LU86855A1 - Heterohydridomes produisant des anticorps monoclonaux anti-rhesus humains - Google Patents

Description

BL-4028 Hétérohybridomes produisant des anticorps monoclonaux anti-Rhésus D humains

La présente invention concerne de nouveaux hétérohybridomes souris-homme qui sécrètent des anticorps monoclonaux humains contre l'antigène Rhésus D des érythrocytes humains (dit ci-après antigène RhD) , par exemple des anticorps monoclonaux humains anti-RhD de la classe des IgM ou IgG se prêtant au typage du sang ou à l'immunisation passive de mères RhD- aux fins de prévenir la maladie hémolytique du nouveau-né (MHNN).

La MHNN se manifeste chez les nouveaux-nés RhD+ issus de mères RhD préalablement sensibilisées à l'antigène RhD du fait que des anticorps qui sont des IgG anti-RhD ont traversé le placenta pendant la grossesse et ont provoqué une destruction des globules rouges foetaux. La sensibilisation des mères RhD- à t l'égard de l'antigène RhD peut avoir eu lieu à la nais sance d'un enfant RhD+ précédent du fait que certains globules rouges foetaux sont entrés dans la circulation maternelle et ont été reconnus par le système immunitaire maternel. Pour réduire la fréquence de la MHNN, il est de pratique courante en Angleterre et dans de nombreux autres pays d'administrer des anticorps anti-RhD aux mères RhD- immédiatement après la naissance d'un enfant RhD afin que les globules rouges RhD foetaux ayant éventuellement pénétré dans la circulation maternelle soient rapidement éliminés (Mollison, P.L. (1983) Blood Transfusion in Clinical Medicine, 7e éd. , Blackwell Scientific, Oxford).

Actuellement, les anticorps anti-RhD sont pour une bonne part recueillis directement chez des donneuses immunisées pendant la grossesse ou après une transfusion de sang inadéquate, ou bien par immunisation délibérée de volontaires. Afin d'obtenir des concentrations anti-RhD plasmatiques adéquates; beaucoup d1 individus don- * 2 neurs nécessitent des injections de rappel d'érythrocytes et cette technique, malgré une surveillance rigoureuse, entraîne les risques communs à toute transfusion de globules rouges, par exemple le risque de transmettre les virus de l'hépatite et le HIV. En outre, l'IgM anti-RhD agglutinante, qui est particulièrement précieuse pour le typage Rh, est fort difficile à obtenir parce qu'elle est rarement produite à des titres élevés chez les individus donneurs immunisés. Par conséquent, les moyens de produire in vitro des anticorps anti-RhD offrent beaucoup d'intérêt.

Il a déjà été montré (Boylston et al. Scand. J. Immunol. 1^2, 355 (1980), outre Melamed et al, Eur.

J. Immunol. 15^, 742 (1985)) que les lymphocytes B humains d'individus donneurs anti-RhD peuvent produire de 1'anti-RhD dans une culture de tissu après infection par le virus d'Epstein-Barr (EBV), mais ces - cellules lymphoblastoïdes cessent toutefois habituel lement de produire de 1'anti-RhD après quelques mois. Afin d'obtenir une lignée cellulaire plus stable sécrétant de l'immunoglobuline humaine, différents chercheurs ont produit des hybridomes fusionnés. Par exemple, en 1973, Schwaber et Cohen ont mentionné la première fusion opérée avec succès entre une lignée de myélome de souris (TEPC-15) et des lymphocytes B du sang périphérique humain (Schwaber & Cohen, Nature 244 , 444 (1973)). L'hétérohybridome résultant sécrète des Ig tant de souris que d'homme alors que la synthèse sélective de l'Ig humaine est nécessaire pour pro-duire avec succès l'anticorps humain recherché.

On a décrit d'autres fusions au moyen de cel-- Iules B provenant de la rate (Nowinski et al? Science 210, 537 (1980)), de nodules lymphoïdes (Schlom et al, Proc. Nat. Acad. Sei. 7_7, 6841 (1980)) ou du sang périphérique (Croce et al., Proc. Nat. Acad, Sei. 76.» 3416 3 (1979), outre Lane et al, J. Exp. Med. 155, 333 (1982)). Pour ces fusions, la lignée NSI ou SP1 de myélome de souris a été utilisée. Une fusion opérée avec succès ί entre des cellules B du sang périphérique humain in fectées par EBV et des cellules de myélome de souris de la lignée cellulaire X63-Ag8.653 ne sécrétant pas d'Ig pour la formation d'hétérohybridomes qui sécrètent un anticorps monoclonal anti-tétanos qui est une IgM a été décrite aussi (Kozbor et al, (1982) Hybridoma 1^, 323-328). Tous les hétérohybridomes ainsi obtenus par Kozbor et collaborateurs se sont révélés produire de l'IgM humaine à chaînes légères kappa. Au cours d'études plus détaillées avec quatre de ces hétérohybridomes , il a été découvert que lorsqu'ils sont repiqués dans des cupules contenant du milieu RPMI-1640 additionné de 10% de sérum foetal de veau (FCS) à raison 4 •7 de 2 x 10 cellules/cupule/2 ml, la production d'anti- ς tcorps anti-tétanos spécifiques après 9-10 jours n'ex cède pas 2jULq/wl. La demande de brevet PCT 85/02413 publiée décrit par ailleurs la fusion de cellules B du sang périphérique humain transformées par EBV avec un myélome qui est lui-même un hétérohybridome formé entre une cellule de myélome humain et une cellule de myélome de souris de la lignée cellulaire X63-Ag8.653 conduisant à des lignées cellulaires stables sécrétant des anticorps monoclonaux anti-RhD de la classe des IgM ou IgG. Il n'est cependant pas indiqué si les hétérohybridomes résultants sont capables de produire des titres adéquats d'anticorps monoclonal anti-RhD, par exemple de plus de 20^/ig/ml/24 heures lorsqu'ils sont mis en culture à environ 1 x 10^ cellules/ml.

