JPS60227674A - 細胞交雑体及びその製造方法 - Google Patents

細胞交雑体及びその製造方法

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JPS60227674A
JPS60227674A JP59083864A JP8386484A JPS60227674A JP S60227674 A JPS60227674 A JP S60227674A JP 59083864 A JP59083864 A JP 59083864A JP 8386484 A JP8386484 A JP 8386484A JP S60227674 A JPS60227674 A JP S60227674A
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JP
Japan
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cells
cell
human
glomerular
renal
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Application number
JP59083864A
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English (en)
Inventor
Michiaki Origasa
折笠 道昭
Isao Iwase
岩瀬 勇雄
Fujio Shimizu
清水 不二雄
Takashi Otsute
追手 巍
Kyoko Sato
京子 佐藤
Akimichi Nakamura
中村 亮道
Masaaki Arakawa
荒川 正昭
Takashi Kazama
隆 風間
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Denka Seiken Co Ltd
Original Assignee
Denka Seiken Co Ltd
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト腎糸球体の特定成分と特異的に反応し他の
腎組織とは反応しない単クローン性抗体を分泌する細胞
交雑体に関するものである。
ヒト腎糸球体の疾患において、免疫グロブリン、補体成
分及び凝固因子等(これらを総合し1− て因子という)の腎糸球体への沈着が証明されており、
これらの因子の疾患への関与が示唆されている。
然しなからこれらの因子と腎糸球固有細胞との関係につ
いては不明な点が多い。例えば糸球体で増殖している細
胞の由来、細胞の増殖機構。
障害された細胞の変性機序などである。一方腎糸球体細
胞の適切なマーカーが欠如しているためこれらに関する
基礎的研究が妨げられている。
本発明はかかる現状に鑑み鋭意研究を行った結果、開発
されたものである。即ち本発明は(1) ヒト腎糸球体
上皮細胞と特異的に反応する単クローン抗体を分泌する
抗体産生細胞と腫瘍細胞とよりなることを特徴とする細
胞交終体(2) ヒト腎糸球体メサンノウムと特異的に
反応する単クローン抗体を分泌する抗体産生細胞と腫瘍
細胞とよシなることを特徴とする細胞交雑体 (3) ヒト胎児腎皮質細胞(h 7 FKC)で高等
動物を免疫賦与し、核高等動物より得られたBリ2− ン・臂球と腫瘍細胞とを融合せしめることを特徴とする
細胞交雑体の製造方法 である。
本発明は免疫原として方今7ケ月の早産死亡胎児よりの
腎細胞を使用するものである。即ち骸胎児よシ摘出した
腎よシ滅菌生理食塩水中でその被膜と髄質部分とを除去
し皮質部分を1n立方程度の細片にした後、その組織片
を37℃、5分間トリプシン処理し、1000r、p、
mにて5分間遠心する。との沈渣を20傳ウシ胎児血清
(FBS)加RPMI−1640培地に浮遊し、50m
!フラス:I(Falconす3013)に5dづつ分
注後37℃、5%CO2インキュベータで培養する。こ
のようにして培養した細胞を3〜4代継代培養し10%
ジメチルスルホキシド加FBS−RPMI 1640培
地に浮遊せしめた後、液体窒集中で凍結保存する。
斯くして得た細胞は必要時において融解後2〜4代継代
培養した時点で免疫源となる。
免疫方法は、上記の細胞と105ae’l 1 /wl
の濃度と1フロイントコンプリードアシユバンドと共に
高等動物好ましくはマウス或はラットに投与した稜、2
週間の間隔で細胞単独で腹腔内に2回投与する。最終投
与(4回目)は腹腔内と静脈内に投与する。
而して本発明は免疫細胞10に対して腫瘍細胞1を混合
するものであシ、通常液体培地(RPMI 1640 
)に浮遊した状態の免疫細胞1〜10XIO個と同様に
浮遊状態の腫瘍細胞1〜10×10 個とを混合し、遠
