TW202126694A - 標靶cd3的抗體、雙特異性抗體及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明公開了一種標靶CD3的抗體、雙特異性抗體及其用途。所述的標靶CD3的抗體包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL為如SEQ ID NO:56所示的胺基酸序列或其突變；所述VH在如SEQ ID NO:42所示的胺基酸序列上發生突變，所述突變選自一個或多個以下位置：第30位、第73位、第76位、第78位、第93位和第94位的胺基酸殘基。所述雙特異性抗體包括第一蛋白功能區和第二蛋白功能區，其中，所述第一蛋白功能區包含如上所述的標靶CD3的抗體。本發明的標靶CD3的抗體降低細胞激素釋放症候群帶來的毒性，由其製備的雙特異性抗體穩定且具有T細胞結合能力，降低了生產難度。

Description

標靶CD3的抗體、雙特異性抗體及其用途
本申請要求申請日為2019/9/30的中國專利申請2019109413286的優先權。本申請引用上述中國專利申請的全文。
本發明涉及生物製藥領域，尤其涉及一種標靶CD3的抗體、雙特異性抗體及其用途。
T淋巴細胞是重要的參與適應性免疫反應的細胞類別，T細胞透過T細胞受體(TCR)辨識抗原。TCR並不能直接辨識抗原表面表位，而是特異性地辨識抗原呈現細胞(APC)或標的細胞表面呈現的抗原胜肽-MHC分子複合物(pMHC)。T細胞反應的特異性透過由TCR和CD3的分子複合物對pMHC的辨識來媒介。TCR是由兩條不同跨膜多肽鏈構成的異二聚體，肽鏈有α、β、γ、δ四種；根據肽鏈的不同組合，TCR分為TCRαβ和TCRγδ。CD3有不同的跨膜多肽鏈即γ、δ、ε、ζ，這些肽鏈相互作用形成同源二聚體或異源二聚體，作為TCR-CD3複合物的一部分。例如，TCR-CD3複合物包括TCRαβ二聚體、CD3γε二聚體、CD3δε二聚體，CD3ζζ二聚體。由於TCR肽鏈的細胞質域很短，一般認為TCR辨識抗原所產生的活化訊息由CD3肽鏈轉導至T細胞內。
由於CD3在活化免疫反應中的重要作用，標靶TCR-CD3訊息傳遞尤其是針對CD3的單株抗體被認為是可以調節免疫過程並用於治療發炎性疾病或自體免疫性疾病的有效藥物。事實上，抗CD3抗體Orthoclone OKT3是第一個被批准的治療性抗體。OKT3最先在1985年由美國FDA批准用於治療器官移植後的急性排斥反應。儘管OKT3的重複施用帶來的免疫抑制能力為腎移植之後的排斥反應提供了有效治療，然而其應用卻被首次毒性劑量反應症候群所限制；該症候群被認為是與OKT3媒介的T細胞活化和細胞激素釋放相關。後來，由於嚴重的細胞激素風暴和小鼠抗體帶來的免疫原性問題以及其他因素，OKT3於2010年退出市場。
CD3抗體的另一個問題是已發現許多CD3抗體為物種特異性的，例如OKT3與黑猩猩CD3反應但不與其它靈長類諸如獼猴的CD3同系物、或鼠的CD3同系物反應。CD3單株抗體的物種特異性是將其開發為治療人類疾病的抗體藥物的顯著障礙。任何新的候選藥物必須經過嚴格的臨床前驗證以後才能被用於人類患者進行臨床試驗。臨床前測試的目的是證實候選藥物具有期望的活性和最重要地是候選藥物是安全的。臨床前安全性測試是將候選藥物施用於相關物種，優選地為非人類靈長類動物(Non-Human Primates)。但是高等靈長類動物，尤其是黑猩猩，被認為是瀕危物種，使用這種動物進行藥物安全性測試是被高度限制的。本領域描述的適用於安全性評價測試的物種可以是獼猴，特別地是食蟹猴。然而，缺乏靈長類物種特異性交叉反應的CD3抗體難以提供有效的臨床前安全性評估數據。在已知的結合人CD3的抗體中，SP34是極少數的可以結合多種靈長類CD3 (例如人和食蟹猴CD3)的抗體(參見，Salmeron, A.et al .,J Immunol 147 (1991) 3047-3052； Conrad M.L.,et. al. ,Cytometry A71 (2007) 925-933)。
儘管CD3的單抗已經在臨床上驗證了其在某些疾病領域的有效性，然而近年來，CD3抗體更多地是應用到雙特異性抗體藥物的開發中。目前，在全球處於臨床階段或臨床前階段的雙特異性抗體項目中，基於CD3的雙特異性T細胞橋接抗體(BsTCE, Bi-specific T-cell engager)的項目占到一半以上。CD3雙特異性抗體BsTCE一方面如CAR-T細胞治療一樣顯示強勁療效，另一方面又可以像傳統單抗那樣進行生產和產品化。目前全球批准上市的雙特異性抗體藥物中，最先上市的Catumaxomab (2009年歐洲EMA批准上市，2013年從美國下市)和Blinatumomab (2014年美國FDA批准上市)都是BsTCE。CD3抗體是建構BsTCE的重要組成部分。BsTCE雙特異性抗體可以同時結合兩個標的，其中一端可以辨識腫瘤細胞表面的抗原分子(Tumor-associated antigen, TAA)，而另一端可以結合T細胞上的CD3分子。在腫瘤細胞存在下，BsTCE雙特異性抗體結合到腫瘤細胞表面後，可以招募並活化腫瘤細胞附近的T細胞，進而殺死腫瘤細胞。在設計和建構BsTCE雙特異性抗體的各種結構的時候，CD3抗體的選擇和最適化至關重要。第一，CD3單抗的種屬特異性及其重要，尤其是猴類交叉反應。第二，CD3抗體對CD3複合體的親和力也非常重要，過高親和力的CD3抗體可能將把抗體限制在脾臟等部位，難以接觸到腫瘤；而且過高親和力也可能過度刺激T細胞帶來高水準細胞激素釋放。第三，CD3抗體結合價鍵也具有重要影響，以前發現多價形式的CD3雙特異性抗體可能會在沒有結合腫瘤相關抗原情況下活化T細胞導致副反應，因而絕大多數研發中CD3雙特異性抗體是以單價CD3形式的。
除了CD3抗體以外，BsTCE雙特異性抗體的結構設計也非常重要。BsTCE雙特異性抗體的結構多種多樣，主要可分為兩大類：含有Fc的類IgG結構和不含Fc的抗體片段結構。例如，Blinatumomab就是由兩個單鏈可變區抗體片段(scFv)串聯組成的單個多肽鏈結構，但是這種結構半衰期很短，需要連續的靜脈灌注，使用起來非常不方便。因而許多BsTCE雙特異性抗體採用含有Fc的結構以改善分子穩定性和藥代動力學性能。但是由於在BsTCE中CD3結合域通常需要單價形式，因此含有Fc的結構往往是非對稱結構。這些含有Fc的非對稱結構有許多技術困難需要克服，例如非對稱結構中的重鏈同源二聚化問題、輕鏈錯配問題、Fcγ受體引起的分子交聯和ADCC或CDC等效應功能作用等等。從抗TAA的IgG抗體和抗CD3的IgG抗體[圖16 (A)]建構BsTCE雙特異性抗體可以選擇不同的非對稱結構，其中一種常用結構是保留兩個獨立Fab結構域的類IgG結構，這種結構含有四條不同的多肽鏈[兩條不同的重鏈和兩條不同的輕鏈，圖16 (B)所示結構]，與傳統單抗有近似的分子量；但是，這種結構由於含有多個不同的多肽鏈，其可能帶來很多種組合的副產物，這給抗體的表現純化和生產工藝帶來巨大的挑戰。如果把其中CD3抗體的Fab改造成scFv結構，則可以將“四鏈”結構改變為“三鏈”結構[圖16 (C)所示結構]，進一步減少副產物組合的數量，進而降低其生產的複雜性。為建構BsTCE雙特異性抗體，本發明人嘗試將SP34小鼠抗體IgG轉變為scFv，但是無論採用哪一種(VH/VL)排列模式或者改變連接胜肽的長度，都不能得到穩定的scFv，因此本領域急需一種穩定的抗CD3單抗，尤其是其穩定的scFv結構。
綜上所述，本領域急需一種能夠結合靈長類動物的CD3，有合適的CD3結合能力，且具有穩定的單鏈scFv結構的CD3抗體。
為克服本領域缺乏低抗原性、有效且安全的抗CD3抗體和雙特異性抗體非對稱結構的技術問題，本發明提供了一種標靶CD3的抗體、雙特異性抗體及其用途。
為解決上述技術問題，本發明第一方面的技術方案為：提供一種標靶CD3的抗體，其中，所述的標靶CD3的抗體包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL為如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列或其突變；所述VH在如SEQ ID NO: 42所示的胺基酸序列上發生突變，所述突變選自一個或多個以下位址：第30位、第73位、第76位、第78位、第93位和第94位的胺基酸殘基(所述位置使用Chothia編碼規則的位置編號)。所述突變即在原胺基酸序列上發生一個或多個胺基酸殘基的增添、缺失或取代。本發明的標靶CD3的抗體改變了與T細胞的結合能力，降低了細胞激素釋放水準，從而預期降低細胞激素釋放症候群帶來的毒性。
在一較佳的具體實施例中，在所述VH上發生的突變選自以下組合： (a)第30位； (b)第30位、第73 位和第76位； (c)第30位、第93位和第94位； (d)第30位、第73位和第93位； (e)第30位、第93位； (f)第30位、第76位和第78位； (g)第73位、第76位、第93位和第94位； (h)第76位、第78位和第93位； (i)第30位、第73位、第76位、第93位和第94位； (j)第30位、第76位、第78位和第93位。
在一較佳的具體實施例中，在所述VH上發生的突變選自以下組合： (a)N30S； (b)N30S、D73N和S76N； (c)N30S、V93A和R94K； (d)N30S、D73N和V93A； (e)N30S和V93T； (f)N30S、S76N和L78A； (g)D73N、S76N、V93A和R94K； (h)S76N、L78A和V93T； (i)N30S、D73N、S76N、V93A和R94K； (j)N30S、S76N、L78A和V93T。
在抗體的VH具有上述限定的突變的前提下，本發明的抗體在如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列的VL上，或在如SEQ ID NO: 42所示的胺基酸序列的VH上進一步進行突變，使得突變後的胺基酸序列與原胺基酸序列具有80%、85%、90%、95%、98%、99%或以上的相同性，且保持或改善了抗體的功能的胺基酸序列也在本發明保護的範疇。
