JPH06296496A - 尿中腎抗原の測定による腎障害の診断方法に用いるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 尿中腎抗原の測定による腎障害の測定に用い
るモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを提供
する。 【構成】 正常ヒト腎組織またはＨｅＬａ細胞で免疫し
た動物の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合して得られ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はヒト正常腎組織由来抗原
と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマに係わる。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】現在本
邦に於いて、腎不全で透析治療を受けている患者は約 7
万人存在し、それらの患者には年間１人当り約 500万円
という膨大な治療費が必要とされており、政府、自治体
の財政を圧迫する大きな原因の一つとなっている。しか
も、現在、更に毎年約 5,000人の新たな腎不全患者が発
生している。

【０００３】腎不全に陥ると、毎週 2〜3 日、１日 4〜
6 時間の透析治療を受けなければならず、患者本人の社
会生活が著しく妨げられるのみならず、前述のように社
会的にも大きな負担を強いることになり、このまま事態
が推移すれば、いずれ社会医療制度が破綻する危険性を
孕んでいるものである。

【０００４】腎不全は腎臓病患者が最終的に至る状態で
あるが、糖尿病、高血圧及び痛風など本来腎臓以外の病
気が原因となり、やがて腎臓が障害を受け腎不全になっ
たり、又は睡眠薬の常用により障害を受けて腎不全に至
る場合、更には、抗生物質及び抗癌剤等の副作用によっ
て腎障害、腎不全の経過を辿る場合など，慢性腎炎，急
性腎炎もしくは急速進行性腎炎などの各種腎炎、又は腎
盂腎炎，腎臓結核，腎臓結石，のう胞腎等本来の腎疾患
以外の病態から腎臓に障害が及ぶ場合も数多くみられ
る。特に近年の社会情勢の変化から、糖尿病、高血圧及
び痛風などを患う患者は著しく増えてきており、又睡眠
薬，抗生物質及び抗癌剤等の薬物使用も多く、これらが
原因となる腎障害の発生も増加してきている。

【０００５】ところで、腎臓病及びこれら他の疾患に随
伴して出現する腎障害に於いては、末期即ち腎不全近く
になるまで、顕著な自覚症状がなく、その発生が見過さ
れることが多い。したがって、浮腫，乏尿などのある少
数例を除き、腎疾患・腎障害は健康診断時の検尿によっ
てはじめて発見されることが多い。

【０００６】因みに、本邦では、学校保険法、労働安全
衛生法、老人保険法により法的に健康診断時の検尿が義
務づけられている。又は、地方自治体により成人病集団
検診などで検尿が実施されている。

【０００７】このように現在行なわれている検尿に於い
ては、尿蛋白及び尿沈渣等が検査されるが、これらの検
査に用いられている試験紙の感度はメーカーにより異な
り、又、その検査で用いる市販検査試験紙の比色対照紙
の質、光沢及び色調等にバラつきがみられ、更には、検
査する場所の照明、検査する人の視力・手技又は反応時
間等により、検査結果の信頼性は充分に満足し得るもの
とはなっていない。尿蛋白は腎・尿路のいずれかで尿中
に血液中の蛋白が漏出してきたものであり、腎疾患患者
のみならず正常人でも毎日蛋白が排泄されており、また
起立性，体位性，運動後、熱性の蛋白尿、あるいは単に
精液の混入による蛋白尿が正常人にもみられる。また尿
路疾患，膀胱疾患，女性性器疾患などでも蛋白尿がみら
れる。従って、尿蛋白検査は健康診断などでのスクリー
ニング目的には適しているが、偽陽性を多く含んでお
り、それ以上の診断的目的には充分でなく、腎疾患を特
定して診断することは不可能である。

【０００８】尿沈渣は尿を遠心し、その沈渣を顕微鏡で
検査するものである。沈渣中、赤血球は尿蛋白とほぼ同
様に健康人でも見られ、また腎以外の尿路関連臓器に由
来するものがあり、また虫垂炎，大腸憩室炎，骨盤内腫
瘍の炎症に際してもみられる。診断的意義は尿蛋白とほ
ぼ同程度である。

