JPS6344881A - ヒト抗リ−サスｄ産生ヘテロハイブリド−マ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒト赤血球ジーサス（Ｒｈｅｓｕｓ）　Ｄ抗
原（以後、ＲｈＤ抗原と称する）に対するヒトモノクロ
ーナル抗体、即ち血液型判定用又は新生児溶血性疾患（
ＨＤＮＢ）を予防するためのＲｈＤ−母体受動免疫用に
適したＩｇＭ又はＩｇＧクラスのヒト抗ＲｈＤモノクロ
ーナル抗体を分泌する新規マウス−ヒトヘテロハイブリ
ドーマに関する。

ＨＤＮＢは、抗ＲｈＤ　　ＩｇＧ抗体が妊娠期に胎盤を
通過して胎児赤血球破壊を起こす結果ＲｈＤ抗原で事前
に感作されたＲｈＤ−母体のＲｈＤ　　新生児において
発生する。ＲｈＤ抗原に対するＲｈＤ−母体の感作は、
胎児赤血球が母体循環に入り母体免疫系で認識されるた
めに、最初のＲｈＤ＋児出生時に生じ得る。ＨＤＮＢ発
生率を低下さけるために、英国及び他の多数の国ではＲ
ｈＤ＋幼児出生後直ちにＲｈＤ−母体に抗ＲｈＤ抗体を
投すする一般的処置が行なわれ、その結果１１体循環に
入った胎児ＲｈＤ＋赤血球は迅速に除去される〔モリメ
ン、ピー・エル（１９８３）臨床医学における輸血、第
７版、ブラックウェル・サイエンティフィック、オック
スフォード（Ｍｏ１１ｉｓｏｎ、Ｐ、ｌ、、（１９８３
）Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓ−ｉｏｎ　　Ｉｎ　　
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　　Ｍｃｄｉｃ４ｎｅ、７Ｌｂ　　ｅ
ｄｎ、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｃｎＬｉｒｉｃ、Ｑｘ
ｆ’ｏｒｄ）］。

現在、抗ＲｈＤ抗体は、妊娠期に免疫された供与者から
、又は不適合輸血もしくはボランティアの意識的免疫に
より、直接大量に得られる。適切な血漿抗ＲｈＤ濃度を
得るためには、多数の供与者は赤血球の追加免疫注射を
要したが、この操作では厳格な監視にもかかわらず赤血
球導入をうける場合に共通した危険、例えば肝炎ウィル
ス及びＨＩＶ導入の危険を伴う。しかも、凝集性ＩｇＭ
抗Ｒｈ　Ｄは特にＲｈ型判定に役立つものの、免疫供Ｉ
ゴ１者からはめったに高力価で産生されないため、人手
が非常に困難である。したがって、イン・ビトロにおけ
る抗ＲｈＤ抗体の産生手段に多大な関心が集まっている
。

抗ＲｈＤ供与者のヒトＢリンパ球はエプスタイン・バー
ル・ウィルス（ＥＢＶ）で感染後組織培養により抗Ｒｈ
Ｄを産生じ得るが、残念なことにこれらのリンパ芽球細
胞は通常数か列後に抗ＲｈＤ産生を停止することがすで
に明らかにされている〔ボイルストンら、スカンジナビ
アン・ジャーナル・オブΦイムノロジー、第１２巻、第
３５５頁、１９８０年（Ｂｏｙｌｓｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ
、５ｃａｎｄｉ−ｎａｖｌａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、　１２，３５５（１９８０））
及びメラミドら、ヨーロピアン・ジャーナル争オブ・イ
ムノロジー、第１５巻、第７４２頁、１９８５年（Ｍｅ
ｌａＩＩｌｅｄ　ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏ
ｕｒｎａｌｏｆＩＩＩｖ＋ｕｎｏ１ｏｇｙ、１５，７４
２（１９８５））　］　ａより安定なヒト免疫グロブリ
ン分泌細胞系を得るために、様々な研究者が融合ハイブ
リドーマを製造した。例えば、１９７３年にシュウニー
バー（５ｃｈｖａｂｅｒ）及びニーエン（Ｃｏｈｅｎ）
は、マウスミエローマ系（ＴＥＰ（、−１，５）及びヒ
ト末梢血Ｂリンパ球間で最初に成功した融合について報
告した〔シュウニーバー及びニーエン、ネーチャー　（
Ｎａｔｕｒｅ）、第２４４８、第４４４頁、１９７３年
〕。得られるヘテロハイブリドーマはマウス及びヒト双
方のＩｇを分泌するか、それでもなおヒトＩｇの選択的
合成は必要なヒ！・抗体の首尾よい産生のために必要と
される。

別の融合は、肺臓〔ノウインスキーら、サイエンス、第
２１０巻、第５３７頁、１９８０年（Ｎｏｖｉｎｓｋｉ
　ｅＬ　ａｌ、５ｅｉｅｎｅｅ　２１０，５３７（１９
８０））　］、リンパ節〔シュロームら、プロシーデイ
ンゲス・オブ昏ナショナル・アカデミ−ψオブ・サイエ
ンス、第７７巻、第６８４１頁、１９８０年（Ｓｃｈ−
１ｏｍ　ａｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃｅｃｄｉｎｇｓ　ｏｆ　
Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆＳｃｉｅｎｃ
ｅ、７７．１ｉ８４１（１９８０））：ｌ又は末梢血〔
クロース（Ｃｒｏｅｃ）ら、プロシーデインゲス・オブ
φナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、第７６
巻、第３４１６頁、１９７６年及びレーンら、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・メディシン、第１５５
巻、第３３３頁、１９８２年（Ｌａｎｅ　ｅＬａｌ、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ　　ｏｆ’　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１５５　．３３３（１９ｇ２））
　’］からのＢ細胞を用いたものについて報告されてい
る。これらの融合の場合、マウスミエローマ系ＮＳＩ又
はＳＰＩが使用された。ＩｇＭ抗破傷風菌モノクローナ
ル抗体を分泌するヘテロハイブリドーマを得るために、
ＥＢｖ感染ヒト末梢血Ｂ細胞及び非Ｉｇ分泌細胞系Ｘ　
６’３−Ａ　ｇ８．６５３マウスミ工ローマ細胞間で成
功した融合についても報告された〔コズバーら、１９８
２年、ハイブリドーマ、第１巻、第３２３−３２８頁（
Ｋｏｚｂｏｒ　ｅｔ　ａｌ、（１９８２）Ｈｙｂｒｊｄ
ｏＩｌｌａ　ｌ　、３２３−３２８）　〕。このように
してコズバーらにより得られたすべてのヘテロハイブリ
ドーマはにＬ鎖をもつヒトＩｇＭを産生ずることが判明
した。これら４種のへテロハイブリドーマを用いて更に
研究を積重ね、それらが２×１０４細胞／ウエル／２ｍ
ｌで１０％牛脂児血清（Ｆｅ２）補助ＲＰＭＩ−１６４
０培地含有のウェルに播種された場合において、９〜１
０日後の特異的抗破傷風菌抗体の産生量は２μｇ／ｍｌ
を超えないことが判明した。