心操作によって培地を除去し、次いでポリエチレングリ
コール又ハセンダイウイルス等の融合剤によって融合す
るものである。
即ち3×108個の抗体産生細胞と3X10’個の腫瘍
細胞とを混合し1000rprn + 10mIn遠心
分離して上清をすてる。次いでポリエチレングリコール
4004を1分間に滴下し、5分間静置しRPM116
40培地を6〜7 mlゆっくり添加し更にlQm/を
追加し、11000rpにて5分間遠心操作を行って上
清をすてる。培養用培地(RPM11640+15%F
BS )で浮遊する。細胞の濃度はl X 10 ca
1ms/II/にする。次いで24穴或は96穴の培養
グレートで培養する。翌日培地の半量をHAT培地に変
える。なおHはヒポキサンチン。
Aはアミノfqリン、Tはサイミジンである。
この場合2〜3日毎に同培地半I:を交換する(10日
間培養)。10日後培地の半量をHT培地に変える。上
記のHAT培地からアミノププ、シンを除いた培地であ
る。この場合2〜3日毎に同培地半−1を交換する(1
0日間培養)。
次いでRPMT1640とFBS 15%で培養し、活
性検索(間接螢光抗体法)で陽性を示したWe l 1
(穴〕の細胞を培養し、限界希釈法によりクローン化す
る。
なお限界希釈法とは細胞を5コア/ ml程度に希釈し
培養する。96 We 11の培養スケールは200μ
!であるから理論上は1コ/ We l 1 となる。
このようにして増殖した細胞は1つの性質をもつクロー
ンである。
本発明において使用する細胞のうち、抗体産生細胞とは
抗原に対し特異的な抗体を産生ずる89721球である
又腫瘍細胞はリンパ球が腫瘍化した細胞であシ、試験管
内にて無限に増殖する。
クローン化された細胞の培養上清は、すでに一般化され
た免疫学的測定法例えば放射線免疫測定法(RIA )
 、酸素免疫測定法(EIA ) 、螢光抗体法(IF
’ )を用いることによシ抗体の特異性を検索する。特
に本発明においては腎組織凍結切片を用いた螢光抗体法
或は培養細胞を用いたEIA法並に螢光抗体法が適して
いる。
本発明の交雑体よル得られる単クローン性抗体は腎疾患
の診断試薬として多大が価値を有するものである。
次に本発明の実施例について説明する。
実施例 Ba1f/sマウスに免疫賦与するためヒト胎児腎皮質
細胞(h −FKC)を105calls 7’sl 
の濃度でフロイドコンブリートアジュノ9ンドと共に筋
肉内に投与し以後2週問おきに同様の方法で、h −F
KCを細胞単独で腹腔内に2回投与後更に2週間稜に腹
腔内と静脈内に投与した。最終免疫薮4日目にマウスの
牌よりリン・9球浮遊液をステンレスメツシーを通して
得た後混入する赤血球を0.28%)・リス塩化アンモ
ニウム緩衝液で除去1〜、これをRPMI]640培地
で2回洗い生細胞をトリバンプルー法で測定しその数を
調整した。
また腫瘍細胞(NS −1)はRPM11640に10
%FBSを含む培地で培養し、対数増殖期細胞を遠心に
よシ採集しトリパンブルー法により生細胞を測定しその
数を調整した。
上記の牌臓細胞3×10 コに対し腫瘍細胞3×10コ
を混合し1001000rp分遠心後、上清をすてその
ペレットに45%ポリエチレングリコールl rR2を
加えて5分間静置した。その後RPMI1640培地を
6dゆっくシ加え、更に10m1の同培地を加え遠心(
1000r、p、m 5分)し、上清をすてた後、RP
MI1640培地に15%F心Sを加えた培地で腫瘍細
胞がlXl0 cell/R/ となるように浮遊し、
24穴(Nunc)の培養グレートで培養した。約24
時間昔培地の半量をHAT培地で置きかえた。次いでH
AT培地を2〜3日毎に半量づつ交換し1o日後にHT
培地を同様の方法で交換した。更に1o日後同様の操作
で培地をRPM11640に15%F6Sを加えた培地
で置換した。この間増殖してくる細胞の培養上清をクリ
オスタットにより作製した正常ヒト腎組織を用いた間接
螢光抗体法により抗体活性を検索し腎糸球体メサンジウ
ムと上皮細胞に特異的に反応する細胞群を選別した。
抗体活性検索により陽性を示した細胞群を限界希釈法に
よシフローン化を図った。更にこれらの中で抗体活性が
認められた細胞群を同様にクローリングすることによ)
得られたクローンをより確実性のあるものとした。なお
操作を実施するにあたり細胞の安定化のためクローニン
グ時にMS −1培養上清をCondltloning
 m@dlumとして用い5eell/肩lの割合て培
養した。クローニングによシえられたH−13及びH−
4と称するクローンはM1表に示す如く夫々腎糸球メサ
ンジウム、瞥斉襠准及び上皮細胞と夫々特異的に反応し
た。
第1表 クローン名 上皮細胞 メサンジウム H−4−1−− H−13+ 彦お上記においてヒト腎組織を用いた間接螢光抗体法と