【０００９】円柱のうち硝子様円柱は正常人でもみられ
ることがある。顆粒円柱が出現すれば病的と考えられる
が特定の疾患を示唆するものではない。

【００１０】その他上皮細胞白血球も場合により病的意
義のあることがある。

【００１１】さて、以上の検尿で、異常又は異常の疑い
がある場合には、更に医療施設に於いてより詳しい検査
をする訳であるが、血清クレアチニン、尿素窒素，糸球
体濾過量，尿細管機能，β₂ ミクログロブリンの測定、
尿濃縮能，尿希釈能，腎血流量及び尿酸性化能などの腎
機能検査を実施しても、そこから特定疾患を診断するこ
とは困難な場合が多い。又、 N-Acetyl-β-D-glucosami
dase（ＮＡＧ）の酵素活性を測定し、尿細管障害を見出
そうとする検査もあるが、尿はｐＨが弱アルカリ側から
強酸性側にまで変動し、塩類濃度も変動が著しく、浸透
圧なども著しく変化するためか、一部疾患，急性腎不全
などを除き有効でない。更に、多くの時間と費用を費し
て、経静脈的腎盂造影，腎シンチ，エコー検査，Ｘ線検
査，ＣＴスキャン，腹部単純Ｘ線撮影又は腎血管造影な
どの画像による検査を行っても得られた画像により形態
学的に変化があり、且つある程度以上の大きさを有する
もの、即ち、腎腫瘍，嚢胞，結石及び奇形等には有効で
あるが、各種腎炎，腎硬化症，ネフローゼ，糖尿病性腎
症及び痛風など大多数の内科的腎疾患では殆んど役に立
たない。また、外部よりのＸ線被曝，体内からの放射能
被曝あるいは外科的処置などに伴なう合併症など不利な
点が多くある。

【００１２】従って、疾患の最終的判定には腎生検を実
施することが必要になる。しかしながら、腎生検を実施
する為には、腎臓専門医，蛍光顕微鏡，電子顕微鏡等を
有する病院に入院しなければならず、患者腎臓に針を刺
すか又は開腹のうえ切除する為、危険度が高いために、
必要性の著しく高い極く限られた少数の患者にしか実施
し得ないのが現状である。

【００１３】前記のように、検尿による尿検査は、毎日
或いは１日に数回行なうことも可能であり、生体外検査
である為に検査による合併症を惹起する心配がない等優
れた検査法ではあるものの、現在そこで実施されている
尿検査は検査自体に包含される不確実性により偽陽性を
多く含み、腎障害・腎疾患の診断という観点からは満足
し得るものとは言えない。一方、腎生検は上記の理由で
その有用性は極く限られたものである。そこで、検尿制
度を利用して、簡便に且つ高感度で測定し得、腎障害、
腎疾患の早期診断を行ない得るような検査方法が強く望
まれていた。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明は以上の問題点を
解決する為になされたものであり、以下に述べる知見に
基づくものである。

【００１５】腎臓の糸球体では血液を濾過し原尿を作り
尿細管を流れ集合管に集まり尿として尿管を経て膀胱に
至り排泄される経路をとる。我々はもし腎臓内に病変が
生じあるいは障害を受けた場合、腎の構造の一部は破壊
され、尿中にこぼれ尿流の経路を経て尿として排泄され
ているのではないかと考えた。さらに、腎内の特定部位
の破壊、或いは特定部位の代謝異常の程度が判れば腎病
変の性質もある程度推測し診断できると考えた。また尿
検査であれば患者への負担は軽く、これだけの情報が入
手できれば検尿と腎生検とのギャップを埋める検査法と
なりうると考えた。