La Demanderesse a découvert à présent qu'il est possible d'obtenir des hétérohybridomes souris-homme qui, lorsqu'ils sont mis en culture dans des conditions appropriées, établissent un titre élevé » 4 ( , d'anticorps monoclonal anti-RhD humain en l'absence d1 Ig de souris par fusion d® cellules de myélome de souris ne sécrétant pas d'Ig directement avec des lymphocytes B humains transformés par EBV provenant d'individus donneurs hyperimmunisés par RhD. La Demanderesse a découvert que ces lymphocytes B humains sont compatibles avec les cellules de myélome de souris sans fusion préliminaire avec des cellules de myélome humain comme dans la demande de brevet PCT 85/02413.

Suivant un aspect, la présente invention a pour objet un hétérohybridome produisant un anticorps monoclonal anti-RhD, formé par fusion de cellules de myélome de souris ne sécrétant pas d'Ig·, de préférence de cellules de myélome de souris X63-Ag8.553, avec une population de lymphocytes B humains transformés par EBV produisant de l'Ig anti-RhD, lequel hétérohybridome lorsqu'il est mis en culture à 37°C dans un milieu de culture d'hybridome tel que défini ci-après à 1 x 10^ cellules/ml produit plus de 20ydq d'anticorps monoclonal anti-RhD/ ml/24 heures. L'anticorps monoclonal anti-RhD est généralement de la classe des IgM ou IgG.

Le terme "milieu de culture d'hybridome" tel qu'il est utilisé ici est à entendre comme désignant un milieu comprenant du milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de (FOS) ou bien un milieu qui entretient une croissance égale dans les mêmes conditions.

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Il est connu qu'à raison de 1 contre 10 ou 104 seulement, les lymphocytes B du sang périphérique des individus donneurs hyperimmunisés par 1'antigène RhD font la sécrétion anti-RhD (Elson et Bradley, Lancet ,1, 789 (1970)). La transformation par EBV de lymphocytes B isolés chez des individus donneurs RhD- immunisés naturellement et/ou délibérément par l'antigène RhD facilite la sélection d'après une croissance vigoureuse et des titres anti-RhD élevés in vitro avant l'exécution 5 de la fusion avec les cellules de myélome choisies.

De plus, les lymphocytes B transformés par EBV se sont révélés avoir une fréquence de fusion avec les cellules - de souris X63-Ag8.653 plus élevée que celle de lym phocytes B non transformés par EBV, dans des conditions identiques. En effet, il a été constaté que lorsque des nombres égaux de lymphocytes B du sang périphérique humain non transformés par EBV et de cellules X63-Ag8.653 de souris sont mis dans les conditions de fusion traditionnelles, la fréquence de fusion moy- —6 enne est d'environ 8,4 x 10 . Le remplacement des lymphocytes B non transformés par EBV par des lymphocytes B transformés par EBV conduit à une augmentation de la fréquence de fusion moyenne jusqu'à environ 1,0 x 10-4.

Pour la préparation d'hétérohybridomes conformes à la présente invention, il est souhaitable que la population de lymphocytes B transformés par EBV choisie pour la fusion avec les cellules de myé-lome de souris produise plus de 200 ng d'anti-RhD/10 cel-lules/24 heures et plus avantageusement plus de 250 ng d'anti-RhD/10° cellules/24 heures lors de la mise en culture à 37°C dans un milieu de culture de cellules lymphoblastoïdes tel que défini ci-après.

Le terme "milieu de culture de cellules lymphoblastoïdes" tel qu'il est utilisé ici est à entendre comme désignant du milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de FCS, de benzylpénicilline K (lOO^-g/ml), de sulfate de streptomycine (100y«.g/ml ) , d ' amphotéricine-B ( 2,5^w-g/ml ) , de 2-mercapto-éthanol (50/^M) et de L-glu-tamine (2 mM) ou bien un milieu équivalent capable d'entretenir une croissance égale des lymphocytes B transformés par EBV dans les mêmes conditions.

Pour obtenir une population préférée de lymphocytes B transformés par EBV en vue de la fusion Λ 1 6 telle qu'elle est définie ci-dessus, il s'est révélé préférable que la population de départ de lymphocytes B soit prélevée sur le sang d'un individu donneur hyper-immunisé par RhD environ 13 à 57 jours et plus avantageusement environ 13 à 28 jours après l'immunisation secondaire. Un procédé pour préparer des lymphocytes B humains transformés par EBV anti-RhD positif en vue de la fusion avec une lignée cellulaire immortalisée, suivant lequel les lymphocytes B de départ sont prélevés sur le sang d'un individu donneur hyperimmunisé par RhD entre certaines limites de temps telles qu'indiquées ci-dessus constitue un autre aspect de la présente invention.

La récolte des lymphocytes B du sang d'un individu donneur humain choisi , par exemple en isolant d'abord la "couche leucocytaire" (globules blancs), r en séparant leß cellules mononucléaires et en éliminant les cellules T et les plaquettes contaminantes est avantageusement suivie de la transformation des cellules B isolées au moyen d'EBV et ensuite d'une ou plusieurs étapes de croissance et sélection, la sélection des colonies étant opérée sur base d'une croissance vigoureuse et d'un titre anti-RhD élevé. Si la chose est souhaitée, des colonies de lymphocytes B isolés contenant des cellules exprimant l'Ig anti-RhD de surface peuvent être sélectionnées avant la transformation au moyen d'EBV en formant des rosettes de lymphocytes B producteurs d'anti-RhD avec des globules rouges RhD+ traités à la papaïne. En variante, les colonies initiales de lymphocytes B traités par EBV peuvent être soumises suivant la même technique à une recherche de la présence de cellules B exprimant l'Ig anti-RhD de surface. La détermination quantitative du titre anti-RhD dans le cas des colonies positives pour ce type d'immunoglobuline peut être effectuée de façon f 7 classique. La transformation par EBV des cellules B isolées peut être effectuée avantageusement par mise en contact des cellules avec le liquide surnageant provenant de cultures de la lignée cellulaire de ouistiti B95.8 après croissance supplémentaire comme décrit, par exemple, par Melamed et al. dans Eur.J. Immunol (1985) 15, 742-746.

