CN102272160A - 抗rhd单克隆抗体 - Google Patents
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Abstract
抗RHD单克隆抗体及其生产方法。
Description
发明领域
本发明涉及抗恒河猴D单克隆抗体及其抗原结合片段的生产和用途。
背景和先有技术
恒河猴D抗原（本领域也称为RhD抗原，恒河猴因子和/或Rh因子）是可以存在于人红细胞表面上的抗原。红血细胞带有这个抗原的那些个体通常被称为“RhD-阳性”，而红血细胞不带有这个抗原的那些个体被称为“RhD-阴性”。
RhD-阴性和从未暴露于RhD抗原的人将不会产生抗-RhD抗体（针对RhD抗原的抗体）。然而，RhD-阳性血液向RhD-阴性个体的转移将导致RhD-阴性个体对RhD抗原的敏化（免疫）。这可能导致许多并发症。特别地，当RhD-阴性妇女生育RhD-阳性婴儿时，存在着少量婴儿血液进入母亲循环的风险，引起母亲产生抗-RhD抗体。虽然这通常将不会损害新生儿，当现在被免疫的母亲怀孕另一个RhD阳性儿童时，母亲的抗-RhD抗体可能穿过胎盘并攻击婴儿的血细胞，导致称为新生儿溶血性疾病（HDN）的状况。
抗-RhD抗体因此被常规地施用给具有暴露于 RhD-阳性血液的风险的RhD-阴性患者，以免患者变为对 RhD-阳性血液免疫。例如，RhD-阴性患者可以给予抗-RhD抗体：在RhD-阳性婴儿的生育或堕胎之前和/或之后不久；在妊娠期间任何可能导致跨胎盘的出血的任何事件之后；作为妊娠期间常规的预防措施；或在含有RhD-阳性红血细胞的血液成分的任何输注之前或之后不久。
常规地，使用的抗-RhD抗体是从已经重复地被 RhD-阳性红血细胞免疫的RhD阴性志愿者血浆获得的多克隆抗体。然而，多克隆抗体的使用具有许多公认的缺点，其至少有足以满足抗体需求的对志愿者供体数量的持续要求，以及带有可能在供体血液中存在的任何病毒或其他病原体的抗体制品的污染风险。
然而，多克隆抗体构成许多不同的浆细胞分泌的抗体，并且因而构成针对特定抗原分泌并且潜在地识别多种表位的免疫球蛋白分子的混合物，单克隆抗体产自作为单个亲本细胞的全部克隆物的细胞，因而构成抗体的匀质群体，这是本领域公知的。产生单克隆抗体的细胞系在体外发展和培养，这意味着单克隆抗体以大数量和高水平纯度、以及当需要大数量和高水平纯度时进行生产的潜力。因而，单克隆抗-RhD抗体具有相对常规使用的多克隆抗-RhD抗体制品的许多潜在优点。
已经描述了一般地生产人类单克隆抗体，特别是人类单克隆的抗-RhD抗体的许多技术。例如，EP-A2-0251440公开了通过融合非Ig分泌小鼠骨髓瘤细胞与EB病毒（EBV）转化的人类淋巴细胞的抗-RhD Ig生产性群体而形成的、生产抗-RhD单克隆抗体的异杂交瘤。
US 5,665,356描述了具有某些限定特征、通过培养选择的EBV转化的人类B淋巴细胞产生的人类单克隆抗-RhD抗体的生产。
US 6,312,690描述了通过重组技术生产抗-RhD单克隆抗体。选择了生产称为D7C2的抗恒河猴D单克隆抗体的EBV永生化人类细胞系。编码D7C2的重链（H）和轻链（L）的可变区的序列被克隆、测序并插入到处在强杆状病毒启动子控制下的重组杆状病毒表达载体中。培养用该重组杆状病毒转染的昆虫细胞，从细胞上清液回收重组D7C2单克隆抗体。
US-A1-2003/0175969描述了制备能够活化表达FcγRIII的效应细胞的抗-RhD单克隆抗体的方法，包括： a）纯化从选自人类B淋巴细胞异杂交瘤或重组的动物或人类细胞系（例如CHO-K、CHO-Lec10、CHO Lec-1、CHO Pro-5、CHO dhfr-、Wil-2、Jurkat、Vero、Molt-4、COS-7、HEK293、YB2/0、BHK、K6H6、NSO、SP2/0-Ag 14和P3X63Ag8.653细胞）的细胞系获得的单克隆抗体；b）将步骤a）获得的每种抗体添加到包含 RhD-阳性红血细胞、包含表达FcγRIII的细胞的效应细胞、多价IgGs的不同的反应混合物中；以及 c）测定目标细胞裂解的百分比，选择活化效应细胞引起 RhD-阳性红血细胞的显著裂解的单克隆抗体。
US 6,475,787公开了制备单克隆抗体的方法，其中适合的真核宿主细胞用编码抗体重链的DNA序列和编码抗体轻链的DNA序列转化，两个序列连接到不同的可扩增标记物基因以容许重链和轻链DNA的差异扩增，以优化重链和轻链DNA的相对基因拷贝数量。在优选的实施方式中，宿主细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，其是DHFR缺陷的（即，不能生产二氢叶酸还原酶），可扩增的标记物基因之一是腺嘌呤核苷脱氨酶（ADA）基因，另一个是DHFR基因。编码一条抗体链和连接在ADA基因中的DNA的扩增然后可以通过用提高浓度的2'-脱氧柯福霉素处理重组细胞来实现，而编码另一个抗体链和连接在DHFR基因中的DNA的扩增可以通过用提高浓度的氨甲喋呤（MTX）处理细胞来实现。
尽管如此，仍然需要进一步的抗-RhD单克隆抗体及其生产方法。
发明描述
根据本发明的第一个方面，提供了分离的抗-RhD单克隆抗体，其包含
a）具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：2的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR（互补决定区）的重链可变区，和具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：4的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
b）具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：6的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：8的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
c）具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：10的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：12的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
如在此使用的，术语“抗-RhD抗体”是指具有对RhD抗原的结合特异性的完整的抗体和其片段。抗体的结合亲和性/特异性可以通过各种分析来测量，这是本领域普通技术人员公知的和可以常规地实现的。例如，识别和特异性结合RhD抗原的抗体可以使用本领域普通技术人员已知的一种或更多种标准技术来测定，例如，但不限于：EIA/ELISA技术，例如，竞争性EIA（酶联免疫测定）；流式细胞术；和/或ADCC（抗体依赖性细胞毒性）分析。示范性的竞争性EIA、流式细胞术和ADCC技术在以下的实施例中进一步详细地描述了。
如本领域公知的，完整抗体一般由一个或两个重链和一个或两个轻链形成。重链和轻链各自包含可变区和恒定区。可变区（也称为可变域）规定抗体的抗原结合特异性。每个可变域由互补决定区（CDR，其一般有三个，称为CDR1、CDR2和CDR3）组成，散布在称为框架区的更为保守的区域中。在抗体折叠而采取正确的四级结构时，重链和轻链的CDR一起形成抗原结合位点。重链的恒定区由三个或更多个恒定域组成，取决于抗体的种类（例如，IgA、IgD、IgE、IgG或IgM）和同种型（例如，IgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）。它在同一种类和同种型的所有抗体中是相同的，但是在不同同种型的抗体中不同。轻链恒定区由单个恒定域组成，其是两种同种型之一，kappa或lambda，在同一同种型的所有抗体中是同样地相同的。抗体的恒定区一般介导了抗体对宿主组织或因子的结合。
根据本发明的抗体片段一般地包括至少CDR和足够的框架区以特异性结合抗原。片段的示范性的类型包括，但不限于，Fab'片段（由轻链和重链两者的可变域和恒定域组成），F（ab '）2片段（由铰链区的二硫键连接的两个Fab'片段）、Fv片段（由仅轻链和重链的可变域组成），以及本领域技术人员已知的其他片段类型。
SEQ ID NO：2和4是在此称为RhD1和如下进一步描述的抗-RhD单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO：6和8是在此称为RhD2和如下进一步描述的抗-RhD单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列。SEQ ID NO：10和12是在此称为RhD3和如下进一步描述的抗-RhD单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列。
根据本发明的第一方面的抗体因而包含具有第一、第二和第三互补决定区（即，CDR1、CDR2和CDR3）的重链和轻链可变区，所述第一、第二和第三互补决定区相同于或基本上相同于抗体RhD1、RhD2或RhD3的第一、第二和第三互补决定区（CDR1、CDR2和CDR3）。
如在此使用的，如果它们具有优选地是至少80%相同的和/或不同不超过一个氨基酸的氨基酸序列，两个CDR是“基本上相同的”。更优选的，所述序列是至少90%相同的和/或不同不超过一个氨基酸。优选的，当发生氨基酸取代时，这样的取代是保守的取代。当两个抗体的CDR是至少基本上相同的时，合理的是预测，两个抗体的产生的抗原结合位点将具有类似的抗原结合性质。例如，抗体RhD1和RhD2具有高度相似的CDR，这可以从附图1和2看出（如下文进一步详述的），都具有对RhD抗原的高结合亲和性。
最优选的，抗体的CDR与RhD1、RhD2或RhD3是相同的。
如在此使用的，术语“分离的单克隆抗体”是指一种抗体，其通过单克隆技术产生，并且其已经与其他类型的抗体分离。换句话说，存在的仅有的其他抗体将是由与产生所述单克隆抗体的细胞相同细胞系（即，都来自相同的单个亲本细胞的细胞）的细胞产生的抗体。例如，这与多克隆抗体相比是当然的，多克隆抗体中抗体构成来自不同浆细胞的不同抗体的混合物。
在优选的实施方式中，分离的抗-RhD单克隆抗体包含重链和轻链可变区，其至少80%、更优选的至少90%、更优选的至少95%、更优选的至少98%、最优选的至少100%相同于RhD1、RhD2或RhD3抗体的重链和轻链的相应的可变区，它的CDR与这些抗体是至少基本上相同的。因而，在这个实施方式中，抗体包括以下任一的：
