BR112016004768B1 - Moléculas de ligação com uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS IGM DE CADEIA CONSTANTE, BIESPECÍFICOS, PENTA E HEXAVALENTES MODIFICADOS. A presente invenção refere-se a moléculas de ligação com uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica, tais como, por exemplo, anticorpos IgM isolados com cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, e a métodos e meios para produção e uso dos mesmos. A invenção também se refere a moléculas de ligação multi-específicas com uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica, tais como, por exemplo, anticorpos IgM isolados com cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, e a métodos e meios para produção e uso dos mesmos.

Description

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação com a estrutura em anel penta ou hexamérica.

[0002] Em particular, a invenção refere-se a moléculas de ligação que têm uma estrutura de anel penta ou hexamérica compreendendo cinco ou seis unidades biespecíficas de ligação. Nas moléculas de ligação da presente invenção cada uma das unidades de ligação biespecíficas se liga a dois alvos diferentes de ligação ou regiões de ligação diferentes (por exemplo, epítopos) no mesmo alvo de ligação, e cada uma das cinco ou seis unidades biespecíficas de ligação têm as mesmas especificidades de ligação (ligação aos mesmos dois alvos de ligação). Em uma modalidade particular, a invenção diz respeito a anticorpos biespecíficos com estrutura penta- ou hexamérica, compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas.

[0003] Em um aspecto diferente, a invenção inclui moléculas de ligação compreendendo cinco ou seis unidades de ligação monoespecíficas, onde (i) cada uma das unidades de ligação monoespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada IgM cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ3 e Cμ4 conjugado com uma região de ligação ao um alvo de ligação, (ii) pelo menos duas das unidades de ligação monoespecíficas se ligam a alvos de ligação diferentes. A invenção inclui ainda moléculas de ligação compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, onde (i) cada uma das unidades de ligação biespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada IgM cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ3 e Cμ4 conjugado com uma região de ligação ao um alvo de ligação e (ii) pelo menos duas das unidades de ligação biespecíficas se ligam a alvos de ligação diferentes. Em uma modalidade particular, as moléculas de ligação são anticorpos IgM multiespecíficos.

Antecedentes da Invenção

[0004] Desde o advento de anticorpos humanizados, a utilização terapêutica de anticorpos, tais como Rituxan® (rituximabe), Herceptin® (trastuzumabe) e Avastinfi® (bevacizumabe), revolucionou o campo da medicina, incluindo oncologia, o tratamento de distúrbios inflamatórios, tais como artrite reumatóide e muitas outras indicações. Nos Estados Unidos, mais do que 30 anticorpos humanos ou humanizados foram aprovados para uso clínico, e mais de 600 novos anticorpos ou moléculas semelhantes a anticorpos estão em vários estágios de desenvolvimento. Alguns anticorpos têm a função de antagonista sobre as moléculas alvo solúveis, tais como o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) ou o factor de necrose tumoral (TNF), cujas acções são parte do processo patológico de uma doença. Alternativamente, os anticorpos podem ligar-se, bloquear e/ou induzir a destruição de células patológicas em determinadas doenças, tais como câncer. As principais funções destes anticorpos terapêuticos são de ligação através da região de Fab, e o recrutamento da função efetora através do domínio de Fe (que também medeia a meia-vida longa de anticorpos circulantes). Uma das grandes vantagens em comparação com os anticorpos de drogas de moléculas pequenas pode ser a sua excelente especificidade. Os anticorpos podem direcionar com muita precisão antígenos de proteína selecionados, tal como oncogenes, para a exclusão de homólogos muito semelhantes, permitindo que os perfis de segurança benignos. Assim, os anticorpos são bem caracterizado para a função de segmentação única específica.

[0005] Conforme o campo progrediu, a função de anticorpo foi melhorada através de meios criativos de engenharia de proteínas, tal como para proporcionar uma afinidade mais elevada, maior meia-vida e/ou uma melhor distribuição do tecido, bem como a combinação de tecnologias de pequenas e grandes moléculas para maior enfoque da destruição das células através de entrega de carga tóxica (por exemplo, conjugados anticorpo-droga). Outra abordagem para melhorar a função dos anticorpos tira vantagem da ligação bivalente da estrutura de imunoglobulina G (IgG), que permite que uma molécula de IgG se ligue a dois antígenos. Na verdade, em certas aplicações, existe um bom potencial para anticorpos assimétricos exercerem funções úteis simultaneamente ligando dois antígenos alvo. Para endereçar esta necessidade, uma variedade de construções foi produzida para produzir uma única molécula que se possa ligar a dois antígenos diferentes, permitindo funções nunca antes vistas na natureza. Um exemplo dessa a abordagem biespecífica é "blinatumumabe" (MT103) que liga os receptores CD3 e CD19 em células T e B, respectivamente. Esta amarração de uma célula T citotóxica para uma célula B cancerosa permite o tratamento eficaz de leucemia de células-B.

[0006] No entanto, continua a haver dificuldades técnicas significativas na construção, expressão e produção de anticorpos biespecíficos. Embora os anticorpos biespecíficos sejam considerados como agentes terapêuticos promissores, devido à sua capacidade de se ligar simultaneamente a dois antígenos diferentes, a sua utilidade é limitada devido a problemas com a estabilidade e complexidade de fabricação.

[0007] Várias formas de engenharia de proteínas têm sido usadas para combinar cadeias pesadas heterólogas, além de correspondência de pares adequados de cadeias pesadas e leves para produzir eficientemente uma IgG biespecífica. Além disso, vários formatos de anticorpos biespecíficos, incluindo quadromas, heteroconjugados químicos, construtos recombinantes utilizando domínios de heterodimerização selecionados e construtos recombinantes de tamanho mínimo que consistem de dois sítios mínimos de ligação ao antígeno.

[0008] No entanto, todos estes esforços têm sido repletos de dificuldades.

[0009] Assim, apesar dos esforços dirigidos para o desenvolvimento de anticorpos biespecíficos terapêuticos, continua a haver uma grande necessidade de desenvolvimento de plataformas mais eficientes que podem levar a uma produção mais eficiente e flexível de anticorpos bi- e multiespecíficos, encurtando, assim, a linha de tempo entre a descoberta e introdução clínica de tais terapêuticas e permitindo a concepção e produção de novos tipos de formatos de anticorpo com múltiplas especificidades e/ou valências.

Sumário da Invenção

[00010] A presente invenção refere-se a moléculas de ligação com uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica, tais como, por exemplo, anticorpos IgM isolados com cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, e a métodos e meios para produção e uso dos mesmos.

[00011] Em um aspecto, uma molécula de ligação com uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica, caracterizada pelo fato de que compreende cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, em que cada uma das unidades de ligação biespecíficas tem as duas especificidades de ligação e compreende uma primeira cadeia compreendendo pelo menos um domínio Cμ4 de uma região constante de cadeia pesada de IgM conjugada a uma primeira região de ligação a um primeiro alvo de ligação, e uma segunda cadeia compreendendo pelo menos um domínio Cμ4 de uma região constante de cadeia pesada de IgM e uma segunda região de ligação a um segundo alvo de ligação, em que os primeiro e segundo alvos de ligação são diferentes, e em que as primeira e segunda cadeias são agregadas para criar uma unidade de ligação biespecífica como resultado de uma interface assimétrica criada entre suas respectivas regiões contantes de cadeia pesada da IgM.

[00012] Em uma modalidade, as unidades de ligação biespecíficas são idênticos.

[00013] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação compreende ainda uma cadeia de IgM J.

[00014] Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação tem uma estrutura em anel pentamérica.

[00015] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação tem uma estrutura em anel hexamérica.

[00016] Em ainda uma outra modalidade, a primeira e segunda cadeias compreendem ainda um domínio Cμ3 de uma região constante de cadeia pesada de IgM.

[00017] Em uma outra modalidade, a primeira e segunda cadeias compreendem ainda um domínio Cμ2 de uma região constante de cadeia pesada de IgM.

[00018] Em outras modalidades, o primeiro e segundo alvos de ligação são selecionados a partir de peptídeos, polipeptídios, glicoproteínas, moléculas de ácidos nucleicos e moléculas pequenas orgânicas e não orgânicas, incluindo, sem limitação, os polipeptídios solúveis, receptores de superfície celular, ligantes, transportadores moleculares, enzimas e substratos de enzimas.

[00019] Em ainda outra modalidade, os primeiro e segundo alvos de ligação são dois sítios no mesmo alvo solúvel, dois sítios no mesmo alvo de receptor de superfície celular, dois alvos solúveis diferentes, dois alvos de receptor de superfície celular, um alvo solúvel e um alvo de receptor de superfície celular, um alvo solúvel ou de receptor de superfície celular e um alvo de longo tempo de permanência, um alvo solúvel e uma proteína de matriz ou alvo de substrato, um alvo solúvel ou de receptor e um alvo de transportador molecular, ou dois tipos celulares diferentes.

[00020] A conjugação das regiões de ligação ao resto da molécula pode ter lugar por fusão. Assim, por exemplo, a primeira e segunda regiões de ligação podem ser fundidas com o terminal N da primeira e da segunda regiões constantes de cadeia pesada de IgM, respectivamente.

[00021] Em uma modalidade particular, a primeira e segunda regiões de ligação são as regiões variáveis de um anticorpo.

[00022] Em uma outra modalidade, o primeiro e segundo alvos de ligação são dois antígenos diferentes.

[00023] Em ainda outra modalidade, o primeiro e segundo alvos de ligação são epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[00024] Noutras modalidades, a primeira e segunda regiões de ligação podem ser duas regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo diferentes, se ligando a dois alvos de ligação, ou a diferentes epítopos no mesmo alvo de ligação.

[00025] Nas moléculas de ligação da presente invenção as regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo podem ser a partir de um anticorpo de IgG, IgA, IgE, e/ou IgM, de preferência a partir de um anticorpo de IgM. De preferência, as moléculas de ligação são aqui moléculas biespecíficas de IgM, que podem compreender ainda, mas não necessariamente, pelo menos uma sequência de região variável de cadeia leve de IgM associada com uma das duas regiões variáveis de cadeia pesada de IgM diferentes.

[00026] Em uma modalidade particular, nas moléculas de ligação da presente invenção pelo menos algumas das interfaces assimétricas entre as regiões constantes de cadeia pesada de IgM das duas cadeias de uma unidade de ligação são criadas por uma ponte de sal formada por trocas em pares entre resíduos de aminoácidos com cargas opostas em pelo menos um dos domínios Cμ2, Cμ3 e/ou Cμ4 das duas cadeias da referida unidade de ligação.

[00027] Assim, uma ponte de sal pode ser formada entre, pelo menos, um dos domínios Cμ2-Cμ2, Cμ4-Cμ4, e Cμ2-Cμ3-Cμ4 das duas cadeias de uma unidade de ligação.

[00028] Em uma modalidade, as trocas em pares são selecionadas a partir do grupo que consiste em E ^ K, K ^ E; R ^ E, E ^ R; D ^ K, K ^ D; e R ^ D, D ^ R.

[00029] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação pode compreender, pelo menos, uma troca em par de resíduo de aminoácido carregada nos domínios Cμ4-Cμ4, em que a troca pode ser, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo que consiste em R328E, DθE339R, K; R344E, DθS330R, K; K376E, DθE385R, K; R427E, DθE339R, K; e T354E, DθI397R, K.

[00030] Em uma outra modalidade, pelo menos uma troca em pares de aminoácido carregada entre os domínios Cμ2-Cμ2, e pode, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo que consiste em E167R, K >K177E, D e K169E, DθE170R, K.

[00031] Em ainda uma outra modalidade, pelo menos uma troca em pares de resíduo de aminoácidos é carregada nos domínios Cμ2-Cμ3- Cμ4, e pode, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo que consiste em D121K, R >K315D, E; K150E, DθE385K, R; e K185D, EθD360K, R.

[00032] Em uma outra modalidade, nas moléculas de ligação da presente invenção pelo menos algumas das interfaces assimétricas entre as regiões constantes de IgM de cadeia pesada das duas cadeias de uma unidade de ligação são criadas através de conexões knobs-into- holes, as quais podem, por exemplo , ser criadas por mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em knobs: T350 ^ Y, F, W; e H395 ^ Y, F; e buracos: L352> G,A,V,I,M,S,T; H395^A,V,I,L,M,F,Y; F393—W,Y; I397—— A,V,S,T; T350—>S,A,V; e T348——S.

[00033] Em uma modalidade específica, nas moléculas de ligação da presente invenção as sequências de região variável de cadeia leve, se presentes, são acopladas à sua região variável de cadeia pesada correspondente, criando uma interface assimétrica entre as cadeias leve e pesada.

[00034] Em outras modalidades, a interface assimétrica é criada por técnica CrossMab, acoplamento knobs-into-holes e/ou acoplamento de pontes salinas.

[00035] As moléculas de ligação da presente invenção podem compreender uma cadeia leve ordinária e/ou podem ser conjugadas a uma toxina ou um agente quimioterapêutico. De preferência, a conjugação é através de fusão, mas a conjugação através de um ligante químico também está incluída no âmbito da invenção.

[00036] As moléculas de ligação aqui podem ser anticorpos biespecíficos com uma estrutura penta- ou hexamérica, que podem ser quiméricas ou humanizadas.

[00037] Em um aspecto diferente, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo pelo menos cerca de 70%, ou, pelo menos, 80%, ou pelo menos 90% ou pelo menos 95%, de pelo menos 98%, ou, finalmente, 99% da molécula de ligação como aqui definida acima.

[00038] Em uma modalidade particular, a composição é uma composição farmacêutica.

[00039] A presente invenção ainda diz respeito a uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica que compreende cinco ou seis unidades de ligação monoespecíficas, em que (i) cada uma das unidades de ligação monoespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM, cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ3 e Cμ4 conjugado a uma região de ligação a um alvo de ligação, (ii) pelo menos duas das unidades de ligação monoespecíficas que se ligam a diferentes alvos de ligação, e (iii) uma interface assimétrica externa é criada entre as regiões constantes de cadeia pesada das unidades de ligação monoespecíficas vizinhas que se ligam a diferentes alvos de ligação.

[00040] Em uma modalidade, pelo menos três das unidades de ligação monoespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação.

[00041] Em uma outra modalidade, pelo menos quatro das referidas unidades de ligação monoespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação.

[00042] Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação tem uma estrutura em anel pentamérica e todas as cinco unidades de ligação monoespecíficas se ligam a diferentes alvos.

[00043] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação tem uma estrutura em anel hexamérica e pelo menos cinco das referidas unidades de ligação monoespecíficas se ligam a diferentes alvos.

[00044] Em ainda outra modalidade, todas as seis unidades de ligação monoespecíficas se ligam a diferentes alvos.

