｍを加えてＰＢＬにＥ
ＢＶを感染させた。

ＰＢＬとＥＢＶとの混合液に１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ１
１６４０培地１４ｍを加え、よぐ懸濁して１５０μρづ
つ９６穴マイクロタイタープレート（ファルコン３０７
２　）に５まき込んだ。

細胞は３７°Ｃ１５％炭酸ガス９５％空気、湿度９５％
以上で培養した。

培養１週間後に培地を１００μ！添加し、その後３〜７
日毎に培地を半量づつ交換した。４〜８週間後、はとん
どのウェルに形質転換したＢＬＣが増殖してきた。

８名のＰＢＬから１５８７のＢＬＣ増殖ウェルを得た。

ＢＬＣの培養上清中に含まれる抗体は下記手順により定
量した。

■測定方法（１）ＥＬＩＳＡ法 ウィルスに対する抗体を測定した。ウィルス抗原として
デンカ生餅のＨＡ抗原、あるいはＣＦ抗原を用いた。

０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムで１００倍希釈した抗原
溶液５０μ！を４°Ｃにて一晩、９６穴ＥＬＩＳＡ用プ
レート（住人ＭＳ−３４９６Ｆ）に吸着させた。プレー
トを４倍希釈したブロックエース（大日本製薬）でブロ
ッキングした後、培養上清５０μ！を添加して室温で２
時間静置した。プレートを０．５％Ｔｉｙｅｅｎ　２０
を含むＰＢＳで洗浄し、１／１０００〜１／１００００
に希釈したパーオキシダーゼ標識抗ヒＨｇＡ、ＩｇＧあ
るいはＩｇＭ（タボ社）５０μｌを加えて２時間インキ
ユヘーションした。プレートをさらに洗浄後、２．２’
−ａｚｉｎｏ−ｃｌｉ−（３−ｅｔｈｙｌ　　ｂｅｎｚ
ｏｔｈｉｏａｚｏｌｉｎｅ−６−ｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａ
ｃｉｄ　）を基質として加え、抗体陽性ウェルを決定し
た。

■測定方法（２）凝集反応 数種のウィルスについては、赤血球ラテックスあるいは
ゼラチンマイクロビーズを担体とした凝集アッセイキッ
トを用いて、抗体を測定した。抗ＨＢ、抗体は、富士レ
ビオの［アンティＨＢｓ　Ｊ抗トキソプラズマ抗体は富
士レビオの「マイコテスト■」抗トキソプラズマ抗体は
第一化学の「トキソテスト」を用いた。

測定結果を第１表に示す。

測定した１２のウィルス抗原に対し、１０のウィルスに
対しては、１５８７のＢＬＣ中に、１個あるいはそれ以
上の抗体陽性細胞が含まれていた。

同様に細胞毒性物質を認識する抗体を分泌するＢＬＣを
測定し第１表に結果を示す。

抗原にはりシン（生化学工業）、ジフテリア毒素（生化
学工業）ネオカルチノスタチン（山之内製薬）を用い、
ＥＬＩＳＡで測定した。

このようにして抗原を特定できたＢＬＣはその抗原の種
類と抗体のクラスをコンピューターに登録し、液体窒素
中に凍結保存した。

その他のＢＬＣは複数の凍結チューブに入れ、液体窒素
中に凍結保存するとともに、その培養上清１〜２ｄを別
に一８０°Ｃに凍結保存し、以後の測定に備えた。

第１表 抗原　　　　　　測定法　　陽性ウェル実施例２ 親株細胞の作製 ８−アザグアニン耐性、ＨＡＴ感受性のマウスミエロー
マ細胞ＳＰ２株を、１μＭのウアバインを含む１０％Ｆ
Ｃ３添加ダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸
濁し、９６穴プレ一ト１枚にウェル当りｌＸｌ０’個の
細胞をまき込んだ。これを２週間培養して、ウアバイン
耐性株４０個を得た。