は正常の腎細胞を一70℃にて瞬間凍結しクリオスタッ
トを用いて約2〜5ミクロンに細断しスライドグラスに
貼着した標本に交雑体を培養したときの上清を加え37
℃で30分反応させる。次いでPBSにて3同洗浄しF
ITCラベル抗マウスグロブリン血清を加え37℃で3
0分反応させる。次いでPBSにて3回洗浄しグリセリ
ン緩衝液で封入し螢光顕微鏡で観察する。なお被検上清
に抗体が含まれない場合には螢光を発しない。
以上詳述した如く本発明によれば腎糸球固有細胞に特異
的に反応する単クローン性抗体を分泌する交雑体をうる
等顕著な効果を有する亀のである。
第1頁の続き ■Int、CI、’ 識別記号 庁内整理番号0発 明
 者 荒 川 正 昭 新潟市旭町通1@発 明 者 
風 間 隆 新潟市旭町通1番町754番地 新潟大学
医学部内 番町754番地 新潟大学医学部内 昭和 年 月 日 特許庁長官 志 賀 学 殿 1、事件の表示 特願昭59−83864号 2、発明の名称 細胞交雑体及びその製造方法 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 デン化生研株式会社 4、代理人 5、自発補正 6、補正の対象 明11ill書 正の内容 1.、明細書第2頁第4行においてr*糸球固有細胞」
とある全「宵糸球体固有細胞」と訂正する。
(2) 同第3頁第17行において「免役源」とあるを
「免疫原」と訂正する。
、(32同第3貴第18行)第19行において「細胞ト
・・・・・・フロイントコンプリードアシュバンド」と
あるを「細胞(10’ oellV鵠、) Y 7 ロ
イ\トコンプリートアジュパント」と訂正する。
(4) 同第4負第157丁におし)てr4004を」
とあるンr 4900をl′−」と訂正する。
(5) 同第4頁第18行において「′jてる。」とう
るを「すて、」と訂正する。
同第6頁轡3行において「−上清は」とあるを「上清中
の抗体の特異性を」とd]圧する。
(7) 同第6頁第6行〜第7行において「抗体の特異
性」とあるを削除する。
(8) 同第6頁第15行においてFBalf/eJと
あるビ「Ba 1 b/a’ Jと訂正する。
 2− (91同第6頁第17行において「フロイドコンプリー
ドアシュバンド」とあるン「フロ河コンシリードアツユ
パント」と訂正する。
toI 同第7貞第3行において「028%」とあるを
「083%」とKj圧する。
旧)同第7jA第1r行において11月0 ’ ce]
、1/y$ Jとあるをr1x+o’○e ]、 ]、
 s /m薊と訂正する。
Q4 同第8貞第16行においてl−5cell−/y
djとある’f r5cells/dJとに1正する。
lJ5ノ 同第8貴第20行において1腎系球体」とあ
るン削除する。
Q4/ 同第9負第16竹において「腎糸球敗1有」と
あるぞ「腎糸球体固有」とK」正する。
 3 −

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. (1) ヒト腎糸球体上皮細胞と特異的に反応する単ク
    ローン抗体を分泌する抗体産生細胞と腫瘍細胞とを融合
    せしめてなる細胞交雑体。
  2. (2) ヒト腎糸球体メサンジウムと特異的に反応する
    単クローン抗体を分泌する抗体産生細胞と腫瘍細胞とを
    融合せしめてなる細胞交雑体。
  3. (3) ヒト胎児腎皮質細、胞(、h −FKC)で高
    等動物を免疫賦与し、該高等動物よ)得られるBリン・
    9球と腫瘍細胞とを融合せしめることを特徴とする細胞
    交雑体の製造方法。
JP59083864A 1984-04-27 1984-04-27 細胞交雑体及びその製造方法 Pending JPS60227674A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63112994A (ja) * 1986-10-31 1988-05-18 Hajime Inamoto モノクロ−ナル抗体を用いた尿中腎抗原の測定による腎障害の診断方法
JPH06296496A (ja) * 1993-10-27 1994-10-25 Hajime Inamoto 尿中腎抗原の測定による腎障害の診断方法に用いるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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JPS63112994A (ja) * 1986-10-31 1988-05-18 Hajime Inamoto モノクロ−ナル抗体を用いた尿中腎抗原の測定による腎障害の診断方法
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