[00045] Em um outro aspecto, a invenção diz respeito a uma molécula de ligação multiespecífica que possui uma estrutura em anel penta ou hexamérica compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, onde (i) cada uma das unidades de ligação biespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM, cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ3 e Cμ4 conjugado com uma região de ligação a um alvo de ligação, (ii) pelo menos duas das unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação, (iii) uma interface assimétrica interna é criada entre duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM de cada unidade de ligação biespecífica e (iv) uma interface externa assimétrica é criada entre as regiões constantes de cadeia pesada das unidades de ligação biespecíficas vizinhas que se ligam a diferentes alvos.

[00046] Em uma modalidade, pelo menos três das unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação.

[00047] Em uma outra modalidade, pelo menos quatro das referidas unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação.

[00048] Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação tem uma estrutura em anel pentamérica e todas as cinco unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos.

[00049] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação tem uma estrutura em anel hexamérica e pelo menos cinco das referidas unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos.

[00050] Em ainda outra modalidade, todas as seis unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos.

[00051] Em uma modalidade diferente, a molécula de ligação multiespecífica compreende ainda uma cadeia de IgM J.

[00052] Em várias modalidades a molécula de ligação multiespecífica pode ter uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica.

[00053] Independentemente do número e natureza das especificidades de ligação das moléculas de ligação multiespecíficas da presente invenção, as seguintes modalidades específicas se aplicam:

[00054] Em uma modalidade, em pelo menos uma das unidades de ligação as regiões constantes de cadeia pesada de IgM compreendem ainda um domínio Cμ2. Em ainda outra modalidade, em todas as unidades de ligação as regiões constantes de cadeia pesada de IgM compreendem ainda um domínio Cμ2. Em várias modalidades, as moléculas de ligação multiespecíficas da presente invenção podem ligar-se aos alvos selecionados a partir de peptídeos, polipeptídeos, glicoproteínas, moléculas de ácidos nucleicos e moléculas pequenas orgânicas e não orgânicas de ligação.

[00055] Em outras modalidades, as moléculas de ligação multiespecíficas da presente invenção ligam-se a alvos de ligação selecionados a partir de polipeptídios solúveis, receptores de superfície celular, ligantes, transportadores moleculares, enzimas e substratos de enzimas de ligação.

[00056] Em outras modalidades, as moléculas de ligação multiespecíficas da presente invenção que se ligam a diferentes alvos são selecionadas do grupo consistindo em unidades de ligação que se ligam a sítios no mesmo alvo solúvel; sítios no mesmo alvo de receptor de superfície celular; diferentes alvos solúveis; diferentes alvos de receptor de superfície celular; alvos solúveis e de receptor de superfície celular; alvos solúveis ou de receptor de superfície celular e de longo tempo de permanência; alvos solúveis e de proteína de matriz ou de substrato; alvos solúveis ou de receptor e de transportador molecular, e diferentes tipos celulares.

[00057] Em uma modalidade particular, nas unidades de ligação dentro das moléculas de ligação da presente invenção a conjugação entre as regiões constantes de cadeia pesada de IgM e a região de ligação a um alvo de ligação é por fusão. Assim, por exemplo, as regiões de ligação podem ser fundidas ao terminal N das regiões constantes de cadeia pesada de IgM.

[00058] Em uma modalidade, pelo menos uma das regiões de ligação é uma região variável de um anticorpo.

[00059] Em uma outra modalidade, todas as regiões de ligação são regiões variáveis de cadeia pesada de anticorpo.

[00060] Em ainda outra modalidade, pelo menos dois alvos de ligação são diferentes antígenos.

[00061] Em uma outra modalidade, pelo menos dois alvos de ligação são epítopos diferentes no mesmo antígeno.

[00062] Em todos os aspectos e modalidades as regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo podem ser de IgG, IgA, IgE, ou IgM, de preferência a partir de um anticorpo de IgM.

[00063] Em uma modalidade preferencial, a molécula de ligação multiespecífica da presente invenção é um anticorpo de IgM de multiespecífico.

[00064] Em uma modalidade, o anticorpo de IgM multiespecífico da presente invenção compreende ainda, pelo menos, uma sequência de cadeia leve da região variável de IgM associada com uma região variável de cadeia pesada de IgM em pelo menos uma das unidades de ligação.

[00065] Noutra modalidade, o anticorpo multiespecífico de IgM compreende ainda uma cadeia leve de sequência da região variável de IgM associada com cada uma das regiões variáveis de cadeia pesada de IgM.

[00066] Em todos os aspectos e modalidades, a interface externa assimétrica é criada por alteração dentro do domínio Cμ3. Em uma modalidade, a alteração é criada por uma ponte de sal formada por trocas em pares entre os resíduos de aminoácidos com carga oposta no domínio Cμ3.

[00067] Em várias modalidades, a ponte de sal proporcionando a interface assimétrica externa é formada por pelo menos uma troca em pares de resíduo de aminoácido carregada nos domínios Cμ3-Cμ3, que podem, por exemplo, ser K238 θ D293 ou K268 θ D294 nas cadeias μ vizinhas.

[00068] Em todos os aspectos e modalidades, nas moléculas de ligação multiespecíficas, por exemplo, anticorpos multiespecíficos de IgM da presente invenção, as interfaces assimétricas internas são criadas por uma ponte de sal formada por trocas em pares entre os resíduos de aminoácidos com carga oposta em pelo menos um dos domínios Cμ2, Cμ3 e/ou Cμ4.

[00069] Em uma modalidade, uma ponte de sal é formada entre pelo menos um dos domínios Cμ2-Cμ2, Cμ4-Cμ4 e Cμ2-Cμ3-Cμ4 das duas cadeias da referida unidade de ligação.

[00070] Em outra modalidade, as trocas em pares são selecionadas a partir do grupo que consiste em E ^ K, K ^ E; R ^ E, E ^ R; D ^ K, K ^ D; e R ^ D, D ^ R.

[00071] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação multiespecífica, o anticorpo de IgM multiespecífico, por exemplo, compreende pelo menos uma troca em pares de resíduos de aminoácidos carregados nos domínios Cμ4-Cμ4, que podem, por exemplo, ser selecionada a partir do grupo constituído por R328E, DθE339R, K; R344E, DθS330R, K; K376E, DθE385R, K; R427E, DθE339R, K; e T354E, DθI397R, K.

[00072] Em ainda outra modalidade, a molécula de ligação multiespecífica, o anticorpo de IgM multiespecífico, por exemplo, compreende pelo menos uma troca em pares de aminoácido carregada entre os domínios Cμ2-Cμ2, que podem, por exemplo, ser selecionados a partir do grupo que consiste em E167R,KθK177E,D e K169E, DθE170R,K.

[00073] Em uma outra modalidade, a molécula de ligação multiespecífica, o anticorpo de IgM multiespecífico, por exemplo, compreende pelo menos uma troca em pares de resíduo de aminoácido carregada nos domínios Cμ2-Cμ3-Cμ4, que podem, por exemplo, ser selecionados a partir do grupo que consiste em D121K,RθK315D,E; K150E,DθE385K,R; e K185D,EθD360K,R.

[00074] Em todos os aspectos e modalidades, pelo menos algumas das interfaces assimétricas externas e/ou internas entre as regiões constantes de cadeia pesada de IgM podem ser criadas através de ligações knobs-into-holes. Por exemplo, pelo menos uma conexão knobs-into-holes pode ser criada por mutações selecionadas a partir do grupo que consiste em knobs: T350 ^ Y, F, W; e H395 ^ Y, F; e buracos: L352> G,A,V,I,M,S,T; H395^A,V,I,L,M,F,Y; F393>W,Y; I397> A,V,S,T; T350>S,A,V; e T348>S.

[00075] Nos anticorpos de IgM multiespecíficos que compreendem uma sequência de região variável de cadeia leve as sequências de região variável de cadeia leve tal podem ser acopladas às suas regiões variáveis de cadeia pesada correspondentes, criando uma interface assimétrica entre as cadeias leve e pesada. Em várias modalidades, a interface assimétrica pode ser criada por técnica CrossMab, acoplamento knobs-into-holes e/ou acoplamento de pontes salinas. Em uma outra modalidade, as unidades de ligação da molécula de ligação multiespecífica compreendem uma cadeia leve comum.

[00076] Em todos os aspectos e modalidades, a molécula de ligação multiespecífica pode ser conjugada com uma toxina ou um agente quimioterapêutico, em que a conjugação pode, por exemplo, ser através de fusão e/ou através de um ligante químico.

[00077] Os anticorpos IgM multiespecíficos da presente invenção podem ser quiméricos ou humanizados.

[00078] Em um aspecto adicional, a invenção diz respeito a uma composição compreendendo pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99 % de uma molécula de ligação multiespecífica deste documento. A composição pode, por exemplo, ser uma composição farmacêutica, compreendendo pelo menos um ingrediente farmaceuticamente aceitável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00079] A FIG. 1 ilustra a estrutura de um pentâmero de IgM, que compreende uma cadeia J, em que as cadeias A e B são idênticas em IgM nativa.

[00080] A FIG. 2A ilustra uma molécula de IgM de cinco membros com duas especificidades de ligação, em que as cadeias pesadas (μ) designadas como A e B são diferentes.

[00081] A Fig.2B ilustra um anticorpo de IgM multiespecífico, composto por cinco ou seis unidades de ligação monoespecíficsa, em que (i) cada uma das unidades de ligação monospecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM, cada qual compreendendo pelo menos um domínio Cμ4 conjugado a uma região de ligação a uma ligação alvo, (ii) pelo menos duas das unidades de ligação monoespecíficas se ligam a alvo de ligação diferente.

[00082] A FIG. 2C ilustra um anticorpo multiespecífico de IgM compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, em que (i) cada uma das unidades de ligação biespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM, cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ4 conjugado com uma região de ligação a um alvo de ligação e (ii) pelo menos duas das unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação.

[00083] A FIG. 3 é um modelo estrutural das cadeias pesadas A e B de uma molécula de IgM, tal como publicado em Czajkowsky DM, Shao Z, PNAS 2009; 106: 14960-14965.

[00084] A FIG. 4A mostra o alinhamento dos domínios CG1, CE1 e CM1constant de IgG1, IgE e IgM humanas, respectivamente.

[00085] A FIG. 4B mostra o alinhamento dos domínios constantes CE2 e CM2 de IgE e IgM humanas, respectivamente.

[00086] A FIG. 4C mostra o alinhamento dos domínios constantes CG2, CE3 e CM3 de IgG1, IgE e IgM humanas, respectivamente.

[00087] FIG. 4D mostra o alinhamento dos domínios constantes CG3, CE4 e CM4 de IgG, IgE e IgM humanas, respectivamente.

[00088] Nas Figs 4A-4D: sequência de IgE humana está no GenBank J00222.1; numeração de resíduo a partir de PDB 2WQR; atribuições de folha (s) e hélice (h) a partir de APO 2WQR; sequência de IgG1 humana é do GenBank J00228.1; numeração de resíduo a partir de PDB 1OQO; atribuições de folha (s) e hélice (h) a partir de APO 1OQO; sequência de IgM humana é do GenBank X14940.1; a numeração de resíduo é sequencial desde o início do domínio CM1; variância relatada em sequências de IgM humana observado abaixo cd sequência de IgM para GenBank CAB37838.1, CAC20458.1, AFM37312.1, X57331.1 e J00260.1

[00089] A FIG. 5 mostra a estrutura de hetero-monômeros preparada no Exemplo 1.

[00090] A FIG. 6 mostra um gel de SDS-PAGE não reduzido do tipo selvagem e pares de IgM Fc projetados 2a e 2b.

[00091] Rota 1: Rtx:Fc de tipo selvagem.

[00092] Rota 2: Uma mistura de Rtx2a:Fc2b, onde Rtx2a é composto por uma cadeia μ para região Vh de Rituxan (anti-CD20) quimérica fundida com CM1 a CM4 de cadeia μ humana com mutações C291S, T350Y, T354E, e I397E e deleção de tailpiece; e Fc2b é cadeia μ humana CH2 a CH4 e com mutações C291S, L352S, T354K, H395V, e I397K e deleção de pedaço da cauda.

[00093] Rota 3: uma mistura de Rtx2b:Fc2a, onde Rtx2b é composto por uma cadeia μ para da região Vh de Rituxan (anti-CD20) quimérica fundida com CM1 s CM4 de cadeia mu humana com mutações C291S, L352S, T354K, H395V e I397K e deleção de tailpiece; e Fc2a consiste em uma região CH2 a CH4 de cadeia μ humana com mutações C291S, T350Y, T354E e I397E e deleção de pedaço da cauda. A seta indica heterodímero.

[00094] A FIG. 7 mostra um gel SDS-PAGE reduzido de tipo selvagem e pares de IgM Fc projetados 1a e 2b, em que as designações são as mesmas que na FIG. 6.

[00095] A FIG. 8 mostra um gel não redutor SDS-PAGE de tipo selvagem e de pares IgM Fc projetados:

[00096] Rota 1: Okt:Fc de tipo selvagem. Okt, composto de OKT3 (anticorpo anti-CD3) scFv fundido com cadeia μ humana CM2 a CM4.

[00097] Rota 2: uma mistura de Okt2a:Fc2b, onde Okt2a é composto de OKT3 (anti-CD3) scFv fundido com cadeia μ humana CM2 a CM4 com mutações C291S, T350Y, T354E e I397E e deleção de tailpiece;

[00098] Rota 3: uma mistura de Okt2b:Fc2a, onde Okt2b é composto de OKT3 (anticorpo anti-CD3) scFv fundido com cadeia μ humana CM2 a CM4 com mutações C291S, L352S, T354K, H395V e I397K e deleção de peça cauda. A seta indica heterodímero.

[00099] Rotas 4-6: Combinação Okt:Rtx de tipo selvagem; Combinação projetada Okt2a:Rtx2b; e combinação Okt2b:Rtx2a, onde Rtx2a é composto por uma cadeia μ para região Vh de Rituxan (anti- CD20) quimérica fundida com cadeia μ humano CM1 a CM4 com mutações C291S, T350Y, T354E e I397E e deleção de tailpiece, e Rtx2b é composto por uma cadeia μ para região Vh e Rituxan (anti-CD20) quimérica fundida com cadeia mu humana CM1 a CM4 com mutações C291S, L352S, T354K, H395V e I397K e deleção de tailpiece. A seta indica heterodímero.

[000100] A FIG. 9 mostra amostras reduzidas em gel SDS-PAGE de transfectantes de células 293F dos mesmos construtos como mostrados na FIG. 8.

[000101] A FIG. 10 ilustra como quatro pontes salinas na região Cμ3 estabilizam duas cadeias vizinhas (AB) μ em torno de uma ponte de dissulfureto em uma molécula de ligação multiespecífica da presente invenção.

[000102] Tabela A lista resíduos de interface de domínio CM4 de IgM humana nas posições knob-in-the-hole e para potenciais introduções de carga.

[000103] Tabela B enumera os resíduos de interface de domínio CM4 de IgM humana para potenciais comutações de carga.

[000104] A Tabela C enumera os resíduos de interface de domínio CM2 de IgM humana para potenciais introduções de carga.