a）至少80%、90%、95%、98%或100%相同于SEQ ID NO：2的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：2的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，以及至少80%、90%、95%、98%或100%相同于SEQ ID NO：4的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：4的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
b）至少80%、90%、95%、98%或100%相同于SEQ ID NO：6的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：6的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，以及至少80%、90%、95%、98%或100%相同于SEQ ID NO：8的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：8的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
c）至少80%、90%、95%、98%或100%相同于SEQ ID NO：10的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：10的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，以及至少80%、90%、95%、98%或100%相同于SEQ ID NO：12的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：12的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
鉴定抗体可变区和CDR、比较和比对氨基酸序列以及确定两个氨基酸序列之间同一性%的技术是本领域公知的。例如，抗体的CDR、可变区和恒定区可以利用软件，例如IMGT/V-QUEST工具（http://imgt.cines.fr/IMGT vquest/share/textes/）使用默认设置，和/或通过与已知免疫球蛋白序列的数据库例如IMGT/GENE-DB（http://imgt.cines.fr/IMGT GENE-DB/GENElect?livret=0）或V-BASE（http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）比较来确定。氨基酸或核酸序列序列，无论是完整抗体还是其特异性部分的，可以进行比对和确定它们的同一性%，利用ClustalW（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/）、ClustalW2（http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/）或GAP（http://genome.cs.mtu.edu/align/align.html）使用默认参数，或使用专用软件例如Vector NTI v.10.3。
在优选的实施方式中，所述抗体进一步包含轻链恒定域和至少一个重链恒定域。轻链恒定域可以是kappa或lambda型的。重链恒定域优选地是IgG类恒定域。因而，在这个实施方式中，抗体可以是例如Fab'或F（ab '）2片段，如以上讨论的，或可以是完整的抗体。如果是后者，优选的所有重链恒定域是IgG结构域（即，抗体包含IgG重链恒定区）。在特别优选的实施方式中，恒定域或区是IgG1或IgG3恒定域或区。优选的，所有恒定域（轻和重的）是人类恒定域。
根据本发明的第二方面，提供了编码根据所述第一方面的抗体的轻链和/或重链的分离的多核苷酸。
如在此使用的，术语“分离的多核苷酸”是指一种多核苷酸，其已经从细胞环境分离（即，它不在细胞或生物体中存在），它可以是含有其他多核苷酸和/或化合物的组合物的形成部分的纯化的形式（即，基本上没有其他多核苷酸、蛋白质或细胞成分）。术语“编码轻链”不仅是指编码完整轻链的序列，还指编码其片段的序列（例如，仅可变域），其中要表达的抗体是如上所述的抗体片段。类似地，术语“编码重链”不仅是指编码完整重链的序列，还指编码其片段的序列（例如，仅可变域，或可变域加一个或更多个但非所有的恒定域），其中要表达的抗体是如上所述的抗体片段。
示范性的核酸序列包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9和11的相关编码序列，这些序列分别是氨基酸SEQ ID NO：2、4、6、8、10和12的编码序列。因而，例如，如果抗体包含与SEQ ID NO：2和4（称为RhD 1的抗-RhD抗体的重链和轻链）的可变区相同的可变区，则示范性的核酸序列可以包含编码所述可变区的SEQ ID NO：1和3的片段。做为选择，这样的核酸序列可以是为了在期望的宿主细胞中最佳表达（即，转录和/或翻译）而修饰的，例如，通过本领域技术人员已知的技术。例如，天然核酸序列的优化可以包括一种或更多种的：优化GC分布以及AT/GC延伸（来增强mRNA的稳定性）；除去抑制性基序（例如，成熟前polyA信号）；除去隐藏的剪接位点（来防止mRNA的选择性的不正确剪接）；优化mRNA二级结构（来避免可能拖延翻译的紧密发夹）；优化开放阅读框（来避免第二的或可选择的阅读框）；以及优化密码子利用率（来避免可能减慢翻译的罕有密码子）。
根据本发明的第三方面，提供了包含一种或更多种表达载体、并包括编码根据第一方面的抗体的轻链和重链的编码序列的表达系统。
所述表达载体可以是本领域中使用的任何类型的，例如，质粒和病毒载体。本发明的表达载体优选地是质粒。除了抗体链编码序列之外，载体将包括用于在预期的宿主细胞中编码序列的适当转录和翻译的必要的调节序列，例如，适合的启动子和多聚腺苷酸（polyA）序列。载体可以进一步包含用于提高表达效率的Kozak序列，和/或编码信号肽用于抗体链的翻译后转运的序列（例如，用于抗体的分泌）。进一步的优选的特征是存在一种或更多种抗生素抗性基因和/或其他形式的选择标志物，容许用所述载体稳定转染的细胞、和/或显示了抗体编码序列的更强表达的细胞的选择，如下文更详细地讨论的。
用于驱动轻链和重链编码序列的表达的启动子和poly（A）序列可以是本领域中使用的任何类型的。多种不同的启动子和poly（A）序列是已知的，用于选定宿主细胞中的合适的启动子和poly（A）序列的选择在本领域普通技术人员的能力之内。例如，用于哺乳动物宿主细胞的适合的启动子包括SV40早期和晚期、延伸因子1（EF-1）和巨细胞病毒（CMV）启动子。适合的poly（A）序列包括来自SV40poly（A）、牛生长激素（BGH）、胸腺核苷激酶（TK）和人生长激素（hGH）的那些。在优选的实施方式中，轻链和重链编码序列由人类延伸因子1α（hEF-1α）启动子和BGH poly（A）序列驱动。
在一个实施方式中，表达系统包含表达载体，其包括轻链的编码序列和重链的编码序列两者。
在可选择的实施方式中，轻链和重链编码序列由独立的载体携带，所述表达系统包含：
包括编码轻链的编码序列的第一表达载体；和
包括编码重链的编码序列的第二表达载体。
在这个实施方式中，所述第一和第二表达载体的之一或两者可以包括二氢叶酸还原酶（dhfr）选择标志物。这种标志物包含DHFR的编码序列，其与适合的启动子和多聚腺苷酸序列联结，优选的SV40早期（SV40E）启动子和poly（A）序列。DHFR容许DNA前体胸腺嘧啶核苷的从头合成。因此，通过转染DHFR缺陷的宿主细胞系（即，其本身不能产生DHFR），人们可以通过在不含脱氧核糖核苷和核糖核苷的介质中生长细胞来选择在它们的基因组中稳定地整合了所述载体的细胞。此外，一旦分离了成功地转染的细胞，期望的编码序列（即，轻链和/或重链）的表达可以通过使用DHFR抑制物甲氨蝶呤（MTX）来扩增，其通过扩增围绕dhfr基因的DNA的大区域来使某些细胞起反应。
在优选的实施方式中，所述第一和第二表达载体之一包括抗生素抗性基因（赋予对所讨论的抗生素的抗性的核酸序列），但是不包括DHFR编码序列，所述表达载体的另一个包括DHFR编码序列但是不包括提供与所述抗生素抗性基因相同的抗生素的抗性的基因。抗生素抗性基因可以是本领域中使用的任何类型的。例如，用于给哺乳动物宿主细胞赋予抗性的适合的抗生素抗性基因包括：氨基糖苷类（例如，新霉素、潮霉素B）抗性基因，例如，新霉素磷酸转移酶（npt）和潮霉素B磷酸转移酶（hpt，hph）、氨基核苷（例如，嘌呤霉素）抗性基因例如嘌呤霉素N-乙酰基转移酶（pac）；糖肽（例如，博来霉素、腐草霉素）抗性基因例如ble基因；和肽基核苷（例如杀稻瘟菌素）抗性基因例如bls、bsr或bsd基因。对于dhfr选择标志物，抗生素抗性基因可以如所需的连接到任何适合的启动子和多聚腺苷酸序列。优选的是SV40早期（SV40E）启动子和poly（A）序列。
在特别优选的实施方式中，抗生素抗性基因包含新霉素磷酸转移酶（NPT）编码序列。用包括NPT编码序列的载体稳定地转染的细胞因此可以通过在含有新霉素、或新霉素类似物例如G418的介质中生长细胞来选择，它们的毒性作用被NPT中和。
因而，上文描述的实施方式，其中一个载体具有dhfr选择标志物以及另一个具有抗生素选择基因，容许通过在缺少脱氧核糖核苷和核糖核苷并且含有相关抗生素（例如，当抗生素抗性基因是npt基因时，新霉素或适合的类似物）的介质中生长细胞，来仅选择那些在它们的基因组中稳定地整合了两种载体的细胞。未转染的或仅被一个质粒转染的细胞将不会在选择过程中存活。此外，由于共转染的质粒经常整合到基因组中的一个位点，成功地转染的细胞在提高浓度MTX下的随后的生长仍然可以用于有效地扩大由两个载体编码的抗体链的表达（即，扩大重链和轻链序列两者的表达）。
要注意的是，虽然在这个实施方式中带有dhfr选择标志物的载体不包括一种基因，所述基因提供与另一个载体携带的抗生素抗性基因相同的抗生素的抗性，该载体以及实际上两种载体可能进一步包含提供针对进一步的抗生素的抗性的不同抗生素抗性基因。再一次，其他抗生素基因可以是本领域中使用的任何类型的。例如，当一个而不是两个载体带有NPT编码序列（提供针对新霉素和其类似物的抗性）时，两种载体都可以有用地额外包含氨苄西林抗性（AmpR）基因，目的是当整合到细菌宿主细胞中时提供氨苄西林抗性。通常用于赋予细菌宿主中的抗性的其他抗生素抗性基因包括：β内酰胺酶基因（提供对β内酰胺酶抗生素例如氨苄西林和其他青霉素的抗性），例如，TEM-1 β-内酰胺酶；提供对氨基糖苷类例如链霉素、卡那霉素、妥布霉素和阿米卡星的抗性的基因；以及四环素（例如，四环素、多西环素、米诺环素、土霉素）抗性基因，例如，tetA基因。
根据第四方面，本发明提供了用根据第三方面或第四方面的表达系统转化的细胞。
