JPH02113896A

JPH02113896A - ヒト抗リシンモノクローナル抗体およびそれを分泌するハイブリドーマ

Info

Publication number: JPH02113896A
Application number: JP63267554A
Authority: JP
Inventors: Yoji Niimoto; 洋士新本; Shunichi Dosemari; 俊一堂迫
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd
Priority date: 1988-10-24
Filing date: 1988-10-24
Publication date: 1990-04-26

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】童】」４１月亀土賢本発明は、ヒマ種子毒リシン（以下リシンという）に対
するヒトモノクローン抗体および該抗体を分泌するハイ
ブリドーマに関する。上記ヒトモノクローン抗体は、リ
シンの定量、抽出及び中毒の治療に利用することができ
る。

遮米ｑ技玉リシンはヒマ（Ｒｔｃｉｎｕｓ　ｃｏｍｕｎｉｓ＞種子
中に含まれる分子量６４，０００の糖蛋白質であり、猛
毒として知られている。因に、リシンのマウスに対する
ＬＤｓ。は２．７μｇ／ｋｇと強い毒性を示している。

りう・ンの分子はＳＳ結合で結合したＡ鎖（分子ｉ３１
　、０００）とＢ鎖（分子ｆｆ１３３．０００）の２本
のペプチド鎖からなる。この内、Ａ鎖は有核細胞中に侵
入し、リポシム内の２８ｓリボゾームＲＮＡの５′末端
から４３２４番目のアデニンを遊離させ、細胞の蛋白合
成を阻害して、殺細胞効果をあられす。一方、Ｂ鎖は、
細胞表面のレセプターに結合して、へ鎖が細胞内に侵入
するのを促進する。したがって、リシンの混入した食品
や、生のヒマ種子を多量に食した場合には、内臓諸器官
に激しい出血を起こして死亡する。

一方、ヒマは古来から油原料として広く栽培されており
、ヒマ種子から搾油された油は、ヒマシ油として薬品、
化粧品などの用途に広く背反している。このため、農作
物の栽培中にヒマ種子が混入する可能性があり、又搾油
後の搾油カスが食品や飼料中に混入する可能性もある。

しかし、食品中に混入したりシンを高感度で検出する方
法は、現在までに知られていない。又、リシン中毒に対
する解毒剤や毒性の治療方法は未だに提供されていない
。

これらの点を解決するため、リシンに対する抗体を作成
し、使用することが考えられる。しかし、上述の通り、
リシンは強い細胞毒を示すために一般的な方法で動物を
免疫し、抗血清を得る方法や抗体生産Ｂ細胞を得る方法
は、動物が死亡したり細胞死を起こすため採用できない
。

又、仮に、抗すシン抗体生産Ｂ細胞を得た場合でも、こ
の細胞を基としてハイブリドーマを作成し、抗体生産株
として樹立する必要がある。特に、ヒトモノクローン抗
体を得る方法としては、Ｆｌ、）ヒト−ヒトハイブリド
ーマ法、（２）マウス−ヒトハイブリドーマ法、（３）
エプスタインパールウィルス（ＥＢＶ）形質転換法、ｆ
４１　Ｅ　Ｂ　Ｖ形質転換後の細胞融合法などがあげら
れる。しかしながら、これらの各方法においても下記の
ようないくつかの賀意があった。

ヒト−ヒトハイブリドーマ法にあっては、融合効率の高
い親株の入手が困難であり、又、入手可能な親株自身が
免疫グロブリンを分泌しているため、融合株の生産する
抗体は、親株抗体とのハイブリッド型抗体となってしま
い、抗体の特異性が低下する欠点がある。

マウス−ヒトハイブリドーマ法では、融合の親株として
マウスミエローマ細胞を使用するが、この方法によって
目的とする抗体生産ハイブリドーマを得る確率は非常に
低い。これはヒトリンパ球中に含まれる目的の抗体を分
泌する細胞の数が少ないためである。

ＥＢＶ形質転換法では、前二者に比べてリンパ球当りの
不死化した細胞が得られる割合は高いため、抗体分泌量
”胞が得られる確率は高い。しかし、この不死化した細
胞はＢリンパ牙球様細胞（以下ＢＬＣと称する）と呼ば
れているが、この方法で得られたＢＬＣの増殖が遅いた
め、細胞クローニングが困難であり、又、半年以上の長
期間培養し続けると抗体分泌能が低下すること、および
ＢＬＣ単位細胞数当りの抗体分泌量がハイブリドーマに
比べて低いことが欠点である。

また、ＥＢＶ形譬転換後の細胞融合法は、ＢＬＣをクロ
ーニングして目的の抗体産生細胞を得、つづいてマウス
或いはヒト親株と融合してハイブリドーマを作製するも
のであるから、この方法もＢＬＣのクローニングが困難
であるとの問題がある。

１Ｊｆｌわ処はＬ立（ｊヱｌｌ蹟本発明は、エプスタインパールウィルス（以下ＥＢＶと
称する）によって形質転換されたＢリンパ芽球様細胞鎖
（ＢＬＣ）を抗体分泌細胞として用い、親株と融合して
得られたハイブリドーマを培養することにより、リシン
に対し、そのＡ瑣またはＢ鎖及びＡＢｔ３￥のそれぞれ
に結合能を有するヒト型のモノクローナル抗体を提供す
ること及び上記ハイブリドーマを提供することを課題と
する。

以下本発明の詳細な説明する。

課題を解決するための本発明においては、さきに述べたとおり、抗リシン抗体
を分泌するＢ細胞が実際上得られないため、ＥＢＶによ
り形質転換されたＢＬＣを抗体分泌細胞として用い、親
株と融合させて得られる融合株をヒト抗リシン抗体の分
泌細胞として利用する。

以下上記ハイブリドーマの作成について説明する。

口）ヒトリンパ球の形質転換ヒトリンパ球は、血液又は手術で摘出した組織所属リン
パ節、肺臓などから調製が可能である。

−ｉ的には、末梢血液から得る方法が容易である。

リンパ球の分離は、フィコールバック（ファルマシア社
製）を使用した遠心分離法などが例示できる。このよう
にして分離したリンパ球をＥＢＶにより形質転換させる
。

ＥＢＶは、これを生産する細胞株から調製するが、−船
釣には、マーモセフトＢ　９５−８株（ＡＴＣＣＣＲＬ
　１６１２）が使用される。Ｂ　９５−８株を１〜２０
％のウシ胎児血清（以下ＦＣＳと称する）を含むＲＰ　
Ｍ　Ｉ　１６４０培地等の適当な培地中で培養し、この
上清をそのまま、或いは、滅菌フィルターを通した後ウ
ィルス液として使用する。

リンパ球は、そのまま、或いは、ヒツジ赤血球ロゼツト
形成法や抗血清と補体で処理する方法などによってＴ細
胞を除いた後、ＥＢＶを感染させて形質転換する。形質
転換後のリンパ球の培養に用いる培地は、動物細胞の培
養に用いられているものであればどのようなものでも良
い。形質転換には、培地】−当り１０４〜１０７個、好
ましくは、１、Ｘ１Ｏ５〜２Ｘ１０”Ｈの回度にリンパ
球を浮遊させ、培地容量のＥＢＶ含有培養液を添加して
ＥＢＶを感染させる。これを試験管、シャーレ、Ｔフラ
スコ、９６穴又は２４穴プレートなどに入れて培養する
。

培養温度は２５〜４０℃、好ましくは３５〜３８℃で、
１〜１５％の炭酸ガス、好ましくは４〜７％の炭酸ガス
存在下、湿度９０％以上の雰囲気下で培養する。

培養開始後、７〜１０日後には形質転換したＢ　ｆ、　
Ｃが増殖してくる。

（２）抗リシン抗体分泌細胞の取得前述の通り、リシンは強い細胞毒性を有するため、抗原
感作を行うことができない。このため、ドナーのリンパ
球中に自然感作されたリンパ球を得るため、多数のＢＬ
Ｃをスクリーニングすることが必要である。

