MX2011006869A - Anticuerpos monoclonales anti-rhd. - Google Patents

Abstract

Anticuerpos monoclonales anti-RhD y métodos para su producción.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES A TI-RHD Campo de la Invención La presente invención se refiere a la producción y uso de anticuerpos monoclonales anti-Rhesus D y sus fragmentos de enlace de antígeno .

Antecedentes y técnica previa El antígeno Rhesus D (también referido en la técnica como antígeno RhD, factor Rhesus, y/o factor Rh) es un antígeno que puede estar presente en la superficie de los glóbulos rojos humanos. Aquellos individuos cuyos glóbulos rojos tienen este antígeno, son usualmente referidos como "RhD positivos", mientras que aquellos individuos cuyos glóbulos rojos no tienen este antígeno, son referidos como "RhD negativos" .

Una persona con RhD-negativo nunca ha sido expuesta al antígeno RhD no producirá anticuerpos anti-RhD (anticuerpos contra el antígeno RhD) . Sin embargo, la transferencia de sangre RhD-positiva a un individuo RhD-negativo llevará a sensibilización (inmunización) del individuo RhD-negativo contra el antígeno RhD. Esto puede llevar a una cantidad de complicaciones. En particular, cuando una mujer RhD-negativa da luz a un infante RhD-positivo, hay riesgo de que pequeñas cantidades de la sangre del infante entren a la circulación materna, provocando que la madre produzca anticuerpos anti-RhD. Mientras que esto normalmente no lesiona al primer bebé, en caso de que la madre ahora inmunizada se embarace con otro bebé RhD positivo entonces los anticuerpos anti-RhD maternos pueden cruzar la placenta y atacar a las células de la sangre del infante, llevando a una condición conocida como enfermedad hemolítica del recién nacido (HDN = Haemolytic Disease of the Newborn) .

Anticuerpos Anti-RhD por lo tanto se administran rutinariamente a pacientes RhD-negativos en donde hay riesgo de exposición a sangre RhD-positiva, para evitar que el paciente se inmunice contra la sangre RhD-positiva. Por ejemplo, un paciente RhD-negativo puede dar anticuerpos anti-RhD antes de y/o poco después de haber dado a luz o tener un aborto de un bebé RhD-positivo; después de un incidente durante embarazo que puede llevar a sangrado a través de la placenta como una medida preventiva rutinaria durante el embarazo; o antes de o poco después de cualquier transfusión de componentes de sangre que contienen glóbulos rojos RhD-positivos .

Tradicionalmente, los anticuerpos anti-RhD empleados han sido anticuerpos policlonales que se obtienen del plasma de la sangre de voluntarios RhD negativos quienes se han inmunizado repetidamente contra los glóbulos rojos RhD-positivos . Sin embargo, el uso de anticuerpos policlonales tiene una cantidad de desventajas reconocidas, la última de las cuales no es la necesidad continua por una cantidad de donadores voluntarios suficientes para satisfacer la demanda del anticuerpo, y el riesgo de contaminación de la preparación del anticuerpo con cualesquiera virus u otros patógenos que puedan estar presentes en la sangre del donador .

Mientras que los anticuerpos policlonales constituyen anticuerpos secretados por una cantidad de diferentes células de plasma, y de esta manera constituyen una mezcla de moléculas de inmunoglobulina secretadas contra un antigeno específico y potencialmente que reconocen una variedad de epítopos, los anticuerpos monoclonales se producen de células que todas son clones de una sola célula precursora y de esta manera constituyen una población homogénea de anticuerpos como es bien conocido en la técnica. Las líneas celulares de las cuales se producen anticuerpos monoclonales se desarrollan y cultivan in vitro, y esto significa anticuerpos monoclonales que tienen el potencial para producirse como y cuando se requieran tanto en grandes cantidades como en altos niveles de pureza. De acuerdo con esto, los anticuerpos anti-RhD monoclonales tienen una cantidad de ventajas potenciales frente a las preparaciones de anticuerpo anti-RhD policlonales que se han empleado tradicionalmente .

Una cantidad de técnicas para producir anticuerpos monoclonales humanos en general, y anticuerpos anti-RhD monoclonales . humanos en particular, se han descrito. Por ejemplo, EP-A2-0251440 describe un . anticuerpo monoclonal anti-RhD que produce heterohibridoma formado por fusión de células de mieloma de ratón que no secretan Ig con una población que produce Ig anti-RhD de linfocitos humanos transformados con virus Epstein Barr (EBV = Epstein Barr Virus) .

La patente de los E.U.A. Número 5,665,356 describe la producción de anticuerpos anti-RhD monoclonales humanos que tienen ciertas características definidas, producidas al cultivar selectos linfocitos B humanos transformados con EBV.

La patente de los E.U.A. Número 6,312,690 describe la producción de anticuerpos monoclonales anti-RhD por técnicas recombinantes . Se eligió una línea celular humana inmortalizada EBV que produce un anticuerpo monoclonal D anti-Rhesus denominado D7C2. Las secuencias que codifican las regiones variables de las cadenas pesadas (H) y ligera (L) de D7C2 se clonaron, secuenciaron e insertaron en vector de expresión de baculovirus recombinante bajo el control de un fuerte promotor de baculovirus . Células de insecto transfectadas con el baculovirus recombinante se cultivaron, y el anticuerpo monoclonal D7C2 recombinante se recuperó del sobrenadante celular.

US-A1-2003/0175969 describe un método para preparar anticuerpos monoclonales anti-RhD capaces de activar células efectoras que expresan FCYRIII que comprende: a) purificar anticuerpos monoclonales obtenidos de líneas celulares seleccionadas de heterohibridomas de linfocitos B humanos, o líneas celulares recombinantes animales o humanas (tales como células CHO-K, CHO-LedO, CHO Lec-1 , CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil- 2, Jurkat, Vera, Molt-4, COS-7, HEK293, YB2/0, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 y P3X63Ag8.653 ) ; b) agregar cada anticuerpo obtenido en la etapa a) a una diferente mezcla de reacción que comprende glóbulos rojos RhD positivos, células efectoras que comprenden células que expresan FCYRIII, IgGs polivalentes; y c) determinar el por ciento de lisis de las células objetivo y seleccionar los anticuerpos monoclonales que activan las células efectoras que provocan lisis significante de los glóbulos rojos RhD positivos.

La patente de los E.U.A. Número 6,475,787 describe un método para preparar anticuerpos monoclonales en donde una célula hospedera eucariótica conveniente se transforma con una secuencia de ADN que codifica una cadena pesada de anticuerpo y una secuencia de ADN que codifica una cadena ligera de anticuerpo, las dos secuencias se enlazan a diferentes genes marcadores amplificables , para permitir amplificación diferencial de los ADNs de cadena pesada y ligera, para optimizar el número de copias de genes relativas de los ADNs de cadena pesada y ligera. En una modalidad preferida, la célula hospedera es una célula de ovario de hámster chino (CHO = Chínese Hámster Ovary) que es deficiente en DHFR (es decir, incapaz de producir dihidrofolato reductasa) , uno de los genes marcadores amplificables es un gen adenosina deaminasa (ADA = Adenosine Deaminase) y el otro es un gen DHFR. La amplificación del ADN que codifica una cadena de anticuerpo y ligado en el gen ADA, puede ser lograda al tratar las células recombinantes con incrementadas concentraciones de 2 ' -deoxicoformicina, mientras que la amplificación del ADN que codifica la otra cadena de anticuerpo y enlazado en el gen DHFR se logra al tratar la célula con incrementadas concentraciones de metrotexato (MTX) .

Sin embargo, queda una necesidad por adicionales anticuerpos monoclonales anti-RhD y métodos para su producción.

Descripción de la Invención De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo, monoclonal anti-RhD aislado, que comprende: a) una región variable de cadena pesada que tiene primeras y segundas regiones de determinación de complementariedad (CDRs = Complementarity Determining Regions) que son idénticas o sustancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 2, y una región variable de cadena ligera que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas ó sustancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 4; o b) una región variable de cadena pesada que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o sustancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o sustancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 8; o c) una región variable de cadena pesada que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o sustancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o sustancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 12.

Como se emplea aquí, la expresión "anticuerpo anti-RhD" se refiere tanto a anticuerpos enteros como a sus fragmentos que tienen especificidad de enlace al antígeno RhD. La afinidad/especificidad de enlace de un anticuerpo puede medirse por una variedad de ensayos, como se conocerá por y puede ser implementado rutinariamente por una persona con destreza ordinaria en la especialidad. Por ejemplo, anticuerpos que reconocen y ligan específicamente el antígeno RhD pueden determinarse utilizando una o más técnicas estándar como se conoce por una persona con destreza ordinaria en la especialidad, tal como pero no limitadas a técnicas: EIA / ELISA, tales como inmunoensayo ligado a enzima (EIA = Enzyme Linked Immunoassay) competitivo; citometría de flujo; y/o ensayos de toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = Antibody Dependant Cellular. Toxicity) . Técnicas de EIA competitivo ejemplar, citometría de flujo y ADCC, se describen con mayor detalle en los Ejemplos siguientes.

Como es bien conocido en la técnica, anticuerpos enteros típicamente se forman de una o dos cadenas pesadas y una o dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas y ligeras comprenden cada una, una región variable y una región constante. Las regiones variables (también referidas como los dominios variables) dictan la especificidad de enlace del antígeno del anticuerpo. Cada dominio variable está compuesto por regiones de determinación de complementariedad (CDRs, de las cuales típicamente hay tres designadas CDRl, CDR2 y CDR3 ) interdispersadas con regiones más conservadas conocidas como regiones marco. Al plegar el anticuerpo para adoptar la estructura cuaternaria correcta, las CDRs de una cadena pesada y ligera juntas forman el sitio de enlace de antígeno. La región constante de la cadena pesada está compuesta por tres o más regiones constantes y depende de la. clase (por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, o igM) e isotipo (por ejemplo, igAl , lgA2, igGl, lgG2, lgG3, lgG4) del anticuerpo. Es idéntico en todos los anticuerpos de la misma clase e isotipo pero diferente en anticuerpos de diferentes isotipos. La región constante de cadena ligera está compuesta por un dominio constante sencillo del cual es de uno o dos isotipos kappa o lambda e igualmente idéntico en todos los anticuerpos del mismo isotipo. Las regiones constantes de los anticuerpos típicamente median el enlace del anticuerpo a tejidos hospederos o factores .