【００１６】そこで、ヒト正常腎組織又はＨｅＬａ細胞
を抗原とし、腎組織由来の抗原と特異的に反応するモノ
クローナル抗体を作成し、これを正常人尿ならびに腎疾
患患者尿と反応させて見たところ両群に著しい差異が認
められることが判明した。即ち、尿中に於いて、腎疾患
患者では腎に局在する正常組織の崩壊物を正常に比べ著
しく多く検出し得た。また正常な新陳代謝が腎疾患患者
では抑制され、その結果、該患者の尿中では、代謝産生
物である抗原の量が著しく減少していることを認めた。
尿の濃縮の程度は人により時々に異なるので２種抗原量
の比を求めると同様に患者群では正常人に比べ著しく異
なっていた。

【００１７】又、いわゆる不健康人の中にも、腎疾患患
者ほど著しくはないが、正常人と較べて有意な異常を示
す例のあることが判明した。

【００１８】従って、本発明のハイブリドーマが産生す
るモノクローナル抗体を用いる検査法により、腎臓内の
微細病変の部位、その重症度を副作用がなく安全に且つ
簡便に判定することが可能になり、また病変の性質をも
推測することが一部可能となり、更に臨床症状等ともあ
わせると病変の性質は更によく判定することが可能にな
ったものである。

【００１９】また検尿における尿蛋白検査、尿潜血検査
等は糸球体の障害がある程度以上進まないと異常が見ら
れないが、本発明のハイブリドーマが産生するモノクロ
ーナル抗体を用いる診断法はそれ以前に微細な病変を見
出すことができるため高血圧、糖尿病、痛風、肥満、や
せ症など潜在的に腎障害を有する可能性のある一般人、
即ち不健康人に於いて、尿蛋白陰性の時期すなわち早期
に腎障害を検出できるものである。

【００２０】更に、腎生検では過去から現在までの累積
された疾患の歴史が重ねられた形で病変をみるのに対
し、本発明の診断法では尿中に排泄された時点での現在
の状態を知ることができる。

【００２１】また、くり返し毎日でも検査することがで
きるため、治療方針の決定に重要な情報を提供し得る。

【００２２】本発明のハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体を用いた診断法は上述のように、高価な設
備も必要とせず極めて簡便に行なえるものであり、従来
の健康診断に於ける尿蛋白陽性あるいは（±）群の第２
次スクリーニング法として極めて有用なものである。

【００２３】更にまた、本発明のハイブリドーマが産生
するモノクローナル抗体を用いた測定法により腎移植に
伴う拒絶反応も早期に発見し得るものである。

【００２４】本発明はヒト腎臓内に局在する、特に成人
の正常腎組織抗原を特異的に認識するモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマを提供する。

【００２５】本発明のハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体は腎疾患患者の尿に対し正常人の尿と比べ
著しく強く反応し、また腎障害を有する人の尿に対し正
常人の尿と比べ強く反応する。このような尿との反応性
の強弱により、腎病変の重症度または腎障害の程度が示
される。これにより、腎臓内病変部における正常構造の
崩壊の程度を知ったり、細胞小器官などの新陳代謝障害
を知ることができる。

【００２６】尚、本発明においては、上記のような腎疾
患患者の病変、新陳代謝障害、さらには腎の組織学的異
常など全てを含めて「腎障害」ということがある。

【００２７】本発明のハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体としては、後述の実施例にも示すように、
ヒト腎尿細管内腔壁、糸球体基底膜、糸球体および尿細
管基底膜、または尿細管細胞質と特異的に反応するモノ
クローナル抗体があり、これらはＩｇＧ₁ クラスまたは
ＩｇＧ_2aクラスに属する。

【００２８】また本発明は、上述のヒト正常腎組織抗原
を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて尿中の
該抗原を測定することにより腎臓内障害の部位および程
度を診断することからなる腎臓内障害の部位および程度
を診断することからなる腎障害診断方法を提供する。こ
の診断方法では、検体尿中の抗原の測定値を正常人尿中
の抗原値と比較することによって診断する。特に、本発
明の方法においては検体尿中の抗原の測定値を正常人尿
中の抗原値と比較することによって腎障害の有無を診断
することができる。