ＩｇＭ又はＩｇＧクラスの抗ＲｈＤモノクローナル抗体
を分泌する安定な細胞系を得るために、ヒトミエローマ
細胞及び細胞系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３マウスミ工ロー
マ細胞間で形成されたそれ自体がヘテロハイブリドーマ
たるミエローマとのＥＢＶ形質転換ヒト末梢而Ｂ面胞の
融合については、公開ＰＣＴ出願第８５７０２４１３号
明細書に更に開示されている。しかしながら、得られる
ヘテロハイブリドーマが例えば約１×１０６細胞／ｍ＋
で培養中２０μｇ／ｍｔ／２４時間以上の十分な力価の
抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産生じ得るか否かについ
ては開示されていなかった。

我々は、適９Ｊな条件下で培養した場合にマウスＩｇ非
存在ドで高力価のヒト抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産
生ずるマウス−ヒトヘテロハイブリドーマを、非Ｉｇ分
泌性マウスミエローマ細胞を直接ＲｈＤ高度免疫供与者
のＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ球と融合させることによ
って得ることかり能であることを見出した。我々は、こ
のようなヒトＢリンパ球が、ＰＣＴ出願第８５１０２４
１３号明細書におけるようにヒトミエローマ細胞と予備
融合させなくとも、マウスミエローマ細胞と適合するこ
とを発見した。

本発明の一面において、我々は、非Ｉｇ分泌性マウスミ
エローマ細胞、好ましくはマウスＸ６３−Ａｇ８．６５
３ミエローマ細胞とＥＢＶ形質転換ヒ）Ｂリンパ球の抗
ＲｈＤ　　Ｉｇ産生群との融合により形成される抗Ｒｈ
Ｄモノクローナル抗体産生ヘテロハイブリドーマを提供
するが、このヘテロハイブリドーマは下記ハイブリドー
マ培地９３７℃約１×１０６細胞／ｍ＋で培養した場合
に抗ＲｈＤモノクローナル抗体２０μｇ／ｍｌ／２４時
間以上を産生ずる。抗ＲｈＤモノクローナル抗体は通常
ＩｇＭ又はＩｇＧクラスに属する。

本明細書で用いられる“ハイブリドーマ培地”という語
は、１０％（ｖ／ｖ）　Ｆ　ＣＳ補助ＲＰＭＩ−１６４
０培地を含有する培地又は同一条件下で同等の増殖を維
持する培地を意味すると理解されるべきである。

ＲｈＤ抗原で高度免疫された供与者の１０３又は１０４
個の末梢血Ｂリンパ球中１個だけが抗ＲｈＤ分泌体であ
ることが知られている〔エルラン及びブラッドリー、ラ
ンセット、第１巻、第７８９頁、１９７０年（Ｅｌｓｏ
ｎ及びＢｒａｄｌｃｙ。

Ｌａｎｃｅｔ　　１．、７８９（１９７０））　）　、
　ＲｈＤ抗原で自然に及び／又は故意に免疫されたＲｈ
Ｄ−供与者から１１１　離されるＢリンパ球のＥＢＶ形
質転換は、選択されたミエローマ細胞との融合を実施す
る前において、イン・ビトロでの活発な増殖性及び高抗
ＲｈＤ力価に基づき選択を容易にさせる。しかもＥＢＶ
形質転換Ｂリンパ球は、同一条件下の非ＥＢＶ形質転換
Ｂリンパ球と比較して高い確率でマウスＸ６３−Ａｇ８
．６５３細胞と融合することが判明した。このように、
同数の非ＥＢＶ形質転換ヒト末梢血Ｂリンパ球及びマウ
スＸ６３−Ａｇ８．６５３細胞が慣用的融合条件下にお
かれた場合の平均融合数は約８．４Ｘ１０　’であるこ
とがわかった。非ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球をＥＢＶ形
質転換Ｂリンパ球で代用した場合は、平均融合数が約１
．０Ｘ１０”−’に増加する。

本発明のヘテロハイブリドーマの製造のためには、マウ
スミエローマ細胞との融合用に選択されるＥＢＶ形質転
換Ｂリンパ球群は、下記リンパ芽球細胞培地中３７℃で
培養した場合に、抗ＲｈＤ２００ｎｇ／１０６細胞／２
４時間以上、最も好ましくは抗ＲｈＤ２５０ｎｇ／１０
６細胞／２４時間以上を産生ずることが望まれる。

本明細書で用いらる“リンパ芽球細胞培地”という語は
、１０％（ｖ／ｖ）　Ｆ　ＣＳ　、ベンジルペニシリン
Ｋ（１００μｇ／ｍｌ）、硫酸ストレプトマイシン（１
００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンーＢ（２，５μｇ／
ｍｌ）、２−メルカプトエタノール（５０μＭ）及びＬ
−グルタミン（２ｍＭ）補助ＲＰＭＩ−１６４０培地、
又は同一条件下でＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球の同等の増
殖を維持し得る等価培地を意味すると理解されるべきで
ある。

上記融合用に好ましいＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球群を得
るために、８９２８球の出発群は二次免疫後約１３〜５
７日目、最も好ましくは約１３〜２８０口にＲｈＤ高度
免疫供与者の血液から採取されることが好ましいと判明
した。出発Ｂリンパ球を上記期間内でＲｈＤ高度免疫供
与者の血液から得ることからなる、永続的細胞系との融
合用の抗ＲｈＤ＋であってＥＢＶで形質転換されたヒト
Ｂリンパ球の産生方法は、本発明のもう一面を構成する
。