Fragmentos de anticuerpo de acuerdo con la presente invención, típicamente incluyen cuando menos las CDRs y suficientes regiones marco para ligar específicamente el antígeno. Tipos ejemplares de fragmento incluyen pero no están limitados a un fragmento Fab' (que consiste del dominio variable y un dominio constante tanto de cadenas pesadas como ligeras), un fragmento F(ab')2 (dos fragmentos Fab' ligados por un puente disulfuro en la región bisagra) , un fragmento Fv (que consiste de los dominios variables solamente de las cadenas ligeras y pesadas) , y otros tipos de fragmentos como se conoce por aquellos con destreza en la técnica.

SEQ ID NOs : 2 y 4 son las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal anti-RhD referido aquí como RhDl y descrito a continuación con mayor detalle. SEQ ID NOs: 6 y 8 son las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal anti-RhD referido aquí como RhD2 y descrito a continuación con mayor detalle. SEQ ID NOs : 10 y 12 son las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal anti-RhD aquí referido como RhD3 y descrito a continuación con mayor detalle.

Los anticuerpos de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención por lo tanto comprenden regiones variables de cadena pesada y cadena ligera que tienen primeras y segundas regiones de determinación de complementariedad (es decir, CDR1, CDR2 y CDR3 ) que son idénticas o sustancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras regiones de determinación de complementariedad (CDRl, CDR2 y CDR3) del anticuerpo RhDl, RhD2 o RhD3.

Como se emplea aquí, dos CDRs son "sustancialmente idénticas" si tienen secuencias de aminoácidos que de preferencia son al menos 80% idénticas y/o difieren en no más que un aminoácido. Más previamente, las secuencias son al menos 90% idénticas y/o difieren en no más de un aminoácido. De preferencia, cuando ocurren sustituciones de aminoácido, dichas sustituciones son sustituciones conservadoras. Cuando las CDRs de dos anticuerpos son al menos sustancialmente idénticas, es razonable el pronosticar que el sitio de enlace de antígeno resultante de los dos anticuerpos tenga propiedades de enlace de antígeno similares. Por ejemplo, anticuerpos RhDl y R D2 tienen CDRs altamente similares como puede verse en las Figuras 1 y 2 (descrito a continuación con mayor detalle) y ambas tienen alta afinidad de enlace para el antígeno RhD.

Más preferible, las CDRs del anticuerpo son idénticas a aquellas de RhDl, RhD2 o RhD3.

Como se emplea aquí, la expresión "un anticuerpo monoclonal aislado" se refiere a un anticuerpo que se ha producido por técnicas monoclonales y que se ha aislado de anticuerpos de otros tipos. En otras palabras, los únicos otros anticuerpos presentes serán anticuerpos producidos por células de la misma línea celular (es decir, células que todas se originan de la misma célula precursora sencilla) que la célula que produce el anticuerpo monoclonal. Esto por supuesto en contraste por ejemplo con anticuerpos policlonales en donde los anticuerpos constituyen una mezcla de diferentes anticuerpos que se originan de diferentes células de plasma.

En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal anti-RhD aislado comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que son al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, más preferiblemente al menos 95%, más preferiblemente al menos 98%, más preferiblemente 100% idénticas a las regiones variables respectivas de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo RhDl, RhD2 o RhD3 al cual sus CDRs son al menos substancialmente idénticas. De esta manera, en esta modalidad, el anticuerpo comprende cualquiera de: a) una región variable de cadena pesada que es al menos 80%, 90%, 95%, 98% o 100% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 2 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 2, y una región variable de cadena ligera que es al menos 80%, 90%, 95%, 98% o 100% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 4 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 4; o b) una región variable de cadena pesada que es al menos 80%, 90%, 95%, 98% o 100% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 6 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera que es al menos 80%, 90%, 95%, 98%, o 100% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 8 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 8; o c) una región variable de cadena pesada que es al menos 80%, 90%, 95%, 98% o 100% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 10 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que es al menos 80%, 90%, 95%, 98% o 100% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 12 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 12.

Técnicas para identificar regiones variables de anticuerpo y CDRs, comparar y alinear secuencias de aminoácidos, y determinar el % de identidad entre dos secuencias de aminoácidos, son bien conocidas en la especialidad. Por ejemplo, las CDRs, regiones variables, y regiones constantes de un anticuerpo pueden determinarse utilizando programas tales como la herramienta IMGT/V-QUEST (http : //imgt . cines . fr/IMGT vquest/share/textes/ ) utilizando los ajustes predefinidos, y/o por comparición con base de datos de secuencias de inmunoglobulinas conocidas tales como IMGT/GENE-DB (http: / /imgt . cines . fr/IMGT GENE- DB/GENEIect?liyret=Q) o V-BASE (http .V/vbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/ ) . Secuencias de aminoácidos o ácidos nucleicos, ya sea para anticuerpos enteros o sus partes específicas, pueden ser alineadas y su % de identidad determinada utilizando ClustalW (http: //www. ebi .ac.uk/Tools/clustalw/ ) . Clustal 2 (http : //www. ebi . ac .uk/Tools/clustalw2A) o GAP (http: //qenome.cs .mtu.edu/align/align.html) utilizando parámetros predefinidos, o utilizando un programa o soporte lógico, de propiedad tal como Vector NTI v.10.3.

En una modalidad preferida, el anticuerpo además comprende una región constante de cadena ligera y al menos una región constante cadena pesada. La región constante de cadena ligera puede ser ya del tipo kappa o lambda. El dominio constante de cadena pesada de preferencia es un dominio constante de clase IgG. De esta manera, en esta modalidad, el anticuerpo puede ser por ejemplo una fragmento Fab' o F(ab')2, como se discutió anteriormente o puede ser un anticuerpo entero. Si es el último, de preferencia todos los dominios constantes de cadena pesada son dominios IgG (es decir el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada IgG) . En una modalidad particularmente preferida, la región o dominio constante es una región ?· dominio constante IgG 1 o IgG 3. De preferencia, todos los dominios constantes (tanto ligeros como pesados) son dominios constantes humanos.

De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que codifica la cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto.

Como se emplea aquí, el término un "polinucleótido aislado" se refiere a un polinucleótido que se ha aislado de un ambiente celular (es decir no está presente en una célula u organismo) , y puede estar en forma purificada (es decir substancialmente libre de otros polinucleotidos, proteínas y componentes celulares) forma parte de composición que contiene otros polinucleotidos y/o compuestos. El término "codificar una cadena ligera" se refiere no solo a secuencias que codifican cadenas ligeras enteras, sino también a secuencias que codifican sus fragmentos (tales como solo el dominio variable) , en donde el anticuerpo a expresarse es un fragmento de anticuerpo como se describió anteriormente. De manera similar, la expresión "codificar una cadena pesada" se refiere no solo a secuencias que codifican cadenas pesadas enteras, sino también a secuencias que codifican sus fragmentos (tal como el dominio variable solo o el dominio variable más uno o más , pero no todos los dominios constantes) en donde el anticuerpo a expresarse es un fragmento de anticuerpo como se describió anteriormente.

Secuencias de ácido nucleico ejemplares incluyen las secuencias de codificación relevantes de SEQ ID NOs : 1, 3, 5, 7, 9 y 11, estas secuencias son las secuencias de codificación respectivamente, para las secuencias de aminoácidos números SEQ ID NOs : 2, 4, 6, 8, 10, y 12. De esta manera, por ejemplo, si el anticuerpo comprende regiones variables idénticas a las regiones variables de SEQ ID NOs: 2 y 4 (las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo anti-RhD designado RhD 1), entonces una secuencia de ácido nucleico ejemplar pueden comprender las secciones de SEQ ID NOs : 1 y 3 que codifican las regiones variables. En forma alterna, estas secuencias de ácido nucleico pueden ser modificadas para expresión optimizada (es decir transcripción y/o traducción) en la célula hospedera deseada, por ejemplo por técnicas conocidas por una persona con destreza en la especialidad. Por ejemplo, la optimización de la secuencia de ácido nucleico nativa puede comprender uno o más de: optimizar la distribución GC, y tramos AT/GC (para mejorar la estabilidad de ARNm) ; retirar motivos inhibitorios (tales como señales polyA prematuras) ; retirar sitios de combinación críptica (para evitar combinación alterna, incorrecta de ARNm) ,· optimizar estructura secundaria de ARNm (para evitar horquillas cerradas que posiblemente estanquen la traducción) ; optimizar marcos de lectura abiertos (para evitar marcos de lectura secundarios o alternos) ; y optimizar uso de codón (para evitar codones raros que pueden frenar la traducción) .

De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema de expresión que comprende uno o más vectores de expresión y que incluye secuencias de codificación que codifican las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo de acuerdo con el primer aspecto.

El o los vectores de expresión pueden ser de cualquier tipo empleado en la técnica, tal como por ejemplo plásmidos y vectores virales. Los vectores de expresión de la presente invención de preferencia son plásmidos. Además de las secuencias de codificación de cadena de anticuerpo, el o los vectores incluirán las secuencias regulatorias necesarias para adecuada trascripción y traducción de las secuencias de codificación en la célula hospedera pretendida, 'tal como por ejemplo una secuencia conveniente de promotor y poliadenilación (polyA) . El o los vectores además pueden comprender una secuencia Kozak para incrementada eficiencia de expresión, y/o una secuencia que codifica un péptido de señal para transporte post-traducción de las cadenas de anticuerpo (por ejemplo para secreción de los anticuerpos) . Una característica preferida adicional es la presencia de uno o más genes de resistencia a antibiótico y/u otras formas de marcador de selección, permitiendo la selección de células que se han transfectado en forma estable con el vector, y/o que exhiben la fuerte expresión de las secuencias de codificación de anticuerpo, como se discute a continuación con más detalle.

Los promotores y/o secuencias poly(A) empleados para impulsar la expresión de las secuencias de codificación de cadena ligera y pesada pueden ser de cualquier tipo empleado en la técnica. Una variedad de diferentes promotores y secuencias poly(A) se conocen, la selección de apropiados promotores y secuencias poly(A) para utilizar en la célula hospedera selecta, está bien dentro de las habilidades de una persona con destreza ordinaria en la técnica. Por ejemplo, promotores convenientes para utilizar en una célula hospedera de mamífero incluyen el factor de elongación SV40 temprano y tardío 1 (EF-1)-, y promotores citomegalovirus (C V) . Secuencias poly(A) convenientes incluyen aquellas de SV40 poly(A) , hormona de crecimiento bovino (BGH) , timidina quinasa (TK) y hormona de crecimiento humano (hGH) . En una modalidad preferida, las secuencias de codificación de cadena ligera y pesada son desplazadas por el promotor de factor de elongación humano 1 alfa (hEF-lar) y la secuencia BGH poly(A) .

