DD282029B5

DD282029B5 - Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikoerpern gegen menschliche B-Erythrozyten

Info

Publication number: DD282029B5
Application number: DD32574689A
Authority: DD
Inventors: Kornelia Dipl -Biol Rueger; Monika Schulz; Jutta Dipl -Chem Dr Rer Nat Mohr; Herbert Dipl -Ing Dr -Ing Musielski
Original assignee: Sifin Inst Fuer Immunpraeparat
Priority date: 1989-02-14
Filing date: 1989-02-14
Publication date: 1995-03-09
Also published as: DD282029A5

Description

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die Kenntnis der Blutgruppe eines Menschen ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Ausführung von Bluttransfusionen und Transplantationen. Im klassischen ABO-Blutgruppensystem werden die Merkmale 0, A, B und AB unterschieden. Die Merkmale sind unter anderem auf der äußeren Membran von menschlichen Erythrozyten vorhanden und können von menschlichen Serumantikörpern agglutiniert werden. Zur Vermeidung von Unverträglichkeitsreaktionen bei Bluttransfusionen und Transplantationen werden die Blutgruppenmerkmale durch Antiseren ermittelt.

Blutgruppentestseren bestehen aus besonders ausgewählten menschlichen Seren, deren Reaktionsparameter mit Erythrozyten den jeweiligen gesetzlichen Bestimmungen (z. B. Arzneibuch der DDR) gerecht werden müssen. In der Regel werden sie von freiwilligen, mit der jeweiligen Blutgruppensubstanz immunisierten Spendern gewonnen.

Jedes für diese Zwecke gewonnene Serum wird selbst bei gleichen Spendern graduelle Unterschiede in der Avidität und im Titer aufweisen. Die Eignung für einen Testserumpool muß überprüft werden. Eine exakte Reproduzierbarkeit der Herstellung derartiger Testseren ist nicht gegeben.

Im Gegensatz dazu lassen sich mit Hilfe der von KÖHLER und MILSTEIN (Nature 256 [1975] 495) entwickelten Hybridantechnologie spezifische, gegen menschliche Blutgruppenmerkmale gerichtete monoklonale Antikörper produzierende Hybridomzellinien etablieren. In der Literatur sind bereits monoklonale Antikörper dieser Spezifität beschrieben. (Sacks et al., Vox. Sang. 40 [1981] 99, Moore et al., Develop, biol. Standard 57 [1984] 55, Messeter et al., Vox. Sang. 46 [1984] 185).

Diese permanent kultivierbaren Zellinien sezernieren die Antikörper in das Zellkulturmedium, das die Grundlage für einen diagnostischen Einsatz bildet. Die Literaturdaten lassen sich wegen NichtVerfügbarkeit der jeweiligen Ausgangsmaterialien nicht reproduzieren bzw. überprüfen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, agglutinierende monoklonale Antikörper gegen menschliche Erythrozyten mit dem Blutgruppenmerkmal B zur Verfügung zu stellen. Sie sollten durch Zellkultivierung gewonnen werden und in ihren Reaktionsparametern die gesetzlichen Forderungen des Arzneibuches der DDR erfüllen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Das erfindngsgemäße Verfahren zur Herstellung von agglutinierenden monoklonalen Antikörpern ist dadurch gekennzeichnet, daß zunächst in an sich bekannter Weise 6-10 Wochen alte weibliche Balb/c-Mäuse mit gewaschenen humanen B-Erythrozyten in mehreren Applikationsstufen sowohl intraperitoneal als auch intravenös immunisiert werden. Die Lymphozyten werden aus den Milzen der immunisierten Mäuse isoliert, mit P3-X63-Ag 8,653-Myelomzellen fusioniert und die Zellsuspension in Selektionsmedium (Littlefield, Science 145 [1964] 709) kultiviert. Simultan mit dem Mediumwechsel werden die Zellkulturüberstände der Mikrotestplatten auf Anwesenheit agglutinierender Antikörper gegen humane Testerythrozyten überprüft. Aus den Vertiefungen der Mikrotestplatten, die eine positive Reaktion aufweisen, werden Hybridzellklone isoliert und separat in der Zellkultur geführt. Nach bestätigter spezifischer Agglutinationsreaktion, Kryokonservierung und nach Reklonierung werden die Subclone nach spezifischer Wirkung, Titer und Avidität bewertet. Unter den derart etablierten Zellinien befinden sich die 4 Zellinien