在一較佳的具體實施例中，所述的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43－55中任一序列所示，和/或，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57－60中任一序列所示。
在一較佳的具體實施例中， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 51所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 51所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 45所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 52所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 50所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 48所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 49所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 53所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 54所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 51所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 55所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示。
在一較佳的具體實施例中，所述抗體包括VL-Linker-VH，或VH-Linker-VL的單鏈可變區抗體(single-chain variable fragment, scFv)。較佳地，所述Linker (即連接胜肽)為(GGGGS)n [縮寫(G4 S)n ]或其變體，其中n為非0自然數，優選1~20，更優選為如SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列。更佳地，所述scFv的胺基酸序列如SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79或SEQ ID NO: 80所示。進一步更佳地，所述抗體還包括可結晶片段(fragment crystallizable, Fc)，所述Fc透過鉸鏈區(Hinge)和scFv相連。
在一較佳的具體實施例中，所述抗體還包括恆定區，優選人源恆定區。較佳地，所述人源恆定區包括人源輕鏈恆定區和人源重鏈恆定區，所述人源輕鏈恆定區優選如SEQ ID NO: 61所示的人κ輕鏈恆定區或如SEQ ID NO: 62所示的人λ輕鏈恆定區。更佳地，所述人源重鏈恆定區為hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4或其突變，優選如SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64所示的重鏈恆定區。
為解決上述技術問題，本發明第二方面的技術方案為：提供一種雙特異性抗體。本發明的雙特異性抗體為三鏈結構，其能減少副產物組合的數量，進而降低其生產的複雜性；但其研發並不是利用現有技術的抗體稍加改造就能夠獲得的。如背景所述，為建構BsTCE雙特異性抗體，本發明人嘗試將SP34小鼠抗體IgG轉變為scFv，但是無論採用哪一種(VH/VL)排列模式或者改變連接胜肽的長度，都不能得到穩定的scFv。發明人經多番突變設計和驗證，發現其中僅有一些突變能使scFv保持穩定結構。本發明的雙特異性抗體包括第一蛋白功能區和第二蛋白功能區，其中，所述第一蛋白功能區包含如本發明的第一方面所述的標靶CD3的抗體；較佳地，所述雙特異性抗體包括以下三條鏈：(1)第一蛋白功能區的VL1-Linker-VH1-Hinge-CH2-CH3 (knob)或VH1-Linker-VL1 -Hinge-CH2-CH3 (knob)，(2)第二蛋白功能區的VH2-CH1-Hinge-CH2-CH3 (hole)和(3)第二蛋白功能區的VL2-CL；所述第二蛋白功能區為標靶另一個標的的抗體，優選標靶B7H4的抗體或標靶ROR1的抗體；所述linker優選為(G4 S)n ，其中n為非0自然數，優選1~20，更優選為如SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列；更佳地，所述雙特異性抗體包括如SEQ ID NO: 88所示的VL1-Linker-VH1-Hinge-CH2-CH3 (knob)、如SEQ ID NO: 86所示的VH2-CH1-Hinge-CH2-CH3 (hole)和如SEQ ID NO: 83所示的VL2-CL，或，如SEQ ID NO: 88所示的VL1-Linker-VH1-Hinge-CH2-CH3 (knob)、如SEQ ID NO: 87所示的VH2-CH1-Hinge-CH2-CH3 (hole)和如SEQ ID NO: 85所示的VL2-CL。本發明的雙特異性抗體克服了標靶CD3的單鏈抗體臂不穩定的缺陷，其穩定且具有T細胞結合能力。僅包含三條鏈的雙特異性抗體容易製備，降低了生產難度。
為解決上述技術問題，本發明第三方面的技術方案為：提供一種分離的核酸，其編碼如本發明的第一方面所述的標靶CD3的抗體或本發明的第二方面所述的雙特異性抗體。
為解決上述技術問題，本發明第四方面的技術方案為：提供一種表現載體，其包含如本發明的第三方面所述的分離的核酸；優選地，所述表現載體選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體。
為解決上述技術問題，本發明第五方面的技術方案為：提供一種基因修飾的細胞，其中，其轉染有如本發明的第四方面所述的表現載體；優選地，所述基因修飾的細胞為真核細胞。
為解決上述技術問題，本發明第六方面的技術方案為：提供一種藥物組成物，其中，所述藥物組成物包含如本發明的第一方面所述的標靶CD3的抗體、本發明的第二方面所述的雙特異性抗體、本發明的第五方面所述的基因修飾的細胞以及藥學上可接受的載體；較佳地，所述藥物組成物還包括免疫檢查點抗體。
為解決上述技術問題，本發明第七方面的技術方案為：提供一種如本發明第一方面所述的標靶CD3的抗體、本發明第二方面所述的雙特異性抗體、本發明第三方面所述的分離的核酸、本發明第四方面所述的表現載體、本發明第五方面所述的基因修飾的細胞或本發明第六方面所述的藥物組成物在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
此外，為解決上述技術問題，本發明第八方面的技術方案為：提供一種藥盒組合，其包括藥盒A和藥盒B；所述藥盒A包含本發明第一方面所述的標靶CD3的抗體、第二方面所述的雙特異性抗體、第五方面所述的基因修飾的細胞或第六方面所述的藥物組成物；所述藥盒B包含其它抗體、雙特異性抗體、基因修飾的細胞或藥物組成物，所述其它抗體、雙特異性抗體、基因修飾的細胞或藥物組成物標靶CD3、B7H4、ROR1或其它標的。所述藥盒A和藥盒B的使用不分先後順序，或先使用藥盒A再使用藥盒B，或先使用藥盒B再使用藥盒A。所述藥盒A中的藥物以可注射的形式例如針劑存在，所述藥盒B中的藥物以可注射的形式例如針劑存在，或可吞服的形式例如藥片或藥丸存在。
本發明的第一方面所述的標靶CD3的抗體、第二方面所述的雙特異性抗體、第五方面所述的基因修飾的細胞、第六方面所述的藥物組成物或第八方面所述的藥盒組合可施用於病人，用於治療相關腫瘤。
在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本發明各較佳實例。
本發明所用試劑和原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於： 1、本發明的單株抗體改變了與T細胞的結合能力，降低了細胞激素釋放水準，從而預期降低細胞激素釋放症候群帶來的毒性； 2、由其製備的雙特異性抗體克服了標靶CD3的單鏈抗體臂不穩定的缺陷，其穩定且具有T細胞結合能力； 3、僅包含三條鏈的雙特異性抗體容易製備，降低了生產難度。
具體實施方式
下面透過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規方法和條件，或按照商品說明書選擇。
在本申請中，術語“抗體”通常是指包含結合抗原的部分的蛋白質，以及任選地允許結合抗原的部分採用促進抗體與抗原結合的構象的支架或骨架部分。可典型地包含抗體輕鏈可變區(VL)、抗體重鏈可變區(VH)或上述兩者。VH和VL區可進一步被區分為稱為互補決定區(CDR)的高度變異區，它們散佈在稱為框架區(FR)的更保守的區域中。每個VH和VL可由三個CDR和四個FR區構成，它們從胺基端至羧基端可按以下順序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重鏈和輕鏈的可變區含有與抗原相互作用的結合結構域。抗體的實例包括但不限於抗體、抗原結合片段(Fab，Fab’，F(ab)2，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫綴合物、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)、抗體片段、抗體衍生物、抗體類似物或融合蛋白等，只要它們顯示出所需的抗原結合活性即可。
在本申請中，術語“可變”通常是指這樣的事實，即抗體的可變結構域的序列的某些部分變化強烈，它形成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，變異性並非均勻地分佈在抗體的整個可變區中。它集中在輕鏈和重鏈可變區中的三個區段，被稱為互補決定區(CDR)或高度變異區(HVR)。可變域中更高度保守的部分被稱為框架(FR)。天然重鏈和輕鏈的可變結構域各自包含四個FR區，大部分採用β-摺疊構型，透過三個CDRs連接，形成環連接，並且在一些情況下形成β-摺疊結構的一部分。每條鏈中的CDRs透過FR區緊密靠近在一起，並與來自另一條鏈的CDR一起形成抗體的抗原結合位置，恆定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的效應功能，例如參與抗體的依賴於抗體的細胞毒性。在本領域中，可以透過多種方法來定義抗體的CDR，例如基於序列可變性的Kabat定義規則(參見，Kabat等人，免疫學的蛋白質序列，第五版，美國國立衛生研究院，貝塞斯達，馬里蘭州(1991))和基於結構環區域位置的Chothia定義規則(參見，Al-Lazikani等人，J Mol Biol 273:927-48, 1997)。在本申請中，還使用包含了Kabat定義和Chothia定義的Combined定義規則確定可變結構域序列和全長抗體序列中的胺基酸殘基(表1)。 表1  本申請抗體CDR定義方法(可參見http://bioinf.org.uk/abs/)
CDR區 Kabat定義 Chothia定義 Combined定義
LCDR1 L24--L34 L24--L34 L24--L34
LCDR2 L50--L56 L50--L56 L50--L56
LCDR3 L89--L97 L89--L97 L89--L97
HCDR1 H31--H35 H26--H32 H26--H35
HCDR2 H50--H65 H52--H56 H50--H65
HCDR3 H95--H102 H95--H102 H95--H102
其中，Laa-Lbb可以指從抗體輕鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列；Haa-Hbb可以指從抗體重鏈的N端開始，第aa位(Chothia編碼規則)至第bb位(Chothia編碼規則)的胺基酸序列。例如，L24-L34可以指從抗體輕鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第24位至第34位的胺基酸序列；H26-H32可以指從抗體重鏈N端開始，按照Chothia編碼規則的從第26位至第32位的胺基酸序列。
抗體Fc結構域媒介的效應子功能如ADCC和CDC也有非常重要的生物學功能，不同的IgG亞型有著不同的ADCC或CDC功能，例如IgG1和IgG3有較強的ADCC和CDC作用，而IgG2和IgG4的作用相對較弱。另外，透過胺基酸突變或者修飾來改變Fc與Fc受體的結合能力也可以調節Fc原有的效應子功能。例如，IgG1中的“LALA”雙突變體(L234A/L235A)能夠顯著降低與FcγRIIIA (CD16A)的親和力，進而降低ADCC作用。另外，P329G突變能夠顯著降低與多種Fcγ受體的結合(參見，Schlothauer T, Herter S, Koller CF,et al. Protein Eng Des Sel. 2016 Oct;29(10):457-466)。在申請中，為了減少CD3抗體與Fcγ受體的結合，這些CD3抗體的Fc引入了“LALA”雙突變體(L234A/L235A)或者“LALAPG”三突變體(L234A/L235A/ P329G)。實施例 1 重組抗體的製備和特徵分析 1.1 製備 IgG 重組抗體
在得到編碼抗體分子的輕、重鏈可變結構域序列以後，可以採用常規的重組DNA技術，將輕、重鏈可變結構域序列和相應的人的抗體輕、重鏈恆定結構域序列進行融合表現，得到重組抗體分子。在本實施例中，抗體重鏈可變結構域序列(VH)透過基因合成並選殖到編碼人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生IgG1抗體的全長重鏈，並且在該IgG1重鏈恆定區引入“LALA”雙突變體(L234A/L235A)(SEQ ID NO: 63)或者“LALAPG”三突變體(L234A/L235A/P329G)(SEQ ID NO: 64)以減少抗體與Fcγ受體的結合。抗體輕鏈可變結構域序列(VL)透過基因合成並選殖到編碼人抗體κ輕鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO: 61)的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生抗體的全長κ輕鏈；或者將VL透過基因合成並選殖到編碼人抗體λ輕鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO: 62)的哺乳動物細胞表現質體載體中，以編碼產生抗體的全長λ輕鏈。
將編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體同時轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到具有輕重鏈正確配對組裝的純化的重組抗體。具體來說，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, #A1383504)中擴增培養。瞬時轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8 × 105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2 × 106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述編碼抗體重鏈的質體和編碼抗體輕鏈的質體以2:3的比例混合共計30 μg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, #31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI (Polysciences, #23966-2) 120 μl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培養10分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS (pH7.4)平衡含有MabSelect ™ (GE Healthcare Life Science, #71-5020-91 AE)的重力管柱(Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱，再用pH3.5的0.1 M甘胺酸洗提目標蛋白，後用pH 8.0的Tris-HCl調節至中性，最後用超濾管(Millipore, #UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的重組抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。1.2 製備單價 scFv-his 重組抗體
將抗體的VH序列和VL序列透過柔性胜肽(Linker)連接起來得到同時編碼VH和VL的單一多肽鏈即單鏈抗體可變區片段(scFv)。如果選擇合適長度的連接胜肽，例如(G4 S)3 (SEQ ID NO: 65(或(G4 S)4 (SEQ ID NO: 66)，VH和VL可以正確地摺疊和組裝成有功能的抗體。根據VH、VL的不同的排列和連接胜肽的不同，可以建構不同的scFv結構(VH-linker-VL或VL-linker-VH)。單個scFv包含由一對VH和VL組成的抗原結合區，通常只能結合一個抗原分子，因而稱為單價結合分子。
為了便於純化，在本實施例中，在scFv的C末端融合有由6個組胺酸組成的His標籤。將編碼scFv和His標籤的多肽序列透過基因合成並選殖到哺乳動物細胞表現質體載體中得到編碼scFv-his的質體轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，利用常規的重組蛋白表現和純化技術，可以得到純化的重組蛋白。具體說來，將HEK293細胞在FreeStyle™ F17 Expression Medium培養基(Thermo, #A1383504)中擴增培養。瞬時轉染開始之前，調節細胞濃度至6~8 × 105 細胞/ml，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養24小時，細胞濃度在1.2 × 106 細胞/ml。準備30 ml培養的細胞。將上述30 μg質體溶解於1.5 ml Opti-MEM減血清培養基(Thermo, #31985088)，並用0.22 µm濾膜過濾除菌。再取1.5 ml Opti-MEM溶入1 mg/ml PEI (Polysciences, #23966-2) 120 μl，靜置5分鐘。把PEI緩慢加入質體中，室溫培養10 分鐘，邊搖晃培養瓶邊緩慢滴入質體PEI混合溶液，於37℃ 8% CO2 震盪培養箱中培養5天。5天後觀測細胞存活率。收集培養物，以3300 g轉速離心10分鐘後取上清；然後將上清高速離心去除雜質。用PBS緩衝液(pH7.4)平衡含有Ni Sepharose excel (GE Healthcare Life Science, #17-3712-01)的重力管柱(Bio-Rad, #7311550)，2-5倍管柱體積沖洗。將上清樣品過管柱；用5-10倍管柱體積的PBS沖洗管柱，先用緩衝液A (含有20 mM咪唑，150 mM磷酸鹽，pH8.0)洗提非特異性吸附的雜蛋白，然後用緩衝液B (含有500 mM咪唑，150 mM磷酸鹽，pH8.0)洗提目標蛋白。最後用超濾管(Millipore, #UFC901024)濃縮換液至PBS緩衝液，得到純化的重組抗體溶液。最後用NanoDrop (Thermo Scientific™ NanoDrop™ One)測定濃度，分裝、存儲備用。1.3 製備雙價 scFv-Fc 重組抗體
在本實施例中，在scFv的C末端融合人IgG1恆定區Fc序列(Glu216-Lys447，包含鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域)建構scFv-Fc重組分子，利用Fc的同源二聚化，形成能夠同時結合兩個抗原分子的雙價的scFv-Fc二聚體分子。並且在Fc引入“LALA”雙突變體(L234A/L235A)或者“LALAPG”三突變體(L234A/L235A/P329G)以減少抗體與Fcγ受體的結合。將編碼scFv-Fc的多肽序列透過基因合成並選殖到哺乳動物細胞表現質體載體中得到編碼scFv-Fc的質體轉染哺乳動物宿主細胞(如人胚腎細胞HEK293)，然後利用實施例1.1所述的蛋白表現純化方法得到純化的重組蛋白。1.4 利用 HPLC-SEC 分析蛋白純度
使用分析型分子粒徑篩析層析法(SEC)來分析蛋白樣品的純度和聚體形式。將分析型層析管柱TSKgel G3000SWxl (Tosoh Bioscience, #08541, 5 µm, 7.8 mm × 30 cm)連接到高壓液相層析儀(HPLC)(Agilent Technologies, Agilent 1260 Infinity II)，用PBS緩衝液室溫下平衡至少1小時。適量蛋白樣品(至少10 µg)用0.22 µm濾膜過濾後注射入系統，並設定HPLC程序：用PBS緩衝液將樣品以1.0 ml/min的流速流過層析管柱，最長時間為20分鐘。HPLC將生成分析報告，報告出樣品內不同分子尺寸組份的滯留時間。實施例 2  CD3 抗體 SP34 的鼠 - 人嵌合抗體重組表現
SP34是來源於小鼠的抗人CD3e的抗體，可以結合多種靈長類CD3，具有活化T細胞的功能。SP34的可變區序列VH和VL已經公開於WO2016071004A1。在本申請中，SP34的VH的胺基酸序列是SEQ ID NO: 42，其對應的小鼠胚系V基因是IGHV10-1；SP34的VL的胺基酸序列是SEQ ID NO: 56，其對應的小鼠胚系V基因是IGLV1。在本實施例中，將SP34的VH序列與包含“LALA”雙突變體(L234A/L235A)的人IgG1抗體重鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO: 63)進行融合產生SP34鼠-人嵌合IgG1抗體的全長重鏈；將SP34的VL的胺基酸序列人抗體λ輕鏈恆定結構域序列(SEQ ID NO: 62)進行融合產生SP34鼠-人嵌合抗體的全長λ輕鏈。
根據實施例1.1的方法製備SP34鼠-人嵌合重組抗體PR000260。下表2為PR000260的重組表現的數據。 表2    重組抗體PR000260的表現和純化
抗體編號 表現系統(體積) 純化方法 產量(mg/L) HPLC-SEC (單體純度%)
PR000260 HEK293 (100 ml) MabSelect 19.30 99.75 %
實施例 3 將 CD3 抗體 SP34 小鼠抗體轉變為重組 scFv 抗體
將SP34的VH序列(SEQ ID NO: 42)和VL序列(SEQ ID NO: 56)透過柔性胜肽(Linker)連接起來得到同時編碼VH和VL的單一多肽鏈即單鏈抗體可變區片段(scFv)。根據VH、VL的不同的排列和不同長度的連接胜肽(SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66)，可以建構不同的scFv結構，並且在scFv的C末端融合有由6個組胺酸組成的His標籤用以純化。如SEQ ID NO: 67所示的連接胜肽也可以用於本申請scFv的建構。
本實施例根據實施例1.2的方法製備了四個重組scFv抗體分子(PR000275, PR000276, PR000307, PR000308)。下表3列出了這四個重組scFv抗體分子的序列編號；下表4為這四個分子的重組表現的數據；圖1為這四個分子經過一步純化後的HPLC-SEC結果，其中(A)為PR000275，(B)為PR000276，(C)為PR000307，(D)為PR000308的結果。可以看出，利用SP34的VH和VL序列建構scFv，無論採用哪一種(VH/VL)排列模式或者改變連接胜肽的長度，都不能得到穩定的scFv。 表3    四個重組抗體分子的結構與序列編號
抗體編號 VH變體 VL變體 分子結構 scFv結構 VH VL 連接胜肽 全長序列 
          (SEQ ID NO:)
PR000275 SP34_VH SP34_VL scFv-his VL-linker-VH 42 56 65 68
PR000276 SP34_VH SP34_VL scFv-his VH-linker-VL 42 56 65 69
PR000307 SP34_VH SP34_VL scFv-his VL-linker-VH 42 56 66 70
PR000308 SP34_VH SP34_VL scFv-his VH-linker-VL 42 56 66 71
表4    重組scFv抗體分子的表現和純化
抗體編號 結構 HEK293表現體積 純化方法 產量 (mg/L) HPLC-SEC (單體純度%)
PR000275 VL-(G4S)3-VH 100 ml Nickel 2.60 46.61 %
PR000276 VH-(G4S)3-VL 100 ml Nickel 0.26 訊號弱
PR000307 VL-(G4S)4-VH 30 ml Nickel 3.33 訊號弱
PR000308 VH-(G4S)4-VL 30 ml Nickel 3.67 訊號弱
實施例 4  SP34 的序列最適化 4.1 可變區序列的人源化和框架區突變
本實施例使用“CDR移植”的方法進行序列的人源化，即：將小鼠抗體的VH的CDR移植到人抗體VH的框架區，將小鼠抗體的VL的CDR移植到人抗體VL的框架區。人抗體VH或VL的框架區的序列可以來源於人的胚系基因序列或者經過V(D)J重排後的抗體序列或者人抗體特定VH或VL基因家族的一致性(consensus)序列。本實施例使用人的胚系基因序列提供的框架區序列作為人源化模板序列，即：人的胚系V基因片段提供框架區FR1，FR2，FR3的序列，人的胚系J基因片段提供框架區FR4的序列。最後以(人) FR1-(鼠) CDR1-(人) FR2-(鼠) CDR2-(人) FR3-(鼠) CDR3-(人) FR4的排列方式建構人源化可變區(VH或VL)序列。
本實施例使用人胚系V基因片段IGHV3-73*01或人胚系V基因片段IGHV3-23*01結合人胚系J基因片段IGHJ1*01的序列作為人源化模板提供框架區序列。並且在第30位、第73位、第76位、第78位、第93位或第94位(按照Chothia編碼規則)引入一個或者多個位置的胺基酸突變，得到多個不同的VH變體序列。
本實施例使用人胚系V基因片段IGLV7-46*02結合人胚系J基因片段IGLJ2*01的序列或者人胚系V基因片段IGKV1-39*01結合人胚系J基因片段IGKJ4*01的序列作為人源化模板提供框架區序列。並且在第2位、第36位、第46位、第49位、第66位、第69位、第71位或第87位(按照Chothia編碼規則)引入零個或者多個位置的胺基酸突變，得到多個不同的VL變體序列。
下表5列出了抗體可變區及最適化變體序列(FV)和CHOTHIA定義的CDR、FR區序列的序列編號。 表5    SP34抗體可變區及其可變區最適化變體序列(FV)和CHOTHIA定義的CDR、FR區的序列表
ID FV FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4
SP34_VH 42 5 1 8 3 11 4 21
VH3730 50 7 1 10 3 17 4 22
VH3731 51 7 1 10 3 18 4 22
VH3732 52 7 2 10 3 18 4 22
VH3733 53 7 2 10 3 19 4 22
VH3734 54 7 2 10 3 20 4 22
VH3735 55 7 2 10 3 17 4 22
VH3230 43 6 1 9 3 12 4 22
VH3231 44 6 1 9 3 13 4 22
VH3232 45 6 2 9 3 13 4 22
VH3233 46 6 2 9 3 12 4 22
VH3234 47 6 2 9 3 14 4 22
VH3235 48 6 2 9 3 15 4 22
VH3236 49 6 2 9 3 16 4 22
SP34_VL 56 26 23 30 24 35 25 40
VL7460 57 27 23 33 24 38 25 40
VL7461 58 27 23 34 24 39 25 40
VK1392 59 28 23 31 24 36 25 41
VK1393 60 29 23 32 24 37 25 41
圖2列出了VH變體序列的對比。圖3列出了VL變體序列的對比。圖4的(A)和(B)分別列出了VH變體序列和VL變體序列在重要位置上的差異。由圖2~4可知，本發明抗體在VH上發生的突變為在如SEQ ID NO: 42所示的胺基酸序列的第30位、第73位、第76位、第78位、第93位和第94位的一個或多個位置上發生了胺基酸殘基的突變。在所述VL上發生的突變為在如SEQ ID NO: 56所示的序列的第2位、第36位、第46位、第49位、第66位、第69位、第71位和/或第87位胺基酸殘基的突變。更詳細的突變資訊可見表5中VH3730、VH3731、VH3732、VH3733、VH3734、VH3735、VH3230、VH3231、VH3232、VH3233、VH3234、VH3235、VH3236、VL7460、VL7461、VK1392和VK1393序列的具體內容。4.2 序列最適化變體的重組抗體分子
將實施例4.1中得到的VH變體序列和VL變體序列進行配對組合，並按照實施例1.1中的方法建構IgG重組抗體，並且在IgG1重鏈恆定區引入“LALA”雙突變體或者“LALAPG”三突變體以降低Fc效應功能。表6列出了經過序列最適化的重組抗體分子的序列表。表7列出了重組抗體的表現的數據。除了VH變體VH3230建構的三個IgG分子的表現產量很低以外，其他IgG分子都有合理的表現產量。 表6    SP34嵌合抗體或者序列最適化抗體的序列表
抗體編號 VH變體 VL變體 VH VL 重鏈恆定區 輕鏈恆定區
      ( SEQ ID NO: )
PR000260 SP34_VH SP34_VL 42 56 63 62
PR000511 VH3231 VL7461 44 58 63 62
PR000512 VH3731 VL7461 51 58 63 62
PR000513 VH3231 VK1393 44 60 63 61
PR000514 VH3731 VK1393 51 60 63 61
PR001848 VH3232 VL7461 45 58 64 62
PR001849 VH3732 VL7461 52 58 64 62
PR002467 VH3230 VL7460 43 57 63 62
PR002468 VH3231 VL7460 44 57 63 62
PR002469 VH3230 VL7461 43 58 63 62
PR002470 VH3230 VK1392 43 59 63 61
PR002471 VH3231 VK1392 44 59 63 61
PR002472 VH3230 VK1393 43 60 63 61
PR002742 VH3730 VL7461 50 58 63 62
PR002743 VH3731 VL7460 51 57 63 62
PR002833 VH3234 VL7461 47 58 64 62
PR002834 VH3235 VL7461 48 58 64 62
PR002835 VH3236 VL7461 49 58 64 62
PR002836 VH3733 VL7461 53 58 64 62
PR002837 VH3734 VL7461 54 58 64 62
PR003886 VH3735 VL7461 55 58 63 62
PR004616 VH3233 VL7461 46 58 63 62
表7    重組抗體表現產量和純度
抗體編號 VH變體 VL變體 HEK293中的 產量(mg/L) HPLC-SEC 單體純度(%)
PR000260 SP34_VH SP34_VL 64.33 99.75%
PR000511 VH3231 VL7461 48.33 99.88%
PR000512 VH3731 VL7461 150.00 100.00%
PR000513 VH3231 VK1393 45.00 100.00%
PR000514 VH3731 VK1393 48.33 100.00%
PR001848 VH3232 VL7461 38.50 99.03%
PR001849 VH3732 VL7461 43.50 99.10%
PR002467 VH3230 VL7460 0.60 n/a
PR002468 VH3231 VL7460 107.25 98.84%
PR002469 VH3230 VL7461 10.20 96.85%
PR002470 VH3230 VK1392 0.60 n/a
PR002471 VH3231 VK1392 62.50 94.96%
PR002472 VH3230 VK1393 0.30 n/a
PR002742 VH3730 VL7461 14.25 100.00%
PR002743 VH3731 VL7460 44.25 100.00%
PR002833 VH3234 VL7461 18.00 98.92%
PR002834 VH3235 VL7461 24.60 95.88%
PR002835 VH3236 VL7461 13.50 95.58%
PR002836 VH3733 VL7461 26.25 94.68%
PR002837 VH3734 VL7461 17.20 97.36%
PR003886 VH3735 VL7461 116 98.49%
PR004616 VH3233 VL7461 22 n/a
4.3 序列最適化變體的重組 scFv 分子
將實施例4.1中得到的VH變體序列和VL變體序列進行配對組合，並按照實施例1.3中的方法製備了多個重組雙價scFv抗體分子。下表8、9分別列出了scFv的序列資訊和蛋白表現情況。從表9可知，尤其是PR000510和PR000627可以得到較好的表現和穩定的分子。圖5顯示了PR000510的(A) SDS-PAGE和(B) HPLC-SEC的結果，可以看出其有很好的單體純度，沒有明顯的聚體。 表8    基於序列最適化後的變體序列建構的scFv分子的結構與序列資訊
抗體編號 VH變體 VL變體 分子結構 scFv結構 VH VL 連接胜肽 全長序列
          ( SEQ ID NO: )
PR000509 VH3731 VL7461 scFv-Fc VH-linker-VL 51 58 67 72
PR000510 VH3731 VL7461 scFv-Fc VL-linker-VH 51 58 67 73
PR000623 VH3231 VK1393 scFv-Fc VH-linker-VL 44 60 67 74
PR000624 VH3731 VK1393 scFv-Fc VH-linker-VL 51 60 67 75
PR000625 VH3231 VK1393 scFv-Fc VL-linker-VH 44 60 67 76
PR000626 VH3731 VK1393 scFv-Fc VL-linker-VH 51 60 67 77
PR000627 VH3731 VL7461 scFv-Fc VL-linker-VH 51 58 67 78
PR000914 VH3231 VL7461 scFv-Fc VH-linker-VL 44 58 67 79
PR000915 VH3231 VL7461 scFv-Fc VL-linker-VH 44 58 67 80
PR001850 VH3732 VL7461 scFv-Fc VL-linker-VH 52 58 67 81
表9    序列最適化後scFv抗體的表現的數據
抗體編號 VH變體 VL變體 HEK293中的產量(mg/L) HPLC-SEC 單體純度(%)
PR000509 VH3731 VL7461 0.00 n/a
PR000510 VH3731 VL7461 7.00 99.84%
PR000623 VH3231 VK1393 0.60 93.29%
PR000624 VH3731 VK1393 1.80 100.00%
PR000625 VH3231 VK1393 0.00 n/a
PR000626 VH3731 VK1393 0.00 n/a
PR000627 VH3731 VL7461 6.00 100.00%
PR000914 VH3231 VL7461 3.33 78.22%
PR000915 VH3231 VL7461 2.67 86.14%
PR001850 VH3732 VL7461 4.88 50.76%
實施例 5 利用 FACS 測定 CD3 抗體和表現 CD3 的細胞的結合能力
利用流式分析法FACS分析CD3抗體與表現CD3的細胞的結合情況，其中表現CD3的細胞可以是：過表現人CD3的CHOK1細胞或者HEK293細胞(編碼人源CD3的γ、δ、ε、ζ鏈ORF的質體和編碼人TCR的α、β鏈ORF的質體共同轉染宿主細胞CHOK1 (ATCC，CCL-61)或者HEK293 (ATCC，CRL-1573)，以建構出表現人TCR/CD3複合物結構的穩定細胞株)；過表現食蟹猴CD3的CHOK1或者HEK293細胞；人pan-T細胞[用人pan-T細胞分離套組(Miltenyi, #130-096-535)從PBMC中分離出]；食蟹猴pan-T細胞。具體地，將收集的細胞用含有2% FBS的PBS (FACS緩衝液)洗兩遍，再加FACS緩衝液重新懸浮，分至96孔盤中，每孔1×105 個細胞，500 g轉速離心5分鐘，棄上清，加入100 μl預先梯度稀釋的CD3抗體，室溫培養1小時，FACS緩衝液洗兩遍，再加入FACS緩衝液稀釋的二抗Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch，#109-545-098)重新懸浮細胞，室溫避光培養30分鐘，FACS緩衝液洗兩遍，再用200 µl FACS緩衝液重新懸浮。使用流式細胞儀(BD FACS CANTOII或ACEA NovoCyte)讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。
圖6顯示實施例2得到的CD3抗體與過表現人CD3的重組CHOK1細胞[圖6(A)]和過表現食蟹猴CD3的重組CHOK1細胞的結合能力[圖6(B)]。其結果說明SP34嵌合抗體PR000260對人CD3和食蟹猴CD3都有較強的結合能力。
圖7的(A)~(G)分別顯示了實施例4.2得到的CD3抗體(包括PR000260及其變體)與人pan-T細胞的結合能力，且計算出CD3抗體在抗體濃度為7.4或10 µg/ml時結合人pan-T細胞的螢光強度MFI以及相對於初始抗體PR000260的相對比值。具體地，SP34 IgG抗體序列最適化以後，PR000512、PR000513、PR001849、PR002837具有與PR000260 (即SP34嵌合抗體)相當的結合能力；而PR000514結合能力略高於PR000260；PR000511、PR001848、PR002469、PR002472、PR002742、PR002833、PR002834、PR002835、PR002836、PR003886和PR004616與T細胞結合的能力較低；PR002467、PR002468、PR002470、PR002471、PR002743則幾乎不結合T細胞(或者說無法在目前抗體濃度下檢測到訊號)。以上結果說明，本發明透過對CD3抗體的序列最適化得到了多個新的抗體，它們與人的T細胞有不同的結合能力，可以適用於不同的應用場景。
圖8的(A)和(B)顯示實施例4.3得到的抗CD3的scFv-Fc單鏈抗體與人pan-T細胞的結合能力，且計算出CD3抗體在抗體濃度為7.4或10 µg/ml時結合人pan-T細胞的螢光強度MFI以及相對於初始抗體PR000260的相對比值。具體地，SP34 scFv抗體人源化最適化以後，PR000624具有與PR000260相當的或略高的結合能力；PR000510、PR000627具有與PR000260相當的或略低的結合能力；而PR001850和T細胞結合的能力明顯低於PR000260。以上結果說明，本發明還透過對CD3抗體的序列最適化得到了幾個穩定的scFv形式的單鏈抗體，它們能夠與人的T細胞結合，以適用於建構雙特異性抗體等應用場景。
圖9顯示了部分從實施例4.2得到的CD3抗體與食蟹猴pan-T細胞的結合能力。可以看出，不同分子對食蟹猴pan-T細胞結合能力不同，而且與其對人pan-T細胞的結合能力呈正相關性；即，對人pan-T細胞結合較強的分子對食蟹猴pan-T細胞結合能力也較強，反之亦然。實施例 6 測定 CD3 抗體對人 T 細胞的活化作用
將梯度稀釋的CD3抗體(如50、10、5、1、0.5、0.05 µg/ml)以每個濃度三個複孔且每孔50 µl塗覆於96孔細胞培養盤中，於4℃過夜。 將人PBMC (妙通生物)或者人pan-T細胞(用人pan-T細胞分離套組(Miltenyi, #130-096-535)從PBMC中分離出)的細胞密度調整至7.5 × 105 /ml，加入人CD28抗體濃度至1 µg/ml，再以每孔200 µl加入到細胞培養盤中，置於CO2 培養箱培養。培養72小時後，取上清，使用IFN-γ ELISA套組(Thermo，#88-7316-77)測定上清中的IFN-γ含量。用GraphPad Prism軟體進行數據分析和製圖。
圖10的(A)~(G)分別顯示了實施例4.2得到的各CD3抗體(包括SP34嵌合抗體)活化人T細胞的能力。當抗體濃度為1 μg/mL時，PR000511、PR000512、PR000513、PR000514活化T細胞後產生IFN-γ水準明顯低於PR000260；當抗體濃度為10 μg/mL時，PR000512、PR000513、PR000514活化的IFN-γ水準略低於PR000260[圖10(A)]。當抗體濃度為0.5 μg/mL和5 μg/mL時，PR001848活化的IFN-γ水準明顯低於PR000260 [圖10(B)]。此外，還檢測了0.5 μg/mL、5 μg/mL和50 μg/mL的抗體PR002468、PR002469、PR002471、PR002742、PR002833、PR002834、PR002835、PR002836、PR002837、PR001848、PR003886和PR004616等活化T細胞的效果[圖10的(C)~(G)]，其結果說明這些抗體活化T細胞產生的IFN-γ水準遠低於PR000260，其中PR002468和PR002471未檢測到IFN-γ的釋放，而PR002469和PR002835僅在50 μg/mL時能夠檢測到微弱的IFN-γ水準；PR002742和PR003886相當，略弱於PR001848；PR002469和PR004616相當，明顯弱於PR001848。以上結果說明，本發明透過對CD3抗體的序列最適化得到了多個新的抗體，它們對人T細胞的活化能力不同，可以控制細胞激素不同的釋放水準，以適用於不同的應用場景。
圖11顯示實施例4.3得到的抗CD3的scFv-Fc抗體活化人T細胞的能力。1 μg/mL和10 μg/mL濃度的PR000510、PR000623、PR000624和PR000627均表現出低於PR000260但高於同型對照抗體的IFN-γ水準，說明這4個分子透過調節T細胞的活化水準來限制細胞激素的釋放。以上結果說明，本發明還透過對CD3抗體的序列最適化得到了幾個穩定的scFv形式的單鏈抗體，它們對人的T細胞的活化能力較弱，有較低的細胞激素釋放水準，以適用於建構雙特異性抗體等應用場景。實施例 7 含有抗 CD3 scFv 抗體的標靶 B7H4 的雙特異性抗體
B7H4是B7家族跨膜蛋白的成員，它在乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌等多種固態腫瘤組織內有高表現，而在正常組織不表現或非常微弱的表現，因此B7H4是特異性非常好的腫瘤相關標的抗原。建構同時標靶B7H4和CD3的雙特異性抗體分子，可以透過標靶和結合到腫瘤細胞表面的B7H4來選擇性地活化腫瘤細胞附近的T細胞，從而對腫瘤細胞進行特異性的毒殺。7.1 製備 B7H4 抗體
B7H4抗體的可變區序列來源於WO2016040724，根據實施例1.1的方法建構針對B7H4的重組IgG抗體PR000014。下表10列出了B7H4抗體PR000014的序列資訊。 表10  B7H4抗體PR000014的輕、重鏈序列資訊
抗體編號 標的 重鏈SEQ ID NO: 輕鏈SEQ ID NO:
PR000014 B7H4 82 83
7.2 製備含有抗 CD3 scFv 抗體的標靶 B7H4 的雙特異性抗體
用實施例7.1得到的B7H4抗體PR000014的序列和實施例4.3得到的CD3單鏈抗體PR000627的序列來建構標靶B7H4 × CD3的雙特異性抗體分子PR002883，其含有三條多肽鏈，分別是：含有CD3單鏈抗體scFv的重鏈(SEQ ID NO: 88)，含有B7H4抗體VH的重鏈(SEQ ID NO: 86)，含有B7H4抗體VL的輕鏈(SEQ ID NO: 83)。其結構如圖16(C)所示。由於該分子有特殊的非對稱結構，為了減少同源重鏈二聚體的產生，在兩條重鏈的恆定區引入了不同的胺基酸突變。同時，為了防止由Fcγ受體結合引起的交聯和降低效應子功能，在重鏈恆定區引入“LALAPG”三突變體(L234A/L235A/P329G)。
用實施例1.1所述方法並結合質體配比(如1:1:1或其他比例)並經過一步親和純化製備雙特異性抗體PR002883的重組蛋白。表11列出了雙特異性抗體PR002883的序列表；表12列出該雙特異性抗體的表現情況。 表11   雙特異性抗體的鏈以及對應的序列資訊
雙特異性抗體 抗B7H4抗體 抗CD3 scFv 重鏈1 SEQ ID NO: 重鏈2 SEQ ID NO: 輕鏈 SEQ ID NO:
PR002883 PR000014 PR000627 88 86 83
表12  雙特異性抗體的表現情況
雙特異性抗體 HEK293中的產量 (mg/L) SDS-PAGE純度 (%)
PR002883 94.0 70
圖12(A)顯示出了雙特異性抗體PR002883經過一步純化後經SDS-PAGE分析的結果。顯示出其主要的副產物是未完全組裝的分子，高聚體組分較少，可以透過最適化純化步驟或者最適化質體轉染比例來減少副產物。7.3 結合表現 B7H4 的腫瘤細胞
本實施例研究雙特異性抗體結合表現人B7H4的腫瘤細胞SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)的能力。具體說來，收集SK-BR-3細胞懸浮液，將細胞密度調整為1 × 106 /ml，以100 µl/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)；隨後以100 µl/孔體積加入2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。放置於4℃避光培養2小時。之後，以100 µl/孔加入預冷PBS漂洗細胞兩次，於500 g、4℃下離心5分鐘，棄上清。再以100 µl/孔加入螢光二抗Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch，#109-545-098)，於4℃避光培養1小時。再以100 µl/孔加入預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g離心5分鐘後棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷PBS重新懸浮細胞。使用流式細胞儀(BD FACS CANTOII或ACEA NovoCyte)讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。
圖13(A)顯示實施例7.1得到的單抗和實施例7.2得到的雙特異性抗體與SK-BR-3細胞的結合能力。可以看出雙特異性抗體PR002883與單抗PR000014相比有相當甚至更好的結合能力。7.4 結合人 T 細胞