Deux lignées cellulaires qui sont des hybridomes conformes à la présente invention, qui ont été obtenues par fusion de cellules de la lignée cellulaire de myélome de souris X63-Ag8.653 avec deux populations différentes de lymphocytes B humains transformés par EBV ayant un titre anti-RhD élevé provenant du sang périphérique d'individus donneurs hyperimmunisés par RhD 7 semaines et 13 jours après l'immunisation secondaire respectivement, ont été déposées à 1'European 1 Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton

Down, Rauyaume-Uni. Ces hétérohybridomes, désignés „ respectivement par MAD-2 et FOM-1, sont tous deux ca pables de produire un anticorps monoclonal anti-RhD de la classe des IgM avec des chaînes légères lambda. Le MAD-2 a été déposé à l'ECACC, Royaume-Uni, sous le n° d'accès 86041803 le 18 avril 1986. Le FOM-1 a été déposé à 1'ECACC le 13 février 1987 sous le numéro d'accès 87021301.

Des études plus détaillées sur 1'anticorps anti-RhD qui est une IgM que produit la lignée cellulaire MAD-2 ont révélé que c'est un anticorps convenant éminemment pour le typage Rh dans la pratique de la transfusion du sang. Au cours d'un essai des titres comparant des cultures de MAD-2 (environ 1 x 106 cellules/ml de milieu de culture d'hybridome à 37°C pendant 24 heures) avec la préparation étalon d'IgM anti-D du U.S. Office of Biologies, Research and Review, les liquides surnageants de cultures se sont *' 8 révélés à peu près 32 fois plus puissants que l'étalon et peuvent donc être dilués pour l'usage de routine. Comme il ressort du tableau 1 ci-après, l'IgM de MAD-2 s'est révélée agglutiner tous les globules rouges RhD positif testés et la plupart des globules Du, mais ne réagit pas avec les rares globules D (fréquence de 1 contre 1000). Ceci est sans importance pour les receveurs d'une transfusion de sang qui seraient ainsi classés comme Rh-négatif et recevraient donc du sang Rh-négatif. Les donneurs classés comme Rh négatif au moyen de cet IgM anti-RhD devraient subir un examen, par exemple à l'aide d'une IgG polyclonale anti-RhD,pour déterminer la présence des antigènes Du et DB.

TABLEAU 1 Résultats d ' épreuves d ' agglutination avec l'IgM de MAD-2 sur des globules rouges de différents génotypes Génotype cellulaire Nombre d'individus Agglutination - donneurs OR^r + 0R2r + OR0r +

Or ' r

Or "r A-^rr

Orr DU 5 4/5* 5/5x DB 3 0/3 couvert d'IgG^ couvert de C3-C4^ + Il y a agglutination

Il n'y a pas d'agglutination

* I

9 * 4 positifs sur 5 après 1 minute d'incubation x après 30 minutes d'incubation Φ globules Rh-négatif fortement recouverts d'IgG anti-c ou globules Rh-négatif recouverts des composants C3 et C4 du complément. Ces globules sont joints comme témoins pour montrer que 1'IgM anti-RhD ne provoque pas d'agglutination spécifique des globules rouges recouverts par IgG "non-anti-RhD".

La nouvelle lignée cellulaire MAD-2 croît bien dans les cultures à grande échelle et donne de bons rendements en anticorps. Une production à l'échelle d'environ 2 à 3 litres par semaine donne suffisamment d'IgM anti-RhD pour typer le sang d'une population de 50 millions de gens avec les pratiques de transfusion existantes et une production d'environ 20 litres/semaine donne suffisamment d'anti-RhD pour l'immunisation pas-; sive. Les liquides surnageants de culture peuvent être recueillis après 24 heures de culture à environ 1 x 10^ cellules/ml avec des teneurs en IgM de plus de 20^/^g/ml et généralement de plus de 25ytog/ml.

La lignée FOM-1 et d'autres lignées cellulaires produites suivant les techniques semblables conformes à la présente invention ont aussi de bonnes caractéristiques de croissance et de production de l'anticorps. L'IgM sécrétée par la lignée cellulaire FOM-1, comme 1'IgM de MAD-2, s'est révélée être fort spécifique du composant D du système Rhésus et être très efficace pour induire une réaction d'agglutination diagnostique avec les cellules RhD-positif.

Il convient d'observer que la présente inven-- tion a pour objet non seulement MAD-2 et FOM-1, mais aussi leurs mutants producteurs d'IgM anti-RhD.

Suivant un autre aspect, la présente invention a pour objet un liquide surnageant non concentré d'une * » 10 culture de cellules contenant plus de 20^/cg d'IgM anti-RhD humaine par ml. Un tel liquide surnageant peut être utilisé avec avantage directement pour le typage Rh après dilution appropriée.

Suivant encore d'autres aspects,la présente invention a pour objet un procédé de typage Rh des globules rouges au moyen d'une immunoglobuline anti-RhD monoclonale produite par un hétérohybridome conforme à la présente invention, de préférence une IgM monoclonale anti-RhD conforme à la présente invention comme l'IgM de MAD-2 ou FOM-1, et l'utilisation d'un tel anticorps pour l'immunisation passive d'une mère RhD- après la naissance d'un enfant RhD+ pour empêcher la sensibilisation de la mère à l'antigène RhD. Une solution stérile d'un anticorps conforme à la présente invention se prêtant à l'injection à l'être humain peut être formulée dans tout milieu aqueux physiologiquement acceptable, par exemple du sérum ou de la solution physiologique salée isotonique tamponnée au phosphate.

Si la chose est souhaitée, l'anticorps peut être présenté sous forme de formulation lyophilisée prête à la dilution avant l'usage.

Les exemples suivants illustrent davantage I ' invention.

EXEMPLE 1

Etablissement de la lignée cellulaire MAD-2 qui est

II hétérohybridome sécrétant 1'IgM anti-RhD

(i) Isolement de cellules B du sang périphérique

On a recueilli la 'touche leucocytaire"(globules blancs) du sang d'un individu donneur Rh-négatif qui avait été initialement immunisé par six injections = de cellules Rh-positif (R2R2) au Centre de Transfusion

Sanguine de Cambridge, à Cambridge, Royaume-Uni, 10 ans auparavant. L'injection de rappel la plus récente était antérieure de 7 semaines à la saignée.