SIFIN-Anti-B-4B10 SIFIN-Anti-B-2D7 SIFIN-Anti-B-6F9 SIFIN-Anti-B-2E11,

die spezifische agglutinierende monoklonale Antikörper gegen menschliche Erythrozyten mit dem Blutgruppenmerkmal B in den Zellkulturüberstand sezernieren.

Diese Hybridome wurden in der ZIM-Hinterlegungsstelle für Zellinien unter den Nummern ZIM-0243, ZIM-0244, ZIM-0245, ZIM-0246 hinterlegt.

Diese Zellinien werden erfindungsgemäß zur Produktion der monoklonalen Antikörper in der Zellkultur eingesetzt, wobei eine stabile Produktion über einen längeren Zeitraum ohne Veränderung der Antikörperbildungsraten möglich ist. Die Produktion der monoklonalen Antikörper ist gleichermaßen auch nach Transplantation in der Ascitesform in Mäuse möglich. Die Isotypcharakterisierung ergab, daß die monoklonalen Antikörper alle Zellinien vom IgM-Typ waren.

Die erfindungsgemäß hergestellten monoklonalen Antikörper reagieren spezifisch mit den Erythrozyten der Blutspendemerkmale B, A₁B und A₂B, jedoch nicht mit 0 und A₁ und A₂. Sie erfüllen bzw. übertreffen die im Arzneibuch der DDR gestellten Forderungen an ein Blutgruppentestserum „Anti-B".

Hinsichtlich der Spezifität wurden an 2500 unterschiedlichen Spendererythrozyten keine Unterschiede zu den polyklonalen Testseren befundet. Ein Titervergleich der Antikörper der 4 Hybridomzellinien, gewonnen aus Zellkulturüberständen der mittleren logarithmischen Wachstumsphase, zeigte die Überlegenheit gegenüber einem staatlich geprüften Testserum Anti-B bzw. die Gleichwertigkeit mit zwei kommerziellen monoklonalen Anti-B-Testreagenzien (Tab. 1).

Testreagenzien der 4 Antikörper, unter produktionsnahen Bedingungen hergestellt, sind in der Prüfung der Avidität polyklonalen Testseren überlegen (Tab.2).

Ausführungsbeispiei

1) Milzzellen von Balb/c-Mäusen, die mit mindestens 4 Applikationen von menschlichen B-Erythrozyten immunisiert worden waren, wurden nach den üblichen Techniken mit P3-X63-Ag8,653-Myelomzellen fusioniert. Die Zellsuspension wurde in HAT-Selektivmedium (RPM11640, supplemented mit 20% fetalem Kälberserum, 2mM/l Glutamin, 2g/l Natriumbicarbonat, 1OmMoVI Hepes, 240IE/ml Penicillin, 150цд/тІ Streptomycin^ χ 10~⁷ Mol/l Aminopterin, 1 χ 10"⁴ Hypoxxanthin, 1,6 χ 10~^sMol/l Thymikin) unter Zusatz von 1 x 10⁵ Maus-Peritonealexsudatzellen/ml 7-10 Tage bei 37°C in einer wassergesättigten 5-6%igen СОг-Atmosphäre inkubiert.

2) Die Selektion antikörper-produzierender Klone wurde simultan mit dem Mediumwechsel durchgeführt. Unter sterilen Bedingungen wurde die Hälfte des Zellkulturüberstandes aus den Vertiefungen der Mikrotestplatte entnommen und in getrennten Agglutinations-Mikrotestplatten identischer Abmessungen mit gewaschenen menschlichen Testerythrozyten der Blutgruppen A₁, A₂, A₁B, A₂B, B und 0 in Kontakt gebracht. Aus den Vertiefungen der Zellkulturmikrotestplatte, deren Überstände eine spezifische Agglutination hervorriefen, wurden Hybridzellklone isoliert und separat in Kultur geführt. Nach Bestätigung der Spezifitätsreaktion wurden sowohl Kryokonserven als auch Reklonierungen nach bekannten Methoden angelegt, in deren Ergebnis nach dem Agglutinationstiter selektiert wurde.