本发明中使用的宿主细胞可以是任何适合的类型。然而，在优选的实施方式中，宿主细胞（被转染的细胞）是真核细胞，更优选的脊椎动物细胞，最优选的哺乳动物细胞。多种适合的哺乳动物宿主细胞是可获得的，例如，在上文提及的US-A1-2003/0175969中列出的。优选的哺乳动物宿主细胞包括：CHO细胞的所有变体，例如CHO K1和dhfr缺陷的CHO（DG44，DXB11）；HEK293；BHK；COS-1和COS-7；NSO；和PER.C6。优选的宿主细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，特别是dhfr缺陷的CHO细胞（dhfr-CHO细胞）。宿主细胞可以使用标准技术和转染条件利用表达载体来转染，例如，本领域中已知的。示范性的转染条件在以下的实施例中提供了。
根据第五方面，本发明提供了制造单克隆抗体的方法，包括培养根据第四方面的重组细胞，以及从培养基回收单克隆抗体。示范性的生长培养基和条件在以下的实施例中提供了，但是可以使用任何适合的生长条件和商业的或常规生长培养基，它们是本领域中常规采用的。同样地，可以采用用于从生长培养基纯化分泌的抗体的任何标准技术，示范性的技术再次在下文列出。
根据第六方面，本发明提供了包含根据第一方面的单克隆抗体的药物组合物。优选的，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体。
单克隆抗体可以取决于预期的施用途径按需要配制。例如，单克隆抗体可以被配制用于注射（例如，肌肉内地），类似于常规的多克隆抗-D制剂。示范性的剂量范围从150到300微克（通过凝集价来测量的，如下文进一步详细描述的）。示范性的载体包括：磷酸盐缓冲盐水；以及甘氨酸盐水缓冲液。
组合物可以包含仅单个类型的单克隆抗体（即，组合物中存在的仅有的抗体是通过相同细胞系的细胞产生的抗体）。做为选择，组合物可以包含超过一种类型的单克隆抗体的组合。例如，组合物可以包含根据本发明的第一方面的两种或更多种不同类型的单克隆抗体，例如，单克隆抗体RhD1、RhD2和/或RhD3的两种或全部三种的组合。做为选择或另外地，除了根据本发明的第一方面的单克隆抗体之外，组合物可以包含其他抗-RhD单克隆抗体，例如现有技术中已知的那些。在优选的实施方式中，所述组合物包含至少一种具有IgG1恒定域或区的单克隆抗体，以及至少一种具有IgG3恒定域或区的单克隆抗体。
当组合物包含超过一种单克隆抗体的组合时，优选的是，所述组合物包含不超过50种不同类型的单克隆抗体。更优选的，所述组合物包含最多25、20、15、10或5种不同类型。
根据第七方面，本发明提供了抑制或阻止 RhD-阴性人类患者对 RhD-阳性血液免疫的方法，包括施用预防有效量的根据第一方面的单克隆抗体或根据第六方面的药物组合物。
可以施用单克隆抗体的具体适应症和/或状况相应于施用现有的抗-RhD多克隆抗体的那些。
根据第八方面，本发明提供了根据第一方面的单克隆抗体、或根据第六方面的药物组合物，其用于抑制或阻止 RhD-阴性人类患者对 RhD-阳性血液免疫的方法中。
根据第九方面，本发明提供了根据第一方面的单克隆抗体在制造用于抑制或阻止 RhD-阴性人类患者对 RhD-阳性血液免疫的药物中的用途。
在以下非限制性实施例中进一步说明了本发明，还参考附随的附图，其中：
附图1是单克隆抗体RhD1、RhD2和RhD3的重链的氨基酸序列的比对，其中可变区是下划线的，互补决定区以粗体来突出；
附图2是单克隆抗体RhD2、RhD2和RhD3的轻链的氨基酸序列的比对，其中可变区是下划线的，互补决定区以粗体和阴影来突出；
附图3是质粒载体pCB3的图；
附图4是质粒载体pCB11的图；
附图5是含有抗-RhD抗体重链（RhD HC）编码序列的pCB3的图；以及
附图6是含有抗-RhD抗体轻链（RhD LC）编码序列的pCB11的图；
附图7是ADCC分析中产生的剂量反应曲线的实例，其中细胞毒性相对于抗体浓度的对数来标绘，在所述浓度下红血球被预敏化；以及
附图8是对取自附图7的相关数据点进行的线性回归的实例。
数目为48个的序列表在附图之后提供。
序列表还以电子形式在附随的CD中单独地提供。
实施例
外周血单核细胞（PBMC）和B细胞从用恒河猴D（RhD）阳性红血细胞超免疫的健康志愿者的外周血分离
来自健康 RhD-阴性志愿者的血液来源于Cliniqa，所述健康 RhD-阴性志愿者用分离自相同ABO血型健康 RhD-阳性个体的红血细胞重复地免疫。在最后的免疫后四周内，检查血清中的抗-RhD滴度，志愿者进行抽血，通过Ficoll-Hypaque（Pharmacia）梯度离心从其他血细胞群体中分离他们的外周血单核细胞（PBMC），细胞新鲜地使用或低温保存待后使用。通过用2% S-（2-氨乙基）异硫脲二氢溴酸盐（AET）处理的绵羊红细胞重新设置来常规地耗尽T细胞，产生的富集的B细胞用Epstein-Barr病毒（EBV）转化。
EBV转化
由于EBV 活化已经显示对于随后人类B细胞与相应的融合配体的融合是有益的，富集的B细胞利用来自作为病毒源的B95-B狨猴细胞系的废弃上清液用EBV转化。重悬浮在具有30%胎牛血清（FCS）的完全IMDM介质（Gibco）中的B细胞以5×103到2.5×104个细胞/孔之间的浓度接种在96-孔平板中。B95-8上清液以总体积5%到40%的数量添加到反应孔中。在筛选之前，平板在潮湿的5% CO2孵化器中在37℃孵育两到四周。
对平板筛选分泌抗-RhD抗体的转化体
通过竞争性酶联免疫分析（EIA）对转化的B细胞的上清液筛选抗-RhD抗体的存在。测试的原理如下：已知结合亲和性和特异性的标记的单克隆抗-RhD参考抗体（Brad-5；NIBSC）与未标记的抗体（在这种情况下，上清液中分泌的抗体）竞争结合 RhD-阳性红血球。参考单克隆抗体（mAb）结合的抑制作用表明存在结合与参考mAb相同的免疫决定簇表位的RhD特异性抗体。参考mAb结合的抑制程度与干扰抗体的浓度和亲和力相关。
用木瓜蛋白酶处理的RhD-阳性红血球（R2R2单体型；ImmucorGamma）用戊二醛固定，固定在96孔平底测试平板的底部。在平板的广泛的洗涤和封闭之后，来自转化的B细胞的上清液、标准物以及阴性对照添加到反应孔中，平板在室温下（RT）孵育30-60分钟。平板洗涤三次。添加生物素化的参考mAb，平板在RT再孵育30分钟。再一次洗涤平板，与二级试剂ExtrAvidin-碱性磷酸酶共轭物（Sigma）在RT孵育30分钟。在另一个洗涤步骤之后，添加Sigma Fast PNPP（p-硝基苯基磷酸盐）底物（Sigma）。当颜色充分地发生时，用3N NaOH停止反应，通过在平板读取器（Bio-Rad）上读取光密度（405 nm）来检测参考mAb的结合。数据用平板读取器提供的软件包来分析。
细胞融合
由于用EBV转化的人类 B细胞是不稳定的，并且可能快速地停止生产抗体，与适合的融合配体的融合通常是延长它们的生命期和允许它们的亚克隆所必需的。因而，通过EIA评估的（参见上文）产生抑制生物素化的参考抗体与RhD+红血球结合的抗体的转化B细胞的任何培养物，通过标准的聚乙二醇（PEG）方法或通过电融合来与人类异杂交瘤K6H6/B5融合。电融合用电融合装置（Eppendorf Multiporator）和电融合缓冲液（Eppendorf）根据厂家的方案来进行。
杂交瘤的亚克隆
亚克隆在从新生儿包皮成纤维细胞系CCD-1114Sk（ATCC）建立的饲养层上生长。饲养物在取决于细胞生长含有2-20%胎儿牛血清（FBS）的IMDM介质上维持。饲养物底板在亚克隆的当天用UV光处理。对要进行亚克隆的细胞系计数，制备大约0.3个细胞/孔的平板的合适稀释度，细胞悬浮液吸移到含有饲养层的96孔平板中。每个细胞系在至少两个平板中接种。每3-4天饲喂培养物。通常在3-4周间，来自展现了杂交瘤生长的反应孔的上清液通过EIA来测试。
选择用于重组细胞系开发的杂交瘤克隆
用于重组抗体的开发选择的杂交瘤克隆在表1中列出（下文）。为了重组细胞系开发的目的，每个克隆指定简化的名称。
表1.抗-RhD抗体的名称
RNA分离
来自杂交瘤细胞的总RNA根据厂家建议的方案利用Trizol试剂（Invitrogen）来纯化，伴随使用氯仿来除去痕量苯酚的RNA提取的额外步骤。
光谱计量的RNA定量在260 nm下进行，假定1 OD相当于40 μg/ml RNA。
第一链合成
cDNA的第一链根据供应商建议的方案利用用于RT-PCR的Super Script III First-Strand系统（Invitrogen）来合成。来自试剂盒的Oligo d（T）引物在所有的情况中使用来引发反应。
RNA水解
从逆转录反应中除去RNA分子根据厂家的说明书通过RNaseH消化（用于RT-PCR的Super Script III First-Strand系统）来进行。使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）清洗第一链cDNA。
第一链cDNA的尾化
为了便于带有未知3'序列的第一链cDNA的扩增，poly（A）尾部附加到每个cDNA的3'末端来产生限定的引发位点。为此，使用重组末端脱氧核苷酸转移酶（Invitrogen）。根据厂家的推荐进行反应。反应产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒（Qiagen）来清洗。
Ig重链（HC）和轻链（LC）的PCR扩增
用于来自第一链cDNA的重链和轻链编码序列的PCR扩增的引物（SEQ ID NO：13到19）是如下列出的（每个引物中的EcoRI限制序列是下划线的）。
正向引物（与第一链cDNA的poly（A）延伸相容的）：
对所有的链：
反向引物（基因特异性的）：
对gamma链：
对kappa链：
对lambda链：
利用PfuUltra High-Fidelity热稳定的DNA聚合酶（Stratagene）进行PCR。一般地，前五个循环将仅用正向引物启动；退火温度是45℃。在此之后，添加反向的基因特异性引物，PCR在50-65℃的退火温度继续另外30-35个循环。产生的片段利用QIAquick Gel Extraction试剂盒（Qiagen）凝胶纯化，亚克隆到pBluescript克隆载体中并测序。
PCR产物向pBluescript克隆载体中的亚克隆
纯化的PCR产物利用Quick Ligation试剂盒（NEB）连接到用EcoRV切割的pBluescript克隆载体（Stratagene）中。DH5α细菌细胞用产生的DNA转化，涂布在补充有40 μg/ml氨苄西林和用50μl 20 mg/ml的Xgal和25 μl 200mg/ml的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）预处理的LB平板上。对于插入物的存在，菌落进行蓝/白选择。
质粒DNA的分离和测序