選択されたヒト供与者の血液からの８９２８球の採取の
後に、例えば最初に“軟膜分画”　（白血球）をｒ、１
を離し、単核球を分離し、しかる後Ｔ細胞及び混入血小
板を除去することによる８９２８球の採取の後に、単離
されたＢ細胞のＥＢＶによる形質転換、続いて１以上の
増殖及び選択工程が行なわれることが適切であって、コ
ロニーの選択は活発な増殖性及び高抗ＲｈＤ力価に基づ
いて行なわれる。所望であれば、表面抗ＲｈＤ　　Ｉｇ
発現細胞を含有する単離Ｂリンパ球コロニーは、ＥＢＶ
形質転換前におけるパパイン処理ＲｈＤ＋赤血球を用い
た抗ＲｈＤ産生Ｂリンパ球の植換えによって選択するこ
とができる。又は、ＥＢＶ処理Ｂ細胞の初期コロニーは
、同様の方法により表面抗ＲｈＤ　　Ｉｇ発現Ｂ細胞の
存在に関して試験することもできる。この型の免疫グロ
ブリンについて陽性のコロニーの場合における抗ＲｈＤ
力価の定量は、慣用的方法で実施し得る。単離されたＢ
細胞のＥＢＶ形質転換は、細胞を例えばメラミドら、ヨ
ーロピアン・ジャーナルψオブ・イムノロジー、１９８
５年、第１５巻、第７４２−７４６頁［Ｍｅｌａｍｅｄ
　ｅｔ　ａｌ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ’　Ｉｍｍｕｎｏｉ−ｏｇｙ（１９８５）　１５．７
４２−７４６３　ニ記載された８９５、Ｂマーモセツト
細胞系の過増殖培養物の培養上澄と接触させることによ
って行なうことが便利である。

マウスミエローマ細胞系Ｘ６３−Ａｇ ８．６５３と、二次免疫後それぞれ７週日及び１３日１
にＲｈＤ高度免疫供与者の末梢血から得られる高抗Ｒｈ
Ｄ力価を有するＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ球の異なる
２群との融合細胞により得られる、本発明の２種のハイ
ブリドーマ細胞系は、欧州動物細胞培養物寄託機関（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎ−１７−５］ Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　　Ｃｅ
１ｌ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、ＥＣＡＣＣ）　　、ポート
ン・ダウン、英国に寄託された。それぞれＭＡＤ−２及
びＦＯＭ−１と称されるこれらのヘテロハイブリドーマ
は、いずれもラムダＬ鎖をもつＩｇＭクラスの抗ＲｈＤ
モノクローナル抗体を産生ずることができる。ＭＡＤ−
２は１９８６年４月１８０に寄託Ｎｏ、、８６０４１８
０３号としてＥＣＡＣＣ，英国に寄託された。ＦＯＭ−
１は１９８７年２月１３日に寄託Ｎｏ、、　８７＝０２
１３０１号としてＥＣＡＣＣに寄託された。

細胞系ＭＡＤ−２により産生されるＩｇＭ抗ＲｈＤ抗体
について更に研究したところ、その抗体は輸血実施に際
するＲｈＤ型判定のための使用に非常に適した抗体であ
ることが判明した。

ＭＡＤ−２培養物（３７℃２４時間で約１×１０　細胞
／ｍｌのハイブリドーマ培地）及びバイオロジー・リサ
ーチ及びレビューの米国オフィス（Ｕ、Ｓ、０ｆｒｌｃ
ｃ　ｏｒＢｉｏｌｏｇｉｅｓ、Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎ
ｄ　Ｒｅｖｉ−ｅｗ）ＩｇＭ抗り標準製剤の効能比較試
験では、培養１−澄は参照標準よりも約３２倍高い効能
を有することか見出され、このため日常的使用のために
希釈することができる。下記表１で示されるように、Ｍ
ＡＤ−２ＩｇＭは試験されたすべてのＲｈＤ＋ｈＤ＋及
び大半のＤｕ赤血球を凝集させることが見出されたが、
希少のＤＢ細胞とは反応しない（１／１０００の確率）
。このとは、Ｒｈ−に属するためにＲｈ−血液が投与さ
れる輸血受容者にとって重要ではない。このＩｇＭ抗Ｒ
ｈＤをもつＲｈ−供与者は、ＤＵ及びＤＢ抗原の存在を
調べるために、例えばポリクローナルＩｇＧ抗ＲｈＤで
スクリーニングされることが必表　　　１ 異種遺伝子型の赤血球を用いたＭＡＤ−２ＩｇＭとの凝
集試験結果 細胞遺伝子型　　　　供与者　　凝　　集０Ｒ１ｒ　　
　　　　　　　　　　＋ ＯＲ２、ｒ　　　　　　　　　　　　’　＋ＯＲｏ　ｒ
　　、　　　　　　　　　　　＋Ｏｒ’ｒ　　　　　　
　　　　　　　−Ｏｒ’ｒ　　　　　　　　　　　　　
−Ａｌｒｒ　　　　　　　　　　　　− 〇　ｒ　ｒ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　−ＤＵ　　　　　　　　５　　　４１５＊Ｄ１３３
　　　０／３ Ｉ　　ｇＧ−１皮覆７ Ｃ，３−Ｃ４−被覆７ ＋　ρ集あり 一　凝集なし ＊　インキュベート開始１分後５例中４例陽性Ｘ　イン
キュベ−１・開始３０分後 ≠　ＩｇＧ抗Ｃで強固に被覆されたＲｈ−細胞又は補体
成分Ｃ３及びＣ４で被覆されたＲｈ−細胞。これらの細
胞はコントロールに属し、ＩｇＭ抗ＲｈＤか“非抗Ｒｈ
Ｄ”ＩｇＧ被覆細胞の非特異的凝集を生じないことを示
す。

新規ＭＡＤ−２細胞系は大規模バルク培養で十分に増殖
し、良好な収率で抗体を産生ずる。約２〜３１１／週の
産生速度は現実の輸血実務に際して５子方人の血液型判
定に十分なＩｇＭ抗ＲｈＤを提供し、約２０Ω／週では
受動免疫に十分な抗ＲｈＤを提供する。培養上澄は、約
１×１０６細胞／ｍｌで２４時間の培養後に、２０μｇ
　／　ｍ１以上、通常２５μｇ　／　ｍ１以上のＩｇＭ
含有量で得ることができる。

本発明の同様の方法で産生されるＦ’０Ｍ−１及び他の
細胞系も、良好な増殖及び抗体産生特性を有する。ＭＡ
Ｄ−２ＩｇＭと同様に、細胞系ＦＯＭ−１から分泌され
るＩｇＭは、ジーサス系のＤ成分に対して非常に特異的
であって、しかもＲｈＤ＋ｈＤ＋の診断凝集反応を誘導
する上で非常に有効であることが判明した。

本発明はＭＡＤ−２及びＦＯＭ−１を包含する他に、そ
のＩｇＭ抗ＲｈＤ産生変異株をも包含すると理解される
べきである。

本発明の別の面として、我々はヒトＩｇＭ抗ＲｈＤ２０
μｇ　／　ｍｌ以−Ｌを含有する細胞培養物の未濃縮１
−澄を提供する。かかる上澄は適切な希釈後にＲｈ型判
定用として直接有利に使用することができる。

