CN116284358A - 特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白ntd表位的中和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白ntd表位的中和抗体及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种特异性结合特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体及其制备方法和应用。该中和抗体的重链CDR1包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸片段、重链CDR2包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸片段以及重链CDR3包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸片段；中和抗体的轻链CDR1包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸片段、轻链CDR2包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸片段以及轻链CDR3包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸片段。能特异性结合刺突蛋白上的NTD结构域，能够同时适用于新型冠状病毒和其突变株的感染防控，具有广谱性，中和活性也较高。

Description

特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中 和抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种特异性结合特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)是具有包膜的正链RNA病毒。SARS-CoV-2的基因组长为29.9kb，其基因组为单股、正链RNA，基因组的5’端带有帽子结构，其后包含6-10个开放阅读框(Open readingframes，ORFs)。占据基因组2/3的第一个阅读框编码复制酶，基因组的后1/3主要编码结构蛋白，一般包括纤突蛋白(Spike,S)、小包膜蛋白(Envelope,E)、囊膜蛋白(Membrance,M)、核蛋白(Nucleocapsid,N)。其中S蛋白是一种跨膜蛋白，且高度糖基化，由1273个氨基酸组成，N端有21-35个糖基化位点。S蛋白以三聚体的形式在病毒表面形成特殊的花冠结构，冠状病毒因此而得名。
中和抗体疗法是用于预防和治疗多种病原体感染的疾病的重要手段，开发新的SARS-CoV-2中和抗体临床意义重大。
发明内容
基于此，本申请的目的之一包括提供一种新的特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，为防治新型冠状病毒提供新的技术方案。
上述本申请目的的实现技术方案包括：
在本申请的第一方面，提供一种特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，所述中和抗体的重链CDR1包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸片段、重链CDR2包含如SEQ ID NO.2所示的氨基酸片段以及重链CDR3包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸片段；
所述中和抗体的轻链CDR1包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸片段、轻链CDR2包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸片段以及轻链CDR3包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸片段。
在本申请的一些实施方式中，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
(1)所述中和抗体的重链可变区如SEQ ID NO.7所示；和，
(2)所述中和抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.8所示。
在本申请的一些实施方式中，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述中和抗体的恒定区的种属来源为人；和，
2)所述中和抗体的恒定区为IgG1恒定区。
在本申请的一些实施方式中，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
(I)所述中和抗体的轻链恒定区如SEQ ID NO.9所示；和，
(II)所述中和抗体的重链恒定区如SEQ ID NO.10所示。
在本申请的第二方面，提供一种重组蛋白，所述重组蛋白包括在第一方面中定义的所述重链CDR1、所述重链CDR2、所述重链CDR3、所述轻链CDR1、所述轻链CDR2、所述轻链CDR3、重链可变区和所述轻链可变区中的一个或者多个。
在本申请的第三方面，提供一种检测试剂、检测试剂盒或者药物，包含第一方面中所述的中和抗体或者第二方面中所述的重组蛋白。
在本申请的第四方面，提供一种核酸，含有用于编码第一方面中所述的中和抗体或者第二方面中所述的重组蛋白的核酸片段。
在本申请的第五方面，提供一种重组表达载体，包含第四方面中所述的核酸。
在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体为抗体表达载体。