挑取选择的白色菌落并扩增。DNA用QIAprep Spin Miniprep试剂盒（Qiagen）分离。对照消化用EcoRI进行（正向和反向PCR引物都含有EcoRI位点）。产生预期的消化图案的质粒中的插入物进行测序（Biotech Core）。
RhD1、RhD2和RhD3编码序列和氨基酸序列
RhD1、RhD2和RhD3的重链（HC）和轻链（LC）的氨基酸序列，以及编码所述重链和轻链的相应的核苷酸序列在附随的序列表中列出，以下进一步解释。
序列借助IMGT数据库和软件（imgt.cines.fr）来分析。更具体地：
从基因组Ig序列的IMGT/GENE-DB数据库（http://imqt.cines.fr/IMGT GENE-DB/GENElect?livret=0）中，通过选择物种、座位、基因型、群（省略亚群）和功能性（例如，物种：智人，座位：IGH，基因型：恒定的，群：IGHC，功能性：功能的），并检索数据库-从产生的列表中，来确定恒定区的序列。选择期望的同种型（例如，IGG1）以鉴定合适的IMGT/LIGM-DB参考序列用于与RhD序列比较；
可变区通过减去恒定区来确定；以及
利用IMGT/V-QUEST工具（http://imgt.cines.fr/IMGT vquest/share/textes/），通过选择免疫球蛋白种类（人类）、以FASTA格式加载完整抗体链、或仅它的可变区的核苷酸序列，并利用IMGT/V-QUEST默认设置来分析序列，确定CDR。
关于IMGT/V-QUEST工具和IMGT/GENE-DB的进一步的信息，还参见：
V-BASE（所有人类种系可变区序列的数据库；http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/）也可以用于确定、或证实可变区的末端。在比对下，人们可以找到所有重链和轻链的信号肽、V-片段、D-片段（如果可用的话）以及J-片段的种系序列。根据IMGT分析明显的是在给定的抗体链中采用了什么片段。因而人们可以参考V-BASE中的特定J-片段来确定确切的末端。
SEQ ID NO：1是RhD1 HC的编码区域的核苷酸序列。核苷酸1-57编码信号肽。核苷酸58-448编码可变区，其中核苷酸133-156编码CDR1，核苷酸208-231编码CDR2，核苷酸346-414编码CDR3。核苷酸449-1437编码恒定区（这个是gamma1，或IgG1，恒定区）。RhD1 HC的氨基酸序列以SEQ ID NO：2给出。
SEQ ID NO：3是RhD1 LC的编码区域的核苷酸序列。核苷酸1-57编码信号肽。核苷酸编码58-388可变区，其中核苷酸133-159编码CDR1，核苷酸211-219编码CDR2，核苷酸328-357编码CDR3。核苷酸389-705编码恒定区（这个是lambda恒定区）。RhD1 LC的氨基酸序列以SEQ ID NO：4给出。
SEQ ID NO：5是RhD2 HC的编码区域的核苷酸序列。核苷酸1-57编码信号肽。核苷酸58-448编码可变区，其中核苷酸133-156编码CDR1，核苷酸208-231编码CDR2，核苷酸346-414编码CDR3。核苷酸449-1437编码恒定区（这个是gamma1，或IgG1，恒定区）。RhD2 HC的氨基酸序列以SEQ ID NO：6给出。
SEQ ID NO：7是RhD2 LC的编码区域的核苷酸序列。核苷酸1-57编码信号肽。核苷酸58-388编码可变区，其中核苷酸133-159编码CDR1，核苷酸211-219编码CDR2，核苷酸328-357编码CDR3。核苷酸389-705编码恒定区（这个是lambda恒定区）。RhD2 LC的氨基酸序列以SEQ ID NO：8给出。
SEQ ID NO：9是RhD3 HC的编码区域的核苷酸序列。核苷酸1-57编码信号肽。核苷酸58-448编码可变区，其中核苷酸133-162编码CDR1，核苷酸214-234编码CDR2，核苷酸349-414编码CDR3。核苷酸449-1578编码恒定区（这个是gamma3，或IgG3，恒定区）。RhD3 HC的氨基酸序列以SEQ ID NO：10给出。
SEQ ID NO：11是RhD3 LC的编码区域的核苷酸序列。核苷酸1-66编码信号肽。核苷酸67-391编码可变区，其中核苷酸145-162编码CDR1，核苷酸214-222编码CDR2，核苷酸331-360编码CDR3。核苷酸392-711编码恒定区（这个是kappa恒定区）。RhD3 LC的氨基酸序列以SEQ ID NO：12给出。
RhD1-RhD3的氨基酸序列的比对
RhD1-RhD3的氨基酸序列用ClustalW程序（www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw）使用来自网站的默认参数进行比对。HC和LC的产生的比对分别在附图1和2中描述。每个序列的可变区是下划线的，CDR以粗体突出（从左到右和从上到下阅读序列，第一个出现的CDR是CDR1，第二个是CDR2，第三个是CDR3）。当在被比对的全部三个链中出现相同的氨基酸时，这在底部序列（RhD3的序列）的相关氨基酸下方标识为“*”。
类似地，使用默认参数（http://genome.cs.mtu.edu/aliqn/align.html）的GAP（最大匹配 = 11；最小错配 =-4；缺口-开口罚分= 10；缺口-延伸罚分 = 2）可以用于比对和确定序列或其片段的单独的配对之间的同一性百分比。当这样比较时，RhD1和RhD2轻链可变区是94%相同的（104个匹配，6个错配，0个缺口，相似性分值540），CDR1区域是88%相同的（8个匹配，1个错配，0个缺口，相似性分值43），CDR2区域是100%相同的（3个匹配，0个错配，0个缺口，相似性分值16），CDR3区域是90%相同的（9个匹配，1个错配，0个缺口，相似性分值43）。RhD1和RhD2重链可变区是94%相同的（123个匹配，7个错配，0个缺口，相似性分值650），CDR1区域是87%相同的（7个匹配，1个错配，0个缺口，相似性分值37），CDR2区域是100%相同的（8个匹配，0个错配，0个缺口，相似性分值41），CDR3区域是95%相同的（22个匹配，1个错配，0个缺口，相似性分值131）。
表达载体
构建称为pCB3和pCB11的两个质粒表达载体，用于在CHO dhfr-细胞中表达抗体重链和轻链。
pCB3
这个质粒在附图3中说明。这个质粒的组件在表2中列出。
表2-表达载体pCB3的组件
pCB11
这个质粒在附图4中说明。这个质粒的组件在表3中列出。
表3-表达载体pCB11的组件
重组免疫球蛋白基因向表达载体中的插入
第二PCR被用于扩增具有添加的合适的限制性位点的HC和LC，从而片段可以插入到表达载体中。基因特异性正向引物的设计基于获得的序列。已知提高真核翻译效力的共有的Kozak基序（GCCACC）被包括在每个正向引物中（表5）。
用于RhD1-RhD3 HC和LC向表达载体中插入的引物（SEQ ID NO：20到27）如下。
RhD1 HC:
正向基因特异性引物（GSP）:
RhD2 HC:
正向GSP:
RhD3 HC:
正向 GSP:
用于所有重链的反向引物：
RhD1-RhD2 LCs:
正向GSP:
反向引物：
RhD3 LC:
正向GSP:
反向引物：
RhD1-RhD3 HC和LC向表达载体插入的PCR循环包括以下步骤：
RhD1抗体的IgG3变体的构建
RhD1的IgG3变体被设计为RhD1的可变区和RhD3的恒定区之间的嵌合体。嵌合利用了RhD1（IgG1）和RhD3（IgG3）恒定区的相同的5'末端。特异于RhD1的可变域的反向引物被设计以重叠恒定区的三个密码子，导入产生Nhel限制性位点的沉默突变。相同的修饰通过正向引物引入到RhD3恒定区5'末端。NheI限制性位点容许处在RhD3恒定区之前的扩增的RhD1可变域的方便的按阅读框克隆。这在两个步骤中进行。
首先，来自RhD3抗体的IgG3 HC的恒定区被扩增，用XbaI和EcoRI酶切割，连接到 Xbal/EcoRI 消化的pCB3载体中。在第二个步骤中，这个中间质粒用XbaI和Nhel核酸内切酶再次切割，用相同的酶消化的RhD1的扩增的可变区被插入。
用于RhD的IgG3变体的构建的引物（SEQ ID NO：28-31）如下。
用于RhD3恒定区的扩增的引物：
正向：
反向：
用于RhD1可变域的扩增的引物：
正向：
反向：
用于构建RhD1的IgG3变体的PCR循环包括以下步骤：
PCR酶：PfuUltra High-Fidelity热稳定的DNA聚合酶（Stratagene）。
含有克隆的抗体基因的表达载体
插入到表达载体中的RhD1 HC、RhD1 LC、RhD2 HC、RhD2 LC、RhD3 HC、RhD3 LC、RhD1V3C HC（由RhD1重链可变域和RhD3重链恒定区组成的嵌合体）编码序列，还包括添加的Kozak基序和限制性位点，分别以SEQ ID NO：32、33、34、35、36、37和38给出。附图5是pCB3的图，说明了插入的抗-RhD抗体重链的位置，附图6是pCB11的图，说明了插入的抗-RhD抗体轻链的位置（插入物的位置是相同的，不考虑要表达的具体的RhD1、RhD、RhD3或RhD1V3C重或轻链）。
基因优化
RhD1和RhD3抗体的编码序列通过GENEART AG使用专有算法进行优化。RhD1 HC、RhD1 LC、RhD3 HC和RhD3 LC的优化的编码序列分别以SEQ ID NO：39、40、41和42给出。
优化的RhD1基因克隆到表达载体中
RhD1的优化的基因亚克隆到pCB表达载体中。为了添加克隆必需的限制性位点，编码区域通过PCR使用下列引物来扩增。每个扩增的片段插入到相应的载体中，并通过测序来验证。
用于向优化的RhD1基因添加与pCB表达载体相容的限制性位点的引物（SEQ ID NO：43到46）如下。
优化的RhD1 HC:
正向：
反向：
优化的 RhD1 LC:
正向：
反向：
引物中的XbaI和BamHI位点是下划线的。
插入到表达载体中、包括添加的Kozac基序和限制性位点的优化的RhD1 HC和RhD1 LC编码序列以SEQ ID NO：47和48给出。
细胞培养
生长培养基
MEMα生长培养基在重组CHO细胞系开发工作的所有阶段使用。成分、配方和材料来源在表4中显示。在添加所有的成分之后，完全培养基过滤通过0.22 μm滤器（Stericup-GP 0.22 μm过滤单位，Millipore或等效的）。
表4-培养基
冷冻介质
用于细胞的低温保存的冷冻介质的组成在表5中给出。
表5-冷冻介质的成分
冷冻介质1：
冷冻介质2：
细胞的维持
二氢叶酸还原酶（DHFR）缺陷的CHO DXB11细胞在宿主细胞生长培养基1或2（表4）中生长，每3-4天进行分裂。
细胞密度和生存力测量
活细胞密度和细胞生存力利用锥虫蓝排出方法和血球计（Hausser Scientific）来测量。