» 11

On a isolé les cellules mononucléaires sur Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suède) et on a séparé les plaquettes contaminantes par une seconde centrifugation avec une solution de Percoll isotonique à 50% (10 minutes à 400 g).On a séparé ensuite les cellules T au moyen de globules rouges de mouton traités au bromure de 2-aminoéthylisothiouronium (Madsen et al. (1980) J. Immunol. Methods 33_, 323).

(ii) Transformation par EBV des cellules B isolées

On a fait croître la lignée cellulaire de ouistiti B95.8 (Miller et Lipman (1973) Proc.Natl. Acad. Sei. USA ^0./190) dans un milieu normal pour culture de tissu, on l'a laissée devenir confluente, puis on l'a fait incuber pendant encore une semaine avant de l'utiliser. On a recueilli le liquide surnageant usé, on l'a filtré à travers une membrane à pores de 0,8^itm et on l'a utilisé pour infecter des cellules B à 10^ cellules/ml pendant 1,5 à 2 heures à 37°C (Melamed et al. (1985) Eur. J. Immunol 15^, 742-746).

(iii) Etablissement de la lignée de cellules lympho-blastoïdes

On a fait croître les cellules B transformées par EBV dans 192 cupules à fond plat (de 200/*1) à une densité initiale de 5 x lO'Vml (milieu de culture: milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de FCS, de benzylpénicilline K (100/A-g/ml ) , de sulfate de streptomycine (100/i-g/ml) , d ' amphotéricine-B ( 2,5yicg/ml ) , de 2-mercaptoéthanol (50/cm) et de L-glutamine (2 mM)).

On a procédé à la détection et au dosage de 1'IgM et de l'IgG anti-RhD obtenues à partir des cupules de culture de tissu en faisant l'agglutination dans des plaques de microtitrage au moyen de globules rouges natifs et traités à la papaïne, respectivement, à une concentration finale de 0,5% de cellules (Melamed et 12 al (1985) Eur. J. Immunol. 15_, 742-746). La sensibilité de ce dosage pour les deux classes d'anticorps est d'environ 1 ng/ml.

On a établi la croissance dans toutes les cupules et on a constaté la présence d'anti-RhD dans 71% des cupules 2 semaines plus tard. On a sélectionné deux des cupules en raison de leur croissance vigoureuse et des titres élevés en anti-RhD (plus de 2000) et on en a poursuivi la culture jusqu'à arriver à des flacons de 3 80 cm . L'une des cupules produisait de l'IgG anti-RhD et l'autre produisait de l'IgM anti-RhD. Deux mois plus tard, la production d'IgG anti-RhD s'est révélée avoir diminué (titre de 81) tandis que la production d'IgM anti-RhD était restée stable (titre d'environ 5000). Les liquides surnageants des deux cultures contenaient des chaînes lourdes «* , y etju, et des chaînes légères kappa et lambda.

r (iv) Fusion - Au cours d'une expérience initiale conçue pour déterminer l'aptitude de X63-Ag8.653 comme partenaire de fusion, l'efficacité de fusion s'est révélée être d'environ 1 contre 1 x 10^.

On a cultivé le myélome de souris X63-Ag8.653 dans du milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de FCS et de glutamine 2 mM,dans une atmosphère de 5% de CO2 dans de l'air, à 37°C. Dans ces conditions, la lignée cellulaire a un temps de doublement de 18 à 20 heures et peut être maintenue en phase de croissance logarithmique par remise quotidienne en sous-culture.

; Avant la fusion, la viabilité des cellules (déterminée par exclusion du colorant nigrosine) excédait 95%. Périodiquement, on a ajouté de la 8-azaguanine au milieu de culture à raison de 20/Ag/ml pour éliminer les variants qui pourraient survivre dans le milieu hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT).

J » 13

On a introduit conjointement des cellules de la culture de cellules lymphoblastoïdes produisant 7 de 11 IgM anti-RhD sélectionnée (1 x 10 ) et des cel- η

Iules de myélome (1 x 10 ) dans un récipient de 25 ml en matière plastique, on les a diluées avec de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (NaCl 150 mM; PO^ 10 mM) et on les a centrifugées en un culot commun pendant 10 minutes à 200 g. Après délayage du culot, on a ajouté 1 ml de polyéthylèneglycol 4000 à 45% (Merck, Darmstadt, RFA) et du diméthylsulfoxyde à 5% dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate goutte a goutte en 1 minute et sous agitation constante. On a poursuivi 11 agitation au bain-marie à 37°C pendant 90 secondes au terme desquelles on a dilué les cellules lentement avec de la solution physiologique salée à la température ambiante. On a centrifugé les cellules pendant 5 minutes à 200 g, puis on les a remises en suspension prudemment dans du milieu RPMI-1640 complet, après quoi on les a réparties· dans des plaques à 96 cupules préalablement ensemencées de cellules péritonéales de souris (2 x 104 par cupule), de façon que chaque cupule reçoive 1 x 10 cellules de myélome dans 100^1 de milieu. Après 24 heures d1 agitation , on a ajouté 100^/cl d'un milieu contenant du HAT à la concentration double et de l'ouabaïne 2ytcM. Le HAT empêche la croissance poursuivie des cellules de myélome de souris qui nOnt pas participé à la fusion et l'ouabaïne tue les cellules lymphoblastoïdes qui n'ont pas participé à la fusion.

On a examiné les cupules après 7 jours, moment auquel on a commencé l'alimentation en remplaçant la moitié du milieu par du milieu frais contenant du HAT ^ et de l'ouabaïne l^tM.On a répété l'alimentation tous les 2 ou 3 jours. Quand les cellules ont couvert la moitié du fond des cupules, on a recherché la production d'immunoglobuline dans les cupules positives pour la » 14 croissance. On a cloné les hybrides intéressants directement à partir des plaques à 96 cupules. On a poursuivi la sélection HAT/ouabaïne pendant 3 semaines après la fusion et on a fait passer les cellules dans du milieu contenant HT avant de les cultiver dans du milieu ordinaire pour culture de tissu.

(v) Clonage des hybrides

Toutes les cupules provenant de la fusion ont donné lieu à une vigoureuse croissance.On n'a observé de croissance dans aucune des cupules de deux fusions factices où le stade polyéthylèneglycol avait été omis. Quatre semaines après la fusion, 30 des 96 cupules produisaient des titres anti-RhD supérieurs à 100. On a sélectionné une cupule vu la croissance et le titre anti-RhD favorables. On a transféré les hybrides isolément de la culture en phase de croissance logarithmique à l'aide d'un micromanipulateur et d'un micros-* cope dans des cupules individuelles d'une plaque à 96 cupules ensemencées au préalable de cellules péritonéales de souris d'apport. Pour assurer que seules des cellules uniques soient transférées, on n'a pris les cellules que lorsqu'elles ont été seules dans lechamp d'une loupe puissante et on les a refoulées dans un récipient intermédiaire en vue d'un examen avant de les amener à la cupule finale. Après 4 semaines, on a recloné les cellules clonées. Après le premier clonage, 10 des 13 sous-clones étaient positifs pour le titre anti-RhD.

Après le second clonage, 33 des 40 sous-clones étaient positifs pour la production d'anti-RhD.

On a recherché dans les liquides surnageants la production de l'immunoglobuline humaine par immuno-dosage au moyen d'une enzyme. On a revêtu des plaques EIA (Dynatech, Bilingshurst, Sussex) d'anticorps de chèvre anti-immunoglobuline polyvalente humaine (Sigma, Poole, Dorset). On a mis les liquides surnageants 15 des cultures à incuber dans les plaques ainsi revêtues. On a lavé les plaques avec de la solution physiologique ' salée tamponnée au phosphate contenant 0,1% de Tween 20, puis on les a fait incuber avec des anticorps spécifiques anti-humains à chaînes lourdes ou chaînes légères conjugués à de la phosphatase alcaline (Sigma). Après un lavage final, on a mis les plaques à incuber avec du phosphate de p-nitrophényle et on a observé les modifications de coloration à l'aide d'un lecteur "Titertek Multiskan" EIA.

Après le second clonage, 1'hétérohybridome cloné manifestant la plus haute production d'IgM humaine anti-RhD a reçu la désignation MAD-2.

EXEMPLE 2

Culture sur une grande échelle de la lignée cellulaire MAD-2

On a cultivé des cellules de la lignée cel-- lulaire MAD-2 (ECACC n° 86041803) dans un fermenteur tournant de 20 litres dans du milieu RPMI-1640 à 37°C.

Le pourcentage de cellules produisant de 1'IgM anti-RhD était initialement de 90% (tel que déterminé par reclonage) et cette valeur s'est révélée inchangée après plusieurs mois. Les concentrations en IgM

g anti-RhD après 24 heures de culture à 1x 10 cellules/ml se sont révélées être de 25 à SO^g/ml. [Le dosage quantitatif de 1'anti-RhD en présence dans les liquides surnageants des cultures a été exécuté par immunodosage d'inhibition. On a mis à incuber des globules rouges R2R2 et de 11 anti-RhD marqué a-l'^^l en présence et en 1'absence du liquide surnageant de culture et on a amené le mélange de réaction à l'équilibre. On a dé-terminé ensuite la quantité d'anti-RhD marqué àl' I fixée sur les globules rouges et on a calculé la concentration en anti-RhD dans le liquide surnageant de la culture par comparaison avec une courbe d'étalon- 16 nage à l'aide de l'étalon international anti-D (68/419)]. L'IgM a réagi avec tous les globules rouges ~ RhD positif et avec certains globules rouges DU, mais pas avec les globules rouges Rh-négatif ou D . Ajoutée à une concentration finale de 5^/cg/ml à une suspension à 1% de globules rouges RhD positif, elle a provoqué l'agglutination complète en environ 30 secondes. L'anticorps s'est révélé stable à 4°C pendant une durée de 8 mois en solution aqueuse.

EXEMPLE 3

Etablissement d'hybridomes sécrétant de l'anti-RhD au moyen de cellules B prélevées chez des individus donneurs hyperimmunisés par RhD à différents moments après l'immunisation secondaire (i) Echantillons de sang

Les échantillons de sang ont été fournis par les centres de transfusion de sang régionaux du nord de Londres et de Cambridge au Royaume-Uni par prélèvement chez des membres de leurs groupes d'individus donneurs volontaires de plasma anti-RhD.

En une durée de 3 ans, 55 "couches leucocytaires" ont été traitées à partir de dons de routine de plasma anti-RhD faits par des individus donneurs hyperimmunisés par RhD ayant des titres élevés en anticorps anti-RhD circulants. Ces dons de plasma ont été sélectionnés sans référence à la durée écoulée après la dernière immunisation de rappel.

On a prélevé aussi hebdomadairement des échantillons de 20 ml de sang additionné d'anticoagulant chez 5 individus hyperimmunisés par RhD pendant 6 à 8 semaines après l'immunisation de rappel. L'immunisation était effectuée par injection intraveineuse de 5 ml d'une suspension à 10%, dans de la solution physiologique salée isotonique, de globules rouges RhD+ lavés sélectionnés avec des mesures de sécurité * 17 sévères (Gibson (1973) Vox. Sang. 24, 425).

* Sur les 5 individus donneurs, 4 ont donné lieu à un pic du titre d'IgM anti-RhD 7 à 10 jours après l’immunisation de rappel, mais il n 'y a pas eu de modifications sensibles des taux d'IgG anti-RhD. Quatre individus donneurs chez lesquels les lymphocytes périphériques exprimant 1'anti-RhD lié à la membrane ont été recherchés ont manifesté tous un pic marqué entre 7 et 16 jours après le rappel. Une seconde montée du nombre des "rosettes" après environ 3 semaines a été due à l'apparition d'agrégats ou amas de globules rouges faiblement agglutinés probablement maintenus ensemble par de l'anticorps sécrété. Ils présentaient un aspect nettement différent des rosettes strictement en monocouches qui sont caractéristiques de l'IgG de membrane observable à la première semaine.

(ii) Isolement de cellules B du sang périphérique h partir des "couches leucocytaires" provenant de dons de plasma anti-RhD de routine, on a éliminé les plaquettes du sang par centrifugation dans du Percoll isotonique à 50% (10 minutes à 400 g). On a séparé les cellules T par formation de rosettes avec des globules rouges de mouton dans du dextrane à 4% (Brown et al (1975) Clin. Exp. Immunol. 20_, 505).

Des cellules provenant des échantillons de 20 ml de sang ont été collectées sur une interface de Ficoll-Hypaque et lavées deux fois avec de la solution physiologique salée stérile en recueillant les cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 minutes.

Pour séparer les cellules B exprimant l'Ig

«P

de surface anti-RhD des cellules mononucléaires re- » cueillies à une interface Ficoll-Hypaque, on a appliqué la technique suivante de formation de "rosettes". On a mis les cellules mononucléaires recueillies en suspension dans un milieu tel que celui utilisé dans g l'exemple l(iii) (0,2 ml à 10 cellules/ml) , on les * t 18 a mélangées avec des globules rouges RhD-positif traités à la papaïne et bien lavés (rapport 1:10) et on a cen-' trifugé les mélanges à 200 g pendant 5 minutes. Après 30 minutes d'incubation à la température ambiante, on a séparé le liquide surnageant et on a redispersé le culot doucement dans du milieu contenant 2,5^g/ml de diacétate de fluorescéine (Ramasamy et Munro (1974) Immunol. 26_, 563). On a déterminé le nombre des rosettes dans 10^ cellules au moyen d'un microscope à champ clair intense. On a utilisé des cellules Rhésus négatif comme témoins qui n'ont jamais donné lieu à des nombres appréciables.

(iii) Transformation par EBV des cellules B isolées

On a exécuté suivant le procédé de Melamed et al., comme dans l'exemple l(ii), le traitement par le virus sur les cellules B isolées en l'absence de cellules T.

On a exposé des cellules B qui n'étaient pas Λ débarrassées des cellules T avant la transformation 6 par EBV au virus à 4 x 10 cellules/ml et on les a „ 5 introduites a 2 x 10 cellules/cupule (0,2 ml) dans du milieu de culture contenant de la phytohémagglutinine 1:100 (Moss et al. (1979) Int. J.Cancer, 23_, 618).

(iv) Etablissement des lignées de cellules lympho-blastoïdes (a) Dans le cas des cellules B traitées par EBV provenant d'échantillons de sang recueillis à des moments pris au hasard, on a appliqué le même mode opératoire que dans l'exemple 1(iii). Seules 5 des populations '* initiales de cellules B traitées par EBV ont donné des lignées anti-RhD qui pouvaient être multipliées jusqu'au point où des fusions auraient pu être possibles avec succès.

(b) On a réparti les cellules B traitées par EBV provenant des échantillons de sang prélevés hebdomadairement

* I

19 pendant environ 6 à 8 semaines après l'immunisation de rappel chez 5 individus donneurs hyperimmunisés par RhD, dans 96 ou 192 cupules à fond plat de micro-„ plaque à une densité initiale de 1 x 10 cellules/ml (milieu tel que dans l'exemple l(iii)). On a observé les titres d'anti-RhD dans les cupules à intervalles d'à peu près une semaine après la transformation. On a observé une réponse d'anticorps spécifique transitoire dans un grand nombre des cupules après les 2 premières semaines. Cette phase de la réponse a été difficile à évaluer quantitativement, mais les titres (déterminés comme dans l'exemple l(iii)) sont restés généralement inférieurs à 100. Après environ 3 semaines, la majeure partie de cette réponse initiale avait baissé et la plupart des cupules avaient gagné en nombre de cellules. On a transféré les cultures ayant les titres les plus élevés dans des plaques à 24 cupules.C'est à la phase suivante de la réponse que des différences significatives ont été observées dans les échantillons provenant du même donneur, mais collectés à des moments différents après le rappel. Dans le cas des échantillons collectés dans la période d'environ 2 à 4 semaines après le rappel, certaines des cupules ont continué de monter en titre et en nombre de cellules et avaient des titres de 250-6000 après transfert dans des plaques à 24 cupules. Dans les échantillons collectés en dehors de cette fenêtre chronologique, une croissance continue du titre n'a été que rarement observée. A 3 ou 4 semaines après * la transformation par EBV, on a sélectionné pour la * fusion les cellules provenant des 3 cupules pour chaque 7 point dans le temps de chaque individu donneur ayant le titre le plus élevé.

(v) Fusion et clonage

On a fait fusionner les populations sélection-

' I

20 nées de cellules traitées par EBV avec des cellules de la lignée cellulaire du myélome de souris X63-Ag8.653 comme dans l'exemple l(iv). On a choisi les cupules * présentant de façon reproductible des titres croissants en anti-RhD en vue du clonage environ 3 à 4 semaines après la fusion et on a répété le clonage et la multiplication des clones sélectionnés jusqu'à ce qu'environ 90% des cellules filles produisent de 1'anti-RhD.

L'établissement avec succès d'hybridomes produisant de 1'anti-RhD a eu lieu principalement avec les cultures de lignées cellulaires lymphoblas-toïdes (LCL) dans lesquelles le titre en anti-RhD était supérieur à 250, ce qui représente une concentration en anti-RhD d'environ 250 ng/ml. L'Ig totale dans une cupule correspondante est habituellement d'environ 25ytg/ml et donc au moins 1% des cellules lymphoblastoïdes produisaient de l'anti-RhD dans les cultures précitées qui ont donné les hybridomes spécifiques. On peut conclure des résultats que les cultures de LCL productives qui dérivaient principalement des cellules B collectées environ 2 à 4 semaines après le rappel sont celles qui ont donné principalement les hétérohybridomes spécifiques.

Le tableau II indique, pour chacune des 11 lignées cellulaires établies hétérohybrides qui sécrétant de 1'anti-RhD,1a classe et le type de chaîne légère de l'anticorps monoclonal anti-RhD,de même que le nombre de jours après l'immunisation secondaire auquel les cellules B ont été recueillies chez l'in-« dividu donneur hyperimmunisé par RhD.

* l 21

TABLEAU II

Hétéro- Classe Type de chaîne Fixation Jours hybridome d1anti- legere de de la après ", corps1 l'anticorps protéine rappel A2 1 (FOM-1) IgM L 13 2 IgGl L +13 3 IgG3 K - 13 4 IgGl K +21 5 IgG3 K 21 6 IgM L +57 7 IgM K +13 8 IgM L 13 9 IgM L + ' 20 10 IgM L +27 11 IgGl L +27

Les anticorps IgG et IgM ont été distingués sur base , de leur réactivité avec des globules rouges natifs et modifiés par la papaïne. Les sous-classes d'IgG ont été identifiées par agglutination indirecte avec des antisérums spécifiques de la sous-classe (Croix-Rouge des Pays-Bas, Amsterdam).

2

On a déterminé la fixation de la protéine A par chaque anticorps monoclonal en faisant passer celui-ci dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate lentement dans une colonne de protéine A sur agarose (Sigma Chemical Company). On a élué l'anticorps fixé alors avec du tampon au citrate à pH 4,0 ou, si nécessaire, à pH 3,5.

^ Tous les hétérohybridomes mentionnés ci-dessus produisent l'anticorps monoclonal anti-RhD à raison de plus de 20^/tg/ml/24 heures lorsqu'ils sont mis en culture à 37eC dans du milieu pour culture d'hybridome 1 l 22 à environ 1 x 10 cellules/ml.

EXEMPLE 4

Utilisation de l'IgM de MAD-2 pour le typage Rh des } globules rouges (i) Préparation du réactif pour le groupage du sang

On a dilué suivant la nécessité dans du tampon au phosphate 0,05M à pH 7,2 contenant du NaCl 0,1M, 50 g/litre d'albumine bovine, de 11 EDTA sodique 2,4 mM et 1 g/litre d'azoture de sodium un liquide surnageant provenant d'une culture de la lignée cellulaire MAD-2 contenant 25-50^/Ag/ml d'anticorps monoclonal anti-RhD.

On a complété le réactif avec du rouge de phénol pour déceler les modifications minimes éventuelles du pH et on l'a stérilisé par filtration avant de le conserver à 2-8°C. On a vérifié le titre de chaque réactif de groupage du sang par comparaison avec une préparation étalon anti-RhD reconnue.

λ / (ii) Modes opératoires pour le test ; A. Technique en tube: centrifugation 1. Préparer une suspension à 3% de globules rouges lavés dans du NaCl à 9 g/litre.

2. Introduire deux volumes de réactif de groupage du sang dans un tube de 10 x 75 mm ou 12 x 75 mm.

3. Ajouter un volume de suspension de globules rouges.

4. Mélanger soigneusement, laisser reposer pendant 1 minute et centrifuger le tube à force centrifuge relative et temps convenables, par exemple 500 fer pendant 60 secondes.

- 5. Redisperser prudemment le culot de globules et observer macroscopiquement l'agglutination r * sur un fond blanc. Lire les négatifs au microscope.

B. Technique: sédimentation à 37°C

1. Préparer une suspension à 3% de globules rouges 23 lavés dans du NaCl à 9 g/litre.

2. Introduire un volume de réactif de groupage du sang dans un tube de 6 x 50 mm.

Γ 3. Ajouter un volume égal de suspension de glo bules rouges.

4. Mélanger soigneusement et mettre à incuber à 37°C pendant 60 minutes.

5. Redisperser prudemment le culot de globules et observer macroscopiquement l'agglutination sur un fond blanc. Lire les négatifs au microscope.

C. Technique en tube: sédimentation à 20°C

1. Préparer une suspension à 3% de globules rouges lavés dans du NaCl à 9 g/litre.

2. Introduire un volume de réactif de groupage du sang dans un tube de 6 x 50 mm.

3. Ajouter un volume égal de suspension de glo- w bules rouges.

4. Mélanger soigneusement et mettre à incuber à la température ambiante (limites 16 et 25°C) pendant 60 minutes.

5. Redisperser prudemment le culot de globules et observer macroscopiquement l'agglutination sur un fond blanc. Lire les négatifs au microscope .

Claims (23)

1. Hetérohybridome produisant un anticorps monoclonal anti-Rhésus D (RhD), formé par fusion de cellules de myélome de souris ne sécrétant pas d ' Ig avec une population de lymphocytes B humains transformés par le virus d'Epstein Barr (EBV) , caractérisé en ce que cette population de lymphocytes B est productrice d ' Ig anti-RhD et que l'hété-rohybridome produit plus de 20y«g d'anticorps monoclonalanti-RhD/ml/24 heures , lorsqu1 il est mis en culture à 37°C à environ 1 x 10 cellules/ml dans un milieu de culture d'hybridome comprenant du milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de FCS ou un autre milieu qui entretient une croissance égale de 1 hétérohybridome dans les mêmes conditions.

2. Hetérohybridome suivant la revendication 1, caractérisé en ce que le partenaire pour la fusion de cellules de myélome est une cellule de la lignée de cellules de myélome de souris X63-Ag8.653.

3. Hetérohybridome suivant l'une quelconque ~ des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il pro duit un anticorps monoclonal anti-RhD de la classe des IgM.

4. Hétérohybridome suivant l'une quelconque des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il produit un anticorps monoclonal anti-RhD de la classe des IgG.

5. Hétérohybridome suivant l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il est formé en utilisant pour la fusion avec les cellules de myélome de souris une population de lymphocytes B humains ~ transformés par EBV capables de produire plus de 200 ng d'anti-RhD/ΊΟ^ cellules/24 heures lorsqu'ils sont mis *' en culture à 37°C dans un milieu de culture de cellules lymphoblastoïdes consistant en milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de FCS , de benzylpénicilline K (lOOyU.g/ml) , de sulfate de streptomycine (lOO^g/ml) ,

1 J 25 d 1 amphotéricine-B ( 2,5^/tg/ml ) , de 2-mercaptoéthanol (50jjM) et de L-glutamine (2 mM) ou en un milieu équiva-; lent capable d'entretenir une croissance égale des ; lymphocytes B transformés par EBV dans les mêmes con ditions.

6. Hétérohybridome suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est formé en utilisant pour la fusion avec les cellules du myélome de souris une population de lymphocytes B humains transformés par EBV capa- g blés de produire plus de 250 ng d'anti-RhD/10 cellules/ 24 heures lorsqu'ils sont mis en culture à 37°C dans un milieu de culture de cellules lymphoblastoïdes consistant en milieu RPMI-1640 additionné de 10% (v/v) de FCS , de benzylpénicilline K (lOO^ttg/ml) , de sulfate de streptomycine (100^cg/ml), d ' amphotéricine-B ( 2,5/i-g/ml), de 2-mercaptoéthanol (50^-M) et de L-glutamine (2 mM) ou en un milieu équivalent capable d'entretenir une crois-“ sance égale des lymphocytes B transformés par EBV dans .v les mêmes conditions.

7. Hétérohybridome suivant l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le lymphocyte B partenaire pour la fusion dérive de lymphocytes B humains isolés du sang d'un individu donneur hyperimmunisé par RhD environ 13-57 jours après l'immunisation secondaire.

8. Hétérohybridome suivant la revendication 7, caractérisé en ce que le lymphocyte B partenaire pour la fusion dérive de lymphocytes B humains isolés du sang d'un individu donneur hyperimmunisé par RhD ^ environ 13-28 jours après l'immunisation secondaire.

9. Hétérohybridome qui est producteur d1 IgM anti-RhD, caractérisé en ce qu'il est 1'hétérohybridome déposé à 1'European Collection of Animal Cell Cultures sous le n° d'accès 86041803, et ses mutants producteurs d'IgM anti-RhD. ' ί 26

10. Hétérohybridome qui est producteur d'IgM anti-RhD, caractérisé en ce qu1 il est l'hétérohybridome déposé à 1'European Collection of Animal Cell Cultures : sous le n° d'accès 87021301 et ses mutants producteurs d'IgM anti-RhD.

11. Anticorps monoclonal anti-RhD, caractérisé en ce qu'il est produit par un hétérohybridome suivant l'une quelconque des revendications 1 à 10, et ses fragments fixant l'antigène RhD.

12. Anticorps monoclonal anti-RhD de la classe des IgM, caractérisé en ce qu 'il est susceptible d 'être produit par l'hétérohybridome suivant la revendication 9 , et ses fragments fixant l'antigène RhD.

13. Anticorps monoclonal anti-RhD de la classe des IgM , caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être produit par l'hétérohybridome suivant la revendication 10 , et ses fragments fixant l'antigène RhD. *“ 14 - Liquide surnageant non concentré d'une » culture de cellules, caractérisé en ce qu'il contient plus de 20yug d'anti-RhD humain par ml.

15. Procédé de préparation d'un anticorps monoclonal anti-RhD, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture d'un hétérohybridome suivant l'une quelconque des revendications 1 à 10 dans des conditions de production de l'anticorps.

16. Procédé de préparation d'un hétérohybridome suivant la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend les stades: (a) d'isoler des lymphocytes B d'un individu donneur e humain positif pour 1'Ig anti-RhD; * (b) de transformer les lymphocytes B isolés ainsi obte nus au moyen d'EBV et d'exécuter ensuite une ou plusieurs étapes de croissance et sélection pour obtenir une population de lymphocytes B transformés par EBV pour la fusion cellulaire capables de produire plus de 200 ng 27 g d1anti-RhD/ΊΟ cellules/24 heures lorsqu'ils sont mis en culture à 37eC dans un milieu de culture de cellules ; lymphoblastoïdes consistant en milieu RPMI-1640 addi tionné de 10% (v/v) de FCS, de benzylpénicilline K ( 100yix-g/ml ) , de sulfate de streptomycine ( lOOyu. g/ml ) , d1 amphotéricine-B ( 2,5y&lg/ml) , de 2-mercapto-éthanol (50 juM) et de L-glutamine (2 mM) ou en un milieu équivalent capable d'entretenir une croissance égale des lymphocytes B transformés par EBV dans les mêmes conditions; (c) de fusionner les lymphocytes B transformés par EBV de cette population avec des cellules d'une lignée cellulaire de myélome de souris ne sécrétant pas d'Ig; et (d) de sélectionner les hétérohybridomes producteurs d'anticorps monoclonal anti-RhD formés au stade (c) qui produisent plus de 20Ji*g d'anticorps monoclonal anti-RhD/ml/24 heures lorsqu'ils sont mis en culture à 37eC à environ 1 x 10^ cellules/ml dans un milieu de culture d'hybridome comprenant du milieu RPMI-1640 additionné 1 de 10% (v/v) de FCS ou un milieu qui entretient une croissance égale de 1'hétérohybridome dans les mêmes conditions.

17. Procédé suivant la revendication 16, caractérisé en ce que les cellules du myélome de souris utilisées sont des cellules de la lignée cellulaire de myélome de souris X63-Ag8.653.

18. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 16 et 17, caractérisé en ce qu'au stade (a) les lymphocytes B sont isolés du sang d'un individu donneur humain hyperimmunisé par RhD environ 13-57 jours après l'immunisation secondaire.

19. Procédé de préparation d'une population productrice d'Ig anti-RhD de lymphocytes B humains transformés par EBV pour la fusion avec une lignée cellulaire immortalisée, caractérisé en ce que les lymphocytes B de départ sont obtenus à partir du sang d'un individu don- * 28 neur humain hyperimmunisé par RhD environ 13-57 jours après l'immunisation secondaire.

20. Procédé de typage Rh des globules rouges, caractérisé en ce qu'un anticorps monoclonal anti-RhD suivant l'une quelconque des revendications 11 à 13 est utilisé.

21. Anticorps monoclonal anti-RhD suivant l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il est destiné à l'utilisation dans le typage Rh des globules rouges.

22. Solution stérile d'un ou plusieurs anticorps monoclonaux suivant l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'elle est propre à l'injection à l'être humain.

23. Anticorps monoclonal anti-RhD suivant l'une quelconque des revendications 11 à 13, caractérisé en ce qu'il est utilisé pour l'immunisation passive d'une mère RhD- après la naissance d'un enfant RhD+ pour empêcher la sensibilisation de la mère à l'égard de 1'an-tigène RhD. UM- 'V <