[000105] A Tabela D enumera os resíduos de interface de domínio CM2 de IgM humana em posições knobs-holes.

[000106] A Tabela E enumera os resíduos de interface de domínio CM2 de IgM humana para potenciais comutações de carga.

[000107] A Tabela F apresenta resíduos de interface de domínios CM2, CM3 e CM4 de IgM humana para trocas de carga.

Descrição Detalhada da Invenção I. Definições

[000108] O termo "anticorpo" inclui anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos de comprimento completo que tenham uma região Fc de imunoglobulina), moléculas de cadeia simples, bem como fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv). O termo "imunoglobulina" (Ig) é usado permutavelmente com "anticorpo" neste documento. A unidade de anticorpo de 4 cadeias básica é uma glicoproteína heterotetramérica composta por duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas.

[000109] No caso de IgG, a unidade 4 de cadeias é geralmente de cerca de 150.000 daltons. Cada cadeia L está ligada a uma cadeia H por uma ligação de dissulfeto covalente, enquanto as duas cadeias H estão ligadas entre si por uma ou mais ligações de dissulfeto dependendo do isotipo de cadeia H. Cada cadeia H e L também tem pontes de dissulfeto intracadeia regularmente espaçadas. Cada cadeia H tem, no N-terminal, um domínio variável (VH), seguido por três domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e Y e quatro domínios CH para isotipos μ e ε. Cada cadeia L tem, no terminal N, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante em sua outra extremidade. O VL está alinhado com o VH e o CL está alinhado com o primeiro domínio constante de cadeia pesada (CH1). Os resíduos de aminoácidos específicos são considerados formar uma interface entre os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada. O emparelhamento de um VH e VL em conjunto forma um único sítio de ligação ao antígeno.

[000110] IgM forma polímeros múltiplos, onde imunoglobulinas estão covalentemente ligadas entre si por ligações de dissulfureto. IgM existe principalmente como um pentâmero, mas também como um hexâmero e, por conseguinte, contém 10 ou 12 sítios de ligação a antígeno. A forma pentamérica contém opcionalmente um polipeptídio adicional, chamado cadeia J, mas também pode ser feita na ausência de cadeia J. A molécula de IgM pentamérica tem um peso molecular de aproximadamente 970 kDa. Devido à sua natureza polimérica, IgM possui uma avidez elevada e é particularmente eficaz na ativação do complemento. Ao contrário de IgG, a cadeia pesada em monômeros de IgM é composta de quatro domínios constantes e um variável. Os domínios constantes de IgM são aqui designados como CM1 ou Cμ1, CM2 ou Cμ2, CM3 ou Cμ3, e CM4 ou Cμ4, em que as designações de "CM" e Cμ "são utilizadas alternadamente.

[000111] Existem anticorpos de IgA em uma forma monomérica, mas também podem polimerizar. Na sua forma secretora IgA compreende 25 das unidades básicas de 4 cadeias ligadas por uma cadeia J e um componente secretor.

[000112] IgE existe na forma monomérica, e tem quatro domínios constantes, que são referidos como CE1, CE2, CE3 CE4 e no presente pedido.

[000113] A cadeia L de quaisquer espécies de vertebrados podem ser atribuídas a um de dois tipos claramente distintos, denominados capa (K) e lambda (À), com base nas sequências de aminoácidos dos seus domínios constantes.

[000114] Alguns tipos de anticorpos podem ainda ser divididos em vários sub-classes: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2.

[000115] Para mais detalhes da estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpos, vide, por exemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a. ed., Daniel P. Stites, Abba I. Terr e Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn. 1994, página 71 e capítulo 6.

[000116] A menos que indicado de outra forma, o termo "anticorpo" inclui especificamente anticorpos humanos nativos e de humanos IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgA, IgD e IgM, incluindo variantes que ocorrem naturalmente. Assim, por exemplo, a sequência de IgM humana está disponível sob o Número de Acesso GenBank X14940.1, enquanto variantes têm sido relatadas como GenBank CAB37838.1, CAC20458.1, AFM37312.1, X57331.1 e J00260.1.

[000117] O termo "anticorpo monoclonal" usado neste documento se refere a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, isto é, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos exceto para mutações de ocorrência natural possíveis que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único sítio antigênico. Ademais, em contraste com preparações de anticorpo (policlonal) convencionais, as quais tipicamente incluem diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. O modificador "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser interpretado como exigindo a produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser feitos pelo método do hibridoma primeiro descrito por Kohler et al. (1975) Nature 256:495, ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US N° 4816567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos utilizando as técnicas descritas em Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628 e Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597, por exemplo.

[000118] Os anticorpos monoclonais neste documento incluem anticorpos especificamente "quiméricos" (imunoglobinas), em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica às ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é(são) idêntica(s) às ou homóloga(s) às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencentes de outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada (Patente U.S. N° 4,816,567; e Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855).

[000119] As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos que contêm uma sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. No geral, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região hipervariável do receptor são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humanas (anticorpo doador), tais como camundongo, rato, coelho ou primata não humano, possuindo a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, resíduos da região estrutural de Fv (FR) da imunoglobulina humana também são substituídos pelos correspondentes resíduos não humanos. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou no anticorpo doador. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente a totalidade de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que toos ou substancialmente todos os loops hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas, ou substancialmente todas, as regiões FR são as de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá também pelo menos uma parte de uma região constante de imunoglobulina (Fc), normalmente o de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes, ver Jones et al. (1986) Nature 321: 522525; Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-329; e Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596.

[000120] Um "anticorpo dependente da espécie" é um que tem uma afinidade de ligação mais forte com um antígeno de uma primeira espécie de mamífero do que tem com um homólogo desse antígeno de uma segunda espécie de mamífero. Normalmente, o anticorpo dependente da espécie "se liga especificamente" a um antígeno humano (isto é, tem um valor de afinidade de ligação (Kd) de não mais do que cerca de 1 x 10-7 M, de preferência não mais do que cerca de 1 x 10-8 M e mais preferencialmente não mais do que cerca de 1 x 10-9 M) mas tem uma afinidade de ligação para um homólogo do antígeno de uma segunda espécie de mamífero não humana que é, pelo menos, cerca de 50 vezes, ou pelo menos cerca de 500 vezes, ou pelo menos cerca de 1000 vezes mais fraca do que a sua afinidade de ligação com o antígeno humano . O anticorpo dependente da espécie pode ser qualquer um dos vários tipos de anticorpos conforme definidos acima, mas preferencialmente é um anticorpo humanizado ou humano.

[000121] Tal como aqui utilizado, "mutante de anticorpo" ou "variante de anticorpo" refere-se a uma variante de sequência de aminoácidos de um anticorpo de referência, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos do anticorpo de referência foram modificados. O anticorpo de referência pode, por exemplo, ser um anticorpo nativo, mas também uma variante conhecida de um anticorpo nativo. Tais mutantes têm necessariamente menos de 100% de identidade de sequência ou semelhança com o anticorpo de referência. Em uma modalidade preferencial, o anticorpo mutante terá uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 75% de identidade de sequência de aminoácidos ou de similaridade com a sequência de aminoácidos tanto do domínio variável de cadeia pesada ou leve do anticorpo de referência, mais de preferência pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 95%. A identidade ou similaridade com respeito a esta sequência é aqui definida como a percentagem de resíduos de aminoácido na sequência candidata que são idênticos (ou seja, mesmo resíduo) ou semelhante (isto é, o resíduo de aminoácido do mesmo grupo com base em propriedades comuns das cadeias laterais), com os resíduos de anticorpo de referência após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, se necessário, para atingir a máxima de identidade de sequência percentual. Nenhum dos N-terminais, C-terminais, ou extensões, deleções ou inserções internas na sequência de anticorpo fora do domínio variável devem ser interpretados como afetando a identidade ou similaridade de sequência.

[000122] Uma molécula de ligação "isolada" biespecífica ou multiespecífica, tal como anticorpo biespecífico ou multiespecífico, é aqui uma que foi identificada e separada e/ou recuperada de um componente do seu ambiente natural em uma célula hospedeira recombinante. Componentes contaminantes do seu ambiente natural são os materiais que interfeririam com utilizações de diagnóstico ou terapêuticas da molécula, por exemplo, anticorpo, e podem incluir enzimas, hormônios e outros solutos proteináceos ou não proteináceos, bem como subprodutos indesejáveis da produção, tais como, por exemplo, unidades de ligação monoespecíficas (AA e/ou BB, no caso de uma molécula biespecífica compreendendo unidades de ligação de AB), ou moléculas de ligação, com menos de cinco unidades biespecíficas. Em modalidades preferenciais, a molécula de ligação biespecífica, tal como anticorpo, será purificada (1) até mais de 95% em peso, ou mais do que 98% em peso, ou mais do que 99% em peso, tal como determinado por métodos SDS-PAGE ou SEC-HPLC, (2) até um grau suficiente para se obter pelo menos 15 resíduos da sequência interna de aminoácido ou N-terminal por utilização de um sequenciador de aminoácidos, ou (3) até à homogeneidade por SDS-PAGE sob condições redutoras ou não redutoras utilizando azul de Coomassie ou, preferivelmente, coloração de prata. Normalmente, uma molécula isolada multiespecífica, por exemplo, molécula biespecífica de ligação, por exemplo, anticorpo, será preparada através de pelo menos um passo de purificação.

[000123] O termo "ligação específica" ou "especificamente se liga a" ou "é específico para" refere-se à ligação de uma molécula de ligação, tal como um anticorpo, a uma molécula alvo, por exemplo, um polipeptídio particular ou um epítopo em um polipeptídio particular, peptídeo, ou outro alvo (por exemplo, uma glicoproteína alvo), e significa ligação que é mensuravelmente diferente de uma interação não específica (por exemplo, uma interação não específica pode ser a ligação a albumina de soro bovino ou caseína). A ligação específica pode ser medida, por exemplo, por determinação da ligação de anticorpo a uma molécula alvo em comparação com a ligação do anticorpo a uma molécula de controle. Por exemplo, a ligação específica pode ser determinada por competição com uma molécula de controle que é semelhante ao alvo, por exemplo, um excesso de alvo não marcado. Neste caso, a ligação específica é indicada se a ligação do alvo marcado a uma sonda é inibida competitivamente pelo excesso de alvo não marcado. O termo "ligação específica" ou "liga-se especificamente a" ou é "específico para" um polipeptídio particular ou um epítopo em um alvo polipeptídio particular, tal como aqui utilizado, pode ser exibido, por exemplo, por uma molécula possuindo um Kd para o alvo de pelo menos cerca de 200 nM, alternativamente pelo menos cerca de 150 nM, alternativamente pelo menos cerca de 100 nM, alternativamente pelo menos cerca de 60 nM, alternativamente pelo menos cerca de 50 nM, alternativamente pelo menos cerca de 40 nM, alternativamente pelo menos cerca de 30 nM, alternativamente pelo menos cerca de 20 nM, alternativamente pelo menos cerca de 10 nM, alternativamente pelo menos cerca de 8 nM, alternativamente pelo menos cerca de 6 nM, alternativamente pelo menos cerca de 4 nM, alternativamente pelo menos cerca de 2 nM, alternativamente pelo menos cerca de 1 nM ou mais. Em certos casos, o termo "ligação específica" refere-se a uma molécula de ligação que se liga a um polipeptídio particular ou epítopo em um polipeptídio particular, sem substancialmente se ligar a qualquer outro polipeptídio ou epítopo de polipeptídio.

[000124] "Afinidade de ligação" refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e o seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado neste documento, "afinidade de ligação" se refere à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação de 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X com seu parceiro Y geralmente pode ser representada pela constante de dissociação (Kd). Por exemplo, o valor de Kd pode ser cerca de 200 nM, 150 nM, 100 nM, 60 nM, 50 nM, 40 nM, 30 nM, 20 nM, 10 nM, 8 nM, 6 nM, 4 nM, 2 nM, 1 nM ou mais forte. A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo aqueles descritos neste documento. Anticorpos de baixa afinidade geralmente se ligam ao antígeno lentamente e tendem a dissociar prontamente, considerando que os anticorpos de alta afinidade geralmente se ligam ao antígeno com mais rapidez e tendem a permanecer ligado por mais tempo. Uma variedade de métodos de medição da afinidade de ligação é conhecida na técnica.

[000125] Tal como aqui utilizado, o "Kd" ou "valor de Kd" refere-se a uma constante de dissociação medida por uma técnica apropriada para o par de anticorpo e alvo, por exemplo, utilizando ensaios de ressonância de plasma de superfície, por exemplo, utilizando um BIAcore™-2000 ou um BIAcore™-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C com antígeno imobilizado em chips de CM5 com cerca de 10 unidades de resposta (RU).

[000126] O termo "unidade de ligação biespecífica" é aqui utilizado para se referir a uma molécula que compreende um par de polipeptídios de região constante de cadeia pesada de IgM, cada um compreendendo pelo menos um domínio CM4, e cada um conjugado com uma região de ligação a um alvo de ligação diferente. De preferência, a conjugação é através de fusão, de preferência para o N-terminal da sequência de polipeptídio da região constante de cadeia pesada de IgM. O termo "unidade de ligação biespecífica" abrange especificamente, mas sem limitação, uma "unidade de ligação do anticorpo de IgM biespecífico," como a seguir definido. As moléculas de ligação da presente invenção têm uma estrutura em anel penta- ou hexamérica e são constituídas por cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas.

[000127] Os termos "conjugado" e "conjugação" referem-se a qualquer e todas as formas de ligação covalente ou de ligação não covalente, e incluem, sem limitação, a fusão genética ou química directa, o acoplamento através de um ligante ou um agente de reticulação e associação não covalente.

[000128] O termo "unidade de ligação do anticorpo de IgM biespecífico" é utilizado no sentido mais amplo e abrange, especificamente, um par de polipeptídios de região constante de cadeia pesada de anticorpo de IgM que compreende pelo menos um domínio constante de CM4 fundido com uma sequência de domínio variável (VH), cada sequência de domínio variável com ligação a um alvo diferente, com ou sem sequências de domínio variável (VL) de cadeia leve do anticorpo relacionado. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico de IgM compreende duas regiões VHVL de ligação ao antígeno, cada uma capaz de se ligar a um epítopo diferente em um antígeno ou epítopos em dois antígenos diferentes. As unidades de ligação de anticorpo de IgM biespecífico podem ser de comprimento completo de uma única espécie, ou quimerizadas ou humanizadas. Os anticorpos de IgM biespecíficos da presente invenção têm uma estrutura em anel penta ou hexamérica compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas de IgM.

[000129] Um "anticorpo de cadeia pesada de IgM de comprimento total" é um polipeptídio que consiste em direção de N-terminal para C- terminal de um anticorpo de domínio variável de cadeia pesada (VH), um domínio constante 1 de cadeia pesada de cadeia pesada constante de anticorpo (CM1 ou Cμ1), um domínio constante 2 de cadeia pesada de cadeia pesada constante de anticorpo (CM2 ou Cμ2), um domínio constante 3 de cadeia pesada de anticorpo (CM3 ou Cμ3) e um domínio constante4 de cadeia pesada de cadeia pesada constante de anticorpo (CM4 ou Cμ4). Os anticorpos de IgM de comprimento total biespecíficos de acordo com a invenção compreendem cinco ou seis monômeros (unidades de ligação), cada um com dois sítios de ligação ao antígeno que se ligam especificamente a dois alvos de ligação diferentes (epítopos). O C-terminal da cadeia pesada ou leve do anticorpo de comprimento total indica o último aminoácido no C-terminal da cadeia pesada ou leve. O N-terminal da cadeia pesada ou leve do anticorpo de comprimento total indica o primeiro aminoácido no N-terminal da cadeia pesada ou leve.

[000130] O termo "valente", tal como aqui usado, denota a presença de um determinado número de sítios de ligação de um anticorpo. Como tal, os termos "bivalentes", "tetravalentes", e "hexavalentes" denotam a presença de dois sítios de ligação, quatro sítios de ligação e seis sítios de ligação, respectivamente. Nos anticorpos de IgM biespecíficos de acordo com a invenção, cada unidade de ligação é bivalente. Por conseguinte, os anticorpos biespecíficos de IgM tem 10 ou 12 valências. A definição aplica-se de forma semelhante a moléculas que são não anticorpos.

[000131] O termo "epítopo" inclui qualquer determinante molecular capaz de se ligar a um anticorpo específico. Em certas modalidades, epítopo determinante inclui agrupamentos superficiais quimicamente activos de moléculas, tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, fosforil ou sulfonil, e, em certas modalidades, podem ter três características estruturais dimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Um epítopo é uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Uma "região de ligação" é uma região em um alvo ligado por uma molécula de ligação.

[000132] "Especificidade poliepitópica" refere-se à capacidade de se ligar especificamente a dois ou mais epítopos diferentes no mesmo ou diferente(s) alvo(s). "Monoespecífico" refere-se à capacidade de se ligar a apenas um epítopo. De acordo com uma modalidade o anticorpo biespecífico de IgM se liga a cada epítopo com uma afinidade de pelo menos 10-7 M, ou 10-8 M ou melhor.

[000133] O termo "alvo" é utilizado no sentido mais amplo e inclui especificamente polipeptídios, ácidos nucleicos, carboidratos, lípidos e outras moléculas com a função biológica, tal como existem na natureza. O "alvo" pode, por exemplo, ser uma célula, em que as unidades de ligação biespecíficas se direcionam a dois tipos de células diferentes, diferentes sub-populações de células do mesmo tipo (por exemplo, as populações de células B diferentes) ou duas entidades diferentes de uma única célula.

[000134] Um "sítio de ligação ao antígeno" ou "região de ligação ao antígeno" de um anticorpo da presente invenção contém tipicamente seis regiões determinantes de complementaridade (CDRs) que contribuem em vários graus para a afinidade do sítio de ligação para o antígeno. Existem três CDRs de domínio variável de cadeia pesada (CDRH1, CDRH2 e CDRH3) e três CDRs de domínio variável da cadeia leve (CDRL1, CDRL2 e CDRL3). A extensão da CDR e regiões estruturais (FR) é determinada por comparação com uma base de dados compilados de sequências de aminoácidos em que essas regiões foram definidas de acordo com a variabilidade entre as sequências e/ou informação estrutural de complexos anticorpo/antígeno. Também incluídos dentro do âmbito da invenção estão os sítios de ligação ao antígeno funcional constituído por menos CDRs (isto é, em que a especificidade de ligação é determinada por três, quatro ou cinco CDRs). Menos do que um conjunto completo de 6 CDRs pode ser suficiente para se ligar a alguns alvos de ligação. Assim, em alguns casos, as CDRs de um domínio VH ou um VL sozinhas serão suficientes. Além disso, certos anticorpos podem ter sítios de ligação não CDR-associados para um antígeno. Tais sítios de ligação são especificamente incluídos no âmbito da presente definição.

[000135] O termo "interface", tal como aqui utilizado, é utilizado para se referir a uma região que compreende os resíduos de aminoácidos de "contato" (ou outros grupos não aminoácido tais como, por exemplo, os grupos de carboidratos), em uma primeira região constante de cadeia pesada de IgM que interage com um ou mais resíduos de "contato" de aminoácidos (ou outros grupos não aminoácido) de uma segunda região constante de cadeia pesada de IgM.

[000136] O termo "interface assimétrica" é usado para referir-se a uma interface (como acima definido) formada entre duas cadeias de anticorpo, tais como uma primeira e uma segunda região constante de cadeia pesada de IgM e/ou entre uma cadeia pesada de região constante de IgM e sua cadeia leve correspondente, em que os resíduos de contato na primeira e na segunda cadeias são projetados diferentes, que compreende resíduos de contato complementares. A interface assimétrica pode ser criada pelas interacções knobs/holes e/ou acoplamento de pontes de sal (comutações de carga) e/ou outras técnicas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, pela abordagem CrossMab para o acoplamento de uma cadeia pesada μ com sua cadeia leve correspondente.

[000137] Uma "cavidade" ou "hole" refere-se a, pelo menos, uma cadeia lateral de aminoácido, que é rebaixada a partir da interface do segundo polipétido e, por conseguinte, acomoda uma protuberância correspondente ("knob") na interface adjacente do primeiro polipétido. A cavidade (hole) pode existir na interface original ou pode ser introduzida sinteticamente (por exemplo, alterando o ácido nucleico que codifica a interface). Normalmente, o ácido nucleico que codifica a interface do segundo polipeptídio é alterado para codificar a cavidade. Para alcançar este objetivo, o ácido nucleico que codifica pelo menos um resíduo de aminoácido "original" na interface do segundo polipeptídio é substituído com DNA que codifica, pelo menos, um resíduo de aminoácido "importado" que tem um volume de cadeia lateral menor do que o resíduo de aminoácido inicial. Será apreciado que pode haver mais do que um resíduo de importação original e correspondente. O limite superior para o número de resíduos originais que são substituídos é o número total de resíduos na interface do segundo polipétido. Os resíduos importados preferenciais para a formação de uma cavidade são normalmente resíduos de aminoácidos de ocorrência natural e são, de preferência, selecionados a partir de alanina (A), serina (S), treonina (T), valina (V) e glicina (G). A maior parte dos resíduos de aminoácidos preferenciais são serina, treonina ou alanina, com maior preferência por alanina. Na modalidade preferencial, o resíduo original para a formação da protuberância tem um grande volume de cadeia lateral, tal como a tirosina (Y), arginina (R), fenilalanina (F) ou triptofano (W).

[000138] Um resíduo de aminoácido "original" é um que é substituído por um resíduo de "importação", que pode ter um volume de cadeia lateral menor ou maior do que o resíduo inicial. O resíduo de aminoácido importação pode ser um resíduo de aminoácido de ocorrência natural ou de ocorrência não natural, mas de preferência é o primeiro.

[000139] Por resíduo de aminoácido "não natural" entende-se um resíduo que não é codificado pelo código genético, mas que é capaz de ligar covalentemente resíduos de aminoácido adjacentes na cadeia de polipeptídio. Exemplos de resíduos de ocorrência não natural de aminoácido são norleucina, ornitina, norvalina, homosserina e outros análogos de resíduos de aminoácidos, tais como os descritos em Ellman et al., Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991), por exemplo. Para gerar tais resíduos de aminoácidos de ocorrência não natural, os procedimentos de Noren et al. Science 244: 182 (1989) e Ellman et al., supra, podem ser usados. Brevemente, esses procedimentos envolvem ativar quimicamente um tRNA supressor com um resíduo de aminoácido de ocorrência não natural, seguido por transcrição e tradução in vitro do RNA. Os métodos da presente invenção, em certas modalidades, envolvem substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido original em uma cadeia pesada de IgM, mas mais do que um resíduo original pode ser substituído. Normalmente, não mais do que o total de resíduos na interface do primeiro ou segundo polipeptídio compreenderá resíduos de aminoácidos originais que são substituídos. Os resíduos originais preferenciais para substituição são "enterrados". Por "enterrado" entende-se que o resíduo é essencialmente inacessível ao solvente. O resíduo de importação preferencial não é cisteína para evitar possível oxidação ou pareamento incorreto de pontes de dissulfeto.

[000140] A protuberância é "posicionável" na cavidade, o que significa que a localização espacial da protuberância e cavidade na interface do primeiro polipeptídio e segundo polipeptídio, respectivamente, e os tamanhos da protuberância e cavidade são tais que a protuberância possa ser localizada no interior da cavidade sem perturbar significativamente a associação normal do primeiro e segundo polipeptídios na interface. Uma vez que as saliências, tais como Tyr, Phe e Trp, tipicamente não se estendem perpendicularmente em relação ao eixo da interface e têm conformações preferenciais, o alinhamento de uma protuberância com uma cavidade correspondente baseia-se na modelação do par protuberância/cavidade com base em uma estrutura tridimensional, tal como a obtida por cristalografia de raios X ou ressonância magnética nuclear (RMN). Isto pode ser conseguido utilizando técnicas amplamente aceitas na técnica, incluindo as técnicas de modelação molecular.

[000141] Por "ácido nucleico original" entende-se o ácido nucleico que codifica um polipeptídio de interesse que pode ser "alterado" (ou seja geneticamente modificado ou mutado) para codificar uma protuberância ou cavidade. O ácido nucleico original ou de partida pode ser um ácido nucleico de ocorrência natural ou pode compreender um ácido nucleico que foi sujeito a alteração antes (por exemplo, um fragmento de anticorpo humanizado). Por "alteração" do ácido nucleico entende-se que o ácido nucleico original é mutado por inserção, eliminação ou substituição de pelo menos um códon codificador de um resíduo de aminoácido de interesse. Normalmente, um códon que codifica um resíduo inicial é substituído por um códon que codifica um resíduo de importação. Técnicas para modificar geneticamente um DNA desta forma foram revistas em Mutagenesis: a Practical Approach, MJ McPherson, Ed, (IRL Press, Oxford, Reino Unido. (1991), e incluem a mutagénese dirigida ao sítio, mutagénese de cassete e mutagénese de reacção em cadeia da polimerase (PCR), por exemplo.

[000142] A protuberância ou cavidade pode ser "introduzida" na interface do primeiro ou segundo polipeptídio por meios sintéticos, por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeos in vitro, as técnicas para introdução de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente anteriormente descritas, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação destas técnicas. De acordo, a protuberância ou cavidade que é "introduzida" é "de ocorrência não natural" ou "não nativa", o que significa que não existe na natureza ou no polipeptídio original (por exemplo, um anticorpo monoclonal humanizado).

[000143] De preferência, o resíduo de aminoácido de importação para a formação da protuberância tem um número relativamente pequeno de "rotâmeros" (por exemplo cerca de 3-6). Um "rotâmero" é uma conformação energeticamente favorável de uma cadeia lateral de aminoácido. O número de rotâmeros para os vários resíduos de aminoácidos são revistos em Ponders e Richards, J. Mol. Biol. 193: 775791 (1987).

[000144] O termo "célula hospedeira", tal como usado na aplicação de corrente, indica qualquer tipo de sistema celular que pode ser manipulado para gerar os anticorpos de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade ovários de hamster chinês (CHO) são utilizados como células hospedeiras.

[000145] Tal como aqui utilizado, as expressões "célula", "linha celular" e "cultura de células" são utilizadas indiferentemente e todas estas designações incluem a descendência. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula sujeito primária e culturas dela derivadas, sem levar em conta o número de transferências. É também entendido que toda a descendência pode não ser exatamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Progênie variante que tem a mesma função ou atividade biológica, conforme triada ou selecionada na célula originalmente transformada, está incluída neste documento.

[000146] Um ácido nucleico está "operativamente ligado" quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo, o DNA para uma pré-sequência ou sequência líder de secreção é ligado operativamente ao DNA para um polipeptídeo se ele estiver expressado na forma de uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou potencializador está operativamente ligado a uma sequência se codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ribossômica está operativamente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operativamente ligado" significa que as sequências de DNA a serem ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretor, contíguas e em frame de leitura. No entanto, os potenciadores não precisam ser contíguos. A ligação é obtida por ligação em sítios de restrição convenientes. Se esses sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes oligonucleotídicos sintéticos são utilizados de acordo com a prática convencional.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[000147] IgM é a primeira imunoglobulina produzida por células B em resposta a estimulação por antígeno, e está presente em cerca de 1,5 mg/ml em soro com uma meia-vida de 5 dias. IgM é uma molécula hexamérica ou pentamérica. Apenas como IgG, monômeros de IgM consistem de duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. No entanto, enquanto IgG contém três domínios constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3), a cadeia pesada (μ) de IgM contém adicionalmente um quarto domínio constante (CH4), de forma semelhante às cadeias pesada ε de IgE. Este domínio constante adicional situa-se no lugar da região de dobradiça rica em prolina de IgG e IgA que é responsável pela flexibilidade rotacional dos domínios Fab de ligação ao antígeno em relação ao domínio Fc de anticorpos de IgG e IgA.

[000148] Cinco monômeros de IgM formam um complexo com uma pequena cadeia de polipeptídeo adicional (a cadeia J) para formar uma molécula de IgM nativa. Considera-se que a cadeia J facilita a polimerização de cadeias μ antes de IgM ser secretada de células produtoras de anticorpos. Embora a cristalização de IgM tenha mostrado ser extremamente desafiadora, Czajkowsky e Shao (PNAS 106 (35): 14960-14965, 2009) publicaram recentemente um modelo estrutural baseado em homologia de IgM, com base na estrutura do domínio Fc de IgE e os conhecidos emparelhamentos de dissulfeto. Os autores relatam que o pentâmero de IgM humana é uma molécula em forma de cogumelo com uma inclinação flexural.

[000149] Em uma molécula penta- ou hexamérica de anticorpo de IgM natural todas as cadeias pesadas (μ) são idênticas e as cadeias leves são idênticas também. A presente invenção permite a produção de moléculas de IgM em que duas cadeias μ são diferentes uma da outra.

[000150] Em um aspecto a presente invenção se refere a moléculas de ligação biespecíficas com especificidades de ligação a duas diferentes regiões de ligação, com uma estrutura penta ou hexamérica, formada por cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, em que cada uma das unidades de ligação biespecíficas tem as duas especificidades de ligação e compreende uma primeira cadeia compreendendo pelo menos um domínio Cμ4 de uma região constante de cadeia pesada de IgM conjugada a uma primeira região de ligação a um primeiro alvo de ligação, e uma segunda cadeia compreendendo pelo menos um domínio Cμ4 de uma região constante de cadeia pesada de IgM e uma segunda região de ligação a um segundo alvo de ligação, em que os primeiro e segundo alvos de ligação são diferentes, e em que as primeira e segunda cadeias são agregadas para criar uma unidade de ligação biespecífica como resultado de uma interface assimétrica criada entre suas respectivas regiões contantes de cadeia pesada da IgM.