【００２９】また、本発明によって、正常ヒト腎組織ま
たはＨｅＬａ細胞で免疫した動物の抗体産生細胞を骨髄
腫細胞と融合し、得られたハイブリドーマを培養し、産
生された該正常ヒト腎組織と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を回収することからなるモノクローナル抗体
の製造方法が提供される。

【００３０】本発明は、正常ヒト腎組織またはＨｅＬａ
細胞で免疫した動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞から得
られ、該正常ヒト腎組織と特異的に反応するモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを提供する。

【００３１】最後に本発明は、ヒト正常腎組織と特異的
に反応するモノクローナル抗体を含む腎障害診断用試薬
を提供する。

【００３２】次に実施例によって本発明を更に詳しく説
明する。

【００３３】

【実施例】実施例 １ ハイブリドーマの作製法 １．免 疫 1) 免疫原として成人男子より摘出した腎の正常皮質部
を用いた。腎皮質部分をアミノベンジルペニシリン（10
mg／ml）、硫酸ストレプトマイシン（10mg／ml）を含む
滅菌生理食塩水で、次いで滅菌生理食塩水で順次洗浄し
た後、１mm角程度に細切する。

【００３４】2) 細切片(3.9ｇ) を生理食塩水とともに
ガラス製ホモジナイザー中で破砕した後さらに生理食塩
水を加え、ホモジナイズ液（腎皮質部 300mg／ml）とす
る。

【００３５】3) 上記ホモジナイズ液を生理食塩水で希
釈し、そのままあるいは補助剤（例えばフロインドの完
全アジュバント等）とともにＢＡＬＢ／ｃマウスあるい
は他の免疫可能な動物に免疫原として投与する。投与方
法は腹腔内注射、皮下注射、皮内注射、静脈内注射等の
いずれでもよいが、皮下または腹腔内注射が好ましい。
例えばマウスでは皮下あるいは腹腔内に皮質47mg相当を
注射した。

【００３６】4) 追加免疫は適当な間隔、例えば 3〜4
週間おいて１回ないし数回行う。抗原液はそのままある
いは補助剤とともに腹腔内あるいは皮下等に投与する。
例えばマウスでは皮質部分30mg相当をそのまま腹腔内注
射した。

【００３７】２．細胞融合 1) 最終免疫３日ないし４日後に、免疫脾細胞とマウス
骨髄腫細胞、例えばP3-NS1-1-Ag4-1細胞（ＮＳ1 細胞）
との融合を行う。

【００３８】免疫脾細胞 5×10⁷ 個とＮＳ1 細胞 1×10
⁷ 個の割合で、あるいは他の適当な割合で混合し、 400
×ｇ、５分間遠心分離して上清を除く。次いでポリエチ
レングリコール（ＰＥＧ）溶液例えば50% ＰＥＧ4000溶
液 1mlを１分間に攪拌しながら滴下し、さらに１分間攪
拌後ダルベコのＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ培地） 9mlを攪拌
しながらゆっくりと滴下し、 400×ｇで５分間遠心分離
して上清を除く。

【００３９】2) 培養培地（栄養培地例えばＤＭＥＭ培
地＋血清、例えば15% 馬血清＋抗生物質、例えばアミノ
ベンジルペニシリン 0.1mg／mlを硫酸ストレプトマイシ
ン 0.1mg／ml）10mlに細胞を浮遊し、96穴組織培養用プ
レートのウェルに 100μｌずつ分注し、37℃， 5% ＣＯ
₂ ，湿潤な雰囲気で培養する。

【００４０】3) 融合の翌日、各ウェルにヒポキサンチ
ン(100μM)，アミノプテリン(0.4μM)およびチミジン
(16μM)を含む培養培地（ＨＡＴ培地）を 100μｌ加え
る。２〜３日毎に培地の半量をＨＡＴ培地と交換する。
10〜14日後からＨＴ培地と交換する。ＨＴ培地とはＨＡ
Ｔ培地よりアミノプテリンを除いたものである。