3) Die Hybridome

SIFIN-Anti-B-4B10 SIFIN-Anti-B-2D7 SIFIN-Anti-B-6F9 SIFIN-Anti-B-2E11,

deren in den Zellkulturüberstand sezernierte monoklonale Antikörper die im Arzneibuch der DDR an ein Blutgruppentestserum „Anti-B" festgelegten Forderungen für die Höhe des Titers und der Avidität mit B, A₁B und A₂B-Erythrozytensuspensionen erfüllen bzw. übertreffen, können mit den bekannten Zellkulturtechniken vermehrt und die Kulturüberstände einschlägig gewonnen werden. Die Spezifität wurde an mehr als 2 500 Spendererythrozyten der Blutgruppenmerkmale A₁, A₂, A₁B, A₂B, B und 0 überprüft.

4) Eine Produktion der genannten Antikörper durch Vermehrung der Hybridomzellen als Ascites-Tumor in Paraffin-stimulierten Balb/c-Mäusen wies für jeweils 5 eingesetzte Tiere eine 100%ige Ascites-Tumorangehrate aus.

Tabelle 1

Vergleich der Score werte monoklonaler „Anti-B"-Antikörper gegen menschliche B- und ΑτΒ-Testerythrozyten

Antikörper	Testerythrozyten	A₁B*¹'	Prozentualer
	_Bx1)		Scorewert*²'
Staatlich geprüftes
Kontrollserum		114
Anti-B 660587	163		100
SNBTS-Anti-B^x3)		179
Lot 9111-60010	217	162	138
Biocard-Anti-B*⁴¹	162		117
SIFIN Anti-B^x5)		159
4B10	197	202	127
2D7	224	169	149
6F9	188	181	122
2E11	211	136

x1 Jeweils 4 unterschiedliche Spendererythrozyten (2%ig).

x2 Summe der Rangordnung der Titerstufen gegen die Testerythrozyten B und A]B (Kontrollserum = 100%).

x3 Testreagenz des Scottish National Blood Transfusion Service.

x4 Biocard: Produktname der Testreagenzien des Kardiologischen Zentrums, Moskau.

x5 Zellkulturüberstände aus der logarithmischen Wachstumsphase der Hybridomzellinien in Zellkulturflaschen.

Tabelle 2 Avidität des Zellkulturüberstandes der Zellinie SIFIN-	Testerythrozyten B B	-Anti-B-6F9 aus einer Perfusionskultur	B	A₁B	A₂B	A₂B	A₂B
Staatlich geprüftes Testserum	5 4 4 4	B	5 4	5 4	5 4	5 4	5 3
Anti-B 92 06 86 SIFIN-Anti-B 6F9	5 3

Claims

Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern gegen menschliche B-Erythrozyten, dadurch gekennzeichnet, daß man Milzlymphozyten von Balb/c-Mäusen, die mit menschlichen B-Erythrozyten intraperitoneal und intravenös immunisiert wurden, mit Mausmyelomzellen derZellinie P3-X63-Ag8,653 fusioniert, spezifisch agglutinierende antikörperbildende Hybridzellen selektiert, kloniert, kryokonserviert und kultiviert sowie die ausgewählten Hybridome SIFIN-Anti-B-4B10 (ZIM-Nr.0243), SIFIN-Anti-B-2D7 (ZIM-Nr. 0244), SIFIN-Anti-B-6F9 (ZIM-Nr. 0245) und SIFIN-Anti-B-2E11 (ZIM-Nr. 0246) für die Antikörperproduktion vermehrt bzw. in der Ascitesform in syngene Mäuse transplantiert.

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die humane Erythrozyten der Blutgruppe B spezifisch agglutinieren. Das Anwendungsgebiet ist die Typisierung von Erythrozyten der Blutgruppe B in der Blutgruppenserologie von Blutspende- und Transfusionseinrichtungen, klinischen und gerichtsmedizinischen Laboratorien.