[000151] Em várias modalidades as regiões constantes de cadeia pesada de IgM, adicionalmente, compreende um ou ambos os domínios CM2 e CM3 ou fragmentos destes, e potencialmente outras sequências de domínio constante de cadeia pesada de IgM. Em uma modalidade, as moléculas de ligação da presente invenção contêm um domínio constante de cadeia pesada (μ) de IgM completa, com uma ou mais modificações para criar uma interface assimétrica entre duas cadeias pesadas.

[000152] A fim de gerar uma molécula de IgM com duas cadeias pesadas μ diferentes (cadeias A e B), uma solução deve ser encontrada para acoplar as duas cadeias pesadasμ correspondentes (A e B), com duas especificidades de ligação diferentes uma da outra. Além disso, se uma cadeia leve é necessária para formar uma região de ligação, uma solução deve ser encontrada para acoplar cada cadeia pesada com a cadeia leve correspondente para fornecer a especificidade de ligação desejada.

[000153] O acoplamento pode ser conseguido por troca de carga de pares de ponte de sal (também referido como comutações de carga ou inversão de carga) entre certos resíduos e/ou através da criação de interacções knobs-holes entre as duas cadeias. As cadeias pesadas também podem ser emparelhadas com suas cadeias leves correspondentes utilizando a técnica CrossMab. As diferentes abordagens podem também ser combinadas de modo a alcançar um resultado ideal.

[000154] Em um outro aspecto, a presente invenção diz respeito a moléculas de ligação multiespecíficas, com as especificidades de ligação para dois ou mais diferentes alvos de ligação, tendo uma estrutura penta- ou hexamérica. A invenção inclui moléculas de ligação compreendendo cinco ou seis unidades de ligação monoespecíficas, onde (i) cada uma das unidades de ligação monoespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada IgM cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ3 e Cμ4 conjugado com uma região de ligação ao um alvo de ligação, (ii) pelo menos duas das unidades de ligação monoespecíficas se ligam a alvos de ligação diferentes. A invenção inclui ainda moléculas de ligação compreendendo cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, onde (i) cada uma das unidades de ligação biespecíficas compreende duas regiões constantes de cadeia pesada IgM cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ3 e Cμ4 conjugado com uma região de ligação ao um alvo de ligação e (ii) pelo menos duas das unidades de ligação biespecíficas se ligam a alvos de ligação diferentes. Em uma modalidade particular, as moléculas de ligação são anticorpos IgM multiespecíficos.

[000155] Em várias modalidades, as regiões constantes de cadeia pesada de IgM compreendem adicionalmente um domínio Cμ2 ou um seu fragmento, e, potencialmente, outras sequências de domínio constante de cadeia pesada de IgM. Em uma modalidade, as moléculas de ligação da presente invenção contêm um domínio constante de cadeia pesada (μ) de IgM completa, com uma ou mais modificações para criar uma interface assimétrica entre duas cadeias pesadas.

[000156] Nas moléculas de ligação multiespecíficas da presente invenção, que contêm pelo menos uma unidade de ligação biespecífica, a fim de gerar uma molécula de IgM com duas cadeias pesadas μ diferentes (cadeias A e B), uma solução deve ser encontrada para acoplar as duas cadeias pesadas μ (A e B) correspondentes, com duas especificidades de ligação diferentes entre si através de uma interface interna assimétrica. Além disso, se uma cadeia leve é necessária para formar uma região de ligação, uma solução deve ser encontrada para acoplar cada cadeia pesada com a cadeia leve correspondente para fornecer a especificidade de ligação desejada.

[000157] Além disso, uma solução deve ser encontrada para criar uma interface externa assimétrica entre as regiões constantes de cadeia pesada das unidades de ligação monoespecíficas vizinhas que se ligam a diferentes alvos de ligação.

[000158] As técnicas para a criação de interfaces assimétricas internas e externas incluem, sem limitação, troca de carga de pares de ponte de sal (também referida como comutações de carga ou reversões de carga) entre certos resíduos e criação de interações knob-sholes entre duas cadeias. As cadeias pesadas também podem ser emparelhadas com suas cadeias leves correspondentes utilizando a técnica CrossMab. As diferentes abordagens podem também ser combinadas de modo a alcançar um resultado ideal.

1. Técnica Knobs-into-Holes

[000159] Para melhorar o rendimento das moléculas de ligação biespecíficas ou multiespecíficas penta ou hexaméricas da presente invenção as regiões constantes de cadeia pesada de IgM, por exemplo, domínios CM4, CM2 e/ou CM3, podem ser alterados pela técnica "knobs-into-holes", que é descrita em pormenor com alguns exemplos, por exemplo em WO 96/027011, Ridgway, J., B., et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621; e Merchant, AM, et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677681. Neste método, as superfícies de interacção dos dois domínios constantes de cadeia pesada de IgM são alterados para aumentar a heterodimerização de duas cadeias pesadas com diferentes especificidades de ligação e/ou entre uma cadeia pesada e a cadeia leve correspondente. Cada um dos dois domínios da cadeia pesada, como CM4-CM4, CM2-CM2 e/ou CM2-CM3-CM4/CM2-CM3-CM4 pode ser "knob", enquanto o outro é "hole". A introdução de uma ponte de dissulfureto estabiliza os heterodímeros (Merchant, AM, et al., Nature Biotech 16 (1998) 677-681; Atwell, S., et al. J. Mol. Biol. 270 (1997) 2635) e aumenta o rendimento. Do mesmo modo, as correspondentes cadeias pesadas e leves podem ser acopladas umas às outras por meio desta técnica Zhu, Z; Presta, LG; Zapata, G; Carter, P. Remodeling domain interfaces to enhance heterodimer formation. Prot. Sci. 6: 781788 (1997).

[000160] Seguindo esta abordagem, no caso de moléculas de ligação de IgM biespecíficas dentro da interface original do domínio CH4, CH2 e/ou CH3 de uma cadeia pesada que satisfaz a interface original do domínio correspondente da outra cadeia pesada dentro da molécula de ligação de IgM biespecífica (por exemplo, anticorpo), um resíduo de aminoácido pode ser substituído com um resíduo aminoácido que tem um volume de cadeia lateral maior, criando assim uma protuberância dentro da interface, que pode ser posicionada em uma cavidade dentro da interface do domínio correspondente na outra região constante de cadeia pesada de IgM. Da mesma forma, a segunda cadeia pesada de IgM pode ser alterada através da substituição de um resíduo de aminoácido dentro da interface com um domínio correspondente na região constante da primeira cadeia pesada de IgM com um resíduo de aminoácido tendo um volume de cadeia lateral menor, criando assim um hole (cavidade) na interface entre as duas regiões de cadeia pesada.

[000161] Resíduos de interface do domínio e CM4 e CM2 de IgM humana em posições knobs-holes são apresentados nas Tabelas A e D. As tabelas identificam o resíduo nativo nas posições indicadas da sequência de CM4 mostrada na FIG. 4D e a sequência CM2 mostrada na FIG. 4B, respectivamente, seguindo a numeração mostrada nestas Figuras, assim como as possíveis mutações que podem ser usadas para criar pares knobs-holes. Assim, por exemplo, no domínio CM4 o resíduo de treonina nativa (T) na posição 350 pode ser mutado em tirosina (Y) para criar um knob, que pode ser combinado com quaisquer combinações das potenciais mutações listadas para os resíduos 352, 393 e 395 da sequência de CM4 nativa (Conjunto #1). Mutações adicionais nas posições 254 e 397, que podem ser opcionalmente combinadas com Conjunto #1 são mostrados em Conjunto #2 e Conjunto #3). Similarmente, #4 exemplifica mutações de knob nas posições 350 e 395 em combinação com mutações de hole em uma ou mais das posições 352, 393, 395, e 397. Mutações adicionais para combinação com Conjunto #4 estão listadas no Conjunto #5 e Conjunto #6. O resto da Tabela A pode ser lido de um modo semelhante. Alguns dos conjuntos incluem introduções de carga, ou seja, as alterações de um resíduo não carregado para um resíduo carregado (de forma semelhante a Tabela C discutida abaixo).

[000162] Destaca-se que as mutações knobs-holes listadas em conjuntos #1-30 podem ser utilizadas em várias combinações, conforme estabelecido na tabela A. Além disso, as mutações listadas podem ser combinadas com outras mutações knobs-holes e/ou comutação de carga e/ou introdução de carga listadas no resto das tabelas. Assim, uma ou mais das mutações knobs-holes apresentadas na Tabela A podem ser combinadas com uma ou mais das seguintes mutações knobs-holes mostradas na Tabela D em qualquer combinação e/ou com uma ou mais das mutações de comutação de carga/introdução de carga listadas nas Tabelas B, C, E e F, tal como aqui discutido abaixo. Assim, pode-se selecionar qualquer conjunto da Tabela A e misturá-lo com qualquer conjunto da Tabela B, misturado com qualquer conjunto da Tabela C etc., em qualquer ordem ou combinação.

2. Troca de carga de pares de ponte de sal (comutação de carga)

[000163] Cargas opostas se atraem e cargas similares se repelem. A carga de uma molécula de aminoácido é dependente do pH e pode ser caracterizada pelos valores pK, que são determinados para o grupo alfa-amino (N), o grupo alfa-carboxil (C) e a cadeia lateral para aminoácidos livres. O ambiente sítio pode alterar o pKa de uma cadeia lateral quando o aminoácido é parte de uma proteína ou peptídeo.

[000164] As propriedades de carga de uma molécula de aminoácido também podem ser caracterizadas pelo ponto isoelétrico (pI), que é o pH no qual a carga total da molécula é neutra. Uma vez que os aminoácidos diferem uns dos outros nas suas cadeias laterais, o pI reflecte diferenças nos pKs das cadeias laterais.

[000165] A maioria dos aminoácidos (15/20) têm um pI perto de 6 por isso eles são considerados como tendo carga global neutra. Asp e Glu são carregados negativamente e His, Lys, Arg são carregados positivamente.

[000166] Na interface entre duas unidades de ligação no complexo de IgM em forma de cogumelo existem quatro pontes salinas, acima e abaixo da ponte de dissulfureto que liga os monômeros. Os resíduos envolvidos nestas interações (Lys-238, Lys-268, Asp-293 e Asp294) são os mesmos nos dois monômeros, mas a sua disposição relativa nesta interface é diferente, devido à assimetria dos domínios CM3 na estrutura de Fc de IgM.

[000167] Posições e resíduos de aminoácidos para mutações de comutação de carga ou introdução de carga são listadas nas Tabelas A, B, D, E e F. Como discutido acima, uma ou mais destas mutações, ou conjuntos de mutações, podem ser combinadas com um ou mais conjuntos de mutações knobs-holes para fornecer uma interface assimétrica desejada entre duas diferentes cadeias pesadas de IgM e/ou entre uma cadeia pesada de IgM e sua cadeia leve correspondente.

[000168] De preferência, a interface assimétrica entre duas regiões constantes de cadeia pesada de IgM diferentes é criada por até 8, tal como, por exemplo, 1-8, ou 1-7, ou 1-6, ou 1-5, ou 1-4, ou 1-3, ou 1-2 mutações em uma cadeia pesada de IgM, ou 2-10, ou 2-9, ou 2-8, ou 27, ou 2-6, ou 2-5, ou 2-4 ou 2-3 mutações combinadas das duas cadeias pesadas de IgM.

[000169] Para moléculas de ligação multiespecíficas aqui, a interface externa assimétrica é criada por uma alteração no domínio Cμ3. Em particular, para criar uma interface externa assimétrica, uma ponte de sal é formada por trocas em pares entre os resíduos de aminoácidos com carga oposta no domínio Cμ3. Em várias modalidades, a ponte de sal proporcionando a interface assimétrica externa é formada por pelo menos uma troca em pares de resíduo de aminoácido carregada nos domínios Cμ3-Cμ3, que podem, por exemplo, ser K238 θ D293 ou K268 θ D294 nas cadeias μ vizinhas.

3. Técnica CrossMab

[000170] Como discutido acima, a tecnologia knobs-into-holes ou comutação de carga permite a heterodimerização das cadeias pesadas de anticorpo. Associação adequada das cadeias leves e suas cadeias pesadas cognatas pode ser conseguida por troca de domínios de cadeia pesada e de cadeia leve dentro do fragmento de ligação ao antígeno (Fab) de uma metade da unidade de ligação do anticorpo biespecífico. Crossover pode ocorrer como um crossover dos domínios completos VH-CM e VL-CL, crossover apenas dos domínios VH e VL ou os domínios CL e CM dentro da metade da unidade de ligação biespecífica de um anticorpo de IgM. Este "crossover" mantém a afinidade de ligação ao antígeno, mas faz com que os dois braços sejam tão diferentes que pareamento incorreto de cadeia leve pode não ocorrer mais. Para detalhes adicionais, no contexto de anticorpos de IgG, ver, por exemplo, Schaeffer et al., (2011) Proc Natl Acad Sci USA 108 (27): 11.18711.192.

4. Produção de moléculas de ligação biespecíficas e multiespecíficas de IgM

[000171] As sequências de codificação das cadeias pesadas das unidades de ligação de anticorpos IgM biespecíficos, com as mutações desejadas (seguindo knobs-into-holes, comutação de carga e/ou técnica de cruzamento mAb), podem ser produzidas através da introdução de alterações de nucleótidos apropriadas no DNA do anticorpo, ou por síntese de nucleótidos. Os anticorpos podem então ser produzidos por meios recombinantes.

[000172] Métodos para a produção recombinante são amplamente conhecidos no estado da técnica e compreendem a expressão da proteína em células procariotas e eucariotas, com o subsequente isolamento do anticorpo e normalmente purificação até um grau de pureza farmaceuticamente aceitável. Para a expressão dos anticorpos em uma célula hospedeira, ácidos nucleicos que codificam as respectivas cadeias pesadas modificada e, opcionalmente, cadeias leves, são inseridos em vetores de expressão por métodos convencionais. A expressão é realizada em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas adequadas tais como as células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, células PER.C6, levedura ou células de E. coli e o anticorpo é recuperado a partir das células (sobrenadante ou células após lise). Os métodos gerais para a produção recombinante de anticorpos estão descritos, por exemplo, nos artigos de revisão de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al., Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271282; Kaufman, R. J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner, R. G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.

[000173] Os anticorpos biespecíficos e multiespecíficos são adequadamente separados do meio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tais como, por exemplo, proteína A-Sepharose®, cromatografia de hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

[000174] Embora, devido à sua estrutura complexa, a produção em grande escala de IgM recombinante tenha sido difícil, vários sistemas de produção recombinantes para IgM utilizando células não linfóides foram reportados, incluindo a co-expressão das cadeias pesada (H) e leve (L) de IgM em células de glioma C6, células CHO e células HeLa. Embora a co-expressão com sucesso tenha resultado na formação de polímero, os rendimentos foram tipicamente baixos (ver, egW089/01975 e Wood et al., J. Immunol. 145, 3011-3016 (1990) para a expressão em células CHO), e a estrutura polimérica exacta das moléculas penta- ou hexaméricas não pôde ser facilmente determinada. A produção de IgM em uma linhagem de células de retina humana imortalizada expressando proteínas E1A e E1B de um adenovírus é descrita na Publicação do Pedido US No. 20060063234. Mais detalhes sobre a produção dos anticorpos IgM biespecíficos da presente invenção são fornecidos no Exemplo abaixo.