本発明の更に他の面として、我々は、本発明のヘテロハ
イブリドーマから産生されるモノクローナル抗ＲｈＤ免
疫グロブリン、好ましくはＭＡＤ−２又はＦ　Ｏ’Ｍ　
−１のＩｇＭのような本発明のモノクローナルＩｇＭ抗
ＲｈＤを用いる赤血球Ｒｈ型１′す定方性、並びに母体
のＲｈＤ抗原感作を予防するためのＲｈＤ＋児出生後出
生後るＲｈＤ−母体受動免疫用としてのかかる抗体の用
途を提供する。ヒトへの注射に適した本発明の抗体の無
菌溶液は、いずれかの生理学的に許容される水性媒体、
例えば等張リン酸緩衝液又は血清で調製することがてき
る。抗体は所望であれば使用前希釈用の凍結乾燥品とし
ても供給できる。

下記例は本発明を更に詳細に説明するものである。

例　　１ “軟膜分画”　（白血球）を、ケンブリッジ輸血センタ
ー（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕ
ｓｉｏｎ　Ｃｅｎｔｒｅ）ケンブリッジ、英国で１０年
前に６回のＲｈ＋細胞（Ｒ２Ｒ２）注射で初期に免疫さ
れたＲｈ−供与者の血液から得た。最後の追加免疫注射
は採血の７週間前であった。

単核細胞をフィコール−ハイパクー（Ｐｊｃｏｌｌ−１
１ｙｐａｑｕｅ）　［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｅｉ
ａ）、゛アップサラ、スウェーデン〕で単離し、混合血
小板を５０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）等張渡中で
の二次遠心分離（４０，Ｏｘｇで１０分間）により除去
した。Ｔ細胞を次いで２−アミノエチルイソチオウロニ
ウムブロミド処理羊赤血球を使用して除去した〔メトセ
ンら、１９８０年、ジャーナル拳オブ脅イムノロジカル
・メソッズ、第３３巻、第３２３頁（Ｍｅｄｓｃｎ　ｃ
ｔ　ａｌｌ（１９８０）Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙＭｅｔｈｏｄｓ　３３，３２３）　）。

（１１）巣、１ＩＩＩＩＢ細胞のＥＢＶ形質転換マーモ
セット細胞系８９５、Ｂ　（ミラー及びリップマン、１
９７３年、プロシーデインダス・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンスＵＳＡ、第７０巻、第１９
０頁（Ｍｉｌｌｅｒ　ａｎｄ　Ｌｊ−ｐｍａｎ（１９７
３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｒ’　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ’５ｃｉｅｎｃｅ　ＵＳ＾、
７０，１９０）　］を標準組織培地中で増殖させ、コロ
ニー形成させ、次いで使用前に更に１週間インキュベー
トした。消費された」１澄を採取し、０、Ｂμｍ膜に通
過させて濾過し、Ｂ細胞を感染させるために１０６細胞
／ｍｌで１．５〜２時間３７℃で使用した〔メラミドら
、１９８５年、ヨーロピアンやジャーナルφオブ・イム
ノロジー、第１５巻、＞１７．４２−７４６頁（Ｍｅｌ
ａｉｅｄ　６ｔ　ａｔ。

（１９８５）ｌシｕｒｏｐｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　ｌｉｍｕｎｏｌｏｇＬ　ｐ、７４２−７４６）　　
）　　。

（ｌｉｔ）リンパ芽球細胞系の確立 ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞を、１９２平底ウエル（２００，
ｃｌ）中初期密度５Ｘ１０５／ｍｌで増殖させた〔培地
；１０％（ｖ／ｖ）　Ｆ　ＣＳ　、ベンジルペニシリン
Ｋ　（１００μｓｒ／ｍｌ）　、硫酸ストレプトマイシ
ン（１００μｇ／ｍｌ）、アムホテリシンーＢ　（２，
５μｇ／ｍり　、２−メルカプトエタノール（５０μＭ
）及びＬ−グルタミン（２ｍＭ）補助ＲＰＭＩ−１６４
０培地〕。

組織培養ウェルから得られるＩｇＭ及びＩｇＧ抗ＲｈＤ
の検出及び分析は、微量滴定プレート中それぞれ天然及
びパパイン処理赤血球を最終細胞濃度０．５％で用いる
凝集により実施した〔メラメドら、１９８５年、ヨーロ
ピアン・ジャーナル拳オブ中イムノロジー、第１５巻、
第７．４２−７４６頁〕。双方の抗体クラスに関する分
析感度は約１．　ｎ　ｇ　／、ｍＩである。

増殖はすべてのウェル中で確立され、抗ＲｈＤは２週間
後にウェル中７１％で存在１ていた。２個のウェルをそ
れらの活発な増殖性及び高抗ＲｈＤ力価（，２００９以
上）に基づき選択し、フラスコ中８０ｃｘｌ　に達する
まで増殖させた。一方のウェルはＩｇＧ抗ＲｈＤを産生
し、他方はＩｇＭ抗ＲｈＤを産生した。２か列後、Ｉｇ
Ｇ抗、ＲｈＤ産生速度は低下する（力価８１）ことがわ
かったが、ＩｇＭ抗ＲｈＤ産生は安定であった（力価約
５０００）。双方の培養上澄はα、γ及びμＨ鎖並びに
に及びλＬ鎖を含有していた。

（Ｉｖ）紋−介 融合相手としてのＸ６３−Ａｇ８．６５３の適合性を調
べるために考えられた最初の実験では、融合効率がおよ
そ１×１０　中の１であることがわかった。

マウスミエローマＸ６３−Ａｇ８．６５３を空気中５％
ＣＯ２雰囲気下３７℃において１０％（ｖ／ｖ）　Ｆ　
ＣＳ、　２ｍＭグルタミン補助！？ＭＩ−１６４０中で
増殖させた。これら条件下において、細胞系は１８〜２
０時間の倍化時間を有し、毎日の継代培養により対数増
殖用を維持し得る。融合前において、細胞生存率にグロ
シン色素排除率による測定）は９５％を超えた。常時、
８−アザグアニンを、ヒポキサンチン−アミノプテリン
−チミジン（ＨＡＴ）培地で生存する変異体を排除する
ため、培地中２０μｇ／ｍｌ含有させた。