在本申请的一些实施方式中，所述载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其组合。
在本申请的一些实施方式中，所述重组表达载体为AbVec2.0-IGHG1和/或AbVec1.1-IGKC表达载体。
在本申请的第六方面，提供一种宿主细胞，包含第四方面中所述的核酸或者第五方面中所述的重组表达载体；
在本申请的一些实施方式中，所述宿主细胞为293T细胞或者Expi293F细胞。
在本申请的第七方面，提供第一方面中所述的中和抗体或者第二方面中所述的重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
培养第六方面中所述的宿主细胞，从所得培养物中分离抗体或者重组蛋白。
在本申请的第八方面，提供第一方面中所述的中和抗体或者第二方面中所述的重组蛋白在制备防治新型冠状病毒感染的药物中的应用。
相对于传统技术，本申请提供的上述技术方案至少具有如下的有益效果：
本申请提供的中和抗体，其包含特定的序列的CDRs，能够特异性地与新型冠状病毒或其突变株的刺突蛋白结合，具体是能特异性结合刺突蛋白上的NTD结构域，从而阻止病毒对细胞的感染，最终实现保护效果。并且，该中和抗体，能够同时适用于新型冠状病毒和其突变株的感染防控，具有广谱性，这一特性是现有结合NTD结构域的抗体所不具备的。同时，该中和抗体靶向性强，中和活性较高。整体上，本发明为预防和治疗新型冠状病毒感染提供了新的候选方案。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2中单克隆中和抗体的结合活性检测结果图；
图2为本发明实施例2中单克隆中和抗体对SARS-CoV-2突变毒株活病毒中和实验检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”、“多元”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，可选的数值分布在上述数值区间内视为连续，且包括该数值范围的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，在本文中，相当于直接列举了每一个整数，比如t为选自1～10的整数，表示t为选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9和10构成的整数组的任一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并这些范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，％(w/w)与wt％均表示重量百分比，％(v/v)指体积百分比，％(w/v)指质量体积百分数。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
本申请的第一方面
本申请提供一种特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，所述中和抗体的重链CDR1包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸片段、重链CDR2包含如SEQID NO.2所示的氨基酸片段以及重链CDR3包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸片段；
所述中和抗体的轻链CDR1包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸片段、轻链CDR2包含如SEQ ID NO.5所示的氨基酸片段以及轻链CDR3包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸片段。
抗体以及可变区
如本文所用，术语“抗体”或者“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
在本申请中，抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性、或者更多的多重特异性。
在本申请中，本申请的抗体还包括其保守性变异体，指与本申请抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。
本申请不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本申请还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
在本申请中，抗体包括用本领域技术人员熟知技术所制备的鼠的、嵌合的、人源化的或者全人的抗体。重组抗体，例如嵌合的和人源化的单克隆抗体，包括人的和非人的部分，可以通过标准的DNA重组技术获得，它们都是有用的抗体。嵌合抗体是一个分子，其中不同的部分来自不同的动物种，例如具有来自鼠的单克隆抗体的可变区，和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体(见例如美国专利4816567和美国专利4816397在此通过引用方式整体引入本文)。人源化的抗体是指来源于非人物种的抗体分子，具有一个或多个来源于非人物种的互补决定区(CDRs)和来源于人免疫球蛋白分子的框架区域(见美国专利5585089，在此通过引用方式整体引入本文)。这些嵌合和人源化的单克隆抗体可以采用本领域熟知的DNA重组技术制备。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类，主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
抗体的制备
