JPS63112994A - モノクロ−ナル抗体を用いた尿中腎抗原の測定による腎障害の診断方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はヒト正常同組織由来抗原と特異的に反応するモ
ノクローナル抗体、及びそれらのモノクローナル抗体を
用いた腎障害の診断法に係わる。

本発明は特に、前記モノクローナル抗体を用いて、尿中
に排泄された前記抗原量を測定することにより、腎臓に
於ける障害部位の特定化、障害程度の診断法に係わるも
のである。

（従来の技術及びその問題点） 現在本邦に於いて、腎不全で透析治療を受けている患者
は約７万人存在し、それらの患者には年間１人当り約５
００万円という膨大な治療費が必要とされており、政府
、自治体の財政を圧迫する大きな原因の一つとなってい
る。しかも、現在、更に毎年的５，０００人の新たな腎
不全患者が発生している。

腎不全に陥ると、ｆｒＪａ　２〜３日、１日４〜６時間
の透析治療を受けなければならず、患者本人の社会生活
が著しく妨げられるのみならず、前述のように社会的に
も大ぎな負担を強いることになり、このまま事態が推移
すれば、いずれ社会医療制度が破綻する危険性を孕んで
いるものである。

腎不全は腎臓病患者が最終的に至る状態であるが、糖尿
病、高血圧及び痛風など本来腎臓以外の病気が原因とな
り、やがて腎臓が障害を受は腎不全になったり、又は睡
眠薬の常用により障害を受けて腎不全に至る場合、更に
は、抗生物質及び抗癌剤等の副作用によって腎障害、腎
不全の経過を辿る場合など、慢性腎炎、急性腎炎もしく
は急速進行性腎炎などの各種腎炎、又は腎孟腎炎、腎臓
結核、腎臓結石、のう胞腎等本来の腎疾患以外の病態か
ら腎臓に障害が及ぶ場合も数多くみられる。

特に近年の社会情勢の変化から、糖尿病、高血圧及び痛
風などを患う患者は著しく増えてきており、又睡眠薬、
抗生物質及び抗癌剤等の薬物使用も多く、これらが原因
となる腎障害の発生も増加してきている。

ところで、Ｗ　Ｉｌｌ病及びこれら他の疾患に随伴して
出現する腎障害に於いては、末期即ち腎不全近くになる
まで、顕著な自覚症状がなく、その発生が見過されるこ
とが多い。したがって、浮腫、乏尿などのある少数例を
除き、腎疾患・腎障害は健ＨＤ断時の検尿によってはじ
めて発見されることが多い。

囚みに、本邦では、学校保険法、労助安全衛生法、老人
保険法により法的に健康診断時の検尿が義務づけられて
いる。又は、地方自治体により成人病集団検診などで検
尿が実施されている。

このように現在性なわれている検尿に於いては、尿蛋白
及び尿沈査等が検査されるが、これらの検査に用いられ
ている試験紙の感度はメーカーにより異なり、又、その
検査で用いる市販検査試験紙の比色対照紙の質、光沢及
び色調等にバラつきがみられ、更には、検査する場所の
照明、検査する人の視力・手技又は反応時間等により、
検査結果の信頼性は充分に満足しくｑるものとはなって
いない。尿蛋白は腎・尿路のいずれかで尿中に血液中の
蛋白が漏出してきたものであり、腎疾患思考のみならず
正常人でし毎日蛋白が排泄されており、また起立性１体
位性、運１ＰＪｌ後、熱性の蛋白尿、あるいは単に精液
の混入による蛋白尿が正常人にもみられる。また尿路疾
忠、膀胱疾患１女性性器疾患などでも蛋白尿がみられる
。従って、尿蛋白検査は健床診断などでのスクリーニン
グ目的には適しているが、偽陽性を多く含んでおり、そ
れ以上の診断的目的には充分でなく、腎疾患を特定して
診断することは不可能である。

尿沈渣は尿を遠心し、その沈漬を顕微鏡で検査するもの
である。沈渣中、赤血球は尿蛋白とほぼ同様に健ｍ人で
も見られ、また腎以外の尿路関連臓器に由来するものが
あり、また中垂炎、大１２憩室炎、骨盤内腫瘍の炎症に
際してもみられる。診断的意義は尿蛋白とほぼ同程度で
ある。

円柱のうら硝子様円柱は正常人でもみられることがある
。顆粒円柱が出現すれば病的と考えられるが特定の疾患
を示唆するものではない。

その信士皮細胞白血球も場合により病的意義のあること
がある。

さて、以上の検尿で、異常又は異常の疑いがある場合に
は、更に医療ＩＭ設に於いてより詳しい検査をする訳で
あるが、血清クレアチニン、尿素窒素、糸球体濾過量、
尿細管機能、β２ミクログロブリンの測定、尿濃縮能、
尿希釈能、賢血流吊及び尿酸性化部などの腎機能検査を
実施しても、そこから特定疾患を診断することは困難な
場合が多い。又、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−β−Ｄ−ｇｌｕｃ
ｏｓａｍｉｄａｓｅ　（Ｎ　Ａ　Ｇ　）の酵素活性を測
定し、尿細管障害を見出そうとする検査もあるが、尿は
ｐＨが弱アルカリ側から強酸性側にまで変動し、塩類濃
度も変動が著しく、浸透圧なども著しく変化するためか
、一部疾患。

急性腎不全などを除き有効でない。更に、多くの時間と
費用を費して、経静脈的腎孟造影、腎シンチ、エコー検
査、Ｘ線検査、ＣＴスキャン、腹部単純ｘａｉ彰又は腎
血管造影などの画像による検査を行っても得られた画像
により形態学的に変化があり、且つある程度以上の大き
さを有するもの、即ち、腎腫瘍、嚢胞、結石及び奇形等
には有効であるが、各種腎炎、腎硬化症、ネフローゼ、
糖尿病性腎症及び痛風など大多数の内科的腎疾患では殆
んど役に立たない。また、外部よりのＸ線被曝。

体内からの放射能被曝あるいは外科的処置などに伴なう
合併症など不利な点が多くある。

従って、疾患の最終的判定には腎生検を実施することが
必要になる。しかしながら、腎生検を実施する為には、
腎臓専門医、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡等を有する病院に
入院しなければならず、患者腎臓に針を刺すか又は開腹
のうえ切除する為、危険度が高いために、必要性の著し
く高い極く限られた少数の患者にしか実施し得ないのが
現状である。

前記のように、検尿による尿検査は、毎日或いは１日に
数回行なうことも可能であり、生体外検査である為に検
査による合併症を惹起する心配がない等優れた検査法で
はあるものの、現在そこで実施されている尿検査は検査
自体に包含される不確実性により偽陽性を多く含み、腎
障害・腎疾患の診断という観点からは満足し１ｑるもの
とはきえない。一方、腎生検は上記の理由でその有用性
は極く限られたものである。そこで、検尿制度を利用し
て、簡便に且つ高感度で測定し得、腎障害、腎疾患の早
期診断を行ない得るような検査方法が強く望まれていた
。

（問題点を解決するための手段） 本発明は以上の問題点を解決する為になされたものであ
り、以下に述べる知見に基づくものである。

腎臓の糸球体では血液、を濾過し原体を作り尿細管を流
れ集合管に集まり尿として尿管を経て膀胱に至り排泄さ
れる経路をとる。我々はもし腎臓内に病変が生じあるい
は障害を受けた場合、腎の構造の一部は破壊され、尿中
にこぼれ尿流の経路を経て尿として排泄されているので
はないかと考えた。さらに、胃内の特定部位の破壊、或
いは特定部位の代謝異常の程度が判れば腎病変の性質も
ある程度推測し診断できると考えた。また尿検査であれ
ば患者への負担は軽く、これだけの情報が入手できれば
検尿と腎生検とのギッヤプを埋める検査法となりうると
考えた。

そこで、ヒト正常同組織又はＨｅ１ａ、細胞を抗原とし
、腎ＩＩ織由来の抗原と特異的に反応するモノクローナ
ル抗体を作成し、これを正常人尿ならびに腎疾患忠者尿
と反応さけて見たところ両群に著しい差異が認められる
ことが判明した。即ち、尿中に於いて、腎疾患患者では
腎に局在する正常組織の崩壊物を正常に比べ著しく多く
検出し得た。

また正常な新陳代謝が腎疾患患者では抑制され、その結
果、該患者の尿中では、代謝産生物である抗原の吊が著
しく減少していることを認めた。尿の濃縮の程度は人に
より時々に異なるので２種抗原昂の比を求めると同様に
思考群では正常人に比べ著しく異なっていた。

又、いわゆる不ｇ！康人の中にも、腎疾患患者はど茗し
くはないが、正常人と較べて有意な異常を示す例のある
ことが判明した。

従って、本発明のモノクローナル抗体を用いる検査法に
より、腎臓内の微粗病変の部位、その重症度を副作用が
なく支今に且つ簡便に判定することが可能になり、また
病変の性質をも推測することが一部可能となり、更に臨
床症状等ともあわせると病変の性質は更によく判定する
ことが可能になったものである。

また検尿における尿蛋白検査、尿潜血検査等は糸球体の
障害がある程度以上進まないと異常が見られないが、本
発明のモノクローナル抗体を用いる診断法はそれ以前に
微細な病変を見出すことができるため高血圧、糖尿病、
痛風、肥満、やせ症など潜在的に腎障害を有する可能性
のある一般人、即ち不健１１人に於いて、尿蛋白陰性の
時期すなわち早期に′ｒ！ｉ障害を検出できるものであ
る。

更に、腎生検では過去から現在までの累積された疾忠の
歴史が重ねられた形で病変をみるのに対し、本発明の診
断法では尿中に排泄された時点での現在の状態を知るこ
とができる。

また、くり返し毎日でも検査することができるため、治
療方針の決定に重要な情報を提供し得る。

本発明の診断法は上述のように、高価な設備も必要とせ
ず極めて簡便に行なえるものであり、従来の健■診断に
於ける尿蛋白陽性あるいはく±）群の第２次スクリーニ
ング法として極めて有用なものである。

更にまた、本発明により腎移植に伴う拒絶反応も早期に
発見し得るものである。

体を提供する。

本発明のモノクローナル抗体は腎疾患患者の尿に対し正
常人の尿と比べ著しく強く反応し、また腎障害を有する
人の尿に対し正常人の尿と比べ強く反応する。このよう
な尿との反応性の強弱により、腎病変の重症度またはｖ
ＩＶ：１害の程度が示される。これにより、腎臓内病変
部における正常構造の崩壊の程度を知ったり、細胞小器
官などの新陳代謝障害を知ることができる。

尚、本発明においては、上記のような腎疾患患者の病変
、新陳代謝障害、さらには腎の組織学的異常など全てを
含めて「腎障害」ということがある。

本発明のモノクローナル抗体としては、後述の実施例に
も示すように、ヒト腎尿細管内腔壁、糸球体基底膜、糸
球体および尿ａ管基底膜、または尿細管細胞質と特異的
に反応するモノクローナル抗体があり、これらはＩＱＧ
、クラスまたは１ｏＧ２．クラスに属する。

また本発明は、上述のヒト正常同組織抗原を特異的に認
識するモノクローナル抗体を用いて尿中の該抗原を測定
することにより腎臓内障害の部位および程度を診断する
ことからなる腎臓内障害の部位および程度を診、断する
ことからなる腎障害診断方法を提供する。本発明の診断
方法では、検体尿中の抗原の測定値を正常人尿中の抗原
値と比較することによって診断する。特に、本発明の方
法においては検体尿中の抗原の測定値を正常人尿中の抗
原値と比較することによって腎障害の有無を診断するこ
とができる。

また１１本発明によって、正常ヒト腎組織またはＨｅ１
ａ細胞で免疫した動物の抗体産生細胞を骨髄肝細胞と融
合し、得られたハイブリドーマを培養し、産生された該
正常ヒト腎組織と特異的に反応するモノクローナル抗体
を回収することからなるモノクローナル抗体の製造方法
が提供される。

さらに、本発明は、正常ヒト腎１］織またはＨｅＬａ１
ｌｌ胞で免疫した動物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞から
得られ、該正常ヒト腎組織と特異的に反応するモノクロ
ーナル抗体を産生するバイブリド応するモノクローナル
抗体を含む腎障害診断用試薬を提供する。

次に実施例によって本発明を更に詳しく説明する。

実施例　１ １、免　疫 １）　免疫原として成人男子より摘出した腎の正常皮質
部を用いた。腎皮質部分をアミノベンジルペニシリン（
１０■／ｍｅ）　、８Ｍストレプトマイシン（１０χＰ
ｇ／ｍｅ）を含む滅菌生理食塩ｌ中で、次いで滅菌生理
食塩水〆で順次洗浄した後、１＃１ｌｌＩ角程度に細切
する。

２）　細切片（３，９ｇ）を生理食塩水とともにガラス
製ホモジナイザー中で破砕した後さらに生理食塩水を加
え、ホモジナイズ液（腎皮質部３００ＪＩ５Ｆ　／　ｔ
ｒｔ！　）とする。

３）上記ホモジナイズ液を生理食塩水で希釈し、そのま
まあるいは補助剤（例えばフロイントの完全アジュバン
ト等）ともにＢΔＬＢ／Ｃマウスあるいは他の免疫可能
な動物に免疫原として投与す（寥 る。投与方法Ａ′腹腹腔性注射皮下注射、皮肉注射、静
脈内注射等のいずれでもよいが、皮下または腹腔内注射
が好ましい。例えばマウスでは皮下ある織 いは腹漣内に皮１ｊＩ４７ｑ相当を注射した。

４）追加免疫は適当な間隔、例えば３〜４週問おいて１
回ないし数回行う。抗原液はそのままあるいは補助剤と
ともに腹腔内あるいは皮下等に投与づる。例えばマウス
では皮質部分３０η相当をそのまま腹腔内注射した。

２、細胞融合 １）最終免疫３日ないし４日後に、免疫牌細胞とマウス
骨髄腫細胞、例えばＰ３−ＮＳＩ−１−Ａ（１４−１￥
１Ａ胞（ＮＳ１細胞）との融合を行う。

免疫牌細胞５×１０　　個とＮ５１１ＩＩｌ胞１×１０
７個の割合で、あるいは他の適当な割合で混合し、４０
０Ｘ　９．５分ｉ！ｌ遠心分離して上清を除く。次いで
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）溶液例えば５０χＰ
　Ｅ　Ｑ　４００Ｇ溶液１１ｄを１分間に撹拌しながら
滴下し、さらに１分間撹拌後ダルベコのＭＥＭ培地（Ｄ
ＭＥＭ培地＞９ｒｄ＠撹拌しながらゆっくりと滴下し、
４００’Ｘｇで５分間遠心分離して上清を除く。

２）培養培地（栄養培地例えばＤＭＥＭ培地十血清、例
えば１５％馬血清＋抗生物質、例えばアミノベンジルペ
ニシリン０．　ＩＩＩｔｔＪ／　ｄを硫酸ストレプトマ
イシン０．ＩＩＲｇ／ｄ）　１０ｍに細胞を浮遊し、９
６穴組織培養用プレートのウェルに１００ＩＪｉずつ分
注し、３７℃、５％ＣＯ２，湿潤な雰囲気で培養する。

３）融合の翌日、各ウェルにヒポキサン（１００μＨ）
。

アミノプテリン（０，４μＨ）およびチミジン（１６μ
Ｈ）を含む培養培地（ＨＡＴ培地）を１００４加える。

２〜３日毎に培地の半墨をＨＡＴ培地と交換する。

１０〜１４日侵からＨＴ培地で交換する。ｌ−Ｉ　Ｔ培
地とはＨＡＴ培地よりアミノプテリンを除いたものであ
る。

抗体産生細胞のスクリーニング 細胞融合侵１０〜２１日めに酸素免疫測定法（ＥＩＡ法
）により抗体産生細胞を調べた。なおスクリーニングは
放射線免疫測定法、蛍光抗体法等でも可能である。

ＥＩＡ法は以下のごとく実滴した。

１）　ヒト腎皮質抗原液を９６穴ＥＩＡ用プレートに加
え適当な条件で吸着固相化する。例えば１００Ｉｉ１の
抗原液を加え、４℃で一夜放置後、抗原液を除き室温で
風乾する。抗原吸むプレートは牛血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）等の溶液でブロッキング処理する。

２）上記プレート用各ウェルに培養上清を加え適当な条
件で反応させる。例えば上清１００度を室温で１時間反
応させる。

３）ツイーン２０を１％含むリン酸緩衝液（洗浄緩衝液
）洗浄する。洗浄は洗浄緩衝液を満したプレートをプレ
ートミキサーで３分間振動させることにより行い、通常
この操作は４回くり返す。このプレートにホースラディ
ツシュペルオキシダーゼ（１−Ｉ　ＲＰ　Ｏ）結合抗？
ウスＩ　（］抗体ｉ液ヲ１００ｄ／ウェル加え、室温で
反応させた。

４）洗浄後、基質溶液を加え発色反応を行う。クエン酸
−・リン酸緩衝液（ｐｌ＋　５．０）にオルトフェニレ
ンジアミンを０．４η／ｄ、３１％過酸化水素水を０．
２蔗／ｄ加えた溶液（基質溶液＞　　１ｏｏ１落ウエル
に加え、室温で３０分間反応後、４Ｎの硫酸を５０成／
ウェル加え反応を停止する。発色のみられるものを抗体
産生陽性細胞（ハイブリドーマ）とげる。

抗体産生陽性細胞のクローン化 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法、軟寒天法、
フィブリンゲル法等により行う。以下に限界１法よる例
を示す。

１）ハイブリドーマは１０個／Ｉｄに、フィーダー細胞
となるマウスあるいはラットの胸腺あるいは牌臓の細胞
は約１．７Ｘ１０７個／ｄになるようにＨＴ培地に浮遊
させ、９Ｇ穴組織培養プレートに１００ＩＩｉ／ウェル
分注し、培養する。翌日ＨＴ培地を１００薦／ウェル加
え２〜３日毎に早急ずつ交換する。

２）２〜３週間侵に前述のスクリーニング操作と同様な
操作を繰り返し、抗体産生陽性細胞を選ぶ。

限界希釈法を１回ないし数回繰り返すことによりクロー
ン化ができる。

３）その結果、後記表１にある４株を含め、総計１３株
のハイブリドーマが得られた。

実施例　２ １−１８　Ｌ　ａ細胞を免疫原とした場合基本的には腎
組織抗原を免疫原として用いた場合と同様に行った。

１）灸−一１ 培養培地（例えばダルベコのＭＥＭ培地＋１０％牛脂児
血清十抗生物質）で培養したＨｅＬａ細胞をフロイント
の完全アジュバントとともに高等動物、例えばＢＡＬＢ
／Ｃマウスに腹腔内注射、静脈内注射等で投与し、免疫
した。適当な期間をおき補助剤とともにあるいは使用せ
ずにＨｅＬａ細胞を上記のごとく投与し、追加免疫を行
った。

２）ｉｌ［！胞融合 最終免疫の３日後に免疫牌細胞と骨髄Ｍ！細胞、例えば
Ｐ３−ＮＳ１−１−Ａａ４−１１［１胞を適当な比で混
ぜ、ポリエチレングリコール（３０〜５０％）を用い、
常法通り行った。融合細胞は９Ｇ穴組織培養プレートを
用い、ＨＡＴ培地中で培養した。

３）抗体産生ハイプリドーマのスクリーニングとクロー
ニング ９６穴組織培養用プレート上で培養したｌ−１ｅｌａ細
胞の培養上清を除去し、１％Ｂ　Ｓ　Ａでブロッキング
した後、融合細胞培養上清を添加し、室温で２時間反応
させた。洗浄用緩衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ結合
ウサギ抗マウス　ＩｇＧ＋ＩｇＨ抗体希釈液を添加し、
室温で２時間反応させた。洗浄用緩衝液で洗浄後、基質
液、例えばＡＢＴＳ溶液を加え、室温で３０分間反応さ
せた後、２ｍＨＮａＮ３を加え反応を停止Ｆさせる。

抗体産生陽性ウェルの細胞は限界希釈法を繰り返すこと
によりクローン化する。

抗体産生ハイブリドーマとしてＴＣＰを含めて６株得ら
れた。

実施例　３ モノクローナル抗体を含む腹　　の・ツハイブリドーマ
を生体に移植して増殖させ、その生体より体液を採取す
ることによりハイブリドーマが分泌する抗体を製造でき
る。ハイブリドーマを腹腔に移植して増殖させる場合は
移植前、例えば３〜８週間にプリスタン（２，６，１０
，１４−テトラメヂルベンタデカン）を腹腔内に投与し
ておくことにより腹水の収量を高めることができる。な
お宿主として用いる生体は移植するハイブリドーマの親
細胞と同種同系の動物が望ましい。他種あるいは他の系
統の動物を用いる場合は宿主にＸ線照射や免疫抑制剤を
投与するなどの免疫応答能力の抑制処置を行う。ヌード
マウスを用いる場合は無処置でら移植が可能である。

１）成熟ＢＡＬＢ／Ｃ７１クスを用いる場合あらかじめ
ブリスタン投与処置を行ったマウスにＨＴ培地で培養し
たハイブリドーマをＤＭＥＭ培地に１×１０〜２Ｘ１０
７２×１０Ｉｌに浮遊させ、マウス−頭あたり５Ｘ１０
６〜ｌＸ１０７個のハイブリドーマを腹腔内に１回から
数回移植する。

２）腹部が肥大したら腹水を採取する。腹水は遠心分離
を行い（例えば４℃、　２５００ｒｐｍ　１０分間）、
上清を回収する。

実施例　４ モノクローナル抗体のタイピング 抗体のサブクラスはオクタロー二法あるいはＥＩＡ法に
より同定した。

１）オクタロー二法にはマウスモノクローナルタイピン
グキット（５ＯｒＯｔｅＣ社）を用いた。寒天プレート
のロゼツトの大きなウェルに抗体を含む培養上清あるい
は腹水等を７５１１１入れる。周囲の小穴に抗１ｏＧ、
抗ＩｇＧ２３等６種の抗マウス免疫グロブリン抗体を１
０ｄ入れる。室温で２４〜４８時間反応させ沈降線の形
成を観察する。

２）ＥＩＡ法にはモノＡｂ−１０ＥＩ八キット（Ｚｙｍ
ｅｄ社）を用いた。抗原を吸着させた固相、例えばＥＩ
Ａプレートに単クローン抗体を含む培養上清等を５０度
加え、室温で１時間またはそれ以上反応させた後、洗浄
用緩衝液で洗浄する。次いでサブクラス特異的ラビット
抗マウス抗体を５０ＩＩＲ加え室温で１時間反応させた
後洗浄する。次いでＨＲＰＯ結合抗ラビッうｌｏＧ抗体
を５０１１１加え、室温で１時間反応させた後洗浄する
。基質としてＡＢＴＳ（２゜２−アジノージ［３−エチ
ルベンズチアゾリンスルフォン酸］）を１ｍＭ含む溶液
を１００／７Ｉｌ加え、室温で２０〜３０分聞反応させ
判定する。結果は後記衣１に示した。

培養上清あるいは腹水中のモノクローナル抗体はゲルク
ロマｊ・グラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、
アフィニティークロマトグラフィー等を適度用いてＭ％
ｌできる。

例えばプロティンＡによるアフィニティークロマ］・グ
ラフィーでの精製は以下のごとく行う。

１）精製にはアフィゲルプロティンＡ　ＨＡＰＳ−Ｉキ
ット（ＢＩＯＲＡＤ社）を用いた。腹水あるいは濃縮し
た培養上清を結合バッファーと１：１に混合し、アフィ
ゲルプロティンＡの充填されたカラムにアプライする。

結合バッファーで洗浄した後溶出バッファーを加え、抗
体を溶出させる。得られた分画は濃縮、脱塩等の操作を
行い精製モノクローナル抗体として用いる。

ハイブリドーマＴＷＬ、ＧＢＭ、ＧＴＢＭ、ＴＣＰの４
種が分泌する抗体を用いてヒト正常人組織を間接蛍光抗
体法で染色した。腎ｌＩ′ｌ織切片をドライアイス−ア
セトンで瞬間凍結し、クリオスタットを用いて約４ｕＩ
Ｉに薄切し、スライドグラスに貼布し、室温で風乾する
。抗体を含む培養上清あるいはマウス腹水等をそのまま
あるいは適当に希釈してこの切片上に加え、３１℃１時
間湿潤な雰囲気中で反応させる。次いでリンＭＦＢＮ液
（ＰＢＳ）にて数回（３〜４回が好ましい）洗浄し、Ｐ
ＢＳで希釈したフルオレセイン結合抗マウスイムノグロ
ブリン抗体（カッベル社）溶液を加え、室温で２時間、
モイストチャンバー内で反応させる。その１！２ＰＢｓ
で洗浄を行い１０％グリセリンを含むＰＢＳで封入し、
蛍光顕微鏡で検鏡する。結果は表１に示す。

表１ヒト腎組織に対する抗体の特異性および性質実施例
　７ の測定 １）正常人尿 通常勤務を行っている会社員９８６名を対象とし木 で問診、理学的所見１体重（松ｆ式標準体重）胸クリッ
ト、ＺＴＴ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＩ−１，ＡＬＰ、γ
−ＧＴＰ、尿酸、ＳＵＮ、中性脂肪、総コレステロール
、血糖、クレアチニン）の項目について検査を行った。

全項目受診者４００名中上記項目すべてが標準値内であ
った老８４名及び上記項目中腎疾患と関連の深い体重、
自圧、検尿（蛋白。

糖、潜血）、尿酸、ＢＵＮ、血糖、クレアチニンは標準
値内でありかつ他の項目も標準値をわずかにはずれるも
のの正常と認められる者４１名の計１２５名より採取し
た尿を正常人尿とした。

２）患者尿 ３施設より集めた腎疾患患者（例えば各種腎炎。

ＳＬＥ、ネフローゼ症候群、急性腎不全、慢性腎不全、
糖尿病性腎症）４５名より採取した尿を患者尿とした。

置した債、尿を除去する。ｌＸＢ５／１ｊＰ８ｓ約４０
０／Ｊｊ加えＳ！瀉で１時間放置後ＢＡＳ加ＰＢＳを除
去し洗浄ＩＩＩ液で２回洗浄する。

適宜ＰＢＳで希釈した精製抗体ＴＷＬ、ＬＪＡＬ。

ＧＴＢＭ、ＴＣＰを５ＯＩ１１加え室温で２時間反応後
、抗体を除去する。次いで洗浄緩衝液で洗浄する（洗浄
は洗浄１！！ｉ液をウェルに満したプレートをプレート
ミキサー上で３分間振動させた後に洗浄液を交換する操
作を４回くり返した）。

ＨＲＰＯ結合抗マウス！ｇＧ抗体（ヒト血漿成分非交差
、ベルフリーズ社）を５０ρ加え室温２時間反応後、洗
浄Ｗ重液で洗浄する。

基質溶液５０ＩＪ１を加えＶ温３０分間反応し４Ｎ−硫
酸を５ＯＪｄ加え反応を停止する。

発色は５Ｊｅｉａオートリーダー（三光！＋１１薬製）
を用い４９０　ｎｓ、　６３０　ｎｍの吸光度を測定し
その差を測定値とした。

４）　カットオフ値の設定 正常群の検査結果をもとに以下のカットオフ値を設定し
た。

ＴＷＬ　　　　　　　　　　０．２０ Ｔ　ＣＰ　　　　　　　　　　Ｏ，６０ＧＢＭ　　　　
　　　　　　Ｏ，４０ ＴＣＰ／ＶＡＬ　　　　　　１．１０ ＴＣＰ／ＧＴＢＭ　　　　０．８０ ここで正常域はＴＷＬ、ＧＢＭについてはカットオフ値
ｕ上ＴｃＰ、ＴＣＰ／ＶＡＬ、ＴＣＰ／ＧＴＢＭについ
てはカットオフ値以下とした。

尚、正常群と患者群の吸光度すなわち抗１ｆｆｉの頻度
分布を図１に、また吸光度の頻度分布を図２゜３に示し
た。図から明らかなように、いずれの場合も正常群と患
者群では分布が大きく異なっている。

実施例　８ 本発明のモノクローナル抗体を用いて正常群、腎疾患患
者群、不健皇群の尿に対する反応性を比較検討した。結
果を表３．１および表３．２に示す。

本健ｍ考とは会社Ωとして通常勤務が可能な健康状態に
あるものであるが、実施例７．１）に記載した内容の健
床診断で表３．１、表３，２に示すごとき検査項目に関
し主として軽度ないし中程度の異常を認めたものである
。