選択されたＩｇＭ抗ＲｈＤ産生リンパ芽球細胞培養物（
１×１０７）及びミエローマ細胞（１×１０７）の細胞
群を２５ｍ１プラスチツク製容器に一緒に加え、リン酸
緩衝液（ＮａＣ１１５０ｍＭ；Ｐ　０４１０　ｍ　Ｍ　
）で希釈し、２００ｘｇで１０分間回転させて通常のペ
レットとした。ペレットをほぐした後、４５％ポリエチ
レングリコール４０００　（メルク（Ｍｅｒｃｋ）、ダ
ルムスタッド（ＤａｒＬｌｌｓｔａｄｔ）、ＦＲＧ）１
ｍｌ及びリン酸緩衝液中５％ジメチルスルホキシドを一
定に撹拌しながら１分間かけて滴下した。撹拌は水浴中
３７℃で９０秒間継続し、しかる後細胞を室温で徐々に
塩水で希釈した。細胞を２００ｘｇで５分間遠心分離し
、次いで完全ＲＰＭＩ−１６４０に静かに再懸濁し、マ
ウス腹膜細胞（２Ｘ’ＩＯ’個／ウェル）が予め播種さ
れた９６ウエルトレーに分配し、各ウェルに培地１００
μρ中ミエローマ細胞ｌＸ１０５を含有させた。２４時
間のインキュベート後、２倍濃縮ＨＡＴ及び２μＭウア
バイン含有の培地１００μΩを加えた。ＨＡＴは未融合
マウスミエローマ細胞の過増殖を防止し、ウアバインは
未融合リンパ芽球細胞を殺す。

ウェルは、培地！Ｉｔ分をＨＡＴ及び１μＭウアバイン
含有新鮮培地と交換することにより給餌が開始された７
日後に試験した。給餌は２又は３日毎に繰返した。増殖
陽性ウェルを、°細胞がウェルの底半分を覆った時点で
、免疫グロブリン産生についてスクリーニングした。目
的とするハイブリッドを９６ウエルＩ・レーから直接ク
ローニングした。

ＨＡＴ／ウアバイン選択を融合後３週間続け、標準組織
培地での培養前に細胞をＨＴ含有培地に通過させた。

（Ｖ）ハイブリッドのクローニング 融合が行なわれたすべてのウェルでは活発な増殖を示し
た。ポリエチレングリコール工程が省略された２つの擬
融合のいずれのウェルにおいても、増殖が見られなかっ
た。融合後４週間目において、ウェル９６個中３０個が
１００以上の抗ＲｈＤ力価を示した。１個のウェルを良
好な増殖性及び抗ＲｈＤ力価に基づき選択した。ハイブ
リッドは、マイクロマニピュレーター及び顕°微鏡を使
用して、対数的増殖相の培養物を１個だけマウス腹膜支
持細胞が予め播種された９６ウエルトレー中の個々のウ
ェルに移し変えた。単独の細胞だけが移し変えられるこ
とを確実にするため、細胞を高倍率レンズの視□野内で
１個だけとなったときのみ選別し、最終ウェルに移す前
に試験用中間容器に入れた。

クローン細胞を４週間後に再クローニングした。

最初のクローニング後、サブクローン１３個中１０個は
抗ＲｈＤ力価に関し陽性であった。第二のクローニング
後、サブクローン４０個中３３個は抗ＲｈＤ産生に関し
陽性であった。

酵素結合免疫試験法により、上ｉをヒト免疫グロブリン
の産生に関してスクリーニングした。

Ｅ　ＩＡ）レー〔ダイナ□チック（Ｄｙｎａｔｅｃｈ）
　、ビリングシュルスト（ＢｉｌｌｎｇｓｈｕｒｓＬ）
　、サセックス〕をヤギ抗多価ヒト免疫グロブリン抗体
〔シグマ（Ｓｉｇｖｌｌａ）、プール（Ｐｏｏｌｅ）、
ドーセット〕で被覆した。培養上澄を次いで被覆トレー
中でインキュベートした。トレーを０．１％ツイーン２
０（Ｔｖｅｅｎ２０）含有リン酸緩衝液で洗浄し、次い
でアルカリホスファターゼに結合した抗ヒトＨ鎖又はＬ
鎖特異的抗体（シグマ）と−緒にインキュベートした。

最後の洗浄後、トレーをｐ−ニトロフェニルリン酸エス
テルと一緒にインキュベートし、“タイタルチック・マ
ルチスキャン（ＴｉｔｅｒｔｅｋＭｕｌｔｉｓｋａｎ）
”ＥＩＡ解読機で変色をモニターした。

第二のクローニング後、最大のヒトＩｇＭ抗ＲｈＤ産生
を行なうクローンヘテロハイブリドーマをＭＡＤ−２と
命名した。

例２ ＭＡＤ”−２細飽系の大規模培養 ＭＡＤ−２細胞系細胞（ＥＣＡＣＣＮｏ。

８６０４１８０３号）は培地としてＲＰＭＩ−１６４０
を用いて２ＯＮスピナー培養器中３７℃で増殖させた。

ＩｇＭ抗ＲｈＤを産生する細胞確率は初期において９０
％（再クローニングにより測定）であったが、このレベ
ルは数か列後も変化しないことがわかった。Ｉ　Ｘ　１
０’細胞／ｍ＋で培養の２４時間後におけるＩｇＭ抗Ｒ
ｈＤ濃度は２５〜５０μｇ　／　ｍｌであることがわか
った。【培養上澄中に存在する抗ＲｈＤの定量は阻害免
疫状験法により実施した。　　　ｌ標識抗ＲｈＤ及びＲ
２Ｒ２赤血球を培養上澄の存在及び非存在下でインキュ
ベートし、反応混合物を平衡化させた。

赤血球に結合した１２５Ｉ標識抗ＲｈＤの量を次いで調
べ、培養上澄中の抗ＲｈＤ濃度を抗り国際標準（６８／
４１９）使用標準曲線との比較により計算した。〕 ＩｇＭはすべてのＲｈＤ＋赤血球及び少量のＤＵ細胞と
反応したが、Ｒｈ−又はＤＢ細胞とは反応しなかった。

ＲｈＤ＋細胞１％懸濁液に最終濃度５μｇ／ｍｌで加え
た場合に、約３０秒間で完全凝集を起こした。抗体は４
℃の水溶液中８か月間にわたり安定であることがわかっ
た。

脛一旦 （１）血液試料 血液試料は、英国の化ロンドン地域又はケンブリッジ地
域輸血センター（Ｎｏｒｔｌ＋　Ｌｏｎｄｏｎ　Ｒｅｇ
ｉｏｎ−ａｌ　ｏｒ　Ｃａｍｌ）ｒｉｄｇｅ　Ｒｅｇｉ
ｏｎａｌ　Ｂｌｏｏｄ　Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｃｅｎ
ｔｒｅｓ）において、ボランティア抗ＲｈＤ血漿供与者
のパネラ−員から人手した。