En una modalidad, el sistema de expresión comprende un vector de expresión que incluye tanto la secuencia de codificación para la cadena ligera como la secuencia de codificación para la cadena pesada.

En una modalidad alterna, las secuencias de codificación de cadena ligera y pesada se transportan por vectores separados, el sistema de expresión comprende: un primer vector de expresión que incluye la secuencia de codificación que codifican la cadena ligera; y un segundo vector de expresión que incluye la secuencia de codificación que codifica la cadena pesada.

En esta modalidad, uno o ambos del primer y segundo vectores de expresión puede incluir un marcador de selección de dihidrofolato reductasa (dhfr) . Este marcador comprende una secuencia de codificación para DHFR, que se acopla a secuencias convenientes de poliadenilación y promotor, de preferencia las secuencias poly(A) y promotor temprano SV40 (SV40E) . DHFR permite síntesis de novo del precursor de ADN timidina. Por lo tanto, al transfectar una línea celular hospedera que es deficiente en DHFR (es decir que la misma es incapaz de producir DHFR) , se pueden entonces seleccionar células que han integrado en forma estable el vector en su genoma al desarrollar las células en un medio deficiente en deoxiribonucleósidos y ribonucleósidos . Aún más, una vez que las células transíectadas exitosamente se han aislado, la expresión de la o las secuencias de codificación deseada (es decir la cadena ligera y/o pesada) pueden ser amplificadas al utilizar el inhibidor DHFR metotrexato (MTX) , que provoca que algunas células reacciones al amplificar grandes regiones de ADN que circundan el gen.

En una modalidad preferida, uno del primer y segundo vectores de expresión incluye un gen de resistencia a antibiótico (una secuencia de ácido nucleico que imparte resistencia al antibiótico en cuestión) pero no incluye la secuencia de codificación DHFR, y el otro de los vectores de expresión incluye la secuencia de codificación DHFR, pero no incluye un gen que proporciona resistencia al mismo antibiótico que el gen de resistencia a antibiótico. El gen de resistencia a antibiótico puede ser de cualquier tipo empleado en la especialidad. Por ejemplo, genes de resistencia a antibiótico. convenientes para impartir resistencia a una célula hospedera de mamífero, incluyen: genes de resistencia a aminoglicosido (por ejemplo neomicina, higromicina B) , tales como genes de resistencia a neomicina fosfotransferasa (npt) y higromicina B fosfotransferasa (hpt, hph) Xaminonucleósido (por ejemplo puromicina) tales como genes de resistencia a puromicina N-acetiltransferasa (pac) ; glicocopéptido (eg. bleomicina, fleomicina) tales como el gen ble; y genes de resistencia peptidil nucleósido (eg. blasticidina) tales como los genes bis, bsr o bsd. Como con el marcador de selección dhfr, el genes de resistencia a antibiótico puede, según sé requiera, acoplarse a cualesquiera secuencias de poliadenilación y promotores convenientes. Se prefieren las secuencias de promotor temprano SV40 (SV40E) y poly(A) .

En una modalidad .particularmente preferida, el gen de resistencia a antibiótico comprende una secuencia de codificación de neomicina fosfotransferasa (NPT) . Las células transíectadas en forma estable con el vector incluyendo la secuencia de codificación NPT pueden seleccionarse por desarrollo de las células en un medio que contiene neomicina, o una análogo de neomicina tal como G418, los efectos tóxicos de los cuales se neutralizan por NPT.

De esta manera, la modalidad anteriormente descrita, en donde un vector tiene el marcador de selección dhfr y el otro tiene el gen de selección de antibiótico, permiten selección de solo aquellas células que han integrado en forma estable ambos vectores en su genoma al desarrollar las células en un medio deficiente en deoxiribonucleósidos y ribonucleósidos y que contiene el antibiótico relevante (tal como neomicina o un análogo conveniente en donde el gen de resistencia a antibiótico es el gen npt) . Células que no se transíectaron o se transíectaron solo con un plásmido no sobrevivirán el proceso de selección. Aún más, debido a que los plásmidos co-transfectados a menudo integran en un punto de genoma, crecimiento subsecuente de las células exitosamente transfectadas en concentraciones crecientes de MTX, todavía pueden emplearse para amplificar efectivamente la expresión de las cadenas de anticuerpo codificadas por ambos vectores (es decir para amplificar la expresión tanto ' de las secuencias de cadena pesada como ligera) .

Habrá de notarse que mientras que, en esta modalidad, el vector que transporta el marcador de selección dhfr no incluye un gen que proporciona resistencia al mismo antibiótico que el gen de resistencia a antibiótico transportado por el otro vector, este y sin duda ambos vectores además pueden comprender un gen de resistencia a antibiótico diferente que proporciona resistencia contra un antibiótico adicional. De nuevo, el gen de antibiótico adicional puede ser de cualquier tipo empleado en la especialidad. Por ejemplo, cuando uno pero no ambos vectores transportan una secuencia de codificación NPT (que proporciona resistencia contra neomicina y sus análogos) ambos vectores pueden comprender en forma adicional útil un gen de resistencia a ampicilina (AmpR) , para el propósito de proporcionar resistencia a ampicilina cuando se incorpora en una célula hospedera bacteriana. Otros genes de resistencia a antibiótico que se emplean comúnmente para impartir resistencia en hospederos bacterianos incluyen: genes ß-lactamasa (que proporcionan resistencia a antibióticos ß-lactama tales como ampicilina y otras penicilinas) , tales como TEM-1 ?-lactamasa; genes que proporciona resistencia a aminoglicósidos tales como estreptomicina, canamicina, tobramicina y amikacina; y genes de resistencia a tetraciclina (por ejemplo tetraciclina, doxiciclina, minociclina, oxtetraciclina) , tales como los genes tetA.

De acuerdo con un cuarto aspecto, la presente invención proporciona una célula transformada con un sistema de expresión de acuerdo con el tercer aspecto o cuarto aspecto .

Las células hospederas para utilizar en la presente invención pueden ser de cualquier tipo conveniente. Sin embargo, en una modalidad preferida, la célula hospedera (célula a transfectar) es una célula eucariótica, más preferible una célula de vertebrado, más preferiblemente una célula de mamífero. Una variedad de células hospederas de mamífero convenientes están disponibles, tales como por ejemplo citadas en US-A1-2003/0175969 referido previamente. Células hospederas de mamífero preferidas incluyen: todas las variantes de células CHO, tales como CHO Kl y CHO deficientes en dhfr (DG44, DXB11) ; HEK293; BHK; COS-1 y COS-7; NSO; y PER.C6. Las células hospederas preferidas son células de ovario de hámster chino (CHO) , en particular células CHO deficientes en dhfr (células dfhr-CHO) . Las células hospederas pueden ser transfectadas con los vectores de expresión utilizando técnicas y condiciones de transfeccion estándar, tales como se conoce en la especialidad. Condiciones de transfeccion ejemplares se proporcionan en los siguientes ejemplos.

De acuerdo con un quinto aspecto, la presente invención proporciona un método para fabricar anticuerpos monoclonales , que comprende cultivar células recombinantes de acuerdo con el cuarto aspecto, y recuperar el anticuerpo monoclonal del medio de cultivo. Medios y condiciones de crecimiento ejemplares se proporcionan en los siguientes ejemplos, pero pueden emplearse cualesquiera convenientes condiciones de crecimiento y medios de crecimiento comerciales o a la medida, como se emplea rutinariamente en la especialidad. Igualmente, cualquier técnica estándar para purificar anticuerpos secretados de medio de crecimiento pueden emplearse, técnicas ejemplares de nuevo se establecen a continuación.

De acuerdo a un sexto aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto. De preferencia, la composición farmacéutica también comprende un portador farmacéutico aceptable.

Los anticuerpos monoclonales pueden formularse como se desee, dependiendo de la ruta de administración pretendida. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden formularse para inyección (por ejemplo intramuscular) análoga a las formulaciones anti-D policlonales convencionales. Dosis ejemplares están en el intervalo de 150 a 300 microgramos (como se mide por título de aglutinación, como se describe a continuación con mayor detalle) . Portadores ejemplares incluyen: salino amortiguado con fosfato y amortiguador glicina salino.

La composición puede comprender anticuerpos monoclonales de un solo tipo solamente (es decir los únicos anticuerpos presentes en la composición son anticuerpos producidos por células de la misma línea celular) . En forma alterna, la composición puede comprender una combinación de más de un tipo de anticuerpo monoclonal. Por ejemplo, la composición puede comprender dos o más tipos distintos de anticuerpos monoclonales que están de acuerdo con el primer aspecto de la invención, tal como una combinación de dos o todos los tres anticuerpos monoclonales RhDl, RhD2 y/o RhD3. En forma alterna o adicional, la composición puede comprender, además de anticuerpos monoclonales de acuerdo con el primer aspecto de la presente invención, otros anticuerpos monoclonales anti-RhD como por ejemplo se conoce en la técnica. En una modalidad preferida, la composición comprende cuando menos un anticuerpo monoclonal que tiene una región o dominio constante IgG 1 y al menos un anticuerpo monoclonal que tiene una región o dominio constante IgG 3.

Cuando la composición comprende una combinación de más de un tipo de anticuerpo monoclonal, se prefiere que la composición comprenda no más que 50 tipos diferentes de anticuerpos monoclonales. Más preferiblemente, la composición comprende cuando más 25, 20, 15, 10 ó 5 diferentes tipos.

De acuerdo con un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir o evitar inmunización de un paciente humano RhD-negativo contra sangre RhD-positiva , que comprende administrar una cantidad profiláctica efectiva de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto o composición farmacéutica de acuerdo con el sexto aspecto.

Indicaciones y/o circunstancias específicas en donde los anticuerpos monoclonales pueden administrarse, corresponden a aquellas para las cuales se administran anticuerpos policlonales anti-RhD existentes.

De acuerdo con un octavo aspecto, la presente invención' proporciona un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto, o una composición farmacéutica de acuerdo con el sexto aspecto, para utilizar en un método para inhibir o evitar inmunización de un paciente humano RhD-negativo contra sangre RhD-positiva .

De acuerdo con un noveno aspecto, la presente invención proporciona el uso de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con el primer aspecto, en la fabricación de un medicamento para inhibir o evitar inmunización de un paciente humano RhD-negativo contra sangre RhD-pósitiva .