このうち増殖の速い１０ウエルを２４穴プレート（コー
ニング２５８２０）に移して培地２ＩＩＩｌを添加し、
１週間培養した。さらに１０ウエルのうち増殖の速い５
ウエルヲ５ＣＩ１１のシャーレ（ファルコン３００２）
に移し、ウアバイン濃度を段階的に、１μＭ、１０μＭ
、５０μＭ１最終的に１００μＭまで増加させた。５株
とも１００μＭウアバイン存在下で生き残り耐性株を取
得できた。

このうち最も増殖の速い１株を選びＳＰ２／　０２と名
づけで以下の細胞融合に用いた。

実施例３ ヒトモノクローナル抗体分泌マウス−ヒトハイブリドー
マの樹立 ヒ）ＢＬＣとマウス親株ＳＰ２／　０２との細胞融合に
よりヒト抗体を分泌するヒト−マウスハイブリドーマの
作製を行った。

ＢＬＣは抗トキソプラズマ抗体分泌ＢＬＣ，Ｈ８３２７
および、抗サイトメガロウィルス抗体分泌ＢＬＣ，ＨＫ
２９、Ｈ３１５５を選択した。

各々ｌＸｌ０’個のＢＬＣとＳＰ２／　０２を５〇−遠
心管中で混合し、５０％ポリエチレングリコール（゛分
子量４０００、シグマ）を用いて融合させた。融合細胞
を９６穴マイクロ力ルチヤープレート３枚にまき込み、
Ｃ１−ＨＡＴ培地を含む１０％ＦＣ３添加ＲＰＭ１１６
４０培地中で、ハイブリドーマを選択した。培養２週間
後に各々２８８ウエルすべてにハイブリドーマの増殖が
みられた。

Ｈ３３２７からのハイブリドーマ増殖ウェル２８８中、
抗トキソプラズマ抗体陽性ウェル数は６で、このうちＨ
３３２７Ｈ７をクローニングして、ヒト抗トキソプラズ
マ抗体分泌マウス−ヒトハイブリドーマＨ５３２７Ｈ７
−３が得られた。

ＨＫ２９およびＨ３１５５からのハイブリドーマ増殖ウ
ェルからは、それぞれ９ウエルおよび１５ウエルの抗サ
イトメガウィルス抗体陽性ウェルが得られた。このうち
ＨＫ２９Ｈ８および、Ｈ３１５５Ｈ１をクローニングし
てヒト抗サイトメガロウィルス抗体分泌マウス−ヒトハ
イブリドーマＨＫ２９Ｈ８２５およびＨ３１５５Ｈ１−
１が得られた。これらの抗体クラスはいずれもヒ目ｇＭ
であった。

主尻■訪果 本発明によれば、ヒトリンパ球をエプスタイン・バー・
ウィルスで形質転換した細胞を凍結保存しておき、マウ
スミエローマ細胞との融合時にこれを解凍して使用する
ので効率よく安定に任意の抗原に対するヒトモノクロー
ナル抗体を分泌する細胞株を作製することができる。そ
して、この方法は健常人末梢血リンパ球から任意の抗原
に対するヒトモノクローナル抗体を安定に分泌する細胞
株を容易に樹立することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトリンパ球をエプスタイン・バー・ウィルスで
   形質転換し、目的とする抗体分泌細胞を選択し、得られ
   た形質転換細胞を凍結保存し、これをマウスミエローマ
   細胞と融合するときに解凍し、これを細胞融合の親株と
   してマウスミエローマと細胞融合を行うことを特徴とす
   るヒトモノクローナル抗体分泌細胞の作製方法。
2. （２）ヒトリンパ球が健常人末梢血由来のものである請
   求項（１）記載のヒトモノクローナル抗体分泌細胞の作
   製方法。
3. （３）凍結保存された細胞が１０００種類以上の形質転
   換細胞を含む細胞集団である請求項（１）または（２）
   記載のヒトモノクローナル抗体分泌細胞の作製方法。