３年間にわたり、５５例の“軟膜分画”が高レベルの循
環抗ＲｈＤ抗体を有するＲｈＤ高度免疫供与者の日常的
抗ＲｈＤ血漿献体から処理された。

これらの血漿献体は、最後の追加免疫後の時間に　　　
　′かかわらず選択された。

抗凝固血液試料２０ｍ１も、追加免疫後６〜８週間にわ
たり５例のＲｈＤ高度免疫者から毎週採取した。免疫は
、厳格な安全管理下で選択された洗浄ＲｈＤ＋赤血球の
１０％等張塩水懸濁液５ｍｌの静脈注射により行なった
〔ギブソン、１９７３年、ボックス・サンプ、第２４巻
、第４２５頁（Ｇｉｂ−ｓｏｎ（１９７ｇ）Ｖｏｘ、Ｓ
ａｎｇ、２４，４２５）　）。

供与者５例中、４例は追加免疫後７〜１０日目にＩｇＭ
抗ＲｈＤ力価のピークをむかえたが、ＩｇＧ抗ＲｈＤレ
ベルには有意の変化がなかった。

膜結合抗ＲｈＤを発現する末梢リンパ球に関して試験さ
れた４例の供与者はすべて、追加免疫後７〜１６日目に
顕著なピークを示した。約３週間後における“ロゼツト
（ｒｏｓｅｔｔｅ）′数の第二の上昇は、おそらく分泌
抗体で一緒に支持されている弱く付着した赤血球の凝集
又は集合の発現に基因するものであった。これらは、第
１週に見られた膜Ｉｇの完全な単層ロゼツト特性とは外
観が全く異なっていた。

（１１）末梢血Ｂ細胞の単離 日常的抗ＲｈＤ血漿献体より得られる“軟膜分画”から
、血小板を５０％等張パーコール（Ｐｅｒ−ｃｏｌｌ）
中での遠心分離（４００ｘ　ｇで１０分間）により除去
した。Ｔ細胞を４％デキストラン中羊赤血球とロゼツト
形成させることにより除去した「ブラウンら、１９７５
年、クリニカル・アンド・エクスペリメンタル・イムノ
ロジー、第２０巻、第５０５頁（１）ｏｒｗｎ　ｅＬ　
ａｔ（＋９７５）ＣＩｉｎｉｃａｌ　ａｎｄｌＥｘｐｃ
ｒｉｍｅｎＬａｌ　１＋ｌ１ｍｕｎｏ１ｏｇｙ、２［１
，５（１５）　）。

２０ｍ、ｌ血液試料の細胞をフィコール−ハイパクー界
面で集菌し、無菌塩水で２回洗浄し、２００ｘｇで５分
間遠心分離することにより細胞を集めた。

フィコール−ハイパクー界面で集められた単核細胞から
抗ＲｈＤ表面Ｉｇ発現Ｂ細胞を分離するために、ド記“
ロゼッティング（ｒｏｓｃｔｔ　ｉｎｇ）”技術を利用
した。集めた単核細胞を例１　（ｌｉｉ）で使用された
ような培地中に懸濁しく１０６細胞／　ｍｌで０．２ｍ
１）、十分に洗浄されたパパイン処理ＲｈＤ　　赤血球
と混合しく比率１：１０）、混合物を２００　ｘ　ｇで
５分間遠心分離した。室温で３０分間インキュベートし
た後、」１澄を除去し、ベレットをフルオレセインジア
セテート２．５μｇ／ｍｌ含有培地〔ラマサミー及びム
ンロ、１９７４年、イムノロジー、第２６巻、第５６３
頁（Ｒａｌｌ１ａｓａＩＩｌｙ２Ａ　　　　− ａｎｄ　Ｍｕｎｒｏ（１９７４）１ｍｍｕｎｏ１ｏｇｙ
、２６，５０３）　］に静かに懸濁した。細胞１０５個
中のロゼツト数を明視野顕微鏡で計測した。Ｒｈ−細胞
はコントロールとして使用され、測定可能なカウントを
示さなかった。

（ｉｉｉ）単離Ｂ細胞のＥＢＶ形質転換Ｔ細胞非存在下
における単離Ｂ細胞のウィルス処理は、例１　（ｉｉ）
のようにメラミドらの方法に従い実施した。

ＥＢＶ形質形質転換子細胞除去がなされなかったＢ細胞
は、４×１０６細胞／　ｍｌでウィルスに接触させ、１
：１０’０フイトヘマグルチニン含有培地に２×１０５
細胞／ウエル（０、２ｍｌ　）で移し替えた〔モスら、
１９７９年、インターナショナル・ジャーナル・オブ・
キャンサー、第２３巻、第６１８頁（Ｍｏｓｓ　Ｏｔ　
ａｌ、（１９７９）ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕ
ｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ、２８．［１１８）　〕
。

（ｉｖ）リンパ芽球細胞系の確立 （ａ）　　ランダムな時間に集められた血液試料から得
られるＥＢｖ処理Ｂ細胞の場合には、例１　＜１１１）
と同様の操作が行なわれた。最初のＥＢＶ処理Ｂ細胞群
のうち５個だけが抗ＲｈＤ系を産生じたが、この系は首
尾よい融合が可能となる時点まで増殖させることができ
た。

（ｂ）　　追加免疫後約６〜８週間にわたり毎週５例の
ＲｈＤ高度免疫供与者から採取された血液試料より得ら
れるＥＢＶ処理Ｂ細胞は（例１　（ｉｉｉ）のような培
地「１す、初期密度１×１０′６細胞／ｍｌで９６又は
１９２平底微量滴定ウェルに播種した。

ウェルの抗ＲｈＤ力価測定は形質転換後はぼ１週間間隔
で実施した。一過性の特異的抗体応答は最初の２週間に
わたり多数のウェルで観察された。

この応答用は定量が困難であったが（例１　（ｉｌｌ）
のようにａ＋＋＋定される）、力価は通常１００以下で
あった。約３週間後、この初期応答の大半は低下し、大
半のウェルは細胞数が増加した。最大の力価をもつそれ
らの培養物を２４ウエルプレートに移した。二次応答用
に関しては、同一の供与者から追加免疫後の異なる時期
に集められた試料間で有意差が見られなかった。追加免
疫後約２〜４週間にわたり集められたそれらの試料の場
合には、いくつかのウェルは力価及び細胞数が増加し続
け、２４ウエルプレートに移した時に２５０〜６０００
の力価を有した。この期間外に集められた試料では、力
価の継続的増加がまれにしか観察されなかった。ＥＢＶ
形質形質転換後３退４最大力価をもつ各供与者の各時期
における３つのウェルから細胞を融合用として選択した
。

（Ｖ）融合及びクローニング 選択されたＥＢＶ処理細胞群を例１　（ｉｖ）のような
マウスミエローマ細胞系Ｘ６３−Ａｇ３、６５３の細胞
と融合させた。−貫して抗ＲｈＤ力価の増加を示すウェ
ルを融合後約３〜４週間口にクローニング用として選択
し、選択クローンのクローニング及び増殖を約９０％の
娘細胞が抗ＲｈＤを産生ずるまで繰返した。

抗ＲｈＤ産生ハイブリドーマの首尾よい確立は主に、抗
ＲｈＤ力価が２５０以上であって約２５０ｎｇ／ｍｌの
抗ＲｈＤ濃度を示すリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）培養物
で行なわれた。相当するウェルの総Ｉｇは通常的２５μ
ｇ　／　ｍｌであることから、特異的ハイブリドーマを
産生ずるそれらの１−記培養物においては少なくとも１
％のリンパ芽球細胞が抗ＲｈＤを産生じていた。その結
果、それが追加免疫後約２〜４週間目に集められたＢ細
胞から主に得られ特異的ヘテロハイブリドーマを主に産
生ずる産生的ＬＣＬ培養物である、と結論づけることが
できる。

下記表２は、確立された１１個の抗ＲｈＤ分泌ヘテロハ
イブリドーマ細胞系、抗ＲｈＤモノクローナル抗体のク
ラス及びＬ鏡型、並びにＢ細胞がＲｈＤ高度免疫供与者
から集められた時点の二次免疫後の１」数の各々につい
て示している。

表　　　２ １　（ＰＯＭ−１）　　Ｉ　ｇＭ　　　　Ｌ　　　　　
　　　　１．３２　ＩｇＧＩ　Ｌ　　＋　　１３ ３ＩｇＧ３に　　１３ ４ＩｇＧ１に　＋　２１ ５　ＩｇＧ３に　　２１ ６ＩｇＭ　　Ｌ　　＋　　５７ ７　　　　　ＩｇＭ　　　　　　　に　　　　　　＋　
　　　　　　　１３８ＩｇＭ　　Ｌ　　　１３ ９　ＩｇＭ　　Ｌ　　＋　　２０ １０　ＩｇＭ　　Ｌ　　＋　　２７ １、Ｉ　　　　　　ＩｇＧＩ　　　　　Ｌ　　　　　　
　＋　　　　　　　　２７＊　ＩｇＧ及びＩｇＭ抗体は
天然及びパパイン変性赤血球との反応性に基づき識別し
た。その場合にＩｇＧサブクラスはサブクラス特異的抗
血清〔ダッチ・レッド・クロス（ＤｕｔｃｈＲｅｄ　Ｃ
ｒｏｓｓ）、アムステルダム〕との間接凝集試験法によ
って確認した。

τ　各モノクローナル抗体とのタンパク質Ａ結合性は、
タンパク質Ａアガロース〔シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇ
ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　：］のカ
ラムに徐々にＰＢＳ中の抗体を通過させることによって
測定した。結合抗体はｐＨ４，０で又は必要であればｐ
Ｈ３，，５でクエン酸緩衝液により溶離させた。

すべての上記ヘテロハイブリドーマは、バイブ１月Ｚ−
マ培地中３７℃約Ｉ　Ｘ　１０６細胞／ｍｌで培養した
場合に、２０μｇ／　ｍｌ　／　２４時間以上の速度で
抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産生ずる。

例４ 抗ＲｈＤモノクローナル抗体２５〜５０μｇ／ｍｌ含有
ＭＡＤ−２細胞系培養物の培養上澄を、０、ＩＭ　　Ｎ
ａＣｌ、５０ｓｒ／ｊ）牛アルブミン、２．４出Ｍ　　
ＥＤＴＡナトリウム及びＩｇ／ρアジ化ナトジナトリウ
ム含有７．２の０．０５Ｍリン酸緩衝液で適度に希釈し
た。試薬はｐＨの微小−４０〜 変化を検出し得るようにフェノールレッドで更に補助し
、２〜８℃で貯蔵する前にか過滅菌した。