甲氨蝶呤（MTX）中的稳定的转染和扩增
CHO DXB11细胞用编码人类IgG的轻链和重链的等量的质粒DNA共转染（表6）。转染根据厂家的推荐使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）进行。利用转染子选择培养基（表4）选择稳定的转染子。
表6-CHO DXB11细胞的典型转染的条件
转染的细胞在37℃和5% CO2下在宿主细胞生长培养基1或2中培养2天，随后通过用转染子选择培养基（表4）替换生长培养基来开始选择过程。
在选择过程期间，废弃的培养基随时地除去并用新鲜培养基替换。在选择过程完成之后，转染的细胞恢复生长，细胞被
--转移到含有各种水平的MTX（Calbiochem）的转染子选择培养基（表4）中用于抗体基因的扩增，或
-亚克隆（见下文）。在这种情况下，选择12个最好的生产克隆，集中用于在MTX中进一步扩增。
单细胞克隆
为了选择单细胞克隆，稳定地转染的细胞以0.5-1个细胞每反应孔平铺在合适量的平底96孔平板中。在过程期间，在显微镜下监视细胞生长和健康状态。在通过用ELISA筛选来选择最佳的生产克隆之前，细胞培养大约两周。
酶联免疫吸附测定（ELISA）
在细胞系开发的所有阶段期间的抗体滴度用人类IgG ELISA定量试剂盒（Bethyl Laboratories）根据厂家的说明书来评估。简短地，Nunc Maxisorp ELISA平板用Fc特异性山羊抗人IgG多克隆抗体（在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中）包被。平板在4℃孵育过夜。第二天，平板洗涤三次，用溶于洗涤缓冲液的无脂奶粉封闭1小时。在洗涤步骤之后，样品和标准物吸移到平板上，在室温下孵育1小时，随后三次洗涤。与辣根过氧化酶（HRP）轭合的二级抗体然后添加到每个反应孔，平板再次在室温下孵育1小时。平板用洗涤缓冲液洗涤三次，用蒸馏水清洗一次，轻敲干燥。含有四甲基联苯胺（TMB）的底物添加到每个反应孔中，在室温下15分钟容许产生颜色。通过硫酸停止反应，平板在平板读取器（Bio-Rad，Molecular Dynamics，或Dynex Technologies）上在450 nm处读取。数据用平板读取器提供的软件包来分析。
来自用非优化cDNA稳定转染的细胞库的重组抗体的表达
转染的方案（根据表6进行的）和转染的细胞的名称在表7中提供。
表7-转染的库的命名的名称
一般地，当转染的细胞在选择过程之后亚克隆时，达到更好的表达，通过ELISA根据抗体生产对克隆排序，仅12个最佳生产性克隆的库在MTX中扩增。选择的非亚克隆转染子的扩增产生了展现更小生产力的库，但是是在较短的时间内。MTX扩增的一种典型的方案显示如下：
- 选择的细胞（0 nM MTX）并行转移到含有50 nM或100 nM MTX的转染子选择培养基中（步骤1）
- 从步骤1回收的细胞进行扩增，分离到200 nM和500 nM MTX中（步骤2）
- 在步骤2中存活的细胞进行扩增，经历1000 nM MTX中的扩增（步骤3）
在每个步骤中，通过ELISA评估抗体生产力（表8）。
表8-12个最佳克隆的未扩增的和扩增的库的生产力的实例
产生最好的抗体滴度的库在转染子选择培养基（没有MTX和遗传霉素，含有低牛IgG FBS而不是常规的FBS）中在组织培养烧瓶中扩增。采集来自这些培养物的上清液，用于抗体的纯化。
适应于无血清培养基的转染和扩增的克隆细胞群体的RhD1和RhD3抗体的表达
由于从细胞库获得的抗体表达水平（表8）仍然不如期望的那么高，重新进行转染、选择和扩增过程，这次在每个扩增步骤之后采用亚克隆步骤（如上所述的），除了在开始的选择步骤后以外，以获得表达扩增水平的抗-RhD抗体的克隆细胞系（单细胞克隆）。
更具体地，CHO DXB11细胞用编码RhD1或RhD3的重链和轻链的质粒转染。转染和稳定地转染的细胞的选择按照基本上与如上所述相同的方式进行。转染的细胞然后亚克隆，筛选产生的克隆的抗体生产。最有生产力的克隆细胞系进行扩增。在扩增之后，细胞再一次亚克隆，最有生产力的克隆进行进一轮的扩增和亚克隆。用于第一和第二扩增步骤的选择培养基、扩增培养基在表9中列出。
最后的最佳生产性克隆细胞系（在两轮扩增之后获得的）适应于商业是无血清培养基（IS CHO_CD4?, Irvine Scientific）中的悬浮生长。通过在最终的扩增培养基（表9）和含有相同水平的MTX的无血清培养基的1：1混合物中接种细胞，然后在四到六周时间内逐渐提高无血清培养基的比例，直到细胞完全能够在100%无血清培养基中生长，来在摇瓶中或在旋转瓶子中进行这些工作。
在适应无血清培养基之前和之后的最佳的生产性RhD1和RhD3克隆细胞系的最大生产力在表9中列出。再次采集来自这些培养物的上清液，用于抗体的纯化。
表9-五种选择的RhD克隆的选择和扩增培养基。包括的是在适应于无血清培养基之前和之后的生产力数据。
抗体纯化
培养物上清液的pH值用1 N NaOH调节到pH 7.2。每种上清液通过0.2 μ滤过器过滤，加载到在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中预平衡的蛋白A柱上。柱用PBS洗涤来从培养物上清液中除去所有未结合的材料。结合到蛋白A柱的抗体用0.1 M甘氨酸（pH 2.5）洗脱。洗脱物用调节到pH 8.0的2 M Tris缓冲液中和。含有单克隆抗体的洗脱物相对于PBS进行透析。抗-RhD抗体浓度通过利用D阳性红血球的凝集分析来测定。抗体浓度根据人类单克隆抗体的摩尔消光系数利用1 mg/ml溶液的1.4 OD的光密度值，在280 nm处光谱计量地测定。
通过血细胞凝集分析的抗-D定量
上清液中和纯化的抗体中的抗-RhD抗体水平通过利用Gunson等（H. H. Gunson, P. K. Phillips, and F. Stratton J. clin. Path., 1972, 25, 198-205.）早先描述的Technicon Autoanalyzer系统测量菠萝蛋白酶处理的RhD阳性红血球的凝集来定量，来自NIBSC（2nd International standard 01/572）的多克隆抗-RhD抗体用作标准物。
简要地,菠萝蛋白酶处理的RhD阳性红细胞与各种浓度的抗-RhD抗体孵育。容许细胞在一定时间内凝集。凝集的细胞在自动分析仪中除去，其余的红血球使用洗涤剂裂解。释放的血红蛋白的光密度光谱计量地测量。样品的抗-D浓度使用获自各种浓度的抗-D标准物的标准图来计算。
流式细胞术分析
每种人类抗-RhD单克隆抗体从0.5 mg/ml连续地1：3稀释下来，来制备总共15个稀释度。每个稀释度添加到1-5×105个RhD阳性或RhD阴性人红细胞（RBC）中，其是具有其他方面匹配的基因型、用木瓜蛋白酶预处理以使RhD的抗原成分能够接近抗体的。用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗人IgG抗体用作二级抗体来染色与RBC结合的抗体。
样品在FACSort仪器（Becton-Dickinson）上分析。根据正向和侧向散射参数对RBC群体进行门选。RhD阴性样品的荧光被认为是背景，因为这些细胞缺乏被抗-RhD抗体靶向的RhD抗原。与特定浓度的抗体孵育的RhD阴性细胞因而充当与相同的抗体稀释度孵育的RhD阳性细胞的阴性对照。然后，对抗-RhD抗体的每个稀释度，根据RhD阳性和RhD阴性样品的荧光水平之间的差异，测定抗-RhD抗体结合的（以及FITC标记的抗人IgG染色的）RhD阳性细胞的比荧光和百分比。对每种抗-RhD抗体，抗体结合的阳性细胞的百分比相对于抗体浓度的对数来标绘，从这个图表估计EC50。这提供了关于抗体对RhD抗原的结合亲和性和特异性的基础信息。
ADCC分析
抗-RhD抗体在体内消除RhD-阳性红血细胞方面的有效性，因而抗体在防止暴露于RhD-阳性血液的RhD-阴性个体的免疫方面的实用性，通过抗体依赖性细胞毒性（ADCC）分析来估计。
ADCC分析基于Miescher et. al（British Journal of Haematology 2000 111:157-166）描述的方法。RhD阳性红血球用木瓜蛋白酶处理，随后用荧光染料5-（和6）羰基荧光素双醋酸琥珀酰亚胺基酯来标记。标记的红血球与不同浓度（0.1-50 ng/ml）的抗-RhD抗体预孵育1小时。外周血单核细胞（PBMC）添加到红血球悬浮液中，在CO2孵化器中在37℃孵育18小时。在孵育的结尾目标细胞裂解的程度通过用荧光计测量从裂解的RBC向上清液中染料的释放来测定。细胞毒性的百分比根据以下公式计算：
其中
Fcexp = 样品的荧光
FCdet =最大荧光对照（通过用洗涤剂（1% Triton-X100）裂解RBC获得的）
Fcmed =背景荧光对照（在不存在PBMC和抗体时染料从RBC的自发释放）
细胞毒性的百分比然后相对于预孵育红血球的抗体浓度的对数来标绘，这个数据用于计算EC50，即，抗体引起该抗体可实现的最大比裂解的50%的有效浓度。举例来说，附图7是利用NIBSC标准物（抗-RhD多克隆抗体）从ADCC分析的结果产生的，相对于抗体浓度的细胞毒性百分比的曲线。这种剂量-反应依赖性理论上产生了S形曲线，带有近线性的中间区域。为了在这个区域内进行线性逼近，可以使用适合的软件包（例如，Microsoft Excel?）通过线性回归将直线拟合到有关的数据点。例如，附图8是对附图7的相关数据点进行的线性回归。代表这个直线的方程式然后可以用于计算EC50。例如对于附图7中的数据，其中由NIBSC标准多克隆抗体引起的最大比裂解，相比洗涤剂诱导的裂解（100%）是大约88%，对比裂解计算的EC50的值等于44%。
血细胞凝集和ADCC分析结果
根据如上所述的操作进行的血细胞凝集和ADCC分析的结果在以下的表10中显示。凝集价表示为每mg蛋白质的活性（RhD抗原结合）抗体的微克数。从两个独立实验测定EC50值。
表9-RhD1、RhD3和RhD4抗体的凝集价和EC50值。对照多克隆抗体（NIBSC标准物）和两个批次的对照单克隆抗体被包括用于比较。
制剂
纯化的单克隆抗-RhD抗体可以被配制用于通过任何适合的途径施用。一般地，抗体通过注射施用。在这样的情况下，抗体一般被配制为在适合的缓冲溶液中的抗体的液体悬浮液。示范性的缓冲液包括：
磷酸盐缓冲盐水（含有150mM NaCl的20 mM磷酸盐缓冲液（pH 6.8））；和
甘氨酸盐水缓冲液（含有0.15 M NaCI，调节到pH6.5的0.3 M甘氨酸）。
优选的制剂包含具有IgG1恒定区的单克隆抗体和具有IgG3恒定区的单克隆抗体两者。因而，包含与RhD3抗体（其是IgG3同种型）和/或RhD4抗体（其由RhD1V3C重链和RhD1轻链组成）组合的RhD1抗体（其是IgG1同种型）的制剂是优选的。
序列表
<110> BHARAT SERUMS AND VACCINES LTD.