La invención además se ilustra en los siguientes ejemplos no limitantes, con referencia también a los dibujos acompañantes en donde: La Figura 1 es un alineamiento de secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de anticuerpos monoclonales RhDl, RhD2 y RhD3 , en donde las regiones variables se han subrayado y las regiones de determinación de complementariedad se han resaltado con negritas y sombreado; La Figura 2 es un alineamiento de secuencias de aminoácido de las cadenas ligeras de anticuerpos monoclonales RhDl , RhD2 y RhD3 , en donde las regiones variables se han subrayado y las regiones de determinación de complementariedad se han resaltado con negritas; La Figura 3 es un mapa del vector plásmido pCB3 ; La Figura 4 es un mapa del vector plásmido pCBll; La Figura 5 es un mapa de pCB3 , que contiene una secuencia de codificación de cadena pesada de anticuerpo anti-RhD (RhD HC) ; y La Figura 6 es un mapa de pCBll que contiene una secuencia de codificación de cadena ligera de anticuerpo anti-RhD (RhD LC) ; La Figura 7 es un ejemplo de una curva de dosis-respuesta generada en un ensayo ADCC, en donde la citotoxicidad se traza contra el logaritmo de concentraciones de anticuerpo en el cual se sensibilizaron previamente los eritrocitos; y La Figura 8 es un ejemplo de regresión lineal realizada en los puntos de datos relevantes tomados de la Figura 7.

Listados de secuencia que son 48 en número, se proporcionan después de los Dibujos.

Los listados de secuencia también se proporcionan por separado en CD acompañante en forma electrónica.

Ejemplos Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) y células B de sangre periférica de voluntarios sanos hiperinmunizados con glóbulos rojos Rhesus D (RhD) -positivos Sangre de voluntarios RhD-negativos sanos inmunizados repetidamente con glóbulos rojos aislados de individuos RhD-positivos sanos del mismo grupo de sangre ABO se obtuvieron de Cliniqa. Dentro de cuatro semanas después de la última inmunización, el título anti-RhD en suero se verificó, se tomó sangre de los voluntarios, sus células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se separaron de otras poblaciones de células de sangre por centrifugación de gradiente Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y las células ya se emplearon frescas o crioconservaron para uso posterior. Células T se agotaron rutinariamente por acumulación en roseta con glóbulos rojos de ovejas tratadas con bromuro hidrobromuro de S- (2-Aminoetil) isotiouronio al 2% (AET) y las células B enriquecidas resultantes, se transformaron por virus Epstein-Barr (EBV) .

Transformación EBV Ya que la activación EBV se ha mostrado que es ventajosa para subsecuente fusión de células B de humano con socio de fusión respectivo, células B enriquecidas se transformaron por EBV utilizando sobrenadante agotado de la línea celular de Tití B95-8 como una fuente de virus. Las células B resuspendidas en un medio IMD completo (Gibco) con suero bovino fetal (FCS = Fetal Calf Serum) al 30% se sembraron en placas de 96 pozos a una concentración entre 5xl03 y 2.5xl04 células /pozo . El sobrenadante B95-8 se agregó a los pozos en una cantidad en el intervalo de 5% a 40% del volumen total . Las placas se incubaron en un incubador de C02 al 5% humidificado a 37°C por dos a cuatro semanas antes de criba o tamizado.

Criba o monitoreo de placas por transformantes que secretan anticuerpos anti-RhD.

Sobrenadantes de células B transformados se cribaron por la presencia de anticuerpos anti-RhD por inmunoensayo ligado a enzima competitivo (EIA) . El principio de la prueba es como sigue: un anticuerpo de referencia a anti-RhD monoclonal etiquetado de afinidad de enlace y especificidad conocidas (Brad-5; NIBSC) compite con un anticuerpo no etiquetado (en este caso, los anticuerpos secretados en los sobrenadantes) para ligar a eritrocitos RhD-positivos . Una inhibición del enlace de anticuerpo monoclonal de referencia (mAb) indica la presencia de anticuerpos RhD específicos que ligan al mismo epítopo inmunodominante que mAb de referencia. El grado de inhibición del enlace mAb de referencia se correlaciona con la concentración y afinidad de los anticuerpos de interferencia.

Eritrocitos RhD-positivos (haplotipo R2R2 ImmucorGamma) tratados con papaína, se fijaron con glutaraldehído e inmovilizaron en el fondo de placas de prueba de fondo plano de 96 pozos. Después de lavado y bloqueo extensivo de las placas, los sobrenadantes de células B transformadas, las normas y controles negativos se agregaron a los pozos y las placas se incubaron por 30-60 minutos a temperatura ambiente (RT) . Las placas se lavaron tres veces. El mAb de referencia biotinilado se agrega y las placas se incubaron por 30 minutos más a RT. Las placas se lavaron de nuevo e incubaron con un reactivo secundario, conjugado ExtrAvidina-Fosfatasa Alcalina (Sigma) por 30 minutos a RT. Después de otra etapa de lavado, se agrega substrato Sigma Fast PNPP (p-Nitrofenil Fosfato) (Sigma) . Cuando el color se reveló lo suficiente, se detuvo la reacción con NaOH 3N y el enlace de mAb de referencia se detecta por lectura de las densidades ópticas (a 405nm) en un lector de placas (Bio-Rad) . Los datos se analizaron con un paquete de programa suministrado con el lector de placas .

Fusión celular Debido a que células B humanas transformadas con EBV son inestables y pueden dejar rápidamente de producir anticuerpos, la fusión con un socio de fusión conveniente, usualmente es necesaria para prolongar su vida útil y permitir sub clonación. Por lo tanto, cualesquiera cultivos de células B transformadas que producen anticuerpos que inhiben el enlace del anticuerpo de referencia biotinilado a eritrocitos RhD+ como se estima por EIA (ver con anterioridad) se fusionaron a heterohibridoma humano K6H6/B5 ya sea por el método de polietilen glicol (PEG) estándar o por electrofusion. La electrofusion se realizó con el aparato de electrofusion (Eppendorf Multiporator) y amortiguador de electrofusion (Eppendorf) de acuerdo con los protocolos del fabricante.

Subelonación de hibridomas Subclones se desarrollaron en capas de alimentación establecidas para línea de fibroblastos de prepucios de recién nacido CCD-1114Sk (ATCC) . Los alimentadores se mantuvieron en medio IMDM que contiene suero bovino fetal (FBS) 2-20%, dependiendo del crecimiento celular. Bandejas alimentadoras se trataron con luz UV el día de subclonación. Las líneas celulares a subclonarse se contaron, las diluciones apropiadas a placa aproximadamente 0.3 células/pozo se prepararon y las suspensiones celulares se pipetearon en placas de 96 pozos que contienen la capa alimentadora . Cada línea celular se sembró en al menos dos placas. Los cultivos se alimentaron cada 3 a 4 días. Los sobrenadantes de pozos que exhiben crecimiento de hibridomas se probaron por EIA usualmente en 3 a 4 semanas .

Clones de hibridomas seleccionados para desarrollo de líneas celulares recombinantes Clones de hibridomas seleccionados para desarrollo de anticuerpos recombinantes se citan en la Tabla 1 (a continuación) . A cada clon se asigna una asignación simplificada con el propósito de desarrollo de linea celular recombinante .

Tabla 1. Designación de anticuerpos Anti-RhD Isotipo de Designación de Clon de hibridoma: anticuerpo: clon: SD30.06.F5.1G2 IgG 1 humano lambda RhDl SD30.02.C3.3D11 IgG 1 humano lambda RhD2 SD412.04.G11.2D10 IgG 3 humano kappa RhD3 Aislamiento de ARN ARN total de células de hibridoma se purifica utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el fabricante con la etapa adicional de extracción de ARN con cloroformo para retirar trazas de fenol. Cuantificación de ADN espectrofotométrica se llevó a cabo a 260 nm considerando que 1 OD es equivalente a 40 µg/ml de RNA.

Síntesis de primera hebra La primera hebra de ADNc se sintetiza utilizando el sistema Super Script III First- Strand System para RT-PCR (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo sugerido por el proveedor. Cebador Oligo d(T) del equipo se utiliza en todos los casos para cebar las reacciones.

Hidrólisis de ARN La eliminación de moléculas de ARN de reacción de transcripción inversa se llevó a cabo por digestión de RNaseH (Super Script III First-Strand System para RT-PCR) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. ADNc de primera hebra se limpia utilizando el Equipo de Purificación QIAquick PCR (Qiagen) .

Prolongación de ADNc de primera hebra Para facilitar la amplificación de ADNc de primera hebra sin secuencia de 3' desconocida, cola poly(A) se agrega al extremo 3 ' de cada ADNc para crear un sitio de cebado definido. Para este propósito, se utilizó Deoxinucleotidil Transferasa Terminal recombinante (Invitrogen) . La reacción se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El producto de reacción se limpió utilizando QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) .

Amplificación PCR de cadenas pesadas Ig - (HCs) y cadenas ligeras (LCs) Los cebadores (SEQ ID NOs : 13 a 19) empleados para amplificación PCR de las secuencias de codificación de cadena pesada y ligera del ADNc primera hebra se citan a continuación (secuencia de restricción EcoRI en cada cebador está subrayada) .

Cebador directo (compatible con la extensión poly(A) de la primera hebra de ADNc) : Para todas las cadenas : 5'-GACTGAATTCl M I I I M I M I I | I j | 1 1 1 V-3' Cebadores inversos (específico de gen) : Para cadenas gamma: 5'-ACTGGA ICGGTGCTTTATrTCCATGCTGG-3' S'-ACTGGAATTCGTACGTGCCAAGCATCCTCG-S' Para cadenas kappa: 5'-ACTGGAATTCAGAGGCCAAAGGATGGGAGG-3' S'-GACTGAATTCCTGGAACTGAGGAGCAGGTGG-S' Para cadenas lambda: 5'-GACTGAATTCCCTGGGATCCTGCAGCTC-3' d'-???ßß???????ß?ß????????? ??-^ PCR se llevó a cabo utilizando ADN polimerasa termoestable de Alta-Fidelidad PfuUltra (Stratagene) . Típicamente, los primeros cinco ciclos se cebaron solamente con el cebador directo; la temperatura de hibridización fue 45 grados C. Después de eso, el cebador específico de gen inverso se agregó y se extendió PCR por otros 30-35 ciclos a temperatura de hibridización de 50-65 grados C. Fragmentos resultantes se purificaron en Gel utilizando QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) , subclonaron en vector de clonación pBluescript y secuenciaron.

Subclonación de Productos PCR en vector de clonación pBluescript Los productos PCR purificados se ligaron utilizando Quick Ligation Kit (NEB) en el vector de clonación pBluescript (Stratagene) cortado con EcoRV. Células bacterianas DH5 se transformaron con el ADN resultante y dispersaron en placas LB suplementadas con 40 ug/ml de ampicilina y pre-trataron con 50 µ? de 20 mg/ml de Xgal y 25µ1 de 200 mg/ml de isopropil ß-D-l-tiogalactopiranósido (IPTG) . Las colonias fueron azul/blanco seleccionadas por la presencia de un inserto.

Aislamiento de ADN Plásmido y Secuenciado Colonias blancas selectas se recogieron y expandieron. El ADN se aisló con QlAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) . Una digestión de control se realizó con EcoRI (tanto cebadores PCR directos como inversos contuvieron un sitio EcoRI) . Insertos en plásmidos que producen un patrón de digestión esperada se secuenciaron (Biotech Core) .

Codificación de KhDl, RhD2 y RhD3 y secuencias de aminoácido Las secuencias de aminoácidos de cadena pesada (HC) y cadena ligera (LC) de RhDl, RhD2 y RhD3 , y las secuencias de nucleótido correspondientes que codifican las cadenas pesadas y ligeras, se establecen en el listado de secuencia acompañante, como se explica más a continuación.

Las secuencias se analizaron con el auxilio de las bases de datos y programa IMGT (imgt.cines.fr). Más específicamente: las secuencias de regiones constantes se determinaron a partir de la base de datos IMGT/GENE-DB de secuencias Ig genómicas (http://imqt.cines.fr/IMGT GENE-DB/GE EIect?liyret=Q) , al seleccionar la especie, sitio, tipo de gen, grupo (sub-grupo faltado) y funcionalidad (por ejemplo especie: Homo sapiens, sitios: IGH, tipo de gen: constante, grupo: IGHC, funcionalidad: funcional), y búsqueda de base de datos - de la lista resultante, el isotipo deseado (e.g. IGG 1) se seleccionó para identificar apropiada o apropiadas secuencias de referencia IMGT/LIGM-DB para comparación con la secuencia RhD; las regiones variables se determinaron al substraer las regiones constantes; y las CDRs se determinaron utilizando la herramienta IMGT/V-QUEST (http://imgt.cines.fr/IMGT vquest/share/textes/ ) , al seleccionar la especie de inmunoglobulina (humana) , cargar la secuencia de nucleótidos de la cadena de anticuerpo completo, o solo su región variable, en formato FASTA, y analizar la secuencia utilizando los ajustes predefinidos IMGT/V-QUEST.

Para mayor información en la herramienta IMGT7V-QUEST y IMGT/GENE-DB ver también: Lefranc M.-P., Giudicelli V., Kaas Q., Duprat E.', Jabado-Michaloud J. , Scaviner D. , Ginestoux C, Clement 0., Chaume D. and Lefranc G. IMGT, the international ImMunoGeneTics información system. Nucí. Acids Res., 2005, 33, D593-D597; Giudicelli V., Chaume D. and Lefranc M.-P. IMGT/V-QUEST, an integrated software for immunoglobulin and T cell receptor V-J and V-D-J rearrangement analysis. Nucí. Acids Res. 2004, 32, W435-W440; y, Giudicelli V., Chaume D. and Lefranc M.-P. IMGT/GENE-DB: a comprehensive datábase for human and mouse immunoglobulin and T cell receptor genes. Nucí. Acids Res. 2005, 33, D256-D261.

V-BASE (una base de datos de todas las secuencias de región variable de línea germinal humana; http : //vbase .mrc-cpe . cam. ac .uk/ ) también puede emplearse para determinar, o corroborar, los extremos de una región variable. Bajo Alineamientos, se puede encontrar secuencias de línea germinal de los péptidos de señal, segmentos V, segmentos D (se aplica) , y segmentos J de todas las cadenas pesadas y ligeras. Será aparente del análisis IMGT que segmentos se emplearon en una cadena de anticuerpo determinada. Puede entonces referirse al segmento J particular en v-BASE para determinar el extremo exacto.

La SEQ ID NO: 1 es la secuencia de nucleótidos de la región de codificación de RhDl HC. Los nucleótidos 1-57 codifican el péptido de señal. Los nucleótidos 58-448 codifican la región variable, de las cuales los nucleótidos 133-156 codifican CDR1, nucleótidos 208-231 codifican CDR2 , y nucleótidos 346-414 codifican CDR3. Los nucleótidos 449-1437 codifican la región constante (esto es una región constante gammal, o IgGI) . La secuencia de aminoácido de RhDl HC se da como SEQ ID NO : 2.

La SEQ ID NO: 3 es la secuencia de nucleótido de la región de codificación de RhDl LC . Los nucleótidos 1-57 codifican el péptido de señal. Los nucleótidos 58-388 codifican la región variable, de los cuales los nucleótidos 133-159 codifican CDRl , los nucleótidos 211-219 codifican CDR2, y los nucleótidos 328-357 codifican CDR3. Los nucleótidos 389-705 codifican la región constante (esto es una región constante lambda) . La secuencia de aminoácidos de RhDl LC se da como SEQ ID NO: 4.

La SEQ ID NO: 5 es la secuencia de nucleótidos de la región de codificación de RhD2 HC. Los nucleótidos 1-57 codifican el péptido de señal. Los nucleótidos 58-448 codifican la región variable, de la cual los nucleotidos 133-156 codifican CDR1, los nucleotidos 208-231 codifican CDR2 , y los nucleotidos 346-414 codifican CDR3. Los nucleotidos 449-14'37 codifican la región constante (esto es, una región constante gammal o IgGl) . La secuencia de aminoácidos de RhD2 HC' se da como SEQ ID NO: 6.

SEQ ID NO: 7 es la secuencia de nucleotidos de la región de codificación de RhD2 LC . Los nucleotidos 1-57 codifican el péptido de señal. Los nucleotidos 58-388 codifican la región variable, de los cuales los nucleotidos 133-159 codifican CDR1, nucleotidos 211-219 codifican CDR2, y los nucleotidos 328-357 codifican CDR3. Los nucleotidos 389-705 codifican la región constante (esto es, una región constante lambda) . La secuencia de aminoácido de RhD2 LC se da como SEQ ID NO: 8.

La SEQ ID NO: 9 es la secuencia de nucleotidos de la región de codificación de RhD3 HC. Los nucleotidos 1-57 codifican el péptido de señal. Los nucleotidos 58-448 codifican la región variable, de la cual los nucleotidos 133-162 codifican CDR1, los nucleotidos 214-234 codifican CDR2 , y los nucleotidos 349-414 codifican CDR3. Los nucleotidos 449-1578 codifican la región constante (esto es, una región constante gamma3 o IgG3). La secuencia de aminoácidos de RhD3 HC se da como SEQ ID NO: 10.

La SEQ ID NO: 11 es la secuencia de nucleótido de la región de codificación de RhD3 LC. Los nucleotidos 1-66 codifican el péptido de señal. Los nucleotidos 67-391 codifican la región variable, de la cual los nucleotidos 145-162 codifican CDRl, los nucleotidos 214-222 codifican CDR2, y los nucleotidos 331-360 codifican CDR3. Los nucleotidos 392-711 codifican la región constante (esto es una región constante kappa) . La secuencia de aminoácidos de RhD3 LC se da como SEQ ID NO: 12.

Alineamientos de secuencias de aminoácidos de RhDl-RhD3 Las secuencias de aminoácidos de RhDl-RhD3 se alinearon con el programa Clustalw (www. ebi .ac.uk/Tools/clustalw) utilizando los parámetros predefinidos del sitio de la red. Los alineamientos resultantes de HCs y LCs se ilustran en las Figuras 1 y 2, respectivamente. La región variable de cada secuencia se ha subrayado, y las CDRs se han resaltado en negritas (la primera CDR que ocurre, leyendo las secuencias de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo, es CDRl, la segunda es CDR2 , y la tercera es CDR3 ) . Cuando el mismo aminoácido ocurre en todas las tres cadenas alineado, esto se identifica por un "*" a continuación del aminoácido relevante en la secuencia de fondo (la de RhD3) .

Similarmente, GAP (http: //genome.cs .mtu.edu/align/align.html) utilizando los parámetros predefinidos (Máximos Apareamientos (Max Match) = 11; Mínimos Apareamientos Incorrectos (Min Mismatch) = -4; Penalidad de Espacio Abierto (Gap-Open Penalty) = 10; Penalidad de Extensión de Espacio (Gap-Extensión Penalty) = 2) puede utilizarse para alinear y determinar por ciento de identidad entre pares individuales de secuencias o sus secciones. Cuando así se compara, las regiones variables de cadena ligera RhDl y RhD2 son 94% idénticas (104 apareamientos, 6 apareamientos incorrectos, 0 espacios, calificación de similaridad de 540), regiones CDR1 son 88% idénticas (8 apareamientos, 1 apareamiento incorrecto, 0 espacios, calificación de similaridad de 43), regiones CDR2 son 100% idénticas (3 apareamientos, 0 apareamientos incorrectos, 0 espacios, calificación de similaridad de 16), y regiones CDR3 son 90% idénticas (9 apareamientos, 1 apareamiento incorrecto, 0 espacios, calificación de similaridad de 43) . Las regiones variables de cadena pesada RhDl y RhD2 son 94% idénticas (123 apareamientos, 7 apareamientos incorrectos, 0 espacios, calificación de similaridad de 650), las regiones CDRl son 87% idénticas (7 apareamientos, 1 apareamiento incorrecto, 0 espacios, calificación de similaridad de 37) , regiones CDR2 son 100% idénticas (8 apareamientos, 0 apareamientos incorrectos, 0 espacios, calificación de similaridad de 41), y las regiones CDR3 son 95% idénticas (22 apareamientos, 1 apareamiento incorrecto, 0 espacios, calificación de similaridad de 131) .

Vectores de expresión Dos vectores de expresión plásmidos, designados pCB3 y pCBll, se construyeron para expresión de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo en células dhfr-CHO. pCB3 Este plásmido se ilustra en la Figura 3. Los componentes de este plásmido son como se cita en la Tabla 2.