本申请的抗体或其抗原结合片段的DNA分子的片段可以用常规技术，比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。一旦获得了有关的序列信息，就可以用重组法来大批量地获得有关序列片段。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列片段。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列片段，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本申请还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。优选的动物细胞包括(但并不限于)：CHO-S、HEK-293细胞。
通常，在适合本申请抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本申请的抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
在其中一些示例中，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
(1)所述中和抗体的重链可变区如SEQ ID NO.7所示；和，
(2)所述中和抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.8所示。
在其中一些示例中，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述中和抗体的恒定区的种属来源为人；和，
2)所述中和抗体的恒定区为IgG1恒定区。
在其中一些示例中，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
(I)所述中和抗体的轻链恒定区如SEQ ID NO.9所示；和，
(II)所述中和抗体的重链恒定区如SEQ ID NO.10所示。
本申请的第二方面
本申请提供一种重组蛋白，所述重组蛋白包括在第一方面中定义的所述重链CDR1、所述重链CDR2、所述重链CDR3、所述轻链CDR1、所述轻链CDR2、所述轻链CDR3、重链可变区和所述轻链可变区中的一个或者多个。
在其中一些示例中，所述重组蛋白还包括第一方面中定义的重链恒定区和轻链恒定区的组合。
在其中一些示例中，所述重组蛋白还可以包括协助所述重组蛋白表达和/或纯化的标签片段，这些标签片段包括但不限于6His标签。
本申请中，所述重组蛋白(或多肽)包括但不限于融合蛋白。
本申请中，所述重组蛋白可以为单体、二聚体、或多聚体。
本申请的第三方面
本申请提供一种检测试剂、检测试剂盒或者药物，包含第一方面中所述的中和抗体或者第二方面中所述的重组蛋白
本申请，“药物”泛指任何具有期望的生物活性，并具有反应性官能团以便制备本发明所述偶联物的化合物。期望的生物活性包括，诊断，治愈，缓解，治疗，预防人或其它动物的疾病。因此，只要具有必需的反应性官能团，术语“药物”涉及的化合物包括正式国家药典，以及例如美国正式同种疗法药典，正式全国处方集，或者其任何增补本等确认的药物。典型的药物列于医师案头用药参考(PDR)和美国食品药品监督管理局(FDA)的橙皮书。应理解，随着新型药物不断被发现和发展，这些药物也应纳入本发明所述偶联药物的中的“药物”。
本申请的第四方面
本申请提供一种核酸，含有用于编码在第一方面中提供的所述的中和抗体或者在第二方面中定义的所述的重组蛋白的核酸片段。
本申请的第五方面
本申请提供一种重组表达载体，包含第四方面中提供的所述的核酸。
可选地，所述重组表达载体为抗体表达载体。本申请对抗体表达载体不做特别限定，包括但不限于细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其组合。更进一步可选地，所述重组表达载体为AbVec2.0-IGHG1和/或AbVec1.1-IGKC表达载体。
本申请的第六方面
本申请提供一种宿主细胞，包含第四方面中提供的所述的核酸或者第五方面中提供的所述的重组表达载体。
在一些示例中，所述核酸可以整合到所述宿主细胞的基因组中。本申请对宿主细胞的种类不做特别限定。包括但不限于CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞和HEK293细胞。例如，所述宿主细胞为293T细胞或者Expi293F细胞。
本申请的第七方面
本申请提供利第一方面提供的所述的中和抗体或者第二方面提供的所述的重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
培养第六方面中提供的所述的宿主细胞，从所得培养物中分离抗体或其抗原结合片段或者重组蛋白。
本申请的第八方面
本申请提供第一方面所述的中和抗体或者第二方面所述的重组蛋白在制备防治沙贝病毒属病毒感染药物中的应用。
药物的定义参照上述第三方面。
本申请中，防治，包括预防、控制、辅助治疗等。
具体实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
实施例1、特异性结合新冠冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的单克隆中和抗 体的表达载体的构建、表达与纯化
本实施例制备的特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的单克隆中和抗体，其重链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的VHCDR1、如SEQ ID NO.2所示的VHCDR2和如SEQ ID NO.3所示的VHCDR3，其轻链可变区包含如SEQ ID NO.4所示的VLCDR1、如SEQID NO.5所示的VLCDR2和如SEQ ID NO.6所示的VLCDR3。