[000175] Os métodos da presente invenção irão resultar em uma composição que compreende uma molécula de ligação biespecífica ou multiespecífica de IgM, tal como um anticorpo de IgM biespecífico ou multiespecífico, como o componente principal em combinação com os vários sub-produtos do processo de fabricação, tais como anticorpos monoespecíficos, fragmentos de anticorpos, monômeros, dímeros, trímeros e/ou tetrâmeros da unidade de ligação biespecífica, em vez da estrutura pentamérica ou hexamérica desejada. As composições produzidas conterão geralmente pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 95%, da desejada molécula de ligação biespecífica penta- ou hexamérica, por exemplo, anticorpo, que irá ser posteriormente purificado por métodos conhecidos na técnica para se obter um produto com uma pureza de pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou, pelo menos, cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99%, ou, pelo menos, cerca de 99,5%, ou pelo menos cerca de 99,9%.

5. Aplicações das moléculas de ligação biespecíficas e multiespecíficas de IgM

[000176] As moléculas de ligação de IgM biespecíficas e multiespecíficas, por exemplo, anticorpos, da presente invenção têm aplicações terapêuticas e de diagnóstico generalizadas.

[000177] Em uma modalidade, as moléculas de ligação biespecíficas deste documento se ligam a dois sítios no mesmo alvo solúvel, tais como, por exemplo, VEGF, TNFα ou IL-6. O efeito pode, por exemplo, ser antagonizar vários sítios da proteína e/ou aumentar a avidez para um determinado alvo.

[000178] Em uma outra modalidade, as moléculas de ligação biespecíficas ou multiespecíficas aqui ligam-se a dois ou mais sítios no mesmo alvo (receptor) de superfície celular, tais como o EGFR ou HER2 (ErbB2). Assim, por exemplo, uma molécula biespecífica ou multiespecífica de ligação pode se direcionar a epítopos 4D5 e 2C4 em uma molécula HER2. Esta abordagem pode aumentar a bio-potência e/ou avidez para um determinado alvo.

[000179] Em ainda outra modalidade, as moléculas de ligação biespecíficas ou multiespecífica da presente invenção ligam-se a dois ou mais alvos solúveis diferentes (proteínas ou peptídeos globulares), por exemplo TNFα e IL-6, e VEGFα Ang2, ou duas citocinas. Esta abordagem pode resultar em bloqueio mais completo de uma via específica; bloqueio da chamada "tempestade de citocina", ou coordenar uma enzima e o seu substrato, por exemplo, o Factor IXa e o Factor X.

[000180] Em uma outra modalidade, as moléculas biespecíficas ou multiespecífica de ligação aqui descritas podem ligar-se a um alvo solúvel e um receptor de superfície da célula alvo, tal como um factor angiogénico e receptor específico neo-vascular. O objetivo desta abordagem também pode ser entrega aumentada e bloqueio em sítios específicos ou tecidos.

[000181] Em ainda uma outra modalidade, as moléculas de ligação biespecíficas aqui são projetadas para se ligarem a dois alvos diferentes de receptor da superfície celular, tais como, por exemplo, HER2 (ErbB2) e HER3 (ErbB3). Da mesma forma, as moléculas de ligação multiespecíficas deste documento podem ser projetadas para se ligar a dois ou mais diferentes alvos de receptores da superfície celular, tais como, por exemplo, HER1, HER2 (ErbB2) e HER3 (ErbB3). Isto pode resultar no aumento da especificidade e seletividade e/ou no bloqueio mais completo de uma determinada via.

[000182] As moléculas de ligação biespecíficas e multiespecíficas da presente invenção, tais como anticorpos, também podem ser projetadas para se ligar um alvo solúvel ou alvo receptor de superfície celular e um alvo de longo tempo de residência, tal como, por exemplo, TNFα e albumina de soro ou VEGF e albumina de soro. Estas moléculas deverão ter meia-vida de circulação mais longa do que as moléculas de ligação sem a especificidade de albumina.

[000183] Em uma outra modalidade, as moléculas de ligação biespecíficas aqui descritas podem ligar-se um alvo solúvel e uma proteína de matriz ou um substrato, tal como, por exemplo, VEGFα e ácido hialurónico. Do mesmo modo, as moléculas de ligação multiespecíficas aqui podem-se ligar a um ou mais alvos solúveis e uma ou mais proteínas e/ou substratos de matriz, tais como, por exemplo, VEGFα e ácido hialurónico. As moléculas de ligação biespecíficas ou multiespecíficas resultantes podem encontrar utilidade, por exemplo, na terapia anti-angiogénica de condições oculares, tais como a degeneração macular relacionada com a idade (AMD), devido a seu maior tempo de permanência no espaço intra-ocular.

[000184] Moléculas biespecíficas, por exemplo, anticorpos, que ligam um alvo solúvel ou receptor, além de um receptor transportador (ou seja, receptor de transferrina), por exemplo, anti-EGFRvIII (forma mutante com o éxon III excluído) encontraram glioblastoma combinado com especificidade anti-transferrina, podem encontrar utilidade na entrega de anticorpos através da barreira hematoencefalica.

[000185] Do mesmo modo, as moléculas multiespecíficas, por exemplo, anticorpos que se ligam a um ou mais alvos solúveis ou receptores, além de um ou mais receptores de transportador (ou seja, receptor de transferrina), por exemplo, anti-EGFRvIII (forma mutante com o éxon III excluído) encontraram glioblastoma combinado com especificidade anti-transferrina, podem encontrar utilidade na entrega de anticorpo através da barreira hematoencefálica.

6. Composições, composições farmacêuticas e métodos de tratamento

[000186] Em um aspecto, a invenção diz respeito a composições que compreendem moléculas de ligação biespecíficas ou multiespecífica de IgM purificadas, tais como ou anticorpos de IgM biespecíficos ou multiespecíficos deste documento. As composições conterão geralmente pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 92%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cerca de 99% da molécula de ligação multiespecífica ou biespecífica de IgM desejada, por exemplo, anticorpo. A composição pode ser uma composição farmacêutica, onde a molécula de ligação biespecífica ou multiespecífica, por exemplo, anticorpo, está em mistura com pelo menos um carreador farmaceuticamente aceitável.

[000187] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Tal como será apreciado por aqueles versados na técnica, a via e/ou modo de administração irão variar dependendo da doença ou condição alvo e os resultados desejados. Para administrar um composto da invenção por certas vias de administração pode ser necessário revestir o composto ou co-administrá-lo com um material para prevenir a sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito em um transportador apropriado, por exemplo, lipossomas ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. Carreadores farmacêuticos incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias ativas farmaceuticamente é conhecido na técnica.

[000188] As composições também podem conter adjuvantes tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e/ou agentes de dispersão. Prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada por procedimentos de esterilização e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico fenol e afins. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos tais como, por exemplo, açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Além da absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser provocada pelo uso de agentes que atrasem a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e gelatina.

[000189] Os níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente em particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico a ser usado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas empregadas, a idade, o gênero, o peso, a condição, a saúde geral e história médica anterior do paciente a ser tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[000190] A composição deve ser estéril e fluida na medida em que a composição possa ser entregue por meio de seringa. Em adição à água, o carreador é de preferência uma solução salina isotônica tamponada.

[000191] Os exemplos que seguem, listagem de sequências e figuras são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, o verdadeiro âmbito da qual é definido nas reivindicações anexas. Entende-se que podem ser feitas modificações nos procedimentos apresentados sem se afastar do espírito da invenção.

[000192] Todas as referências de patentes e científicas citadas ao longo desta divulgação são aqui expressamente incorporadas por referência.

Exemplo 1 1. Geração de construtos de DNA com mutações concebidas

[000193] Materiais e Métodos a. síntese de construto de DNA

[000194] Todos os construtos de DNA com mutações concebidas foram sintetizados por fornecedores comerciais (Genewiz, Inc.), com sítios de restrição compatíveis nas duas extremidades para subclonagem nos respectivos vectores de expressão, usando métodos bem conhecidos na técnica. b. Construção de vetores de expressão

[000195] Os construtos de DNA sintetizados foram re-suspensos em tampão de Tris-EDTA a 1 μg/ml. DNA (1 μg) foi submetido a digestão enzimática e o gene sintetizado foi separado do DNA de plasmídeo carreador por electroforese. O DNA de plasmídeo digerido foi ligado ao DNA pré-digerido (pFUSEss-Chig-HM * 03 para a cadeia μ; pFUSE2ss- clig-HK para a cadeia kapa, Invivogen) por técnicas padrão de biologia molecular. O DNA ligado foi transformado em bactérias competentes e plaqueado em placas de LB com múltiplos antibióticos seletivos. Várias colônias bacterianas foram escolhidas e preparações de DNA foram feitas através de técnicas padrão de biologia molecular. O DNA preparado foi verificado por sequenciamento. Apenas foram utilizados os clones bacterianos com 100% de correspondência de sequência de DNA com a sequência de DNA projetada para preparação de DNA de plasmídeo e, subsequentemente, para a transfecção de células. c. Cadeias μ de tamanho diferente

[000196] A fim de demonstrar que duas cadeias μ diferentes, com ou sem mutação de interface de interacção de CM4 (A e B) foram capazes de acoplamento, dois conjuntos de cadeias μ de diferentes tamanhos foram calculados com pesos moleculares e especificidades de ligante distintas. i. A cadeia de RTX é composta por uma cadeia μ para a região Vh de Rituxan (Rituximabe) do anticorpo anti-CD20 quimérico fundida com a região CM1 da cadeia μ de anticorpo de IgM humana com uma mutação de C291S e deleção de tailpiece: QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGL EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENS PSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGK YAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPP KVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGS GVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRG LTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTY DSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGE RFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESA TITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYF AHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVD (SEQ ID NO: 1)

[000197] A cadeia RTX tem um peso molecular calculado de cerca de 60kD (sem glicosilação) e 66kD (com 4 sítios de N-glicosilação) e é capaz de se ligar às células B positivas de CD20, tal como as células Raji. ii. A cadeia Fc compreende regiões CM2 a CM4 de cadeia μ de IgM humana, carregando uma tag cMyc e tendo a sua peça da cauda substituída por tag 6His e com uma mutação C291S: GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGK QVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRV DHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVT DLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDD WNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQL NLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQ APGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTG KGGGSEQKLISEEDLNSAVDHHHHHH (SEQ ID NO: 2)

[000198] A cadeia de Fc tem um peso molecular de cerca de 39kD (sem glicosilação) e 43 kD (com 3 sítios de N-glicosilação) e é capaz de se ligar a anticorpo monoclonal anti-myc 9E4 ou de outros anticorpos anti-myc. iii. A cadeia Okt é composta de uma versão de Fv de cadeia simples de OKT3 (anti-CD3) fundida com CM2 de cadeia mu humana com C291S e deleção de tailpiece: QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQI VLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIY DTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNP FTFGSGTKLEIKGSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPR QIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESD WLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIF LTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFS AVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPD VYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKY VTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRV TERTVD (SEQ ID NO: 3)

[000199] A cadeia Okt tem um peso molecular calculado de cerca de 61kD sem glicosilação e 67kD incluindo 4 sítios de N-glicosilação, e é capaz de se ligar às células T positivas de CD3. d. acoplamento de cadeia leve i. Cadeia kappa (K) de Rituxan quimérico nativo QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWI YATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSN PPTFGGGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPR EAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEK HKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4)

[000200] A cadeia kappa tem uma massa molecular calculada de cerca de 23 kD e é capaz de ligar-se a cadeia pesada de IgM de Rituxan. e. Mutações de interface

[000201] Knobs e holes, acoplamento de carga electrostática foram assimetricamente introduzidos na interface de interacção CM3 para maximizar hetero-dimerização de duas cadeias μ. Dois pares de mutantes de interface de interacção de CM3 foram gerados. ii. Fc1a é uma região CH2 a CH4 de cadeia μ humana com mutações C291S e T350Y e deleção de tailpiece: GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGK QVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRV DHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVT DLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDD WNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQL NLRESATIYCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQ APGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTG K (SEQ ID NO: 5)

[000202] A cadeia Fc1a tem um peso molecular calculado de cerca de 36kD sem glicosilação e 41kD se 3 sítios de N-glicosilação estão incluídos. iii. Fc1b é cadeia μ humana CH2 a CH4 e com mutações C291S, L352S e H395V e deleção de tailpiece GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGK QVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRV DHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVT DLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDD WNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQL NLRESATITCSVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQ APGRYFAVSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTG K (SEQ ID NO: 6)

[000203] A cadeia de Fc1b tem um peso molecular calculado de cerca de 36kD sem glicosilação e 41kD incluindo 3 sítios de N-glicosilação. iv. . Fc2a consiste em uma região CH2 a CH4 de cadeia μ humana com mutações C291S, T350Y, T354E e I397E e deleção de peça da cauda. GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGK QVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRV DHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVT DLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDD WNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQL NLRESATIYCLV EGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQ APGRYFAHSELTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKST GK (SEQ ID NO: 7)

[000204] A cadeia Fc2a tem um peso molecular calculado de cerca de 36kD e 41kD sem glicosilação incluindo 3 sítios de N-glicosilação. v. . Fc2b é CH2 a CH4 de cadeia μ humana e com mutações C291S, L352S, T354K, H395V e I397K e deleção de peça da cauda. GSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGK QVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRV DHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVT DLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDD WNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQL NLRESATITCSV KGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQ APGRYFAVS K LTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKST GK (SEQ ID NO: 8)

[000205] A cadeia de Fc2b tem um peso molecular calculado de cerca de 36kD e 41kD sem glicosilação incluindo 3 sítios de N-glicosilação. f. mutações de interface

[000206] As cadeias de Fc2ae Fc2b com knobs, holes e acoplamento de carga electrostática foram adicionalmente ligadas a ambos Rituxan e o scFv de OKT3 (anticorpo anti-CD3) por clonagem molecular para assimetricamente hetero-dimerizar duas cadeias μ. vi. Rtx2a é composta por uma cadeia μ para regiões Vh de Rituxan (anti- CD20) quiméricas fundidas com CM1 a CM4 de cadeia μ humana com mutações C291S, T350Y, T354E e I397E e deleção de tailpiece. QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGL EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENS PSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGK YAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPP KVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGS GVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRG LTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTY DSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGE RFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESA TIYCLV EGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYF AHSELTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK (SEQ ID NO: 9)