Tabla 2 - Componentes de vector de expresión pCB3 Señal de poli Vector adenilación SV40E Terminación comercial de virus de poli (A) de (pSV40; BRL/- simio transcripció Invitrogen) n Secuencia Promotor Promotor de Vector promotora de SV40E expresión comercial virus de simio 40E Señal de poli BGH Terminación Vector adenilación Poly(A) de comercial de hormona de trancripción (BRL/- crecimiento Invitrogen) bovino Gen de DHFR Marcador de ADNc murino hidrofolato selección (Sierra reductasa DHFR Biosource, Inc. ) pCBll Este plásmido se ilustra en la Figura componentes de este plásmido se citan en la Tabla 3.

Tabla 3 - Componentes de vector de expresión pCBll Componente Forma Fruición Fuente vector corta Factor de Promotor Promotor ADN genómico elongación EFIOÍ de humano humano la con expresión (Clontech) primer intrón Gen de AMPr PropagaVector resistencia a ción de comercial ampicilina (ß plásmido (pBluescript ; lactamasa) en Stratagene) bacterias Origen de pUCori Replicaci Vector replicación ón de comercial plásmido (pBluescript; en Stratagene) bacterias Señal de poli Vector adenilación de SV40E Terminacomercial virus de simio poly (A) ción de (pSV40; BRL/- transcrip Invitrogen) ción Vector Neomicina Neo Marcador comercial fosfotrans- mutante de pSV-Neo ; ferasa selección BRL/Invitrogen (mutante) antibióModificado por tico Sierra Biosource, inc .

Secuencia Promotor Promotor Vector promotora de SV40E de comercial virus de simio expresión (pSV40; BRL/- 40E Invitrogen) BGH Terminaci Vector Señal de poli Poly (A) ón de comercial adenilación de transcrip (BRL/- hormona de ción Invitrogen) crecimiento bovino Inserción de genes de inmunoglobulina recombinantes en vectores de expresión Se empleó una segunda PCR para amplificar las HCs y LCs, con sitios de restricción apropiados agregados de manera tal que los fragmentos puedan insertarse en vectores de expresión. El diseño dé los cebadores directos específicos de gen se basó en secuencias obtenidas . El motivo Kozak consenso (GCCACC) , que se conoce incrementa la eficiencia de traducción eucariotica, se incluye en cada cebador directo (Tabla 5) .

Los cebadores (SEQ ID NOs : 20 a 27) para Inserción de RhDl-RhD3 HCs y LCs en vectores de expresión fueron como sigue .

RhDl HC: Cebador específico de gen directo (GSP) : 5-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3' RhD2 HC: GSP directo: 5,-??06?0??0?600?a0??66?0?66?00?66?60t?0?3· RhD3 HC: GSP directo: 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACACACTTTGCTACACACTCC-3' El cebador inverso empleado para todas las cadenas pesadas: 5 OACGMTTCCACTCATrTACCCGGAGACAGG-3* RhDl-RhD2 LCs: GSP directo: 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGCCTGGGCTCTGCTATTC-3' Cebador inverso: 5*-ACTGG TTCGMCCTATG CATTCTGTAGGGG-3' RhD3 LC: GSP directo: 5*-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACATGAGGGTCCCCG-3' Cebador inverso: S'-GACTGAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTGAAGC-S' El ciclo PCR para inserción de RhDl-RhD3 HCs y LCs en vectores de expresión comprenden las siguientes etapas: 94aC 2 min 94'C 20s 55°C 20s 72°C · 2 min (lmin por RhDl, RhD2 LC) 72°C ' 10 min 4°C retención Construcción de variante IgG3 de anticuerpo RhDl Una variante IgG3 de RhDl se diseña como una quimera entre la región variable de RhDl y la región constante de RhD3. La quimerización aprovechó los extremos 5' idénticos de las regiones constantes RhDl (IgGl) y RhD3 (lgG3). El cebador inverso específico para dominio variable de RhDl se diseñó para superponer tres codones de la región constante y para introducir mutaciones silenciosas que crean un sitio de restricción Nhel . Modificación idéntica se introduce en el extremo 5' de la región constante RhD3 por el cebador directo. El sitio de restricción Nhel permite clonación en-cuadro conveniente de dominio variable RhDl amplificado frente a la región constante RhD3. Esto se realizó en dos etapas.

Primero, la región constante de lgG3 HC del anticuerpo RhD3 se amplificó, cortó con enzimas Xbal y EcoRI, y ligó en vector pCB3 digerido con Xbal/Ncori. En la segunda etapa, este plásmido intermedio se volvió a cortar con Xbal y Nhel endonucleasas , y la región variable amplificada de RhDl, digirió con las mismas enzimas, fue insertada.

Los cebadores (SEQ ID NO: 28-31) empleados para Construcción de variante lgG3 de RhD fueron como sigue.

Cebadores empleados para amplificación de región constante RhD3 : Directo: 5'-ATCGTCTAGAGTCAGCTAGC ACCAAGGGCCCATCGGTCTTCC-3' Inverso : 5'-TGACG TTCCACTCATTTACCCGGAGACAGG-3' Cebadores empleados para amplificación de dominio variable RhDl: Directo: 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGACTGGACCTGGAGGTTCC-3' Inverso: 5 -GATGCTAGCTGAGGAGACGGTGATCGTGG-3' El ciclo PCR para construir la variante lgG3 de RhDl comprende las siguientes etapas: 94°C 2 min 94°C 20s \ 55°C 20s 35x 72'C 2 min / 72°C 10 min 4°C retención Enzima PCR: ADN-polimerasa termoestable de Alta-Fidelidad PfuUltra (Stratagene) .

Vectores de expresión que contienen genes de anticuerpo clonado Las secuencias de codificación RhDl HC, RhDl LC, RhD2 HC, RhD2 LC, RhD3 HC, RhD3 LC, RhDlV3C HC (quimera compuesta de la región constante de cadena pesada RhDl y de cadena pesada RhD3 ) como se inserta en los vectores de expresión, incluyendo también los motivos Kozak agregados y los sitios de restricción, se dan como SEQ ID NOs : 32, 33, 34, 35, 36, 37, y 38, respectivamente. La Figura 5 es un mapa de pCB3 que ilustra la ubicación de la cadena pesada de anticuerpo anti-RhD insertada, y la Figura 6 es un mapa de pCBll que ilustra la ubicación de la cadena ligera de anticuerpo anti-RhD insertada (la ubicación de inserción es la misma, independientemente de la cadena pesada o ligera RhDl , RhD, RhD3 o RhDlV3C expresada específica) .

Optimización de genes Secuencias de codificación de anticuerpos RhDl y RhD3 se optimizaron por GENEART AG utilizando algoritmos de propiedad. Las secuencias de codificación optimizadas para RhDl HC, RhDl LC, RhD3 HC , y RhD3 LC se dan como SEQ ID NOs : 39, 40, 41 y 42, respectivamente.

Clonación de genes RhDl optimizados en vectores de expresión Los genes optimizados para RhDl fueron subclonados en vectores de expresión pCB. Para agregar los sitios de restricción necesarios para clonación, las regiones de codificación se amplificaron por PCR utilizando los cebadores citados a continuación. Cada fragmento amplificado se insertó en el vector respectivo y se verificó por secuenciado.

Los cebadores (SEQ ID NOs : 43 a 46) que se emplearon para agregar los sitios de restricción compatibles con los vectores de expresión pCB a los genes RhD 1 optimizados son como sigue.

RhDI HC Optimizado: Directo: 5'-ATCGimAGAGCCACCATGGACTGGACCTG-3' Inverso: 5'~ATCGGGATCCTCATCACTTGCCGGGGGAC-3' RhDI LC optimizado: Directo: 5'-ATCGTCTAGAGCCACCATGGCCTGGGCCC-3' Inverso: 5'-ATCGG^ATCCTCATCAGCTGCACTCGGTGGGG-3' Los sitios Xbal y BamHl en los cebadores están subrayados .

Las secuencias de codificación RhDI HC y RhDI LC optimizadas como se insertan en los vectores de expresión, incluyendo motivos Kozac agregados y sitios de restricción se dan como SEQ ID NOs: 47 y 48.

Cultivo celular Medio de crecimiento Medio de crecimiento MEMa, se empleó en todas las etapas del trabajo de desarrollo de línea de células CHO recombinantes . Los componentes, formulación y fuentes de material son mostrados en la Tabla 4. Después de adición de todos los componentes, el medio completo se filtró a través de un filtro 0.22 µp? (unidad de filtro Stericup-GP 0.22 µp?, Millipore o equivalente) .

Tabla 4 - Medio de cultivo Medio de MEMa con ribonucleósidos y Gibco o selección de deoxiribonucleósidos dFBS Cellgro transfectante Gamma Irradiado GlutraMax, lOOx Hyclone Geneticina (una formulación G-418) Gibco Gibco Tabla 4 (continúa) Medio Número de Concentración catálogo final Medio de crecimiento 32561-037 lx de célula hospedera CV2561-049 lx 1 CHO DXB11 31985-070 lx SH30079.33 7.5% 35050-061 lx Medio de crecimiento 32571-036 lx de célula hospedera 2 CHO DXB11 SH30070.03 7.5% 35050-061 lx Medio de selección 32561-037 o lx de transfectante CV2561-049 lx SH30079.33 7.5% 35050-061 lx 10131-027 0.5 mg/ml Medio de congelamiento La composición del medio de congelamiento empleada para crioconservacion de células se da en la Tabla 5.

Tabla 5 - Componentes de medio de congelamiento Medio de congelamiento 1 : Medio de congelamiento 2 : Componentes Distribuidores Número de Volumen catálogo por 100 mi FBS Gamma HyClone SH30070.03 90 mi Irradiado DMSO Sigma D2438 10 mi Mantenimiento de células Células CHO DXBll deficientes en dihidrofolato reductasa (DHFR) se desarrollaron en un Medio de Crecimiento de Células Hospederas 1 ó 2 (Tabla 4) y se dividieron cada 3 a 4 días.

Mediciones de densidad celular y viabilidad Se determinaron viabilidad celular y densidad de células viables utilizando el método de exclusión de Azul Triptano y un hemocitómetro (Hausser Scientific) .

Transfeccion estable y amplificación en metrotexato (MTX) Células CHO DXBll se co-transfectaron con cantidades iguales de ADN plásmido que codifica las cadenas ligeras y pesadas de igG humano (Tabla 6) . Se realizaron transíecciones utilizando reactivo Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo la recomendación de los fabricantes. Transíectantes estables se seleccionaron utilizando Medio de Selección de Transíectante (Tabla 4) .