【００４１】抗体産生細胞のスクリーニング 細胞融合後10〜21日めに酵素免疫測定法（ＥＩＡ法）に
より抗体産生細胞を調べた。なおスクリーニングは放射
線免疫測定法、蛍光抗体法等でも可能である。

【００４２】ＥＩＡ法は以下のごとく実施した。

【００４３】1) ヒト腎皮質抗原液を96穴ＥＩＡ用プレ
ートに加え適当な条件で吸着固相化する。例えば 100μ
ｌの抗原液を加え、４℃で一夜放置後、抗原液を除き室
温で風乾する。抗原吸着プレートは牛血清アルブミン
（ＢＳＡ）等の溶液でブロッキング処理する。

【００４４】2) 上記プレート用各ウェルに培養上清を
加え適当な条件で反応させる。例えば上清 100μｌを室
温で１時間反応させる。

【００４５】3) ツイーン20を 1％含むリン酸緩衝液
（洗浄緩衝液）で洗浄する。洗浄は洗浄緩衝液を満した
プレートをプレートミキサーで３分間振動させることに
より行い、通常この操作は４回くり返す。このプレート
にホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）結
合抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体溶液を 100μｌ／ウェル
加え、室温で反応させた。

【００４６】4) 洗浄後、基質溶液を加え発色反応を行
う。クエン酸−リン酸緩衝液（pH 5.0）にオルトフェニ
レンジアミンを 0.4mg／ml、31％過酸化水素水を 0.2μ
ｌ／ml加えた溶液（基質溶液）を 100μｌ／ウェル加
え、室温で30分間反応後、４Ｎの硫酸を50μｌ／ウェル
加え反応を停止する。発色のみられるものを抗体産生陽
性細胞（ハイブリドーマ）とする。

【００４７】抗体産生陽性細胞のクローン化 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法、軟寒天法、
フィブリンゲル法等により行う。以下に限界希釈法によ
る例を示す。

【００４８】1) ハイブリドーマは10個／mlに、フィー
ダー細胞となるマウスあるいはラットの胸腺あるいは脾
臓の細胞は約 1.7×10⁷ 個／mlになるようにＨＴ培地に
浮遊させ、96穴組織培養プレートに 100μｌ／ウェル分
注し、培養する。翌日ＨＴ培地を 100μｌ／ウェル加え
２〜３日毎に半量ずつ交換する。

【００４９】2) ２〜３週間後に前述のスクリーニング
操作と同様な操作を繰り返し、抗体産生陽性細胞を選
ぶ。限界希釈法を１回ないし数回繰り返すことによりク
ローン化ができる。

【００５０】3) その結果、後記表１にある４株を含
め、総計13株のハイブリドーマが得られた。

【００５１】実施例 ２ ＨｅＬａ細胞を免疫原とした場合 基本的には腎組織抗原を免疫原として用いた場合と同様
に行った。

【００５２】1)免 疫 培養培地（例えばダルベコのＭＥＭ培地＋10％牛胎児血
清＋抗生物質）で培養したＨｅＬａ細胞をフロインドの
完全アジュバントとともに高等動物、例えばＢＡＬＢ／
ｃマウスに腹腔内注射、静脈内注射等で投与し、免疫し
た。適当な期間をおき補助剤とともにあるいは使用せず
にＨｅＬａ細胞を上記のごとく投与し、追加免疫を行っ
た。

【００５３】2)細胞融合 最終免疫の３日後に免疫脾細胞と骨髄腫細胞、例えばＰ
３−ＮＳ１−１−Ａｇ４−１細胞を適当な比で混ぜ、ポ
リエチレングリコール（30〜50％）を用い、常法通り行
った。融合細胞は96穴組織培養プレートを用い、ＨＡＴ
培地中で培養した。