[000207] A cadeia de Rtx2a tem um peso molecular calculado de cerca de 61kD e 67kD sem glicosilação com 4 sítios de N-glicosilação. vii. Rtx2b é composta por uma cadeia μ para regiões Vh de Rituxan (anti- CD20) quiméricas fundidas com CM1 a CM4 de cadeia mu humana com mutações C291S, L352S, T354K, H395V e I397K e deleção de tailpiece. QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGL EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSSGSASAPTLFPLVSCENS PSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGK YAATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPP KVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGS GVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRG LTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTY DSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASISEDDWNSGE RFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESA TITCSV KGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYF AVS K LTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGK (SEQ ID NO: 10)

[000208] A cadeia de Rtx2b tem um peso molecular calculado de cerca de 61kD e 67kD sem glicosilação incluindo 4 sítios de N- glicosilação. viii. Okt2a é composto por scFv de OKT3 (anticorpo anti-CD3) fundido com a CM4 a CM2 de cadeia μ humana com mutações C291S, T350Y, T354E e I397E e deleção de tailpiece. QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQI VLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIY DTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNP FTFGSGTKLEIKGSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPR QIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESD WLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIF LTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFS AVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPD VYLLPPAREQLNLRESATIYCLV E GFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKY VTSAPMPEPQAPGRYFAHSELTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNR VTERTVDKSTGK (SEQ ID NO: 11)

[000209] A cadeia de Okt2a tem um peso molecular calculado de cerca de 62kD sem glicosilação e 68 kD incluindo 4 sítios de N- glicosilação. ix. Okt2b é composto por scFv de OKT3 (anticorpo anti-CD3) fundido com CM2 a CM4 de cadeia μ humana com mutações C291S, L352S, T354K, H395V e I397K e deleção de tailpiece. QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARYYDDHYSLDYWGQGTTLTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQI VLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIY DTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNP FTFGSGTKLEIKGSGSKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPR QIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESD WLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIF LTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFS AVGEASISEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPD VYLLPPAREQLNLRESATITCSV KGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEK YVTSAPMPEPQAPGRYFAVS K LTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPN RVTERTVDKSTGK (SEQ ID NO: 12)

[000210] A cadeia Okt2b tem um peso molecular calculado de cerca de 62kD sem glicosilação e 68 kD incluindo 4 sítios de N-glicosilação. 2. Expressão de proteínas, purificação e caracterização a. Transfecção

[000211] IgM foi feita por co-transfecção de vários vectores de expressão diferentes em proporções equimolares em células de mamífero, tais como células 293F (Invitrogen). 10 μg de DNA misto para vectores de expressão foram misturados com 20 μl de 293Fectin (Invitrogen) durante 30 minutos à temperatura ambiente em 2 ml de Opti-MEM (Invitrogen) e, em seguida, adicionados a 107 células 293F. As transfecções com células 293F foram incubadas durante 72 horas pós-transfecção antes da colheita do sobrenadante. b. Purificação de proteína por imunoprecipitação. i. Capturar IgM seleto (Catalog 2890.05, BAC, Thermo Fisher)

[000212] Sobrenadantes transfectados foram colhidos por centrifugação a 2000g durante 10 minutos. Proteínas de IgM foram purificadas por imunoprecipitação com matriz de afinidade de lgM Capture Select. 100 μl de pasta fluida de lgM de Capture Select foram adicionados a 15 mL de sobrenadante colhido. As misturas de matriz de afinidade e de sobrenadante foram incubadas à temperatura ambiente durante 2 horas em um agitador. As matrizes de afinidade foram, então, centrifugadas a 300 g durante 2 minutos, decantando a solução. As matrizes de afinidade foram adicionalmente lavadas com PBS mais 0,05% de Tween por 3 vezes. Finalmente, as proteínas de IgM purificadas foram lavadas das matrizes de afinidade por incubação de 20 μl de tampão de carga de amostra 4x LSD (Invitrogen) à temperatura ambiente durante 5 minutos, seguido por centrifugação a 10.000 g. As matrizes de afinidade foram adicionalmente lavadas com 60 μL de PBS e os sobrenadantes foram reunidos para análise por electroforese em gel. c. Eletroforese em gel i. SDS PAGE não redutor

[000213] SDS PAGE não redutor foi utilizado para separar várias proteínas de IgM mutantes de pesos moleculares diferentes. Novex 412% Bis-Tris Gel (Life Technologies) foi usado com Novex MES SDS Running Buffer (Life Technologies). ii. SDS-PAGE redutor

[000214] Tampão de amostra NuPage LDS (Life Technologies) e agente redutor NuPage ditiotreitol (Life Technologies) foram adicionados a amostras de proteína de IgM e aquecidos a 80 °C durante 10 minutos antes de carregar no NuPage Novex 4-12% Bis-Tris Gel (Life Technologies, cat# NP0322). NuPage MES SDS Running Buffer (Life Technologies, cat# NP0002) foi usado para electroforese em gel. Após a electroforese estar completa, o gel foi removido do aparelho e corado utilizandoColloidal Blue Staining (Life Technologies, manual #LC6025. iii. Quantificação de banda de gel

[000215] Géis de proteína são secos, então digitalizados utilizando scanner de imagem. As imagens do gel são processadas com programa Image J e a quantidade de proteína em uma faixa específica é determinada usando a função de quantificação em gel. iv. Análise de géis de SDS-PAGE

[000216] RTX:Fc incluindo géis de SDS-PAGE de par 2a e 2b de fc de lgM de tipo selvagem e projetado. As rotas 1, 2 e 3 no gel SDS-PGE não reduzido (FIG. 6) mostram uma banda superior para Rtx homodimérica (H2L2, esperado MW 168-180 kDa) e uma banda inferior para meio-anticorpo (HL, esperado MW 84-90 kDa) para Rtx2a sozinho, Rtx2b sozinho e Rtx de tipo selvagem. Uma banda de Fc não associada (esperado, MW 36-41 kDa) está presente em todas as três rotas; Fc (MW 72-82 kDa esperado) associado pode também ser um componente da banda de 80-90 kDa. A rota 2 mostra a mistura de Rtx2a:Fc2b e a rota 3 mostra a mistura de Rtx2b:Fc2a. Em ambas as rotas heterodímero (MW 120-131 kDa esperado) está indicado por uma seta. As combinações projetadas de Rtx2a:Fc2b e Rtx2b:Fc2a mostram ambas a presença de heterodímero significativa enquanto a combinação Rtx:Fc de tipo selvagem só mostra uma pequena quantidade de heterodímero.

[000217] Fc é de facto presente, como visto em rotas 1-3 do SDS- PAGE reduzido mostrado na FIG. 7: banda superior é cadeia pesada de Rtx (esperado, MW 61-67 kDa), banda do meio é Fc (esperado, MW 3641 kDa), e banda inferior é cadeia leve de Rtx (esperado, MW 23 kDa).

[000218] Okt:Fc incluindo par 2 a e 2b de Fc de lgM projetado e de tipo selvagem, SDS-PAGE, FIG. 8, rotas 1-3

[000219] Combinação de Okt:Fc de tipo selvagem (SDS-PAGE, FIG. 8, rota 1) mostra uma banda superior de heterodímero de Okt:Fc (esperado, MW 98-107 kDa), uma banda inferior para Fc não associado (esperado, MW 36-41) e uma grande banda do meio representando Fc associado (esperado, MW 72-82). Em contraste, para as combinações Okt2a:Fc2b e Okt2b:Fc2a, o gel de SDS-PAGE mostrado na FIG. 8, rota 2 mostra uma banda de destaque para o heterodímero e bandas muito leves para Fc2b associado e o homodímero de Okt2a acima e congruente com a heterodímero de Okt2a:Fc2b. A seta indica heterodímero.

[000220] Tanto o Okt2a e Fc2b estão presentes no gel reduzido (gel SDS-PAGE mostrado na FIG. 9, rota 2). Resultados semelhantes são observados para o par Okt2b:Fc2a em géis mostrado nas Figs. 8 e 9.

[000221] OKT:Rtx incluindo géis de SDS-PAGE de par 2a e 2b de Fc de lgM projetado e de tipo selvagem mostrados nas Figs. 8 e 9, rotas 46

[000222] Combinação de Okt:Rtx de tipo selvagem (gel de SDS-PAGE mostrado na FIG. 8, rota 4) mostra uma banda de homodímero wt Rtx (H2L2; esperado, MW 168-180 kDa), um grupo de meio-anticorpo wt Rtx (HL; esperado MW 84-90 kDa) e uma banda leve que pode ser homodímero de Okt (MW; esperadodo, 124-133 kDa). Em contraste, a combinação de Okt2:Rtx2b projetada (gel de SDS-PAGE mostrado na FIG. 8, rota 5) mostra a presença de heterodímero significativa (MW; esperado, 146-157), bem como homodímero de Rtx2b (MW; esperado, 168-180 kDa) e um meia-anticorpo (MW; esperado, 84-90 kDa). Quando reduzida (gel de SDS-PAGE mostrado na FIG. 9, rota 5), a cadeia leve de Rtx2b mostra uma banda a MW 23 kDa; a pesada banda entre 6080 kDa é provavelmente composta de cadeia pesada de Rtx2b (esperado, MW 61-67 kDa) e cadeia pesada de Okt2a (esperado, MW 62-67 kDa). Resultados semelhantes são vistos para o par Okt2b:Rtx2a.

Conclusões:

[000223] Para todos os três sistemas testados - Okt:Rtx, Okt:Fc, Rtx:Fc - as variantes de Fc de IgM modificadas mostraram aumento substancial de formação de heterodímero em relação ao Fc de lgM nativo (não modificado). Um único par de sequências (isto é, Fcs 2a e 2b) foi testado e variantes adicionais da interface de Fc projetada podem ser avaliadas para reduzir melhor a formação de homodímero e optimizar a formação de heterodímeros. 3. Análise funcional biespecífica a. Análise ELISA para dois ligantes

[000224] IgM com OKT3 (cadeia A) e o peptídeo cMyc (cadeia B) é ensaiada por análise de ELISA com captura de proteína solúvel epsilon CD3 e detecção de anti-cMyc (9E10). Proteína solúvel CD3e é revestida sobre placas de ELISA a 2 mg/ml em 150 mM de NaHCO3 seguido de bloqueio com BSA a 3% em PBS. O sobrenadante (100 μl) contendo IgM-OKT3-cMyc transfectados é adicionado à placa de ELISA bloqueada durante 4 horas a 25 C. Após lavagem com PBS, o anticorpo 9E10 é adicionado à placa de ELISA durante 2 horas à temperatura ambiente. IgG-HRP anti-camundongo é adicionada seguinte a lavagens com PBS. A existência de anticorpos de IgM biespecíficos de é detectada por leitura com OD 450 após a adição de substrato HRP.

[000225] IgM com OKT3 (cadeia A) e Rituxan (cadeia B) é ensaiada por análise de ELISA de captura com proteína solúvel CD3 epsilon e detecção de proteína-L-HRP. Proteína solúvel CD3e é revestida sobre placas de ELISA a 2 mg/ml em 150 mM de NaHCO3 seguido de bloqueio com BSA a 3% em PBS. O sobrenadante (100 μl) que continha IgM- Okta:Rtxb ou Oktb:RTXA transfectados é adicionado à placa de ELISA bloqueada durante 4 horas a 25 C. Após lavagem com PBS, a proteína- L-HRP é adicionada à placa de ELISA durante 2 horas à temperatura ambiente. A existência de anticorpos de IgM biespecíficos de é detectada por leitura com OD 450 após a adição de substrato HRP. b. Análise FACS ligação a alvo

[000226] A ligação de OKT3-IgM-cMyc a célula T é confirmada por ligação do anticorpo à linhagem de células T (Peer, linhagem celular positiva) e a linhagem celular B (Daudi, linhagem celular de controle negativo). Após a lavagem, 9E10 marcada com rodamina é adicionada à suspensão de células. A ligação de células-alvo é detectada por MFI de ambas as células positivas e negativas controlados com ou sem antígeno CD20. c. Ensaio de microscopia fluorescente para ligação biespecífica

[000227] Verificar a ligação biespecífica da IgM projetada pela sua capacidade para reunir duas populações de células positivas CD3 e células positivas CD20, as quais foram pré-marcadas por dois corantes vitais diferentes em cada tipo de célula. Por exemplo: i. corante vital citosólico Green Fluorescent (CellTrac ™ Calcein Green AM) marcação de linhagem celular positiva CD3 (Peer) ii. Corante vital citosólico Red Fluorescent (CellTrace™ Calcein Red- Orange, AM), linhagem de células de células B positivas marcada CD20 (Daudi) Exemplo 2 1. Geração de construtos de DNA com mutações concebidas

[000228] Síntese de construto de DNA e construção de vectores de expressão são realizadas como no Exemplo 1. a. Cadeias μ Chains de diferentes tamanhos

[000229] A cadeia A é composta por uma cadeia μ de comprimento total para região Vh de OKT3 quimérico (anti-CD3) fundida com CM1 da cadeia mu humana: QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGL EWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSSGSASAPTLFPLVSCENSPS DTSSVAVGCLAQDFLPDSITFSWKYKNNSDISSTRGFPSVLRGGKYA ATSQVLLPSKDVMQGTDEHVVCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKV SVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGV TTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTF QQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSV TISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFT CTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATIT CLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAH SILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVS LVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 13)

[000230] A cadeia A tem um peso molecular de cerca de 63 KD e é capaz de se ligar a uma cadeia epsilon solúvel de CD3 (10977-H08H, Sino Biological) ou células T.

[000231] A cadeia B tem uma tag cMyc fundida com CH2 de cadeia μ humana: QVQLGGPEQKLISEEDLNSAVLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPR KSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPT TYKVTSTLTIKESDWLSQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDT AIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTH TNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTI SRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQW MQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETY TCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 14)

[000232] A cadeia B tem um peso molecular de cerca de 41kD e é capaz de se ligar a anticorpo monoclonal anti-myc 9E4 ou outros anticorpos anti-myc.