Tabla 6 - Condiciones para una transfeccion típica de células CHO DXB 11 Recipiente Cantidad de Cantidad Cantidad de HC ADN de LC Lipofectamine ADN 2000 Matraz T75 o 15 µg 15 µg 30-75 plato de lOcm Células transfectadas se cultivaron por 2 días a 37"c y C02 al 5% en Medio de Crecimiento de Células Hospederas 1 ó 2 antes de iniciar el proceso de selección al reemplazar el Medio de Crecimiento con el Medio de Selección de Transfectante (Tabla 4) .

Durante el proceso de selección, el medio agotado se retira y reemplaza con medio fresco cuando sea necesario. Después de completarse el proceso de selección y las células transfectadas reanudan el crecimiento, las células fueron cualquiera de: - transferidas en el Medio de Selección de Transfectante (Tabla 4) que contiene diversos niveles de MTX (Calbiochem) para amplificación de genes de anticuerpo, o — subclonadas (ver a continuación) . En este caso, 12 clones de mejor producción se seleccionaron y recolectaron para mayor amplificación en MTX.

Clonación de célula sencilla A fin de seleccionar clones de una sola célula, células transfectadas en forma estable se revistieron en una cantidad apropiada de placas de 96 pozos de fondo plano a 0.5-1 célula por pozo. Durante el proceso, se supervisa bajo el microscopio el crecimiento y salud de las células. Células se cultivaron por aproximadamente dos semanas antes de selección de los clones de mejor producción por criba con ELISA.

Ensayo de Inmunoabsorción Ligado a una enzima (ELISA = Enzyme-linked Immunosorbent Assay) Los títulos de anticuerpo durante todas las etapas del desarrollo de línea celular se evaluaron con el equipo Human IgG ELISA Quantitation Kit (Bethyl Laboratories) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Brevemente, las placas Nunc Maxisorp ELISA se revistieron con anticuerpo policlonal IgG cabra antihumano específicas de Fe en salino amortiguado con fosfato (PBS) . Las placas se incubaron durante la noche a 42C. Al día siguiente, las placas se lavaron tres veces y bloquearon por 1 hora con leche descremada en polvo disuelta en el amortiguador de lavado. Después de una etapa de lavado, muestras y normas se pipetearon sobre las placas e incubaron a temperatura ambiente por 1 hora, seguido por tres lavados. Anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP) después se agrega a cada pozo y las placas se incubaron de nuevo a temperatura ambiente por 1 hora. Las placas se lavaron tres veces con amortiguador de lavado, y enjuagaron una vez con agua destilada y secaron con golpecitos . Sustrato que contiene tetrametilbenzidina (TMB) se agrega a cada pozo y se deja que se desarrolle el color por 15 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico y las placas se leyeron en un lector de placas (Bio- Rad, Molecular Dynamics, o Dynex Technologies) a 450 nm. Los datos se analizan con un paquete de programa suministrado con el lector de placas.

Expresión de anticuerpos recoxnbinantes de recolectados celulares transfectados en forma estable con ADNcs no optimizados El esquema de transfecciones (realizado de acuerdo con la Tabla 6) y designaciones de las células transfectadas se proporcionan en la Tabla 7.

Tabla 7 - Nombre de asignación para reservas transfectadas .

En general, se alcanzó una mejor expresión cuando células transfectadas se subclonaron después del proceso de selección, los clones se calificaron por producción de anticuerpo por ELISA y sólo las reservas de los 12 clones mejores productores se amplificaron en MTX. La amplificación de transíectantes selectos pero no subclonados dio por resultado reservas que exhiben menor productividad, aunque en más corto tiempo. Un esquema típico de amplificación MTX se muestra a continuación: Células selectas (OnM MTX) se transfirieron en paralelo a Medio de Selección de Transíectante que contiene 50 nM ó 100 nM MTX (Etapa 1) - Células recuperadas de la Etapa 1 se expandieron .y separaron en 200nM y 500nM MTX (Etapa 2) Células que han sobrevivido a la Etapa 2 se expandieron y sometieron a amplificación en 1000 nM MTX (Etapa 3 ) .

En cada etapa, se estimó la productividad de anticuerpo por ELISA (Tabla 8) .

Tabla 8 - Ejemplos de productividad de reservas no amplificadas y amplificadas de 12 mejores clones Reservas de 12 Nivel Niveles de expresión de mejores clones MTX anticuerpo después de 7 (nM) días de cultivo {µg/ml) RhDl 0 10.8 RhDl 50 5.66 Las reservas que producen los mejores títulos de anticuerpos se expandieron en matraces de cultivo de tejido en Medio de Selección de Transfectante (sin MTX y Geneticina y que contiene ba o FBS IgG bovino en lugar de FBS regular) . Los sobrenadantes de estos cultivos se recolectaron y emplearon para purificación de los anticuerpos.

Expresión de anticuerpos RhDl y RhD3 por poblaciones de células clónales transfectadas y amplificadas adaptadas a medio libre de suero.

Ya que los niveles de expresión de anticuerpo obtenidos de reservas de células (Tabla 8) todavía no eran tan altos como se deseaba, el proceso de transfección, selección y amplificación se llevó a cabo de nuevo, esta vez empleando una etapa de subclonación (como se describió con anterioridad) después de cada etapa de amplificación, además de después de la etapa de selección inicial, para obtener líneas celulares clónales (clones de una sola célula) que expresan niveles amplificados de anticuerpo anti-RhD.

Mas específicamente, células CHO DXB11 se transfectaron con plásmidos que codifican las cadenas pesadas y ligeras de cualquiera de RhDl o RhD3. Transfección y selección de células transfectadas en forma estable se llevaron a cabo esencialmente en la misma forma que se describió con anterioridad. Células transfectadas después se subclonaron, y los clones resultantes se cribaron para producción de anticuerpo. Se amplificaron las líneas celulares clónales más productivas. Después de amplificación, la células de nuevo se subclonaron y los clones más productivos, se sometieron a una ronda adicional de amplificación y subclonación. Los medios de selección y medios de amplificación empleados para la primera y segunda etapas de amplificación se citan en la Tabla 9.

Las líneas celulares clónales de mejor producción final (que se obtienen después de ambas rondas de amplificación) se adaptaron a crecimiento de suspensión en medio libre de suero comercial (IS CHO_CD4™, Irvine Scientific) . Esta tarea se realizó en cualquiera de los matraces de agitación o en botellas giratorias por siembra de las células en una mezcla 1:1 de medio de amplificación final (Tabla 9) y un medio libre de suero que contiene el mismo nivel de MTX, y después incrementar gradualmente la proporción del medio libre de suero sobre un período de cuatro a seis semanas hasta que las células fueron completamente capaces de crecer en medio libre de suero al 100%.

Las productividades máximas de. las líneas celulares clónales mejores productoras RhDl y RhD3 antes y después de la adaptación a medio libre de suero, se citan en la Tabla 9. Los sobrenadantes de estos cultivos de nuevo se recolectaron y emplearon para purificación de los anticuerpos.

Tabla 9 - Medio de amplificación y selección para cinco clones RhD selectos . Se incluyen datos de productividad antes y después de la adaptación a medio libre de suero.

Clon recombinante : Clon 1 RhDl Clon 6 RhDl Optimización de Gen: Si Si Medio de Selección: Medio de Medio de amplificación Selección de Selección de y selección. Transfectante Transfectante La Etapa de Medio de Medio de composición amplificación Selección de Selección de de medio de 1: Transfectante Transfectante selección de No. G418 No. G418 transfectante 300nM MTX 300nM MTX se cita en la Etapa de Medio de Medio de Tabla 4. amplificación Selección de Selección de 2 : Transfectante Transfectante No. G418 No. G418 2,400nM MTX 1, 200nM MTX Productividad Antes de 87 µg/ml 100 µg/ml de anticuerpo adaptación a medio libre de suero Después de 419 µg/ l 431 µ9/p?1 adaptación a medio libre de suero Clon recombinante : Clon 1 RhD3 Clon 4 RhD3 Optimización de Gen: No No Medio de Selección: Medio de Medio de amplificación Selección de Selección de y selección. Transfectante Transfectante La 20nM MTX 20nM MTX composición Etapa de Medio de Medio de de medio de amplificación Selección de Selección de selección de 1: Transfectante Transfectante transfectante No. G418 No. G418 se cita en la 200nM MTX 200nM MTX Tabla 4. Etapa de Medio de Medio de amplificación Selección de Selección de 2: Transfectante Transfectante No. G418 No. G418 800nM MTX 800nM MTX Productividad Antes de 128 µ?/???? 87 µg/ l de anticuerpo adaptación a medio libre de suero Después de 320 µg/ml 326 µg ml adaptación a medio libre de suero Purificación de anticuerpo El pH de los sobrenadantes de cultivo se ajustó a pH 7.2 con NaOH 1N. Cada sobrenadante se filtró a través de un filtro 0.2µ y cargó en una columna de proteína A pre-equilibrada en salino amortiguado con fosfato (PBS) . La columna se lavó con PBS para retirar todo el material no ligado del sobrenadante de cultivo. El anticuerpo ligado a la columna de proteína A se eluyó con glicina al 0.1 M (pH 2.5). El eluato se neutralizó con amortiguador Tris 2M ajustado a pH 8.0. El anticuerpo monoclonal que contiene el eluato se dializó contra PBS. La concentración de anticuerpo anti-RhD se determinó por ensayo¦ de aglutinación utilizando eritrocitos D positivos. La concentración de anticuerpo se determinó espectrofotomét.ricamente a 280 nm utilizando un valor de densidad óptica de 1.4 OD para una solución 1 mg/ml con. base en el coeficiente de extinción molar para anticuerpo monoclonal humano .

Cuantificación Anti-D por ensayo de hemaglutinación Los niveles de anticuerpo anti-RhD en los sobrenadantes y anticuerpo purificado se cuantificaron al medir la aglutinación de eritrocitos RhD positivo tratados con bromelina utilizando el sistema analizador Technicon como se describió previamente por Gunson et al., (H. H. Gunson, P. K. Phillips, y F. Stratton J. clin. Path. , 1972, 25, 198-205. Anticuerpos anti-RhD policlonales de NIBSC (2nd International standar 01/572) se emplearon como una norma.

Brevemente, glóbulos rojos RhD positivos tratados con bromelina se incuban con diversas concentraciones de anticuerpos anti-RhD. Se deja que las células aglutinen sobre un periodo de tiempo. Las células aglutinadas se retiran en el autoanalizador y el resto de los eritrocitos se lisan utilizando detergente. La densidad óptica de la hemoglobulina liberada se mide en forma espectrofotométrica . Las concentraciones anti-D de las muestras se calculan utilizando una gráfica estándar que se obtiene de diversas concentraciones de la norma Anti-D.

Ensayo de citometría de flujo Cada anticuerpo monoclonal anti-RhD humano se diluyó en serie 1 en 3 desde 0.5 mg/ml para preparar el total de 15 diluciones. Cada dilución se agregó a glóbulos rojos humanos RhD positivos o RhD negativos (RBCs) l-5xl05, con genotipos de otra forma apareados, pretratados con papa na para ser los componentes antigénicos de RhD más accesibles a los antídotos. Un anticuerpo IgG anti-humano etiquetado con isotiocianato de Fluoresceína (FITC) se utilizó como un anticuerpo secundario para teñir los anticuerpos ligados a RBCs .

Las muestras se analizaron en el instrumento FACSort (Becton-Dickinson) . La población RBC fue controlada basada en los parámetros de dispersión directa y lateral.

Fluorescencia de muestras RhD negativa se consideró como fondo, ya que estas células carecen del antígeno RhD que es blanco por anticuerpos anti-RhD. Células RhD negativas incubadas con una concentración particular de anticuerpo, por lo tanto sirvieron como un control negativo para células RhD positivas incubadas con la misma dilución de anticuerpo. La fluorescencia específica y el por ciento de células RhD positivas ligadas por el anticuerpo anti-RhD (y teñidas con IgG anti-humano etiquetado FITC) después se determinó, por cada dilución de anticuerpo anti-RhD, con base en la diferencia entre el nivel de fluorescencia entre las muestras RhD positivas y RhD negativas. Para cada anticuerpo anti-RhD, el porcentaje de células positivas ligadas por el anticuerpo se trazó contra el logaritmo de la concentración de anticuerpo, y EC50 se estimó de este diagrama. Esto proporciona información básica respecto a la afinidad de enlace y especificidad de los anticuerpos para el antígeno RhD.

Ensayo ADCC La efectividad de los anticuerpos anti-RhD para eliminar glóbulos rojos RhD-positivos in vivo, y de esta manera la utilidad de los anticuerpos para evitar inmunización de un individuo RhD-negativo expuesto a sangre RhD-positiva, se midió mediante un ensayo de toxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .

El ensayo ADCC se basó en el método descrito por Miescher ét al. (Britis Journal de Haematology 2000 111:157-166) . Eritrocitos RhD positivos se trataron con papa na y subsecuentemente etiquetaron con colorante fluorescente 5- (y 6) carboxifluoresceína diacetato sucinimidil éster. Los eritrocitos etiquetados fueron pre-incubados con concentraciones variantes (0.1-50 ng/ml) de anticuerpos anti-RhD por 1 hora. Células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se agregaron a la suspensión de eritrocitos e incubaron por 18 horas en un incubador de C02 a 37 grados C. La extensión de la lisis/objetivo al final del a incubación se determinó al medir la liberación del colorante de las RBCs lisadas en sobre nadante con un fluorómetro. El porcentaje de citotoxicidad se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula: % de lisis especifica = x100 r(½t - Cmed en donde Fcexp = fluorescencia de muestras FCdet = control de fluorescencia máximo (obtenido al lisar los RBCs con un detergente (1% Triton-Xl00) ) FCmed = control de fluorescencia de fondo (liberación espontánea del colorante de RBCs en la ausencia de PBMCs y anticuerpo) El porcentaje de citotoxicidad después se trazó contra el logaritmo de concentración de anticuerpo en el cual los eritrocitos se pre-incubaron, y estos datos se utilizaron para calcular la EC50, es decir la concentración efectiva del anticuerpo que provoca 50% de la lisis específica máxima que se alcanza por ese anticuerpo. A manera de ejemplo, la Figura 7 es un trazo de porcentaje de citotoxicidad contra concentración de anticuerpo generado de los resultados de un ensayo ADCC utilizando una norma NIBSC (anticuerpos policlonales anti-RhD) . Esta dependencia de respuesta de dosis teóricamente produce una curva sigmoide con una región media casi lineal. Para realizar una aproximación lineal en esta región, puede ajustarse una línea recta a los puntos de datos pertinentes por regresión lineal utilizando un paquete de programa conveniente, (tal como, por ejemplo, Microsoft Excel™) . La Figura 8, por ejemplo, es una regresión lineal realizada en los puntos de datos relevantes de la Figura 7. Una ecuación que representa esta línea recta puede entonces emplearse para calcular la EC50. Por ejemplo para los datos en la Figura 7, en donde la lisis específica máxima provocada por el anticuerpo policlonal estándar NIBSC fue aproximadamente de 88% en comparación con la lisis inducida por detergente (100%), la EC50 se calcula por el valor de lisis específico que iguala a 44%.

Resultados de ensayo ADCC y Hemaglutinación Los resultados de ensayo de hemaglutinación y ADCC, llevados a cabo de acuerdo con los procedimientos descritos anteriormente, se ilustran a continuación en la Tabla 10. Títulos de aglutinación se expresan como microgramos de anticuerpo activo (de enlace de antígeno RhD) por mg de proteína. Los valores EC50 se determinaron de dos experimentos independientes .

Tabla 9 - Títulos de aglutinación y valores EC50 para anticuerpos RhD 1, RhD3, y RhD4. Un anticuerpo policlonal de control (norma NIBSC) y dos lotes del anticuerpo monoclonal de control, se incluyen para comparación. mAb anti- 100.0 0.9 1.9 1.4 RhD de control lote No . 2 Norma 7.1 0.5 1.3 0.9 NIBS (Ab poli clonal anti-RhD) Clon 1 716.2 0.7 1.5 1.1 RhDl Clon 6 378.1 0.4 0.9 0.7 RhDl Clon 1 324.3 0.2 0.3 0.3 RhD3 Clon 4 275.3 0.1 0.2 0.2 RhD3 RhD4 303.3 0.1 0.5 0.3 Formulaciones Los anticuerpos anti-RhD monoclonales purificados pueden formularse para administración mediante cualquier ruta conveniente. Típicamente, los anticuerpos se administran por inyección. En estas circunstancias, el anticuerpo se formula típicamente como una suspensión líquida de los anticuerpos en una solución amortiguadora conveniente. Amortiguadores ejemplares incluyen: salino amortiguado con fosfato (amortiguador fosfato 20 mM (pH 6.8) que contiene NaCl 150 mM) ; y amortiguador de salino-glicina (glicina 0.3 M que contiene NaCl 0.15 M ajustada a pH 6.5) .

Formulaciones preferidas comprenden tanto anticuerpos monoclonales que tienen una región constante IgG 1 como anticuerpos monoclonales que tienen una región constante IgG 3. De esta manera, se prefieren formulaciones que comprenden anticuerpos RhDl (que son del isotipo IgG 1) en combinación con anticuerpos RhD3 (que son del isotipo IgG 3) y/o anticuerpos RhD4 (que consisten de la cadena pesada RhDlV3C y la cadena ligera RhDl) .

Claims (24)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal anti-RhD aislado, caracterizado porque comprende: a) una región variable de cadena pesada que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas, y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 2, y una región variable de cadena ligera que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 4; o b) una región variable de cadena pesada que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 6, y una región variable cadena ligera que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas, y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 8; o c) una región variable de cadena pesada que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas, y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 12.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: a) una región variable de cadena pesada que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 2 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras , segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 2, y una región variable cadena ligera que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 4 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas, y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 4; o b) una región variable de cadena pesada que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 6 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las primeras, segundas y terceras CDRs respectivas de SEQ ID NO: 6, y una región variable de cadena ligera que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 8 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idéntica o substancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 8; o c) una región variable de cadena pesada que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 10 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 10, y una región variable de cadena ligera que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 12 y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas o substancialmente idénticas a .las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 12.

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo comprende : una región variable de cadena pesada que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 2, y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 2; y una región variable de cadena ligera que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 4, y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 4.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 6, y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 6; y una región variable de cadena ligera que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 8, y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 8.

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el anticuerpo comprende: una región variable de cadena pesada que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 10, y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 10; y una cadena ligera región variable que es al menos 80% idéntica a la región variable de SEQ ID NO: 12, y tiene primeras, segundas y terceras CDRs que son idénticas a las respectivas primeras, segundas y terceras CDRs de SEQ ID NO: 12.

6. El anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, caracterizado porque las regiones variables respectivas son al menos 90% idénticas.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque las regiones variables respectivas son al menos 95% idénticas.

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las regiones variables respectivas son idénticas .

9. El anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente, caracterizado porque el anticuerpo comprende un dominio constante de cadena ligera y un dominio constante de cadena pesada.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada.

11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9 ó 10, caracterizado porque el dominio o región constante de cadena pesada es un dominio o región constante IgG.

12. El anticuerpo o fragmento de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el dominio o región constante IgG es un dominio o región constante IgG 1 o IgG 3.

13. Un polinucleótido aislado que codifica la cadena ligera y/o pesada de un anticuerpo de conformidad con cualquier reivindicación precedente.

1 . Un vector de expresión que incluye secuencias de codificación que codifican las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Un sistema de expresión que incluye secuencias de codificación, que codifican las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, el sistema de expresión se caracteriza porque comprende: un primer vector de expresión que incluye la secuencia de codificación que codifica la cadena ligera; y un segundo vector de expresión que incluye la secuencia de codificación que codifica la cadena pesada.

16. Una célula transformada con un vector de expresión o sistema de conformidad con la reivindicación 14 o 15.

17. La célula recombinante de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la célula es una célula de mamífero.

18. Un método para fabricar anticuerpos monoclonales , caracterizado porque comprende cultivar células recombinantes de acuerdo con la reivindicación 16 o 17, y recuperar el anticuerpo monoclonal del medio de cultivo.

19. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

20. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque la composición farmacéutica comprende un primer anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, y un segundo anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 , en donde el primer y segundos anticuerpos monoclonales son distintos entre sí.

21. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el primer anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada que comprende un dominio o región constante IgG 1, y el segundo anticuerpo monoclonal tiene una cadena pesada que comprende un dominio o región constante IgG 3.

22. Un método para inhibir o evitar inmunización de un paciente humano con RhD-negativo contra sangre RhD-positiva, que comprende administrar una cantidad profiláctica efectiva de un anticuerpo monoclonal de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21.

23. Un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o una composición farmacéutica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, para utilizar en un método para inhibir o evitar inmunización de un paciente humano con RhD-negativo contra sangre RhD-positiva .

24. Uso de un anticuerpo monoclonal de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en la fabricación de un medicamento para inhibir o evitar inmunización de un paciente humano con RhD-negativo contra sangre RhD-positiva.