DAFTARY, Gautam Vinod
KAUNDINYA, John
CINEK, Tomas
<120> 抗-RHD 单克隆抗体
<130> PCT-ANTID-01
<140> PCT/IN2009/000741
<141> 2009-12-24
<150> 2730/MUM/2008
<151> 2008-12-31
<160> 48
<170> PatentIn version 3.3
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Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
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Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
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cct ggg tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc atc ttc 144
Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ile Phe
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aga acc tat gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt 192
Arg Thr Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
gag tgg atg gga ggg atc atc cct atg ttt ggt aca gta aac tac gca 240
Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala
65 70 75 80
cag aag ttc cag ggc aga gtc acg att agc gcg gac aaa tcc acg agc 288
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tat tac tgt gcg agg ccg cct tcc ggg ggt tgt ggt ggt gac tgc tca 384
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acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt gac aaa act cac 768
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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
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Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Met Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala
65 70 75 80
Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Gly Lys Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Asp Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Pro Ser Gly Gly Cys Gly Gly Asp Cys Ser
115 120 125
Arg Arg Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr
130 135 140
Val Ile Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His
245 250 255
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val
260 265 270
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
275 280 285
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
290 295 300
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
305 310 315 320
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
325 330 335
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
340 345 350
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
355 360 365
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
370 375 380
Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
385 390 395 400
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
405 410 415
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
420 425 430
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
435 440 445
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
450 455 460
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470 475
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<211> 708
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(708)
<220>
<221> sig_肽
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<220>
<221> V_区
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<220>
<221> C_区
<222> (389)..(705)
<400> 7
atg gcc tgg gct ctg cta ttc ctc acc ctc ctc act cag ggc aca ggg 48
Met Ala Trp Ala Leu Leu Phe Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
tcc tgg gcc cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct 96
Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
cct gga cag tcg atc acc atc tcc tgc agt gga agc agc agt gac gtt 144
Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Val
35 40 45
ggt gct tat aag tat gtc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc aaa acc 192
Gly Ala Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Thr
50 55 60
ccc aaa ctc atg att tat gat gtc aat aat cgg ccc tca ggg gtt tct 240
Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser
65 70 75 80
gat cgc ttc tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc ttt ctg acc atc 288
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile
85 90 95
tct ggg ctc cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc aac tca tat 336
Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr
100 105 110
aca agc agc agc act cga gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc 384
Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
cta ggt cag ccc aag gct gcc ccc tcg gtc act ctg ttc cca ccc tcc 432
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
130 135 140
tct gag gag ctt caa gcc aac aag gcc aca ctg gtg tgt ctc ata agt 480
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
145 150 155 160
gac ttc tac ccg gga gcc gtg aca gtg gcc tgg aag gca gat agc agc 528
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
165 170 175
ccc gtc aag gcg gga gtg gag acc acc aca ccc tcc aaa caa agc aac 576
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
180 185 190
aac aag tac gcg gcc agc agc tac ctg agc ctg acg cct gag cag tgg 624
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
195 200 205
aag tcc cac aaa agc tac agc tgc cag gtc acg cat gaa ggg agc acc 672
Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
210 215 220
gtg gag aag aca gtg gcc cct aca gaa tgt tca tag 708
Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
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<211> 235
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Ala Trp Ala Leu Leu Phe Leu Thr Leu Leu Thr Gln Gly Thr Gly
1 5 10 15
Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser
20 25 30
Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asp Val
35 40 45
Gly Ala Tyr Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Thr
50 55 60
Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Phe Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr
100 105 110
Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val
115 120 125
Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser
145 150 155 160
Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser
165 170 175
Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn
180 185 190
Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp
195 200 205
Lys Ser His Lys Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr
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Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
225 230 235
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<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1581)
<220>
<221> sig_肽
<222> (1)..(57)
<220>
<221> V_区
<222> (58)..(448)
<220>
<221> C_区
<222> (449)..(1578)
<400> 9
atg gac aca ctt tgc tac aca ctc ctg ctg ctg acc acc cct tcc tgg 48
Met Asp Thr Leu Cys Tyr Thr Leu Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser Trp
1 5 10 15
gtc ttg tcc cag gtc acc ttg aag gag tct ggt cct gtg ctg gtg aaa 96
Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys
20 25 30
ccc aca gag acc ctc acg ctg acc tgc acc gtc tct ggg ttc tca ctc 144
Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
aac aat gct aga atg ggt gtg agc tgg atc cgt cag ccc cca ggg aag 192
Asn Asn Ala Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
gcc ctg gag tgg ctt gca cac att ttt tcg aat gac gaa aaa tcc tac 240
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr
65 70 75 80
agc aca tct ctg aag agc agg ctc acc atc tcc aag gac acc tcc aaa 288
Ser Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
85 90 95
agc cag gtg ttc ctt acc atg acc aac atg gac cct gtg gac aca gcc 336
Ser Gln Val Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
100 105 110
aca tat tac tgt gca cgg acc cct att act atg gtt cgg gga gct att 384
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Ile Thr Met Val Arg Gly Ala Ile
115 120 125
agg cta tac tac tac tac tac atg gac gtc tgg ggc aaa ggg acc acg 432
Arg Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr
130 135 140
gtc acc gtc tcc tca gct tcc acc aag ggc cca tcg gtc ttc ccc ctg 480
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
gcg ccc tgc tcc agg agc acc tct ggg ggc aca gcg gcc ctg ggc tgc 528
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg tcg tgg aac tca 576
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct gtc cta cag tcc 624
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc gtg ccc tcc agc agc 672
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
ttg ggc acc cag acc tac acc tgc aac gtg aat cac aag ccc agc aac 720
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
acc aag gtg gac aag aga gtt gag ctc aaa acc cca ctt ggt gac aca 768
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr
245 250 255
act cac aca tgc cca cgg tgc cca gag ccc aaa tct tgt gac aca cct 816
Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro
260 265 270
ccc ccg tgc cca cgg tgc cca gag ccc aaa tct tgt gac aca cct ccc 864
Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro
275 280 285
cca tgc cca cgg tgc cca gag ccc aaa tct tgt gac aca cct ccc cca 912
Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro
290 295 300
tgc cca cgg tgc cca gca cct gaa ctc ctg gga gga ccg tca gtc ttc 960
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
305 310 315 320
ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gat acc ctt atg att tcc cgg acc cct 1008
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
325 330 335
gag gtc acg tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac ccc gag gtc 1056
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
340 345 350
cag ttc aag tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca 1104
Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
355 360 365
aag ccg cgg gag gag cag ttc aac agc acg ttc cgt gtg gtc agc gtc 1152
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
370 375 380
ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aac ggc aag gag tac aag tgc 1200
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
385 390 395 400
aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc atc gag aaa acc atc tcc 1248
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
405 410 415
aaa acc aaa gga cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca 1296
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
420 425 430
tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc 1344
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
435 440 445
aaa ggc ttc tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc agc ggg 1392
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly
450 455 460
cag ccg gag aac aac tac aac acc acg cct ccc atg ctg gac tcc gac 1440
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
465 470 475 480
ggc tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg 1488
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
485 490 495
cag cag ggg aac atc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac 1536
Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
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aac cgc ttc acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa tga 1581
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520 525
<210> 10
<211> 526
<212> PRT
<213> 智人
<400> 10
Met Asp Thr Leu Cys Tyr Thr Leu Leu Leu Leu Thr Thr Pro Ser Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys
20 25 30
Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu
35 40 45
Asn Asn Ala Arg Met Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Leu Glu Trp Leu Ala His Ile Phe Ser Asn Asp Glu Lys Ser Tyr
65 70 75 80
Ser Thr Ser Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys
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Ser Gln Val Phe Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala
100 105 110
Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Thr Pro Ile Thr Met Val Arg Gly Ala Ile
115 120 125
Arg Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
145 150 155 160
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys
165 170 175
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
180 185 190
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
195 200 205
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
210 215 220
Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn
225 230 235 240
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr
245 250 255
Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro
260 265 270
Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro
275 280 285
Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro
290 295 300
Cys Pro Arg Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
305 310 315 320
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
325 330 335
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
340 345 350
Gln Phe Lys Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
355 360 365
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val
370 375 380
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
385 390 395 400
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
405 410 415
Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
420 425 430
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
435 440 445
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly
450 455 460
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp
465 470 475 480
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
485 490 495
Gln Gln Gly Asn Ile Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
500 505 510
Asn Arg Phe Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
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<221> C_区