抗リシン抗体分泌細胞の検出には、リシン或いはりシン
Ａｔｆｆ、リシンＢ鎖を用いた酵素免疫測定法（ＢＬＩ
ＳＡ）が使用可能である。９６六巳Ｌ　ＩＳＡプレート
０．１〜１．００　ｌＪｇ／　ａ＋１γ局度の抗原、好
ましくは１〜１０μＨａｍｌの抗原溶液を５０〜１００
μｌ添加し、抗原をプレートに吸着させた後、抗原溶液
をプレートから捨てブロッキング操作を行う、ブロッキ
ングには、生血清アルブミン、スキムミルク、市販のブ
ロッキング試薬を用いることができる。ブロンキング試
薬をウェル−杯に満たし、室温で１時間静置してブロッ
キングを行い、その後ブロッキング試薬又はＰＢＳ等で
プレートを洗浄し、ついでプレートにＢＬＣの培養上清
を２０〜１００μ！加える。室温で１時間以上静置し、
その段プレートを洗浄し、酵素標識した抗ヒト免疫グロ
ブリン抗体を５０〜１００μｉ加える。標識抗体を加え
て１時間以上静置後、プレートを洗浄し、基質溶液を加
えて、ウェルに結合した酵素活性を検出する。この方法
の他に市販のビオチン−アビジンシステムを用いた高域
度検出法を使用して抗リシン抗体を検出することもでき
る。

抗リシン抗体陽性細胞は、継代し、細胞融合を行う。

（３）細胞融合に用いる親株の取得 −ｉ的なハイプリドーマ作製用親株のほとんどは、８−
アザグアニン、或いは６−チオグアニン耐性でアミノプ
テリン存在下で死滅するＨＡＴ　（ヒボキサンチン、ア
ミノプテリン、チミジン）感受性株であるが、本発明で
使用するＢＬＣは、ＨＡ　Ｔ培地中でも生育するため、
細胞融合親株には他の選択マーカーを付与することが必
要となる。

細胞融合親株としては、ＨＡ　Ｔ感受性でかつウアバイ
ン耐性を持つ細胞が適する。この親株をＢＬ　Ｃと融合
し、ＨＡ　Ｔ　、ウアバインを含む培地で培養すると、
細胞融合株のみが生育し、親株およびＢＬＣとも死滅す
るため容易に融合細胞のみを選択できる。

このような、細胞融合親株は、マウスミエローマ細胞５
Ｐ２１０を用いて作製する。すなわち、１μｈのウアバ
イン存在下で５Ｐ２１０を培養し、生残細胞を、さらに
階段的に、１００μ門のウアバインを含む培地に移して
培養し、ウアハ・イン耐性株を得る。この株をハイブリ
ドーマ親株として使用し得る。

（４）親株とＢＬＣの細胞融合細胞融合を行うに当り、融合細胞の選択を確実に行うた
め、親株とＢＬＣの比率を１：１にすることが必要であ
る。細胞融合にあたっては、ポリエチレングリコール（
ＰＥＧ）又はセンダイウィルスを用いる方法のいずれで
も使用し得る。或いは、電気融合法等の物理的な方法も
採用可能である。

融合操作終了後、細胞を９６穴或いは２４穴ブレトに２
Ｘ１０’／−以下でまき込むことが必要である。

このようにしてまいた細胞ｆｉｔウェルに５〜！０μｈ
ウアバイン、１００μｈヒボキサンチン、０．４μｈア
ミノプリテン及び１６μｈチミジンを含む培地を加え、
２〜３日毎に半量交換し、細胞を選択する。

細胞生育ウェル上清中の抗リシン抗体をＥＬｒＳＡで測
定し、所望とする細胞の生育ウェルを選択する。

（５）ハイブリドーマのクローニング上記（４）に記載した手順で選択して得られた抗リシン
抗体を分泌するハイブリドーマのうちから、生育の速い
ハイブリドーマを選ぶためにクローニングを行う。クロ
ーニングにあたっては、限界希釈法、ソフトアガー平板
法、フ、イブリンゲル平板法、セルソーターによる細胞
分画法が例示できる。

このようにして得たヒト抗リシン抗体産生ハイブリドー
マは、次の細胞生物学上の特性を有す。

細胞由来　：マウスヒトハイブリドーマ形状　　　：球
形表面付着性：培養器に弱く付着する性質を有す無血清培
地での生育：インスリン、トランスフェリン、エタノールアミン、セレンを含む無血清培地（ＩＴＥＳ培地）で生育以上の方法で得た細胞の内、Ｍ　８１０８　＋１１６−
１、ＹＫ４５Ｈ７−３は微工研菌寄託寛２０９７、ＮＱ
　２０９８として寄託されている。この細胞は、血清培
地、無血？Ｉｌ培地に於いてほぼ同等に生育する特性を
存する。

生育曲線を図１に示す。

又、上述のハイブリドーマ細胞を培養して得た抗体は次
の性質を有している。

■リソンに対し結合性を存し、Ａ鎖又はＢ鎖、或いはＡ
Ｂ両鎮に認識性を有す。

■アイソタイプがＩｇＭであり、かつ重鎖μ、軽鎖にで
ある。

■ヒト型の抗体である。

以下に実施例を示し本発明をさらに具体的に説明する。

実施例１健常人６名の上腕静脈より末梢血を採取した。

それぞれの血液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２
倍希釈し、遠心管（フアシヨン２０９５）に予め分注し
ておいたフィコールパック（ファルマシア）上に重層し
た。

これを１．８００回転で４０分間遠心し、フィコールバ
ックと血漿の界面に沈降したリンパ球（末梢血リンパ球
、ＰＢＬ）を採取した。

ＰＢＬをＰＢＳで２回洗浄した後形質転換に用いた。Ｅ
ＢＶはマーモセットＢ９５−８株の培養上清に含まれる
ものを用いた。

１３９５−８株を１０−≦牛胎児血清（Ｆｅ２、大日本
製薬）を含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　１．６４０培地で培養した
。

培養上清を０．４５μｍのフィルター　（マイＬノクス
ＨＡ、ミリボア）で濾過し、使用まで一８０℃に保存し
た。

上記ＰＢＬＩＸＩＯ’個を遠心し、その上清を除いたベ
レットにＥＢ、Ｖを含む培養上清１ｍｌを加えてＰＢＬ
にＥＢＶを感染させた。

ＰＢＬとＥＢＶの混合液に１０％ＦＣ５添加ＲＩ）Ｍ　
ｌ　１６４０培地１４−を加え、よくセ、濁して１５０
μβづつ９６六マイクロタイタープレート　（フアシヨ
ン３０７２）にまき込んだ。

細胞は３７℃、５％炭酸ガス９５％空気、湿度９５％以
上で培養した。

培養１週間後に培地を１００μｐ添加し、その後３〜７
日毎に培地を半量づつ交換した。４〜８週間後、はとん
どのウェルに形質転換したＢＬＣが増殖してきた。

６名のＰＢＬからＬ４００のＢＬＣ増殖ウェルを得た。

ＢＬＣの培養上清中に含まれる抗リシン抗体を酵素免疫
測定法（ＥＬＩＳＡ）で下記手順により定量した。

定量法：リシン（ＲＣＡ＆。、生化学工業社製）を０．０５μｉ
　ａ　ｔｌ　ＣＯｓに５ｐｇ／ｌｓｌとなるように７容
解し、その５ＱμＪを９６穴ＥＬＩＳＡプレート　（住
人ベークライト社製）に分注し４〜７℃で一夜静置して
リシンをプレートに吸着させた。翌日リシン？容ン夜を
Ｉ舎て、脱イオン水で４倍希釈したプロッツエース（大
日本製薬社製）４００μｌを加え、室温で１時間プレー
トをプロフキングした。

プレートを０．０５％ツイン２０を含むＰＢＳで２回洗
浄後、ＢＬＣの培養上清５０μｌを加えて室温で１時間
静置した。

プレートを３回洗浄後、４　（８希釈ブロツクニスで１
０．０００倍希釈したパーオキシダーゼ標識抗ヒＨｇＭ
Ｃタゴ）５０μｌを加えて、室温でさらに１時間静置し
た。

プレートを６回洗浄後、ｉｔとして、０．００６％のＩ
Ｉ　、　Ｏ！を含む０．１１１クエン酸！！街液（ｐｌ
＋　４．０）に溶解した２、２′−アジノビス（３−エ
チルヘンズーチアゾリンスルホン酸）２アンモニウム塩
（ＡＢＴＳ、和光社製）を基質として１００μｌ加えた
。

６名のドナーのうち、Ｍ　１４、ＹＫ、からのＢ　１．
□Ｃより、それぞれ各１個づつのＩｇＭ彫りンン抗体を
含むウェルを検出した。

ＢＬＣの番号はＭＨＩ０８、ＹＫ４．５であった。これ
らの細胞は段階的に１０ｍ１ｌ＠養まで増殖させ、８０
°Ｃまたは液体窒素中に保存した。

■凱巷迦胞の作贅８−アザグアニン耐性、ＨＡＴ感受性のマウスミエロー
マ細胞ＳＰ２株を、１μｉのウアバインを含む１０％Ｆ
Ｃ３添加ダルヘフコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に懸
濁し、９６穴プレ一ト１枚にウェル当りＩＸｌ、０’個
の細胞をまき込んだ。これを２週間培養して、ウアバイ
ン耐性株４０個を得た。

このうち増殖の早いｌＯウェルを２４穴プレート（コー
ニング２５８２０）に移して培地２ｍｌを添加し、１週
間培養した。さらに１０ウエルのうち増殖の連い５ウエ
ルを５ｃｍのシャーレ（ファルコン３００２）に移し、
ウアバイン濃度を段階的に、１μ門、１０μｉ、５０ｔ
ｔＭ、最終的に１００μ門まで増加させた。５株とも１
００μ門ウアバイン存在下で生き残り耐性株を取得でき
た。

このうち最も増殖の速い１株を選び、５Ｐ２１０２と名
づけで以下の細胞融合に用いた。

上記■で得た抗リシン抗体分泌Ｂ　Ｌ　Ｃ１，５ＸＩ０
７個と同数のＳ　Ｐ　２１０２を、Ｆｅ２を含まないＲ
Ｐ　Ｍｌ　１６４０培地で２回洗浄した。

これを５０１Ｒ１遠心管（ファルコン２０７０）中で混
合後、１５００回転で１０分間遠心してベレットにした
。

上７ｕを完全に除去した後、５０％ポリエチレングリコ
ール（ＰＥＧ、シグマ）１ｍ１を５０〜６０秒かけてゆ
っくり滴下して細胞融合を行った。

３分間静置後、Ｆｅ２を含まないＲＰＭ１１６４０培地
１５Ｍ１を徐々に加えてＰＥＧを希釈した。細胞を遠心
分＾Ｕさせた後、これを１０％ＦＣ３を含むＲＰ　Ｍ　
Ｉ　１６４０培地６Ｑｍｌに懸濁し、この１５０ｐｌづ
つを９６穴マイクロタイタ一ブレ〜ト４枚に分注した。

Ｍｌ（１０８は２回、ＹＫ４５は１回、細胞融合を行っ
た。融合の翌日、５μＨウアバイン、１００μｉヒポキ
サンチン、０．４μＨアミノプテリン、１６μｈチミジ
ン（ｏ−ＨＡ　Ｔ　）を含む１０％ＦＣ５添加ＲＰＭ１
１６４０培地を加え、その後２〜３日毎にｏ−ＨＡＴ培
地を用いてプレートの培地を半量づつ交換して、ハイブ
リドーマを増殖させた。

培養２〜３週間後、プレートを観察したところ、すべて
のウェルにハイブリドーマが増殖していた。

ハイブリドーマの培養上清中の抗リシン抗体の検出は上
記■と同様に行った。

Ｍ　８１０Ｂからのハイブリドーマでは７６８ウ工ル中
７６８ウエル全部、ＹＫ４５からは３８４ウ工ル全部が
陽性であった６増殖の速いハイブリドーマ、Ｍ）１１０Ｂ　）１１６、
ＹＫ４５Ｈ７のクローニングを行った。

９６大丸底プレート　（コーニング２５８５０）にハイ
ブリドーマを１ウェル当り平均０．５個人るようにまき
込み、３〜４週間培養後上清中の抗体をＥＬＩＳＡによ
り測定した。

Ｍ　Ｈ１０８Ｈ１６はプレート４枚にまき込んで１７４
ウエルにハイブリドーマが増殖し、このうち１３２ウエ
ルが抗リシン抗体陽性であった。

ＹＫ４５Ｈ７はプレート２枚にまき込んで６４ウエルに
ハイブリドーマが増殖し、このうち１５ウエルが抗体陽
性であった。

最終的に抗体産生の良い増殖の速いハイブリドーマＭ　
Ｈ１０８１１１６−１とＹ　Ｋ２Ｓ　Ｈ７−３を得た。

実施例２本例は、実施例１で作製した抗リシンモノクローナル抗
体の特性を示す。

抗リシンモノクローナル抗体の物理化学的特性二Ｍ　Ｈ
２Ｏ２＋１１６−１　、　Ｙ　Ｋ２Ｓ　＋１７−３の２
株の培養上清について抗原特異性をそれぞれ検索した。

リシンＣＲＣＡｈ。、生化学工業製）、リシンＡ鎖、リ
シンＢｔＡ（いずれもシグマ社製）を５μｇｏｄになる
ように０．０５Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯｓに溶解し、この５０
μｍ２をＥＬＩＳＡプレートに分注し抗原とした。以後
の操作は、実施例Ｉと同様に行い、抗と）ｒｇＭ抗体を
使用し、測定を行った。

又、抗ヒト抗体、抗ヒトμ抗体（いずれもタボ社製）を
使用したＥＬＩＳＡ法により抗体の軽鎖と重鎮を特定し
た。すなわち、プレートに抗ヒトμ抗体を固定し、洗浄
後、各細胞の培養上清より得た抗体を加え、反応後洗浄
し、さらにペルオキシダーゼラベル抗ヒトμ抗体を加え
反応させ、再度洗浄した後、基質を加え発色させて、抗
体の重鎮、軽鎖を特定した。

上記検索の結果、抗体の物理化学的特性は下記表のとお
りであった。

表実施例３本例は実施例１で作製したハイブリドーマの培養を示す
。

ハイブリドーマの無血清培養；実施例１の■で得たハイブリドーマＭＨ１０８Ｉ＋　１
．６−１、Ｙ　Ｋ　４５　）＋７−３の２クローンにつ
いて無血清培養を行った。

ｅＲＤＦ培地（極東製薬社製）にインスリン（ノボ社製
）５μｇ７ｍｌ、ヒトトランスフェリン（シグマ社製）
２０Ｍｇ７ｍｌ、エタノールアミン（和光社製）２０Ｍ
ｇ７ｍｌ及び亜セレン酸ナトリウム２５ｎＭを加えたＩ
ＴＥＳ培地中に、１　×１０５／ｍｌの細胞数でまき、
３７゛Ｃの温度、５％二酸化炭素濃度、湿度９５％雰囲
気下で培養し、細胞数を計測した。

同様に、ｅＲＤＦ培地に１０％生胎児血清（Ｆｅ２）を
含む培養液で培養を行った。

両クローンとも図１に示す通り、正常な生育を示した。

衾肌■法来以上述べたとおり、本発明のヒト抗リシンモノクローナ
ル抗体はりシンに対し、Ａ鎮、Ｂ鎖、ＡＢ鎖それぞれに
特異的な結合能を有しているため、リシンの定量、抽出
および毒性の中和などに利用することが可能となる。

また、本発明による抗リシン抗体分泌ハイブリトーマは
、長期にわたり安定的にヒト抗リシン抗体を生産してお
り、又無血清培地でも生育することから、大量にかつ高
純度で抗リシン抗体を生産することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

図１は本発明によるハイプリドーマのクローン株である
（ａｔ　ＭＨ１０８Ｈ１６−１と（ｂｌ　ＹＫ　４５１
（７−３の培養（実施例３）による生育状況をそれぞれ
示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）リシンＡ鎖またはリシンＢ鎖もしくはリシンＡ鎖
およびリシンＢ鎖に抗原認識性を示す特性を有するＩｇ
Ｍクラスのヒマ種子有毒蛋白質リシンに対するヒトモノ
クローン抗体。
（２）ヒト末梢血リンパ球をエプスタインバールウイル
スで形質転換した細胞とマウスミエローマ細胞ＳＰ２株
のウアバイン耐性細胞との融合株から成る、ヒマ種子有
毒蛋白質リシンに対するヒトモノクローン抗体を分泌す
るハイブリドーマ細胞。