具体地，其重链可变区如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区如SEQ ID NO.8所示，轻链恒定区如SEQ ID NO.9所示，重链恒定区如SEQ ID NO.10所示。
SEQ ID NO.1：GFTFSDYY，
SEQ ID NO.2：ISSSGSTI，
SEQ ID NO.3：ARGGWELRSLAGGYYGMDV，
SEQ ID NO.4：QGIRNDL，
SEQ ID NO.5：AAS，
SEQ ID NO.6：LQHNSYPWT，
SEQ ID NO.7：
EVQLVESGGGLVKPGRSLRLSCAASGFTFSDYYMSWIRQAPGKGLEWVSYISSSGSTI YYADSVRGRFTISRDNAKNSLYLQMNTLRAEDTAVYYCARGGWELRSLAGGYYGMDV WGQGTTVTVSS，
SEQ ID NO.8：
DIVMTQTPFTLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKCLIYAASSLLSGV PSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCLQHNSYPWTFGQGTKLEIK，
SEQ ID NO.9：
TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO.10：
STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。
本实施例特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的单克隆中和抗体的制备方法包括如下步骤：
一、将含有编码单克隆中和抗体重链可变区(SEQ ID NO.7)和轻链可变区(SEQ IDNO.8)的核苷酸序列片段分别整合入含人IgG1抗体重轻链恒定区序列的AbVec2.0-IGHG1和AbVec1.1-IGKC(载体使用的参考文献Efficient generation of monoclonal antibodiesfrom single human B cells by single cell RT-PCR and expression vectorcloning.Tiller T,Meffre E,Yurasov S,Tsuiji M,Nussenzweig MC,Wardemann H.JImmunol Methods.2008Jan 1；329(1-2):112-24.Epub2007Oct 31.10.1016/j.jim.2007.09.017PubMed 17996249)中，得到能分别表达目标抗体的重链和轻链的重组表达载体。
二、细胞的转染、单克隆中和抗体的表达和纯化
1、细胞转染和单克隆中和抗体的表达
采用Gibco公司Expi293F表达系统，并按照说明书进行转染操作，步骤简述为：
将分别表达单克隆中和抗体的重链和轻链的两个重组表达载体DNA共30μg与转染试剂ExpiFectamineTM混合，室温放置20分钟，使其形成稳定的复合物；
随后加入至25.5mL已经调整浓度为2.9×106cells/mL的Expi 293F细胞培养液中；
于37℃、8％(v/v)CO2、125rpm摇床中培养20小时；
加入Expi293F表达系统所带的转染增强剂1和转染增强剂2；
继续置于37℃、8％(v/v)CO2、125rpm摇床中培养4天。
2、纯化
收集第1步制备的培养物，3000rpm离心15分钟收集细胞培养上清，用Genscript公司的Protein A磁珠进行抗体纯化。
纯化步骤简述为：
将Protein A磁珠与细胞培养上清混合，室温摇床结合4小时；
磁力架吸附磁珠，弃去细胞上清，用pH7.0 0.1％(v/v)Tween 20的1×PBS清洗磁珠5次；
用pH2.0 0.1M glycine的Elution buffer洗脱；
用pH8.5 1M Tris缓冲液平衡；
取平衡后的单克隆中和抗体进行脱盐处理以及进行DPBS溶剂置换。
纯化后的中和抗体置于-80℃冰箱中保存。
实施例2、特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体的功 能分析
1、实施例1制备的人源特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体与抗原的结合活性检测
采用ELISA方法测定单克隆中和抗体与SARS-CoV-2病毒和其突变株的刺突蛋白上NTD结构域结合的能力。
步骤简述为：
(1)用SARS-CoV-2刺突蛋白Spike上的NTD蛋白(Novoprotein，DRA45)每孔25ng，包被于ELISA酶标板上，以DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)为包被液，4℃过夜；
(2)10％(v/v)小牛血清的DPBS作为封闭液，37℃封闭2小时；加入系列梯度稀释后的实施例1制备的待检单克隆中和抗体，37℃孵育2小时；
(3)加入1:40000稀释的HRP-conjugated Goat anti-human IgG(H+L)antibody(Jackson ImmunoResearch)作为二抗，37℃孵育1小时；
(4)用TMB单组分显色液显色后，用2M硫酸终止反应，用酶标仪检测吸光度A450数值。
结果：
单克隆中和抗体与抗原的结合活性检测结果见图1，由图1可知，该单克隆中和抗体针对Spike蛋白中NTD结构域的结合活性为EC50＝14.55μg/mL。
2、人源特异性结合新型病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体对SARS-CoV-2和其突变毒株活病毒中和活性检测