<222> (392)..(711)
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atg gac atg agg gtc ccc gct cag ctc ctg ggg ctc ctg cta ctc tgg 48
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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ctc cga ggt gcc aga tgt gac atc cag gtg acc cag tct ccg tcc tcc 96
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser
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ctg tct gcg tct gta gga gac aga gtc acc atc aat tgc cgg gca agt 144
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser
35 40 45
cag agc att ggc acc tat tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa 192
Gln Ser Ile Gly Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
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gcc cct aac ctc ctg atc tat gct gca tcc agt ttg cag agt ggg gtc 240
Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
cca tca agg ttc agt ggc agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc 288
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
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atc agc agt ctg caa cct gaa gat ttt gca act tat tac tgt caa cag 336
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
act tac agt acc ccc acg tgg acg ttc ggc cga ggg acc aag gtg gaa 384
Thr Tyr Ser Thr Pro Thr Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
atc aag cga act gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct 432
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
gat gag cag ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat 480
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
aac ttc tat ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc 528
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
ctc caa tcg ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag 576
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
gac agc acc tac agc ctc agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac 624
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
tac gag aaa cac aaa ctc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg 672
Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
agc tcg ccc gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag 714
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
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<211> 237
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Gly Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Thr Tyr Ser Thr Pro Thr Trp Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Leu Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
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<211> 31
<212> DNA
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<223> PCR 正向引物
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<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 14
actggaattc ggtgctttat ttccatgctg g 31
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 15
actggaattc gtacgtgcca agcatcctcg 30
<210> 16
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 16
actggaattc agaggccaaa ggatgggagg 30
<210> 17
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 17
gactgaattc ctggaactga ggagcaggtg g 31
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 18
gactgaattc cctgggatcc tgcagctc 28
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 19
actggaattc ggggtgaggg ttgagaacc 29
<210> 20
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 20
atcgtctaga gccaccatgg actggacctg gaggttcc 38
<210> 21
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 21
atcgtctaga gccaccatgg actggacctg gaggttcc 38
<210> 22
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 22
atcgtctaga gccaccatgg acacactttg ctacacactc c 41
<210> 23
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 23
tgacgaattc cactcattta cccggagaca gg 32
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 24
atcgtctaga gccaccatgg cctgggctct gctattc 37
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 25
actggaattc gaacctatga acattctgta gggg 34
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 26
atcgtctaga gccaccatgg acatgagggt ccccg 35
<210> 27
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 27
gactgaattc ctaacactct cccctgttga agc 33
<210> 28
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 28
atcgtctaga gtcagctagc accaagggcc catcggtctt cc 42
<210> 29
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 29
tgacgaattc cactcattta cccggagaca gg 32
<210> 30
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 30
atcgtctaga gccaccatgg actggacctg gaggttcc 38
<210> 31
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 31
gatgctagct gaggagacgg tgatcgtgg 29
<210> 32
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB3表达载体的RhD1 HC插入物
<400> 32
tctagagcca ccatggactg gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt 60
gtccagtccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg 120
gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggaggc atcttcagaa cctatgctat cagctgggtg 180
cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggaggga tcatccctat gtttggtaca 240
gtaaactacg cacagaagtt ccagggcaga gtcacgatta gcgcggacaa atccacgagc 300
acagcctata tggaactgag cagactgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg 360
aggccgcctt ccgggggttg tggtggtgac tgctcacgga ggggctacta ctacgccatg 420
gacgtctggg gccaagggac cacgatcacc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg 480
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 540
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 780
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 840
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 900
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1020
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1140
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1200
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1260
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1320
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1380
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1440
ccgggtaaat gagtggaatt c 1461
<210> 33
<211> 730
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB11表达载体的RhD1 LC插入物
<400> 33
tctagagcca ccatggcctg ggctctgcta ttcctcaccc tcctcactca gggcacaggg 60
tcctgggccc agtctgccct gactcaacct gcctccgtgt ctgggtctcc tggacagtcg 120
atcaccatct cctgcagtgg aagcagcagt gacgttggtg gttataagta tgtctcctgg 180
taccaacaac acccaggcaa agccccccaa ctcatgattt atgatgtcaa taatcggccc 240
tcaggggttt ctaatcgctt ctctggctcc aagtctggca acacggcctc cctgaccatc 300
tctgggctcc aggctgagga cgaggctgat tattactgca gctcatatac aagcagcagc 360
actcgagtgt tcggcggagg gacgaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 420
tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 480
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 540
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 600
gccagcagct acctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacaaaag ctacagctgc 660
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcatag 720
gttcgaattc 730
<210> 34
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB3表达载体的RhD2 HC插入物
<400> 34
tctagagcca ccatggactg gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt 60
gtccagtccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg 120
gtgaaggtct cctgcaaacc ttctggaggc atcttcagca cctatgctat cagctgggtg 180
cgacaggccc cgggacaagg gcttgagtgg atgggaggga tcatccctat gtttgggaca 240
gtaaactacg cacagaagtt ccagggcaga gtcaccatta gcgcgggcaa atccacgagc 300
acagccgata tggaactgag cagactgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg 360
aggccgcctt ccgggggttg tggtggtgac tgctcacgga ggggctatta ttatggtatg 420
gacgtctggg gccaagggac cacggtcatc gtctcctcag cctccaccaa gggcccatcg 480
gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 540
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaaa gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 780
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggac cgtcagtctt cctcttcccc 840
ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 900
gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960
cataatgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg tgtggtcagc 1020
gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080
aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1140
gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggatgagc tgaccaagaa ccaggtcagc 1200
ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 1260
gggcagccgg agaacaacta caagaccacg cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 1320
ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcaggggaa cgtcttctca 1380
tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1440
ccgggtaaat gagtggaatt c 1461
<210> 35
<211> 730
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB11表达载体的RhD2 LC插入物
<400> 35
tctagagcca ccatggcctg ggctctgcta ttcctcaccc tcctcactca gggcacaggg 60
tcctgggccc agtctgccct gactcagcct gcctccgtgt ctgggtctcc tggacagtcg 120
atcaccatct cctgcagtgg aagcagcagt gacgttggtg cttataagta tgtctcctgg 180
taccaacaac acccaggcaa aacccccaaa ctcatgattt atgatgtcaa taatcggccc 240
tcaggggttt ctgatcgctt ctctggctcc aagtctggca acacggcctt tctgaccatc 300
tctgggctcc aggctgagga cgaggctgat tattactgca actcatatac aagcagcagc 360
actcgagtgt tcggcggagg gaccaagctg accgtcctag gtcagcccaa ggctgccccc 420
tcggtcactc tgttcccacc ctcctctgag gagcttcaag ccaacaaggc cacactggtg 480
tgtctcataa gtgacttcta cccgggagcc gtgacagtgg cctggaaggc agatagcagc 540
cccgtcaagg cgggagtgga gaccaccaca ccctccaaac aaagcaacaa caagtacgcg 600
gccagcagct acctgagcct gacgcctgag cagtggaagt cccacaaaag ctacagctgc 660
caggtcacgc atgaagggag caccgtggag aagacagtgg cccctacaga atgttcatag 720
gttcgaattc 730
<210> 36
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB3表达载体的RhD2 HC插入物
<400> 36
tctagagcca ccatggacac actttgctac acactcctgc tgctgaccac cccttcctgg 60
gtcttgtccc aggtcacctt gaaggagtct ggtcctgtgc tggtgaaacc cacagagacc 120
ctcacgctga cctgcaccgt ctctgggttc tcactcaaca atgctagaat gggtgtgagc 180
tggatccgtc agcccccagg gaaggccctg gagtggcttg cacacatttt ttcgaatgac 240
gaaaaatcct acagcacatc tctgaagagc aggctcacca tctccaagga cacctccaaa 300
agccaggtgt tccttaccat gaccaacatg gaccctgtgg acacagccac atattactgt 360
gcacggaccc ctattactat ggttcgggga gctattaggc tatactacta ctactacatg 420
gacgtctggg gcaaagggac cacggtcacc gtctcctcag cttccaccaa gggcccatcg 480
gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 540
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acacctgcaa cgtgaatcac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagctca aaaccccact tggtgacaca 780
actcacacat gcccacggtg cccagagccc aaatcttgtg acacacctcc cccgtgccca 840
cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca cctcccccat gcccacggtg cccagagccc 900
aaatcttgtg acacacctcc cccatgccca cggtgcccag cacctgaact cctgggagga 960
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggataccc ttatgatttc ccggacccct 1020
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaagtgg 1080
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 1140
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 1200
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1260
aaaaccaaag gacagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1320
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1380
gccgtggagt gggagagcag cgggcagccg gagaacaact acaacaccac gcctcccatg 1440
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1500
cagcagggga acatcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1560
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagtggaat tc 1602
<210> 37
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB11表达载体的RhD3 LC插入物
<400> 37
tctagagcca ccatggacat gagggtcccc gctcagctcc tggggctcct gctactctgg 60
ctccgaggtg ccagatgtga catccaggtg acccagtctc cgtcctccct gtctgcgtct 120
gtaggagaca gagtcaccat caattgccgg gcaagtcaga gcattggcac ctatttaaat 180
tggtatcagc agaaaccagg gaaagcccct aacctcctga tctatgctgc atccagtttg 240
cagagtgggg tcccatcaag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 300
atcagcagtc tgcaacctga agattttgca acttattact gtcaacagac ttacagtacc 360
cccacgtgga cgttcggccg agggaccaag gtggaaatca agcgaactgt ggctgcacca 420
tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg 480
tgcctgctga ataacttcta tcccagagag gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc 540
ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc acagagcagg acagcaagga cagcacctac 600
agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa gcagactacg agaaacacaa actctacgcc 660
tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag 720
tgttaggaat tc 732
<210> 38
<211> 1602
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB3表达载体的RhD1V3C HC插入物
<400> 38
tctagagcca ccatggactg gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt 60
gtccagtccc aggtgcagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaagcc tgggtcctcg 120
gtgaaggtct cctgcaaggc ttctggaggc atcttcagaa cctatgctat cagctgggtg 180
cgacaggccc ctggacaagg gcttgagtgg atgggaggga tcatccctat gtttggtaca 240
gtaaactacg cacagaagtt ccagggcaga gtcacgatta gcgcggacaa atccacgagc 300
acagcctata tggaactgag cagactgaga tctgaggaca cggccgtgta ttactgtgcg 360
aggccgcctt ccgggggttg tggtggtgac tgctcacgga ggggctacta ctacgccatg 420
gacgtctggg gccaagggac cacgatcacc gtctcctcag ctagcaccaa gggcccatcg 480
gtcttccccc tggcgccctg ctccaggagc acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc 540
ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 660
gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acacctgcaa cgtgaatcac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagctca aaaccccact tggtgacaca 780