血液型判定試薬の各バッチを、公認抗ＲｈＤ標準製剤に
対する有効性に関して評価した。

（ｊｌ）試験操作 Ａ、管内技術法：遠心分離 １、　　９ｇ／ρＮａＣ１中の洗浄赤血球３％懸濁液を
調製する。

２、　　１０１０Ｘ７５又は１２Ｘ７５＋ａｍ＋の管内
に血液型判定試薬２容量部を入れる。

３、　細胞懸濁液１容量部を加える。

４、　十分に混合し、１分間放置し、適切な回転速度及
び時間、例えば６０秒間５００ｒｃｆで管を遠心分離す
る。

５、　細胞集合物（ｃｅｌｌ　ｂｕｔｔｏｎ）を静かに
再懸濁し、白色背景上で凝集形成について顕微鏡観察す
る。顕微鏡で陰性を読取る。

Ｂ、技術法二３７℃での沈降分離 １、　　９ｓ−／ｌｌＮａＣ１中の洗浄赤血球の３％懸
濁液を調製する。

２、　　６Ｘ５０ｍｍ管内に血液型判定試薬１容量部を
入れる。

３、　等容は部の細胞懸濁液を加える。

４、　十分に混合し、３７℃で６０分間インキュベー１
・する。

５、　細胞集合物を静かに再懸濁し、白色背景りで凝集
形成について顕微鏡観察する。顕微鏡で陰性を読取る。

Ｃ４管内技術法：２０℃での沈降分離 １、　　９ｇ／ｊ）ＮａＣｌ中の洗浄赤血球の３％懸濁
液を調製する。

２、　　６Ｘ５０ｍｎ＋管内に血液判定試薬］容量部を
入れる。

３、　等容量部の細胞懸濁液を加える。

４、　十分に混合し、室温で（１６〜２５℃に限定）６
０分間インキュベートする。

５、　細胞集合物を静かに再懸濁し、白色背景上で凝集
形成について顕微鏡観察する。顕微鏡で陰性を読取る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、非Ｉｇ分泌性マウスミエローマ細胞とエプスタイン
   ・バール・ウィルス（ＥＢＶ）形質転換ヒトＢリンパ球
   の抗リーサスＤ（ＲｈＤ）Ｉｇ産生群との融合により形
   成される抗ＲｈＤモノクローナル抗体産生ヘテロハイブ
   リドーマであって、３７℃で本明細書記載のようなハイ
   ブリドーマ培地中約１×１０＾６細胞／ｍｌにて培養し
   た場合に、抗ＲｈＤモノクローナル抗体２０μｇ／ｍｌ
   ／２４時間以上を産生することを特徴とするヘテロハイ
   ブリドーマ。 ２、ミエローマ細胞融合相手がマウスミエローマ細胞系
   Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の細胞である、特許請求の範囲
   第１項記載のヘテロハイブリドーマ。 ３、ＩｇＭクラスの抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産生
   する、特許請求の範囲第１又は２項記載のヘテロハイブ
   リドーマ。 ４、ＩｇＧクラスの抗ＲｈＤモノクローナル抗体を産生
   する、特許請求の範囲第１又は２項記載のヘテロハイブ
   リドーマ。 ５、マウスミエローマ細胞との融合のために、本明細書
   記載のようなリンパ芽球細胞培地中３７℃で培養した場
   合に抗ＲｈＤ２００ｎｇ／１０＾６細胞／２４時間以上
   産生可能なＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ球群を使用する
   ことにより形成される、特許請求の範囲第１〜４項のい
   ずれか一項に記載のヘテロハイブリドーマ。 ６、マウスミエローマ細胞との融合のために、本明細書
   記載のようなリンパ芽球細胞培地中３７℃で培養した場
   合に抗ＲｈＤ２５０ｎｇ／１０＾６細胞／２４時間以上
   産生可能なＥＢＶ形質転換ヒトＢリンパ球群を使用する
   ことにより形成される、特許請求の範囲第５項記載のヘ
   テロハイブリドーマ。 ７、Ｂリンパ球融合相手が、二次免疫後約 １３〜５７日目にＲｈＤ高度免疫供与者の血液から単離
   されたヒトＢリンパ球より誘導されるものである、特許
   請求の範囲第１〜６項のいずれか一項に記載のヘテロハ
   イブリドーマ。 ８、Ｂリンパ球融合相手が、二次免疫後約 １３〜２８日目にＲｈＤ高度免疫供与者の血液から単離
   されたヒトＢリンパ球より誘導されるものである、特許
   請求の範囲第７項記載のヘテロハイブリドーマ。 ９、寄託Ｎｏ、８６０４１８０３号として欧州動物細胞
   培養物寄託機関に寄託されたＩｇＭ抗ＲｈＤ産生ヘテロ
   ハイブリドーマ及びそのＩｇＭ抗ＲｈＤ産生変異体。 １０、寄託Ｎｏ、８７０２１３０１号として欧州動物細
   胞培養物寄託機関に寄託されたＩｇＭ抗ＲｈＤ産生ヘテ
   ロハイブリドーマ及びそのＩｇＭ抗ＲｈＤ産生変異体。 １１、特許請求の範囲第１〜１０項のいずれかに記載さ
   れたヘテロハイブリドーマにより産生された抗ＲｈＤモ
   ノクローナル抗体及びそのＲｈＤ抗原結合性断片。 １２、特許請求の範囲第９項記載のヘテロハイブリドー
   マにより産生されるＩｇＭ抗ＲｈＤモノクローナル抗体
   及びそのＲｈＤ抗原結合性断片。 １３、特許請求の範囲第１０項記載のヘテロハイブリド
   ーマにより産生されるＩｇＭ抗ＲｈＤモノクローナル抗
   体及びそのＲｈＤ抗原結合性断片。 １４、ヒト抗ＲｈＤ２０μｇ／ｍｌ以上含有する細胞培
   養物からの未濃縮上澄液。 １５、抗体産生条件下で特許請求の範囲第１〜１０項の
   いずれに記載のヘテロハイブリドーマを培養することか
   らなる抗ＲｈＤモノクローナル抗体の産生方法。 １６、（ａ）抗ＲｈＤＩｇ陽性のヒト供与者からＢリン
   パ球を単離する； （ｂ）このようにして得られた単離Ｂリ ンパ球をＥＢＶで形質転換し、しかる後１以上の増殖及
   び選択工程を実施し、もって本明細書記載のリンパ芽球
   細胞培地中３７℃で培養した場合に抗ＲｈＤ２００ｎｇ
   ／１０＾６細胞／２４時間以上産生可能な細胞融合用の
   ＥＢＶ形質転換Ｂリンパ球群を得る； （ｃ）上記群のＥＢＶ形質転換Ｂリンパ 球を非Ｉｇ分泌性マウスミエローマ細胞系の細胞と融合
   する；及び （ｄ）本明細書記載のハイブリドーマ培 地中約１×１０＾６細胞／ｍｌにて３７℃で培養した場
   合に抗ＲｈＤモノクローナル抗体２０μｇ／ｍｌ／２４
   時間以上を産生する、段階（ｃ）で形成された抗ＲｈＤ
   モノクローナル抗体産生ヘテロハイブリドーマを選択す
   る； 段階からなる、特許請求の範囲第５項記載のヘテロハイ
   ブリドーマの製造方法。 １７、使用されるマウスミエローマ細胞がマウスミエロ
   ーマ細胞系Ｘ６３−Ａｇ８．６５３の細胞である、特許
   請求の範囲第１６項記載の方法。 １８、段階（ａ）において、Ｂリンパ球が二次免疫後約
   １３〜５７日目にヒト抗ＲｈＤ高度免疫供与者の血液か
   ら単離される、特許請求の範囲第１６又は１７項記載の
   方法。 １９、永続的細胞系との融合用のＥＢＶ形質転換ヒトＢ
   リンパ球の抗ＲｈＤＩｇ産生群の製造方法であって、 出発Ｂリンパ球が二次免疫後約１３〜５７日目にヒトＲ
   ｈＤ高度免疫供与者の血液から得られるものであること
   を特徴とする方法。 ２０、特許請求の範囲第１１〜１３項のいずれかに記載
   の抗ＲｈＤモノクローナル抗体が使用される赤血球Ｒｈ
   型判定方法。 ２１、赤血球Ｒｈ型判定に使用される、特許請求の範囲
   第１１〜１３項のいずれか一項に記載の抗ＲｈＤモノク
   ローナル抗体。 ２２、ヒト注射に適する、特許請求の範囲第１１〜１３
   項のいずれか一項に記載の１種以上の抗ＲｈＤモノクロ
   ーナル抗体の無菌溶液。 ２３、ＲｈＤ抗原に対する母体の感作を防止するための
   ＲｈＤ＾＋児出生後におけるＲｈＤ＾−母体受動免疫用
   の、特許請求の範囲第１１〜１３項のいずれか一項に記
   載の抗ＲｈＤモノクローナル抗体。