[000233] A cadeia alternativa B tem uma cadeia μ de comprimento total paraM-CL (VH+CL) Rituximabe (anti-CD20) fundido com CH2 da cadeia mu humana: QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGL EWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSA VYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSASVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKD STYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECDKT HLPVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWL REGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLSQSMF TCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLT CLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASIC EDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAR EQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMP EPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDK STGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY (SEQ ID NO: 15)

[000234] A cadeia B tem um peso molecular de cerca de 64kD e é capaz de se ligar às células B positivas para CD20. b. Acoplamento de cadeia leve diferente Cadeia kappa de OKT3 quimérica nativa QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRW IYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSS NPFTFGSGTKLEINRAVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYP REAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYE KHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 16) CrossMabCM1-CL para Rituximabe QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWI YATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSN PPTFGGGTKLEIKSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDY FPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQ TYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC (SEQ ID NO: 17) c. Diferentes marcadores de seleção para vetores de expressão diferentes

[000235] Marcadores de seleção diferentes são utilizados em diferentes vetores de expressão utilizados para co-transfecção. Várias drogas são utilizadas para a seleção de células a fim de acomodar todos os vectores de expressão necessários relevantes para a produção de IgM. As técnicas de biologia molecular padrão são usadas para a clonagem de DNA específica para estes vectores. i. Cadeia mu utiliza seleção de Zeocina (ant-zn-1, Invivogen). Zeocina é utilizada a uma concentração de 100 μg/ml. Após a transfecção com um plasmídeo contendo o gene Sh ble, as células então são incubadas em meio Opti-CHO contendo zeocina a 100 μg/ml para selecionar transfectantes estáveis. ii. Cadeia kappa utiliza selecção de Blasticidina S (ant-bl-1, Invivogen). Blasticidina S é utilizada a uma concentração de 10 μg/ml. Após a transfecção com um plasmídeo contendo o gene bsr, as células são então incubadas em meio Opti-CHO contendo Blasticidina S a 10 μg/ml para selecionar transfectantes estáveis. d. Expressão, purificação de expressão de proteína i. Transfecção

[000236] IgM é feita por co-transfecção de vários vetores de expressão diferentes em razões molares iguais ou razão molar variável (5-10 vezes de diferença) em células de mamífero, tais como células 293 ou células CHO. DNAs para vectores de expressão são misturados com PEI e, em seguida, adicionados a células CHO-S. Transfecção de PEI com células CHO-S é realizada de acordo com técnicas estabelecidas (ver "Biotechnology and Bioengineering, Vol 87, 553545”). ii. Purificação de proteína Capture Select IgM (Catalog 2890.05 , BAC, Thermo Fisher) Proteínas de IgM de sobrenadantes de células CHO-S transfectadas são purificadas por captura de afinidade matriz de IgM de Capture Select acordo com o protocolo dos fabricantes. • Capto-L (Catalog 17-5478-01, GE Healthcare)

[000237] Proteína IgM transfectada, contendo cadeia kappa, no sobrenadante de células CHO-S é purificada por matriz de afinidade Capto-L acordo com o protocolo dos fabricantes iii. Electroforese por gel • SDS-PAGE não redutor

[000238] SDS-PAGE não redutor separa IgM nativa e as suas formas mutantes de acordo com o tamanho. IgM pentâmico, composto por cadeias pesadas homodiméricas (AA), produz uma banda de proteína de aproximadamente um milhão de peso molecular. IgM pentamérica composta de uma versão mais curta de cadeias pesadas homodiméricas (BB) produz uma banda de proteína com um peso molecular significativamente mais baixo. IgM pentamérica composta por cadeias pesadas heterodiméricas (AB quimérico) produzir várias proteínas com pesos moleculares maiores do que BB e menores que AA.

[000239] NuPage LDS Sample Buffer (Life Technologies) é adicionado a amostras de proteína de IgM a 25 C durante 30 minutos antes do carregamento para o gel. NativePage Novex 3-12% Bis-Tris Gel (Life Technologies) é utilizado com Novex Tris-Acetate SDS Running Buffer (Life Technologies). Executar gel até a frente do corante atingir o fundo do gel. • SDS-PAGE redutor

[000240] Tampão de amostra NuPage LDS (Life Technologies) e agente redutor NuPage ditiotreitol (Life Technologies) foram adicionados a amostras de proteína de IgM e aquecidos a 80 °C durante 10 minutos antes de carregamento no NuPage Novex 4-12% Bis-Tris Gel (Life Technologies, cat# NP0322). NuPage MES SDS Running Buffer (Life Technologies, Cat # NP0002) é usado para electroforese em gel. Os géis são executados até que a frente de corante atinja o fundo do gel.

[000241] Após a eletroforese ser concluída, remova gel de aparelhos e colora o gel usando Colloidal Blue Staining (Life Technologies, manual #LC6025) • Quantificação de banda de gel

[000242] Géis de proteína são secos, então digitalizados utilizando scanner de imagem. A imagem é processada com gel de programa Image J e a quantidade de proteína em uma banda específica pode ser determinada utilizando a função de quantificação em gel iv. Análise por espectrometria de massa para identificar/quantificar os vários mAbs na preparação biespecífica. v. Análise de estabilidade usando calorimetria de varredura diferencial (DSC) e. Análise funcional biespecífica i. Análise ELISA para dois ligantes

[000243] IgM com OKT3 (cadeia A) e o peptídeo cMyc (cadeia B) é ensaiada por análise de ELISA com captura de proteína solúvel epsilon CD3 e detecção de anti-cMyc (9E10). Proteína solúvel CD3e é revestida na placa de ELISA a 2 mg/ml em 150 mM de NaHCO3 seguido de bloqueio com BSA a 3% em PBS. O sobrenadante (100 μl) contendo IgM-OKT3-cMyc transfectados é adicionado à placa de ELISA bloqueada durante 4 horas a 25 C. Após lavagem com PBS, o anticorpo 9E10 é adicionado à placa de ELISA durante 2 horas à temperatura ambiente. IgG-HRP anti-camundongo é adicionada seguinte a lavagens com PBS. A existência de anticorpos de IgM biespecíficos de é detectada por leitura com OD 450 após a adição de substrato HRP. ii. Análise FACS da ligação a alvo

[000244] A ligação de IgM-OKT3-cMyc a célula T é confirmada por ligação do anticorpo à linhagem de células T (Peer, linhagem celular positiva) e a linhagem celular B (Daudi, linhagem celular de controle negativo). Após a lavagem, 9E10 marcada com rodamina é adicionada à suspensão de células. A ligação de células-alvo é detectada por MFI de ambas as células positivas e negativas controlados com ou sem antígeno CD20. iii. Ensaio de microscopia fluorescente para ligação biespecífica

[000245] Verifique ligação biespecífica da IgM projetada em sua capacidade para reunir, duas populações de células positivas CD3 e células positivas CD20 que foram pré-marcadas por dois corantes vitais diferentes em cada tipo de célula. Por exemplo: • corante vital citosólico Green Fluorescent (CellTrace™ Calcein Green AM) marcação de linhagem celular positiva CD3 (Peer) • Corante vital citosólico Red Fluorescent (CellTrace™ Calcein Red- Orange, AM), linhagem de células de células B positivas marcada CD20 (Daudi)

[000246] Ligação multiespecífica e análise funcional multiespecífica podem ser realizadas de um modo semelhante, utilizando técnicas conhecidas na técnica, tais como as descritas acima.

Claims (17)

1. Molécula de ligação com uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica, caracterizada pelo fato de que compreende cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, em que cada uma das referidas unidades de ligação biespecíficas tem as mesmas duas especificidades de ligação e compreende uma primeira cadeia compreendendo pelo menos um domínio Cμ2, um domínio Cμ3 e um domínio Cμ4 de uma região constante da cadeia pesada de IgM conjugada a uma primeira região de ligação a um primeiro alvo de ligação, e uma segunda cadeia compreendendo pelo menos um domínio Cμ2, um domínio Cμ3 e um domínio Cμ4 de uma região constante da cadeia pesada de IgM e uma segunda região de ligação a um segundo alvo de ligação, em que os referidos primeiro e segundo alvos de ligação são diferentes, e em que as referidas primeira e segunda cadeias são montadas para criar uma unidade de ligação biespecífica como resultado de uma interface assimétrica criada entre suas respectivas regiões constantes de cadeia pesada da IgM; em que as interfaces assimétricas entre as regiões constantes da cadeia pesada de IgM das duas cadeias de uma unidade de ligação são criadas por uma ponte de sal formada por trocas de pares entre resíduos de aminoácidos com carga oposta em pelo menos um dos domínios Cμ2, Cμ3 e/ou Cμ4 das duas cadeias da referida unidade de ligação, em que pelo menos uma referida troca é selecionada do grupo que consiste em R328E, DθE339R, K; R344E, DθD330R, K; K376E, DθE385R, K; R427E, DθE339R, K; T354E, DθI397R, K; E167R, K >K177E, D; K169E, DθE170R, K; D121K, R >K315D, E; e K185D, EθD360K, R; e em que a numeração de aminoácidos é baseada na sequência de Cμ1 a Cμ4 da cadeia μ humana como mostrado na figura 4 e é sequencial desde o início do domínio Cμl.

2. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que as interfaces assimétricas entre as regiões constantes da cadeia pesada de IgM das duas cadeias de uma unidade de ligação incluem ainda conexões knobs-into-holes, em que pelo menos uma conexão knobs-into-hole é criada por mutações selecionadas do grupo consistindo em knobs: T350—Y,F,W; e H395—Y,F; e holes: L352 — G,A,V,I,M,S,T; H395—A,V,I,L,M,F,Y; F393—W,Y; I397—— A,V,S,T; T350—>S,A,V; e T348——S.

3. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que as referidas unidades de ligação biespecíficas são idênticas.

4. Molécula de ligação, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que as referidas primeira e segunda regiões de ligação são duas regiões variáveis de cadeia pesada diferentes do anticorpo IgM fundidas aos N-terminais das referidas primeira e segunda regiões constantes de cadeia pesada de IgM, respectivamente, e ligando-se ao referido primeiro e ao referido segundo alvo de ligação, respectivamente, e em que a molécula de ligação compreende ainda pelo menos uma sequência de região variável de cadeia leve de IgM associada a pelo menos uma das referidas duas regiões variáveis de cadeia pesada de IgM diferentes.

5. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que as referidas sequências da região variável da cadeia leve são acopladas às suas regiões variáveis da cadeia pesada correspondentes, criando uma interface assimétrica entre as cadeias leve e pesada.

6. Molécula de ligação, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a interface assimétrica é criada pela técnica CrossMab, acoplamento knobs-into-holes e/ou acoplamento por pontes de sal.

7. Molécula de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que tem uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica que compreende cinco ou seis unidades de ligação monoespecíficas, em que (i) cada uma das referidas unidades de ligação monoespecíficas compreende duas regiões constantes da cadeia pesada de IgM, cada uma compreendendo pelo menos um domínio Cμ2, Cμ3 e Cμ4 conjugado a uma região de ligação a um alvo de ligação, (ii) pelo menos duas das referidas unidades de ligação monoespecíficas que se ligam a diferentes alvos de ligação, e (iii) uma interface assimétrica externa é criada entre as regiões constantes da cadeia pesada das unidades de ligação monoespecíficas vizinhas que se ligam a diferentes alvos de ligação, em que a interface assimétrica externa é criada por pelo menos uma troca de resíduos de aminoácidos carregados em pares nos domínios Cμ3-Cμ3, em que a troca de aminoácidos carregados em pares é K238 θ D293 ou K268 θ D294; e em que a numeração de aminoácidos é baseada na sequência de Cμ1 a Cμ4 da cadeia μ humana como mostrado na figura 4 e é sequencial desde o início do domínio Cμ1.

8. Molécula de ligação multiespecífica, caracterizada pelo fato de que tem uma estrutura em anel pentamérica ou hexamérica que compreende cinco ou seis unidades de ligação biespecíficas, em que (i) cada uma das referidas unidades de ligação biespecíficas compreende duas regiões constantes da cadeia pesada de IgM compreendendo pelo menos um domínio Cμ2, Cμ3 e Cμ4 conjugado a uma região de ligação a um alvo de ligação, (ii) pelo menos duas das referidas unidades de ligação biespecíficas se ligam a diferentes alvos de ligação, (iii) uma interface assimétrica interna é criada entre duas regiões constantes da cadeia pesada de IgM de cada unidade de ligação biespecíficas, e (iv) uma interface assimétrica externa é criada entre as regiões constantes da cadeia pesada das unidades de ligação biespecíficas vizinhas que se ligam a diferentes alvos; em que a interface assimétrica interna é criada por uma ponte de sal formada por trocas de pares entre resíduos de aminoácidos com carga oposta em pelo menos um dos domínios Cμ2, Cμ3 e/ou Cμ4 das duas cadeias da referida unidade de ligação, em que pelo menos uma referida troca é selecionada a partir do grupo que consiste em R328E, DθE339R, K; R344E, DθD330R, K; K376E, DθE385R, K; R427E, DθE339R, K; T354E, DθI397R, K; E167R, KθK177E, D; K169E, DθE170R, K; D121K, RθK315D, E; e K185D, EθD360K, R; em que a interface assimétrica externa é criada por pelo menos uma troca de resíduos de aminoácidos carregados em pares nos domínios Cμ3-Cμ3, em que a troca de aminoácidos carregados em pares é K238 θ D293 ou K268 θ D294; e em que a numeração de aminoácidos é baseada na sequência de Cμ1 a Cμ4 da cadeia μ humana, conforme mostrado na figura 4 e é sequencial desde o início do domínio Cμ1.

9. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a interface assimétrica interna inclui ainda conexões knobs-into-holes, em que pelo menos uma conexão knobs-into-hole é criada por mutações selecionadas do grupo que consiste em knobs: T350 ^ Y, F, W; e H395 ^ Y, F; e holes: L352 ^ G, A, V, I, M, S, T; H395 ^ A, V, I, L, M, F, Y; F393 ^ W, Y; I397 ^ A, V, S, T; T350 ^ S, A, V; e T348 ^ S.

10. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizada pelo fato de que as referidas regiões de ligação são fundidas aos N-terminais das regiões constantes da cadeia pesada de IgM, e em que pelo menos uma das referidas regiões de ligação é uma região variável de um anticorpo.

11. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizada pelo fato de que é uma molécula de IgM multiespecífica, compreendendo ainda pelo menos uma sequência de região variável de cadeia leve de IgM associada a uma região variável de cadeia pesada de IgM em pelo menos uma das unidades de ligação.

12. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que as referidas sequências da região variável da cadeia leve são acopladas a sua região variável da cadeia pesada correspondente pela criação de uma interface assimétrica entre as cadeias leve e pesada, opcionalmente criada pela técnica CrossMab, acoplamento knobs-into-holes e/ou acoplamento por ponte de sal.

13. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma cadeia J de IgM.

14. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que os alvos de ligação são selecionados dentre peptídeos, polipeptídeos, glicoproteínas, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequenas orgânicas e não orgânicas, tais como polipeptídeos solúveis, receptores de superfície celular, ligantes, transportadores moleculares, enzimas e substratos de enzimas.

15. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que as unidades de ligação que se ligam a diferentes alvos são selecionadas do grupo consistindo em unidades de ligação que se ligam a sítios no mesmo alvo solúvel; sítios no mesmo alvo de receptor de superfície celular; diferentes alvos solúveis; diferentes alvos de receptor de superfície celular; alvos solúveis e de receptor de superfície celular; alvos solúveis ou de receptor de superfície celular e de longo tempo de permanência; alvos solúveis e de proteína de matriz ou de substrato; alvos solúveis ou de receptor e de transportador molecular, e diferentes tipos celulares.

16. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que é conjugada a uma toxina ou a um agente quimioterapêutico, em que a conjugação é por fusão ou por um ligante químico.

17. Molécula de ligação multiespecífica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que é quimérica ou humanizada.