【００５４】3)抗体産生ハイブリドーマのスクリーニン
グとクローニング 96穴組織培養用プレート上で培養したＨｅＬａ細胞の培
養上清を除去し、 1%ＢＳＡでブロッキングした後、融
合細胞培養上清を添加し、室温で２時間反応させた。洗
浄用緩衝液で洗浄後、ＨＲＰＯ結合抗マウス IgG＋IgM
抗体希釈液を添加し、室温で２時間反応させた。洗浄用
緩衝液で洗浄後、基質液、例えばＡＢＴＳ溶液を加え、
室温で30分間反応させた後、2mM ＮａＮ₃ を加え反応を
停止させる。

【００５５】抗体産生陽性ウェルの細胞は限界希釈法を
繰り返すことによりクローン化する。

【００５６】抗体産生ハイブリドーマとしてＴＣＰを含
めて６株得られた。

【００５７】参考例 １ モノクローナル抗体を含む腹水等の作製 ハイブリドーマを生体に移植して増殖させ、その生体よ
り体液を採取することによりハイブリドーマが分泌する
抗体を製造できる。ハイブリドーマを腹腔に移植して増
殖させる場合は移植前、例えば 3〜8 週間にプリスタン
（2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン）を腹腔内に投
与しておくことにより腹水の収量を高めることができ
る。なお宿主として用いる生体は移植するハイブリドー
マの親細胞と同種同系の動物が望ましい。他種あるいは
他の系統の動物を用いる場合は宿主にＸ線照射や免疫抑
制剤を投与するなどの免疫応答能力の抑制処置を行う。
ヌードマウスを用いる場合は無処置でも移植が可能であ
る。

【００５８】1)成熟ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いる場合 あらかじめプリスタン投与処置を行ったマウスにＨＴ培
地で培養したハイブリドーマをＤＭＥＭ培地に１×１０
⁷ 〜２×１０⁷ 個／ml浮遊させ、マウス一頭あたり５×
１０⁶ 〜１×１０⁷ 個のハイブリドーマを腹腔内に１回
から数回移植する。

【００５９】2)腹部が肥大したら腹水を採取する。腹水
は遠心分離を行い（例えば 4℃，2500rpm 10分間）、上
清を回収する。

【００６０】参考例 ２ モノクローナル抗体のタイピング 抗体のサブクラスはオクタローニ法あるいはＥＩＡ法に
より同定した。

【００６１】1)オクタローニ法にはマウスモノクローナ
ルタイピングキット（Serotec 社）を用いた。寒天プレ
ートのロゼットの大きなウェルに抗体を含む培養上清あ
るいは腹水等を75μｌ入れる。周囲の小穴に抗Ｉｇ
Ｇ₁ 、抗ＩｇＧ_2a等６種の抗マウス免疫グロブリン抗体
を10μｌ入れる。室温で24〜48時間反応させ沈降線の形
成を観察する。

【００６２】2)ＥＩＡ法にはモノAb-ID EIA キット（Zy
med 社）を用いた。抗原を吸着させた固相、例えばＥＩ
Ａプレートにモノクローナル抗体を含む培養上清等を50
μｌ加え、室温で１時間またはそれ以上反応させた後、
洗浄用緩衝液で洗浄する。次いでサブクラス特異的ウサ
ギ抗マウスイムノグロブリン抗体を50μｌ加え室温で１
時間反応させた後洗浄する。次いでＨＲＰＯ結合抗ウサ
ギＩｇＧ抗体を50μｌ加え、室温で１時間反応させた後
洗浄する。基質としてＡＢＴＳ（2,2-アジノージ［3-エ
チルベンズチアゾリンスルフォン酸］）を1mＭ含む溶液
を 100μｌ加え、室温で20〜30分間反応させ判定する。
結果は後記表１に示した。

【００６３】参考例 ３ モノクローナル抗体の精製 培養上清あるいは腹水中のモノクローナル抗体はゲルク
ロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー等を適度用いて精製で
きる。