表２に示したようにＴＷＬの場合、正常群ではすべて正
常域にあり該抗体で異常が出ればすべて腎疾患と認めら
れる。ＴＣＰで正常群の正常率は９６％で、偽陽性率は
４％のみである。一方患者群では異常率５３％に達する
。腎疾患患者群ではＴＣＰ／１ＪＡＬで９８％、ＴＣＰ
／ＧＴＢＭで９３％の異常が認められるのに対し、正常
群ではそれぞれ０％、１％とほとんど偽陽性が認められ
ず腎疾患を発見するのに非常に有効な検査法である。な
おネフローゼ症候群１２例中４例にＧＢＭの異常を認め
た。

表３よりＴＷＬの異常率は腎疾患患者群で最も高く次い
で腎疾患異常が示唆される群であり正常群では異常が認
められなかった。ＴＣＰ、ＴＣＰ／ＬＪＡＬおよびＴＣ
Ｐ／ＧＴＢＭの異常率は腎疾患患者群、で最も高く次い
で不Ｒ康者群で、正常群では著しく低い。抗体検査値異
常群中肝Ｊｐｎ能検査異常群では多くが標準域を大きく
はずれていた。肝腎症候群のごとく肝臓に異常がある場
合に腎障害を認めることがあるが、中等４度以上の肝機
ｒｉｇｌ書のある場合に既に腎Ｐ５害の始まっている可
能性を示すものと解釈できる。

このようにこれまでの腎ｉ能検査では発見できなかった
早期の腎ＩＩＩ害を発見する可能性が示唆された。

【図面の簡単な説明】

添付した図１〜３はそれぞれＴＷＬ、ＴＣＰ／ＬＪＡＬ
、ＴＣＰ／ＧＴＢＭに対する正常群と患者群の反応性の
比較を示す図である。 代理人弁理士　中　　村　　　　至 手ｖＦ、？市正書 昭和６１年１り月／日 ２、発明の名称　　　モノクローナル抗体を用いた尿中
腎抗原の測定による腎障害の診断方法 ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 氏名　樹木　元 （ほか１名） ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４
号　山田ピル５、補正命令の日付　　　自　発 ６、；ｆＩｌ正により増加する発明の数７、補正の対象
　　　明Ｉｌカ ８、補正の内容　　　正式明細書を別紙の通り補充する
。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト正常腎組織抗原と特異的に反応するモノクロ
   ーナル抗体。
2. （２）ヒト腎尿細管内腔壁、糸球体基底膜、糸球体およ
   び尿細管基底膜、または尿細管細胞質と特異的に反応す
   ることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のモノ
   クローナル抗体。
3. （３）ＩｇＧ＿１クラスに属することを特徴とする特許
   請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
4. （４）ＩｇＧ＿２＿ａクラスに属することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載のモノクローナル抗体。
5. （５）ヒト正常腎粗織抗原を特異的に認識するモノクロ
   ーナル抗体を用いて尿中の該抗原を測定することにより
   腎臓内障害の部位および程度を診断することからなる腎
   障害診断方法。
6. （６）検体尿中の抗原の測定値を正常人尿中の抗原値と
   比較することによつて診断することを特徴とする特許請
   求の範囲第５項に記載の診断方法。
7. （７）検体尿中の抗原の測定値を正常人尿中の抗原値と
   比較することによって腎障害の有無を診断することを特
   徴とする特許請求の範囲第５項に記載の診断方法。
8. （８）正常ヒト同組織またはＨｅＬａ細胞で免疫した動
   物の抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合し、得られたハイ
   ブリドーマを培養し、産生された該正常ヒト同組織と特
   異的に反応するモノクローナル抗体を回収することから
   なるモノクローナル抗体の製造方法。
9. （９）正常ヒト同組織またはＨｅＬａ細胞で免疫した動
   物の抗体産生細胞と骨髄腫細胞から得られ、該正常ヒト
   腎組織と特異的に反応するモノクローナル抗体を産生す
   るハイブリドーマ。
10. （１０）ヒト正常同組織抗原と特異的に反応するモノク
    ローナル抗体を含むことを特徴とする腎障害診断用試薬
    。