SARS-CoV-2活病毒中和实验采用SARS-CoV-2活病毒野生型毒株(Wild Type，WT)SARS-CoV-2/human/CHN/IQTC01/2020、Alpha突变株、Beta突变株、Eta突变株、OmicronBA.1突变株和Omicron BA.1.1突变株进行。
步骤简述为：
将定量的SARS-CoV-2病毒和系列梯度稀释的单克隆中和抗体混合后，37℃孵育1小时，然后加入到预先铺好的Vero E6细胞的96孔板中，于37℃继续培养24小时；
细胞板经4％(v/v)多聚甲醛固定2小时后进行染色操作；
用0.2％(v/v)Triton X-100室温通透2分钟；
用Cross-reactive rabbit anti-SARS-CoV-N IgG(Sino Biological Inc)作为一抗37℃孵育1小时，标记病毒抗原；
用HRP-conjugated Goat anti-human IgG(H+L)antibody(JacksonImmunoResearch)作为二抗37℃孵育1小时；
用KPL TrueBlue Peroxidase substrates(SeraCare Inc)作为显色底物，显色5分钟；
用CTL ImmunoSpot S6 Ultra reader(Cellular Technology Ltd)扫板计算被染上的病毒抗原焦点数，并计算病毒中和活性(以EC50表示)。
结果：
单克隆中和抗体的活病毒中和实验检测结果见图2，由图2可知该单克隆中和抗体能够广谱地中和多种SARS-CoV-2病毒突变株，同时具有较好的中和活性(WT，3.388μg/mL；Alpha，3.531μg/mL；Beta，5.317μg/mL；Eta，3.827μg/mL；BA.1，1.401μg/mL；BA.1.1，2.881μg/mL)。
以上所述实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本申请的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (11)

1.一种特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，其特征在于，
所述中和抗体的重链CDR1包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸片段、重链CDR2包含如SEQID NO.2所示的氨基酸片段以及重链CDR3包含如SEQ ID NO.3所示的氨基酸片段；
所述中和抗体的轻链CDR1包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸片段、轻链CDR2包含如SEQID NO.5所示的氨基酸片段以及轻链CDR3包含如SEQ ID NO.6所示的氨基酸片段。
2.根据权利要求1所述的特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，其特征在于，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
(1)所述中和抗体的重链可变区如SEQ ID NO.7所示；和，
(2)所述中和抗体的轻链可变区如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求1或者2所示特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，其特征在于，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
1)所述中和抗体的恒定区的种属来源为人；和，
2)所述中和抗体的恒定区为IgG1恒定区。
4.根据权利要求1或者2所述的特异性结合新型冠状病毒或其突变株刺突蛋白NTD表位的中和抗体，其特征在于，所述中和抗体满足如下条件中的一个或者多个：
(I)所述中和抗体的轻链恒定区如SEQ ID NO.9所示；和，
(II)所述中和抗体的重链恒定区如SEQ ID NO.10所示。
5.一种重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白包括权利要求2中定义的所述重链CDR1、所述重链CDR2、所述重链CDR3、所述轻链CDR1、所述轻链CDR2、所述轻链CDR3、重链可变区和所述轻链可变区中的一个或者多个。
6.一种检测试剂、检测试剂盒或者药物，其特征在于，包含权利要求1至4任一项所述的中和抗体或者权利要求5所述的重组蛋白。
7.一种核酸，其特征在于，含有用于编码如权利要求1至4中任一项所述的中和抗体或者如权利要求5所述的重组蛋白的核酸片段。
8.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求7所述的核酸；
可选地，所述重组表达载体为抗体表达载体；
进一步可选地，所述载体选自细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其组合；
更进一步可选地，所述重组表达载体为AbVec2.0-IGHG1和/或AbVec1.1-IGKC表达载体。
9.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求7所述的核酸或者权利要求8所述的重组表达载体；
可选地，所述宿主细胞为293T细胞或者Expi293F细胞。
10.权利要求1至4任一项所述的中和抗体或者权利要求5所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
培养权利要求9所述的宿主细胞，从所得培养物中分离抗体或其抗原结合片段或者重组蛋白。
11.权利要求1至4任一项所述的中和抗体或者权利要求5所述的重组蛋白在制备防治新型冠状病毒感染的药物中的应用。
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