【００６４】例えばプロテインＡによるアフィニティー
クロマトグラフィーでの精製は以下のごとく行う。

【００６５】1)精製にはアフィゲルプロテインＡMAPS−
IIキット（BIO RAD 社）を用いた。腹水あるいは濃縮し
た培養上清を結合バッファーと１：１に混合し、アフィ
ゲルプロテインＡの充填されたカラムにアプライする。
結合バッファーで洗浄した後溶出バッファーを加え、抗
体を溶出させる。得られた分画は濃縮、脱塩等の操作を
行い精製モノクローナル抗体として用いる。

【００６６】参考例 ４ 蛍光抗体法 ハイブリドーマＴＷＬ，ＧＢＭ，ＧＴＢＭ，ＴＣＰの４
種が分泌する抗体を用いてヒト正常腎組織を間接蛍光抗
体法で染色した。腎組織切片をドライアイス−アセトン
で瞬間凍結し、クリオスタットを用いて約 4μｍに薄切
し、スライドグラスに貼布し、室温で風乾する。抗体を
含む培養上清あるいはマウス腹水等をそのままあるいは
適当に希釈してこの切片上に加え、37℃１時間湿潤な雰
囲気中で反応させる。次いでリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に
て数回（ 3〜4 回が好ましい）洗浄し、ＰＢＳで希釈し
たフルオレセイン結合抗マウスイムノグロブリン抗体
（カッペル社）溶液を加え、室温で２時間、モイストチ
ャンバー内で反応させる。その後ＰＢＳで洗浄を行い10
％グリセリンを含むＰＢＳで封入し、蛍光顕微鏡で検鏡
する。結果は表１に示す。

【００６７】

【表１】

【００６８】参考例 ５ モノクローナル抗体を用いた腎疾患関連尿中抗原の測定 1) 正常人尿 通常勤務を行っている会社員 986名を対象として問診，
理学的所見，体重（松木式標準体重），胸部Ｘ線，血
圧，検尿（蛋白，糖，潜血），血液生化学検査（血沈，
白血球数，ヘモグロビン，ヘマトクリット，ＺＴＴ，Ｇ
ＯＴ，ＧＰＴ，ＬＤＨ，ＡＬＰ，γ−ＧＴＰ，尿酸，Ｂ
ＵＮ，中性脂肪，総コレステロール，血糖，クレアチニ
ン）の項目について検査を行った。全項目受診者 400名
中上記項目すべてが標準値内であった者84名及び上記項
目中腎疾患と関連の深い体重，血圧，検尿（蛋白，糖，
潜血），尿酸，ＢＵＮ，血糖，クレアチニンは標準値内
でありかつ他の項目も標準値をわずかにはずれるものの
正常と認められる者41名の計125名より採取した尿を正
常人尿とした。

【００６９】2) 患者尿 ３施設より集めた腎疾患患者（例えば各種腎炎，ＳＬ
Ｅ，ネフローゼ症候群，急性腎不全，慢性腎不全，糖尿
病性腎症）45名より採取した尿を患者尿とした。

【００７０】3) 尿中抗原の測定法 尿50μｌを96穴ＥＩＡプレートに加え 4℃で一夜放置し
た後、尿を除去する。1%ＢＳＡ加ＰＢＳを約 400μｌ加
え室温で１時間放置後ＢＳＡ加ＰＢＳを除去し洗浄緩衝
液で２回洗浄する。

【００７１】適宜ＰＢＳで希釈した精製抗体ＴＷＬ，Ｕ
ＡＬ，ＧＴＢＭ，ＴＣＰを50μｌ加え室温で２時間反応
後、抗体を除去する。次いで洗浄緩衝液で洗浄する（洗
浄は洗浄緩衝液をウェルに満したプレートをプレートミ
キサー上で３分間振動させた後に洗浄液を交換する操作
を４回くり返した）。

【００７２】ＨＲＰＯ結合抗マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ抗体
（ヒト血漿成分非交差，ペルフリーズ社）を50μｌ加え
室温２時間反応後、洗浄緩衝液で洗浄する。