actcacacat gcccacggtg cccagagccc aaatcttgtg acacacctcc cccgtgccca 840
cggtgcccag agcccaaatc ttgtgacaca cctcccccat gcccacggtg cccagagccc 900
aaatcttgtg acacacctcc cccatgccca cggtgcccag cacctgaact cctgggagga 960
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggataccc ttatgatttc ccggacccct 1020
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcca gttcaagtgg 1080
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagttcaac 1140
agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaacggcaag 1200
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1260
aaaaccaaag gacagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1320
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1380
gccgtggagt gggagagcag cgggcagccg gagaacaact acaacaccac gcctcccatg 1440
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1500
cagcagggga acatcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccgcttcacg 1560
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagtggaat tc 1602
<210> 39
<211> 1463
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 优化的RhD1 HC编码序列
<400> 39
ggatccgcca ccatggactg gacctggcgc ttcctgttcg tggtggccgc cgccaccggc 60
gtgcagagcc aggtgcagct ggtgcagagc ggcgccgagg tgaagaagcc cggcagcagc 120
gtcaaggtgt cctgcaaggc cagcggcggc atcttccgca cctacgccat ctcttgggtc 180
cggcaggctc ccgggcaggg gctcgagtgg atgggcggca tcatccccat gttcggcacc 240
gtgaactacg cccagaagtt ccagggccgc gtcaccatca gcgccgacaa gagcaccagc 300
accgcctaca tggagctgtc ccgcctgcgc tccgaggaca ccgccgtgta ctactgtgct 360
aggcctccca gcggcggctg cggcggcgac tgcagccgca ggggctacta ctacgctatg 420
gacgtgtggg gccagggcac caccatcacc gtgagcagcg ctagcaccaa gggccccagc 480
gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc acctccggcg gcaccgccgc cctgggctgc 540
ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg accgtgagct ggaacagcgg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc 660
gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag gtggagccca agagctgcga caagacccac 780
acctgccccc cctgccccgc ccccgagctg ctgggcggcc cctccgtgtt cctgttcccc 840
cccaagccca aggacaccct gatgatcagc cgcacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 900
gacgtgagcc acgaggaccc cgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960
cacaacgcca agaccaagcc ccgcgaggag cagtacaaca gcacctaccg cgtggtgtcc 1020
gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080
aacaaggccc tgcccgcccc catcgagaag accatcagca aggccaaggg gcagcctaga 1140
gagccccagg tctacaccct gcctccatcc cgcgacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc 1200
ctgacctgtc tggtcaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1260
ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc 1320
ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag agccgctggc agcagggcaa cgtgttcagc 1380
tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc 1440
cccggcaagt gatgagcggc cgc 1463
<210> 40
<211> 731
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 优化的RhD1 LC编码序列
<400> 40
ggatccgcca ccatggcctg ggccctgctg ttcctgaccc tgctgaccca gggcaccggc 60
agctgggccc agagcgccct gacccagccc gccagcgtga gcggcagccc cggccagtct 120
atcaccatct cttgtagcgg cagcagcagc gacgtgggcg gctacaagta cgtgtcttgg 180
tatcagcagc accccggcaa ggccccccag ctgatgatct acgacgtgaa caaccgcccc 240
agcggcgtga gcaaccgctt cagcggctcc aagagcggca acaccgccag cctgaccatc 300
tctgggctgc aggctgagga cgaggccgac tactactgca gcagctacac cagcagctcc 360
acccgcgtgt tcggcggcgg caccaagctg accgtgctgg gccagcccaa ggccgccccc 420
agcgtgaccc tgttcccccc cagcagcgag gagctccagg ccaacaaggc taccctggtg 480
tgcctgatca gcgacttcta ccccggcgcc gtgaccgtcg cctggaaggc cgacagcagc 540
cccgtgaagg ccggcgtgga gaccaccacc cccagcaagc agagcaacaa caagtacgcc 600
gccagcagct acctgagcct gacccccgag cagtggaaga gccacaagag ctacagctgc 660
caggtgaccc acgagggcag caccgtggag aagaccgtgg cccccaccga gtgcagctga 720
tgagcggccg c 731
<210> 41
<211> 1604
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 优化的RhD3 HC编码序列
<400> 41
ggatccgcca ccatggacac cctgtgctac accctgctgc tgctgaccac ccccagctgg 60
gtgctgtccc aggtgaccct gaaggagagc ggccctgtcc tggtgaagcc caccgagacc 120
ctgaccctga cctgcaccgt gagcggcttc agcctgaaca acgcccgcat gggcgtgagc 180
tggatcaggc agccccctgg caaggccctg gagtggctgg cccacatctt cagcaacgac 240
gagaagagct acagcaccag cctgaagagc cgcctgacca tcagcaagga caccagcaag 300
agccaggtgt tcctgaccat gaccaacatg gaccccgtgg acaccgccac ctactactgc 360
gcccgcaccc ccatcacaat ggtcagaggc gccatccgcc tgtactacta ctattacatg 420
gacgtgtggg gcaagggcac caccgtgacc gtgagcagcg ctagcaccaa gggccccagc 480
gtgttccccc tggccccctg cagccgcagc acctctggcg gcaccgccgc tctgggctgc 540
ctggtgaagg actacttccc cgagcctgtg accgtgtcct ggaactctgg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc 660
gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc acccagacct acacctgcaa cgtgaaccac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagcgc gtggagctga agacccccct gggcgacacc 780
acccacacct gccccagatg tcccgagccc aagagctgcg acaccccccc tccctgccct 840
cgctgccctg agcctaagtc ctgtgacacc cctccccctt gcccccggtg tccagagcca 900
aagtcttgcg ataccccacc cccctgtcca aggtgccctg cccccgagct gctgggcgga 960
ccctccgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag ccgcaccccc 1020
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgca gttcaagtgg 1080
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc cccgcgagga gcagtttaac 1140
agcaccttcc gcgtggtgtc tgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 1200
gaatacaagt gcaaggtctc caacaaggcc ctgcctgccc ccatcgagaa gaccatctct 1260
aagaccaagg gccagcctcg cgagccccag gtgtacaccc tgccccccag ccgcgaggag 1320
atgaccaaga accaggtgtc cctcacctgc ctcgtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1380
gccgtggagt gggagtccag cggccagccc gagaacaact acaacaccac cccccccatg 1440
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagccgctgg 1500
cagcagggca acatcttctc ttgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccgcttcacc 1560
cagaagagcc tgagcctgtc ccccggcaag taatgagcgg ccgc 1604
<210> 42
<211> 737
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 优化的RhD3 LC编码序列
<400> 42
ggatccgcca ccatggacat gcgcgtgccc gcccagctgc tgggcctgct gctgctgtgg 60
ctgaggggcg cccgctgcga catccaggtg acccagagcc ccagcagcct gagcgccagc 120
gtgggcgacc gcgtgaccat caactgccgc gccagccaga gcatcggcac ctacctgaac 180
tggtatcagc agaagcccgg caaggccccc aacctgctga tctacgccgc cagctccctg 240
cagagcggcg tgcccagccg cttcagcggc agcggctccg gcaccgactt caccctgacc 300
atcagcagcc tgcagcccga ggacttcgcc acctactact gccagcagac ctacagcacc 360
cccacctgga ccttcggcag gggcaccaag gtggagatca agcgcaccgt ggccgccccc 420
agcgtgttca tcttcccccc cagcgacgag cagctgaaga gcggcaccgc tagcgtggtg 480
tgcctgctga acaacttcta cccccgcgag gccaaagtgc agtggaaggt ggacaacgcc 540
ctgcagtccg gcaacagcca ggagagcgtc accgagcagg acagcaagga ctccacctac 600
agcctgagca gcaccctgac cctgagcaag gccgactacg agaagcacaa gctgtacgcc 660
tgcgaggtga cccaccaggg cctgtccagc cccgtgacca agagcttcaa ccgcggcgag 720
tgctgatgag cggccgc 737
<210> 43
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 43
atcgtctaga gccaccatgg actggacctg 30
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 44
atcgggatcc tcatcacttg ccgggggac 29
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 正向引物
<400> 45
atcgtctaga gccaccatgg cctgggccc 29
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> PCR 反向引物
<400> 46
atcgggatcc tcatcagctg cactcggtgg gg 32
<210> 47
<211> 1461
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于RhD1V3C HC载体优化的RhD1 HC插入物
<400> 47
tctagagcca ccatggactg gacctggcgc ttcctgttcg tggtggccgc cgccaccggc 60
gtgcagagcc aggtgcagct ggtgcagagc ggcgccgagg tgaagaagcc cggcagcagc 120
gtcaaggtgt cctgcaaggc cagcggcggc atcttccgca cctacgccat ctcttgggtc 180
cggcaggctc ccgggcaggg gctcgagtgg atgggcggca tcatccccat gttcggcacc 240
gtgaactacg cccagaagtt ccagggccgc gtcaccatca gcgccgacaa gagcaccagc 300
accgcctaca tggagctgtc ccgcctgcgc tccgaggaca ccgccgtgta ctactgtgct 360
aggcctccca gcggcggctg cggcggcgac tgcagccgca ggggctacta ctacgctatg 420
gacgtgtggg gccagggcac caccatcacc gtgagcagcg ctagcaccaa gggccccagc 480
gtgttccccc tggcccccag cagcaagagc acctccggcg gcaccgccgc cctgggctgc 540
ctggtgaagg actacttccc cgagcccgtg accgtgagct ggaacagcgg cgccctgacc 600
agcggcgtgc acaccttccc cgccgtgctg cagagcagcg gcctgtacag cctgagcagc 660
gtggtgaccg tgcccagcag cagcctgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaaccac 720
aagcccagca acaccaaggt ggacaagaag gtggagccca agagctgcga caagacccac 780
acctgccccc cctgccccgc ccccgagctg ctgggcggcc cctccgtgtt cctgttcccc 840
cccaagccca aggacaccct gatgatcagc cgcacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 900
gacgtgagcc acgaggaccc cgaggtgaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 960
cacaacgcca agaccaagcc ccgcgaggag cagtacaaca gcacctaccg cgtggtgtcc 1020
gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 1080
aacaaggccc tgcccgcccc catcgagaag accatcagca aggccaaggg gcagcctaga 1140
gagccccagg tctacaccct gcctccatcc cgcgacgagc tgaccaagaa ccaggtgtcc 1200
ctgacctgtc tggtcaaggg cttctacccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaac 1260
ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc 1320
ttcctgtaca gcaagctgac cgtggacaag agccgctggc agcagggcaa cgtgttcagc 1380
tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgtcc 1440
cccggcaagt gatgaggatc c 1461
<210> 48
<211> 729
<212> DNA
<213> 人工的
<220>
<223> 用于pCB11载体的优化的 RhD1 LC插入物
<400> 48
tctagagcca ccatggcctg ggccctgctg ttcctgaccc tgctgaccca gggcaccggc 60
agctgggccc agagcgccct gacccagccc gccagcgtga gcggcagccc cggccagtct 120
atcaccatct cttgtagcgg cagcagcagc gacgtgggcg gctacaagta cgtgtcttgg 180
tatcagcagc accccggcaa ggccccccag ctgatgatct acgacgtgaa caaccgcccc 240
agcggcgtga gcaaccgctt cagcggctcc aagagcggca acaccgccag cctgaccatc 300
tctgggctgc aggctgagga cgaggccgac tactactgca gcagctacac cagcagctcc 360
acccgcgtgt tcggcggcgg caccaagctg accgtgctgg gccagcccaa ggccgccccc 420
agcgtgaccc tgttcccccc cagcagcgag gagctccagg ccaacaaggc taccctggtg 480
tgcctgatca gcgacttcta ccccggcgcc gtgaccgtcg cctggaaggc cgacagcagc 540
cccgtgaagg ccggcgtgga gaccaccacc cccagcaagc agagcaacaa caagtacgcc 600
gccagcagct acctgagcct gacccccgag cagtggaaga gccacaagag ctacagctgc 660
caggtgaccc acgagggcag caccgtggag aagaccgtgg cccccaccga gtgcagctga 720
tgaggatcc 729
Claims (24)
1. 一种分离的抗-RhD单克隆抗体，包含：
a） 具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：2的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和
具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：4的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
b） 具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：6的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和
具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：8的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
c） 具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：10的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和
具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：12的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
2. 权利要求1的抗体，包含：
a） 至少80%相同于SEQ ID NO：2的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：2的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和
至少80%相同于SEQ ID NO：4的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：4的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
b） 至少80%相同于SEQ ID NO：6的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：6的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和
至少80%相同于SEQ ID NO：8的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：8的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区；或
c） 至少80%相同于SEQ ID NO：10的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：10的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区，和
至少80%相同于SEQ ID NO：12的可变区、并具有相同于或基本上相同于SEQ ID NO：12的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
3. 权利要求2的抗体，其中所述抗体包含： 至少80%相同于SEQ ID NO：2的可变区、并具有相同于SEQ ID NO：2的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区；和至少80%相同于SEQ ID NO：4的可变区、并具有相同于SEQ ID NO：4的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
4. 权利要求2的抗体，其中所述抗体包含： 至少80%相同于SEQ ID NO：6的可变区、并具有相同于SEQ ID NO：6的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区；和至少80%相同于SEQ ID NO：8的可变区、并具有相同于SEQ ID NO：8的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
5. 权利要求2的抗体，其中所述抗体包含： 至少80%相同于SEQ ID NO：10的可变区、并具有相同于SEQ ID NO：10的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的重链可变区；和至少80%相同于SEQ ID NO：12的可变区、并具有相同于SEQ ID NO：12的相应的第一、第二和第三CDR的第一、第二和第三CDR的轻链可变区。
6. 权利要求2到5的任一项的抗体，其中所述相应的可变区是至少90%相同的。
7. 权利要求6的抗体，其中所述相应的可变区是至少95%相同的。
8. 权利要求7的抗体，其中所述相应的可变区是相同的。
9. 前述任一项权利要求的抗体，其中所述抗体包含轻链恒定域和重链恒定域。
10. 权利要求9的抗体，其中所述抗体包含重链恒定区。
11. 权利要求9或10的抗体，其中所述重链恒定域或区是IgG恒定域或区。
12. 权利要求11的抗体或片段，其中所述IgG恒定域或区是IgG1或IgG3恒定域或区。
13. 一种编码根据前述任一项权利要求的抗体的轻链和/或重链的分离的多核苷酸。
14. 一种包括编码序列的表达载体，所述编码序列编码根据权利要求1到12的任一项的抗体的轻链和重链。
15. 一种包括编码序列的表达系统，所述编码序列编码根据权利要求1到12的任一项的抗体的轻链和重链，所述表达系统包含：
包括编码轻链的编码序列的第一表达载体；和
包括编码重链的编码序列的第二表达载体。
16. 一种用根据权利要求14或15的表达载体或系统转化的细胞。
17. 权利要求16的重组细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
18. 一种制造单克隆抗体的方法，包括培养根据权利要求16或17的重组细胞，以及从培养基回收单克隆抗体。
19. 一种包含根据权利要求1到12的任一项的单克隆抗体的药物组合物。
20. 权利要求19的药物组合物，其中所述药物组合物包含根据权利要求1到12的任一项的第一单克隆抗体，以及根据权利要求1到12的任一项的第二单克隆抗体，其中所述第一和第二单克隆抗体是彼此不同的。
21. 权利要求20的药物组合物，其中所述第一单克隆抗体具有包含IgG1恒定域或区的重链，所述第二单克隆抗体具有包含IgG3恒定域或区的重链。
22. 一种抑制或阻止RhD-阴性人类患者对RhD-阳性血液免疫的方法，包括施用预防有效量的根据权利要求1到12的任一项的单克隆抗体，或根据权利要求19到21的任一项的药物组合物。
23. 根据权利要求1到12的任一项的单克隆抗体，或根据权利要求19到22的任一项的药物组合物，其用于抑制或阻止RhD-阴性人类患者对RhD-阳性血液免疫的方法中。
24. 根据权利要求1到12的任一项的单克隆抗体在制造用于抑制或阻止RhD-阴性人类患者对RhD-阳性血液免疫的药物中的用途。
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