用實施例5所述方法檢測雙特異性抗體PR002883與人pan-T細胞結合的能力。如圖13(B)所示，PR002883可以與人pan-T細胞結合。7.5 雙特異性抗體對 B7H4 高表現細胞株 SK-BR-3 的體外毒殺以及細胞激素的釋放
為了研究B7H4 × CD3雙特異性抗體在體外媒介的標的細胞毒殺能力，採用人PBMC作為效應細胞，高表現B7H4的細胞株SK-BR-3 (ATCC, HTB-30)作為標的細胞進行體外毒殺實驗以及細胞激素釋放的檢測。具體的，在E-plate (ACEA Biosciences Inc., #05232368001)裡每孔加入50 µL RPMI1640/10% FBS培養基，放置在37 ℃，5% CO2 培養箱內平衡30分鐘，然後將E-plate放入儀器xCELLigence RTCA (ACEA Biosciences)上檢測是否正常。用RPMI1640/10% FBS培養基將SK-BR-3的密度調整為0.4 × 106 細胞/mL, 50 µL細胞/孔接種於E-plate內，然後將E-plate放在xCELLigence RTCA上過夜檢測細胞指數(cell index)。用RPMI1640/10% FBS培養基將PBMC的密度調整為4 × 106 細胞/mL，50 µL細胞/孔接種於E-plate內，隨後加入50 µL/孔，4倍於終濃度的5倍濃度梯度稀釋的待測抗體，其中抗體最高終濃度為0.2 nM，每個抗體共7個濃度，最終效應細胞與標的細胞的比例為10：1，設置兩個重複。同時，在盤內設置空白對照：SKBR3 + PBMC + RPMI1640/10% FBS培養基；E-plate置於37 ℃ 5% CO2 培養箱培養24小時。培養完成後，將E-plate 放入xCELLigence RTCA儀器上檢測細胞指數。
將檢測的細胞指數按照如下公式計算抗體對細胞的特異性毒殺： 細胞毒殺%=(1-檢測樣品/空白對照)*100%。
收集細胞培養上清，用於檢測細胞激素IFN-γ的釋放。ELISA檢測方法參照IFN-γ套組(IFN gamma Human Uncoated ELISA Kit, Thermo, #88-7316-77)的操作說明。
如圖14的(A)和(B)所示，雙特異性抗體PR002883可以活化T細胞釋放出細胞激素如IFN-γ，並對腫瘤細胞SK-BR-3進行有效地毒殺。當雙特異性抗體的濃度在0.01 µg/ml時，幾乎100%的腫瘤細胞被毒殺[圖14(A)]。實施例 8 含有抗 CD3 scFv 抗體的標靶 ROR1 的雙特異性抗體
ROR1是一種無活性的酪胺酸蛋白激酶跨膜蛋白，其在許多腫瘤中過表現，但在正常組織中幾乎不表現。ROR1作為受體與Wnt5a相互作用後，轉導Wnt訊息途徑，從而有助於慢性淋巴細胞白血病中的細胞增殖和遷移，並且有助於固態腫瘤中的上皮-間質細胞轉化(EMT)。ROR1的腫瘤特異性表現使其成為用於開發治療藥物的合適的腫瘤相關抗原標的。建構同時標靶ROR1和CD3的雙特異性抗體分子，可以透過標靶和結合到腫瘤細胞表面的ROR1來選擇性地活化腫瘤細胞附近的T細胞，從而對腫瘤細胞進行特異性的毒殺。8.1 製備 ROR1 抗體
ROR1抗體的可變區序列來源於WO2016094873，根據實施例1.1的方法建構針對ROR1的重組IgG抗體PR000374。表13列出了ROR1抗體PR000374的序列表。 表13  ROR1抗體PR000374的序列表。
抗體編號 標的 重鏈SEQ ID NO: 輕鏈SEQ ID NO:
PR000374 ROR1 84 85
8.2 製備含有抗 CD3 scFv 抗體的標靶 ROR1 的雙特異性抗體
用實施例8.1得到的ROR1抗體PR000374的序列和實施例4.3得到的CD3單鏈抗體PR000627的序列來建構標靶ROR1 × CD3的雙特異性抗體分子PR002885，其含有三條多肽鏈，分別是：含有CD3單鏈抗體scFv的重鏈(SEQ ID NO: 88)，含有ROR1抗體VH的重鏈(SEQ ID NO: 87)，含有ROR1抗體VL的輕鏈(SEQ ID NO: 85)。其結構如圖16(C)所示。由於該分子有特殊的非對稱結構，為了減少同源重鏈二聚體的產生，在兩條重鏈的恆定區引入了不同的胺基酸突變。同時，為了防止由Fcγ受體結合引起的交聯和降低效應子功能，在重鏈恆定區引入“LALAPG”三突變體(L234A/L235A/P329G)。
用實施例1.1所述方法並結合質體配比(如1:1:1或其他比例)並經過一步親和純化製備雙特異性抗體PR002885的重組蛋白。表14列出了雙特異性抗體PR002885的序列資訊；表15列出該雙特異性抗體的表現情況。 表14 雙特異性抗體的鏈以及對應的序列編號
雙特異性抗體 抗ROR1抗體 抗CD3 scFv 重鏈1 SEQ ID NO: 重鏈2 SEQ ID NO: 輕鏈 SEQ ID NO:
PR002885 PR000374 PR000627 88 87 85
表15 雙特異性抗體的表現情況
雙特異性抗體 HEK293中的產量(mg/L) SDS-PAGE純度(%)
PR002885 90.0 70
圖12(B)顯示出了雙特異性抗體PR002885經過一步純化後經SDS-PAGE分析的結果。顯示出其主要的副產物是未完全組裝的分子，高聚體組分較少，可以透過最適化純化步驟或者最適化質體轉染比例來減少副產物。8.3 結合表現 ROR1 的腫瘤細胞
本實施例研究雙特異性抗體結合表現人ROR1的腫瘤細胞Panc-1 (ATCC, CRL-1469)的能力。具體說來，收集Panc-1細胞懸浮液，將細胞密度分別調整為1 × 106 /ml，以100 µl/孔接種於96孔V底盤(Corning, #3894)；隨後以100 µl/孔體積加入2倍於終濃度的3倍濃度梯度稀釋的待測抗體。放置於4℃避光培養2小時。之後，以100 µl/孔加入預冷PBS漂洗細胞兩次，於500 g下離心5分鐘，棄上清。再以100 µl/孔加入螢光二抗Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragment specific (Jackson ImmunoResearch，#109-545-098)，於4℃避光培養1小時。再以100 µl/孔加入預冷PBS洗滌細胞兩次，於500 g下離心5分鐘，棄上清。最後，以200 µL/孔加入預冷PBS重新懸浮細胞。使用流式細胞儀(BD FACS CANTOII或ACEA NovoCyte)讀取螢光發光訊號值，並用軟體FlowJo v10 (FlowJo, LLC)處理和分析數據。應用軟體GraphPad Prism 8進行數據處理和作圖分析，透過四參數非線性擬合，得到結合曲線及EC50值等參數。
圖15(A)顯示實施例8.1得到的單抗和實施例8.2得到的雙特異性抗體與Panc-1細胞的結合能力。可以看出雙特異性抗體PR002885與單抗PR000374都可以結合Panc-1。8.4 結合人 T 細胞
用實施例5所述方法檢測雙特異性抗體PR002885與人pan-T細胞結合的能力。如圖15(B)所示，PR002885可以與人pan-T細胞結合。
圖1為CD3單鏈抗體經過一步純化後的HPLC-SEC結果：(A) PR000275，(B) PR000276，(C) PR000307，(D) PR000308；
圖2為SP34 VH人源化變體序列比對；
圖3為SP34 VL人源化變體序列比對；
圖4為不同VH/VL變體序列在重要位置上的差異，其中(A)為VH變體序列，(B)為VL變體序列；
圖5為CD3單鏈抗體PR000510經過一步純化後的 (A) SDS-PAGE結果，(B) HPLC-SEC結果；
圖6為CD3抗體PR000260與(A)過表現人CD3的重組CHOK1細胞和(B)過表現食蟹猴CD3的重組CHOK1細胞的結合能力；
圖7為CD3抗體與人T細胞的結合能力，包括結合曲線和MFI相對強度(抗體在特定濃度時結合人T細胞的螢光強度MFI，以及相對於初始抗體PR000260(SP34)的相對比值)或MFI最大值，其中(A) PR000511、PR000512、PR000513、PR000514和PR000260結合人T細胞，(B) PR001848、PR001849和PR000260結合人T細胞，(C) PR002467、PR002468、PR002469、PR002470、PR002471、PR002472、PR001848和PR000260結合人T細胞，(D) PR001848、PR002742、PR002743和PR000260結合人T細胞，(E) PR002833、PR002834、PR002835、PR002836、PR002837、PR002742、PR001848、PR002469和PR000260結合人T細胞，(F) PR003886、PR001848和PR002742結合人T細胞，(G) PR001848、PR002469和PR004616結合人T細胞；
圖8為CD3單鏈抗體與人T細胞的結合能力，包括結合曲線和MFI相對強度(抗體在特定濃度時結合人T細胞的螢光強度MFI，以及相對於初始抗體PR000260(SP34)的相對比值)，其中(A) PR000510、PR000624、PR000627和PR000260結合人T細胞，(B) PR001850和PR000260結合人T細胞；
圖9為CD3抗體與食蟹猴T細胞的結合能力；
圖10為CD3抗體活化人T細胞產生細胞激素IFN-γ的能力，其中(A) PR000511、PR000512、PR000513、PR000514和PR000260活化T細胞，(B) PR001848、PR001849和PR000260活化T細胞，(C) PR002468、PR002469、PR002471和PR001848活化T細胞，(D) PR002742、PR001848和PR000260活化T細胞，(E) PR002833、PR002834、PR002835、PR002836、PR002837和PR000260活化T細胞，(F) PR003886、PR001848和PR002742活化T細胞，(G) PR001848、PR002469和PR004616活化T細胞；
圖11為CD3單鏈抗體(PR000510、PR000623、PR000624、PR000627和PR000260)活化人T細胞產生細胞激素IFN-γ的能力；
圖12為雙特異性抗體(A) PR002883和(B) PR002885經過一步純化後的樣品的SDS-PAGE結果；
圖13為單抗和雙特異性抗體與(A) SK-BR-3細胞和(B) 人T細胞的結合能力；
圖14為雙特異性抗體PR002883在體外媒介的標的細胞毒殺能力(A) SK-BR-3細胞毒殺和(B) IFN-γ釋放水準；
圖15為單抗和雙特異性抗體與(A) Panc-1細胞和(B) 人T細胞的結合能力；
圖16為單抗或雙特異性抗體結構(A) IgG結構，(B) 非對稱“四鏈”結構，(C) 含有單鏈抗體的非對稱“三鏈”結構。
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Claims (15)

  1. 一種標靶CD3的抗體，其特徵在於，所述的標靶CD3的抗體包含輕鏈可變區(VL)和重鏈可變區(VH)，所述VL為如SEQ ID NO: 56所示的胺基酸序列或其突變；所述VH在如SEQ ID NO: 42所示的胺基酸序列上發生突變，所述突變選自一個或多個以下位置：第30位、第73位、第76位、第78位、第93位和第94位的胺基酸殘基；所述位置使用Chothia編碼規則的位置編號。
  2. 如請求項1所述的標靶CD3的抗體，其特徵在於，在所述VH上發生的突變選自以下組合： (a)第30位； (b)第30位、第73 位和第76位； (c)第30位、第93位和第94位； (d)第30位、第73位和第93位； (e)第30位、第93位； (f)第30位、第76位和第78位； (g)第73位、第76位、第93位和第94位； (h)第76位、第78位和第93位； (i)第30位、第73位、第76位、第93位和第94位； (j)第30位、第76位、第78位和第93位。
  3. 如請求項1所述的標靶CD3的抗體，其特徵在於，在所述VH上發生的突變選自以下組合： (a)N30S； (b)N30S、D73N和S76N； (c)N30S、V93A和R94K； (d)N30S、D73N和V93A； (e)N30S和V93T； (f)N30S、S76N和L78A； (g)D73N、S76N、V93A和R94K； (h)S76N、L78A和V93T； (i)N30S、D73N、S76N、V93A和R94K； (j)N30S、S76N、L78A和V93T。
  4. 如請求項1-3中任一項所述的標靶CD3的抗體，其特徵在於，所述的VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43-55中任一序列所示，和/或，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57-60中任一序列所示。
  5. 如請求項4所述的標靶CD3的抗體，其特徵在於， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 51所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 51所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 45所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 52所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 60所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 50所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 47所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 48所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 49所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 53所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 54所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 43所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 44所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 59所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 51所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 57所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 55所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示；或， 所述VH的胺基酸序列如SEQ ID NO: 46所示，所述VL的胺基酸序列如SEQ ID NO: 58所示。
  6. 如請求項1-5中任一項所述的抗體，其特徵在於，所述抗體包含VL-Linker-VH或VH-Linker-VL的單鏈抗體(scFv)； 較佳地，所述Linker為(G4 S)n 或其變體，其中n為非0自然數，優選1~20，更優選為如SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列； 更佳地，所述scFv的胺基酸序列如SEQ ID NO: 73、SEQ ID NO: 74、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 79或SEQ ID NO: 80所示； 進一步更佳地，所述抗體還包括Fc，所述Fc透過鉸鏈區(Hinge)和scFv相連。
  7. 如請求項1-6中任一項所述的抗體，其特徵在於，所述抗體還包括恆定區，優選人源恆定區； 較佳地，所述人源恆定區包括人源輕鏈恆定區和人源重鏈恆定區，所述人源輕鏈恆定區優選如SEQ ID NO: 61所示的人κ輕鏈恆定區或如SEQ ID NO: 62所示的人λ輕鏈恆定區； 更佳地，所述人源重鏈恆定區為hIgG1、hIgG2、hIgG3、hIgG4或其突變，優選如SEQ ID NO: 63或SEQ ID NO: 64所示的重鏈恆定區。
  8. 一種雙特異性抗體，其包括第一蛋白功能區和第二蛋白功能區，其中，所述第一蛋白功能區包含如請求項1~7中任一項所述的標靶CD3的抗體。
  9. 如請求項8所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述雙特異性抗體包括以下三條鏈：(1)第一蛋白功能區的VL1-Linker-VH1-Hinge-CH2-CH3 (knob)或VH1-Linker-VL1-Hinge-CH2-CH3 (knob)，(2)第二蛋白功能區的VH2-CH1-Hinge-CH2-CH3 (hole)和(3)第二蛋白功能區的VL2-CL；所述第二蛋白功能區為標靶非CD3標的的抗體，優選標靶B7H4的抗體或標靶ROR1的抗體，所述linker優選為(G4 S)n ，其中n為非0自然數，優選1~20，更優選為如SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 66、SEQ ID NO: 67所示的胺基酸序列。
  10. 如請求項9所述的雙特異性抗體，其特徵在於，所述雙特異性抗體包括如SEQ ID NO: 88所示的VL1-Linker-VH1-Hinge-CH2-CH3 (knob)、如SEQ ID NO: 86所示的VH2-CH1-Hinge-CH2-CH3 (hole)和如SEQ ID NO: 83所示的VL2-CL，或，如SEQ ID NO: 88所示的VL1-Linker-VH1-Hinge-CH2-CH3 (knob)、如SEQ ID NO: 87所示的VH2-CH1-Hinge-CH2-CH3 (hole)和如SEQ ID NO: 85所示的VL2-CL。
  11. 一種分離的核酸，其編碼如請求項1-7中任一項所述的標靶CD3的抗體或如請求項8-10中任一項所述的雙特異性抗體。
  12. 一種表現載體，其包含如請求項11所述的分離的核酸；較佳地，所述表現載體選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體。
  13. 一種基因修飾的細胞，其特徵在於，其轉染有如請求項12所述的表現載體；較佳地，所述基因修飾的細胞為真核細胞。
  14. 一種藥物組成物，其特徵在於，所述藥物組成物包含如請求項1-7中任一項所述的標靶CD3的抗體、請求項8-10中任一項所述的雙特異性抗體、請求項13所述的基因修飾的細胞以及藥學上可接受的載體；較佳地，所述藥物組成物還包括免疫檢查點抗體。
  15. 一種如請求項1-7中任一項所述的標靶CD3的抗體、請求項8-10中任一項所述的雙特異性抗體、請求項11所述的分離的核酸、請求項12所述的表現載體、請求項13所述的基因修飾的細胞或請求項14所述的藥物組成物在製備治療腫瘤的藥物中的應用。
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