【００７３】基質溶液50μｌを加え室温で30分間反応し
４Ｎ−硫酸を50μｌ加え反応を停止する。

【００７４】発色はSJeia オートリーダー（三光純薬
製）を用い490 nm，630 nmの吸光度を測定しその差を測
定値とした。

【００７５】4) カットオフ値の設定 正常群の検査結果をもとに以下のカットオフ値を設定し
た。

【００７６】 ＴＷＬ 0.20 ＴＣＰ 0.60 ＧＢＭ 0.40 ＴＣＰ／ＵＡＬ 1.10 ＴＣＰ／ＧＴＢＭ 0.80 ここで正常域はＴＷＬ，ＧＢＭについてはカットオフ値
以上ＴＣＰ，ＴＣＰ／ＵＡＬ，ＴＣＰ／ＧＴＢＭについ
てはカットオフ値以下とした。

【００７７】

【表２】

【００７８】尚、正常群と患者群の吸光度すなわち抗原
量の頻度分布を図１に、また吸光度の頻度分布を図２，
３に示した。図から明らかなように、いずれの場合も正
常群と患者群では分布が大きく異なっている。

【００７９】参考例 ６ 本発明のモノクローナル抗体を用いて正常群、腎疾患患
者群、不健康群の尿に対する反応性を比較検討した。結
果を表3.1 および表3.2 に示す。

【００８０】不健康者とは会社員として通常勤務が可能
な健康状態にあるものであるが、参考例５、1)に記載し
た内容の健康診断で表 3.1、表 3.2に示すごとき検査項
目に関し主として軽度ないし中程度の異常を認めたもの
である。

【００８１】

【表３】

【００８２】

【表４】

【００８３】表２に示したようにＴＷＬの場合、正常群
ではすべて正常域にあり該抗体で異常が出ればすべて腎
疾患と認められる。ＴＣＰで正常群の正常率は96％で、
偽陽性率は 4％のみである。一方患者群では異常率53％
に達する。腎疾患患者群ではＴＣＰ／ＵＡＬで98％、Ｔ
ＣＰ／ＧＴＢＭで93％の異常が認められるのに対し、正
常群ではそれぞれ 0％、 1％とほとんど偽陽性が認めら
れず腎疾患を発見するのに非常に有効な検査法である。
なおネフローゼ症候群12例中４例にＧＢＭの異常を認め
た。

【００８４】表３よりＴＷＬの異常率は腎疾患患者群で
最も高く、次いで腎疾患異常が示唆される群であり正常
群では異常が認められなかった。ＴＣＰ，ＴＣＰ／ＵＡ
ＬおよびＴＣＰ／ＧＴＢＭの異常率は腎疾患患者群で最
も高く、次いで不健康者群で、正常群では著しく低い。
抗体検査値異常群中肝機能検査異常群では多くが標準域
を大きくはずれていた。肝腎症候群のごとく肝臓に異常
がある場合に腎障害を認めることがあるが、中等程度以
上の肝機能障害のある場合に既に腎障害の始まっている
可能性を示すものと解釈できる。

【００８５】このようにこれまでの腎機能検査では発見
できなかった早期の腎障害を発見する可能性が示唆され
た。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はＴＷＬに対する正常群と患者群の反応性
の比較を示す図である。

【図２】図２はＴＣＰ／ＵＡＬに対する正常群と患者群
の反応性の比較を示す図である。

【図３】図３はＴＣＰ／ＧＴＢＭに対する正常群と患者
群の反応性の比較を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｓ 8310−2Ｊ Ｄ 8310−2Ｊ Ｙ 8310−2Ｊ 33/577 Ｂ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 國頭 一也 奈良県橿原市山之坊町85−58 (72)発明者 松川 晃 大阪府南河内郡狭山町茱萸木532−１−809

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 正常ヒト腎組織またはＨｅＬａ細胞で免
   疫した動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞から得られ、該
   正常ヒト腎組織と反応するモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマ。