JPH0372271B2 - - Google Patents
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Classifications
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- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/948—Microorganisms using viruses or cell lines
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はセルラインおよびその抗体の生産への
使用に関する。 適当な親セルラインから細胞融合技術によつて
誘導されるセルラインから単クローン性の抗体の
生産が最近かなりの注目を集めてきた。まず、免
疫を有するマウスまたはラツトからの細胞と融合
させる親セルラインとして一種または数種のマウ
ス骨髄腫セルラインを用いてハイブリツド骨髄腫
を得、これを増殖させて免疫化に使用された免疫
原に対する抗原を生産する方法がある。この方法
の利点は非精製免疫原を用いて、極めて特異的な
抗体の生産に使用し得る点である。 この方法は免疫法に使用するための重要な新し
い手段を提供するが、入手し得る親セルラインの
性質から生ずる或る種の限界を有している。しか
しながら、1979年、ガルフレ、ミルスタインおよ
びライトらによつてラツト骨髄腫セルラインY3
−Ag1.2.3が報告され（ネイチヤー1979、277、
131）、このセルラインは英国特許出願第8000595
（第2039948号として公告された）の主題であり、
この出願と関連して、1979年１月９日にインスチ
チユート・パスツール（Institut Pasteur）にお
けるC.N.C.M.に寄託された（C.N.C.M.No.１−
078）。セルラインY3−Ag1.2.3自体は現存するマ
ウス骨髄腫セルラインと比較してハイブリツド骨
髄腫（またはハイブリドーマ（hybridoma））を
生成する単クローン性抗体の生産における親セル
ラインとして使用するためのかなりの利点を有し
ている。本発明者らはY3−Ag1.2.3の誘導体であ
つて、この目的にとつてより適当な新しいラツト
骨髄腫セルラインを調製した。 即ち、本発明はラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20を提供する。 ラツト骨髄腫セルラインはマウス骨髄腫セルラ
インより多くの利点を有する。抗体の生産用ハイ
ブリツド・セルラインのインビボ培養はインビト
ロ組織培養法と比較して或る種の利益−例えば培
養基と比較して動物血清中ではml当り著るしく高
いレベルの抗体が得られるがある。インビボ培養
のためのラツトの使用はいくつかの点でマウスの
使用より優れている。例えば血清および腹水流体
の収率が高く、同腹子（litter）が一般に大きく、
ラツトは抗原刺戟に対しマウスよりよく応答す
る。さらにラツトは単クローン性異種発生性抗マ
ウスおよび同種異系抗ラツト抗原の生産に必要で
ある。しかし親マウス骨髄腫セルラインと免疫化
されたラツトからの細胞の組合せによつて生産さ
れるハイブリツド・セルはマウスまたはラツトい
ずれにおいても容易に培養されないことがわかつ
た。加えてラツト骨髄腫セルラインは或る種の異
種融合（heterogeneous fusions）、例えばうさぎ
（rabbit）または人（human）の細胞との融合に
利点があることがわかつた。 セルラインYB2／3.0.Ag.20はもとのラツト・
セルラインY3−Ag1.2.3に由来する上述の利点を
有するのみならず、かなり有用な別の性質を有し
ている。Y3−Ag1.2.3は特有のカツパー型のライ
ト・チエーン（light chain）、コード名S210、を
生成および分泌し、Y3−Ag1.2.3を用いて生産し
たハイブリドーマもまた、ほぼ一定不変にこのラ
イト・チエーンを含んでいることがわかつた。し
かしながらその調製中に使用される免疫原に関す
る抗体活性は免疫化動物から誘導され、通常Ｈお
よびＬとして指示される免疫グロブリン・チエー
ンが存在するときしか一般により完全には発現せ
ず、かつ骨髄腫からの免疫グロブリンは抗体の結
合特性と干渉しかねないのでハイブリドーマ中に
それが存在することは不利である。 ある種のマウス骨髄腫親セルラインの場合にお
いて免疫グロブリンチエーンを発現しない突然変
異体をそこから直接単離することは可能であつた
が、その後の研究にもかかわらず、同様の手がか
りはY3−Ag1.2.3セルラインの場合にも可能であ
ることは知られていなかつた。セルライン
YB2／3.0.Ag.20がやゝ常套でない方法によつて
Y3−Ag1.2.3から得られた。セルラインY3−
Ag1.2.3を用いた融合試験の一つは、Y3−
Ag1.2.3と、人の補体C3に感作されたAOラツト
からの脾臓セルと融合して数種の抗−C3抗体産
生セルラインを得ることにある。その一つである
YB2／3HLは、Y3−Ag1.2.3から誘導されるハイ
ブリドーマ間では一般的ではなく、カツパー・ラ
イトチエーンを発現する能力を欠いている。一連
のクローニング試験によつて、後に詳述するごと
く、YB2／3HLからセルラインYB2／3.0.Ag.20
を選択することが可能なことがわかつた。そこで
はＨおよびＬチエーンを発現する能力を欠き、そ
れによつて免疫グロブリン・チエーンを発現しな
いゼロ・セルラインを与える。 また本発明はセルラインY3−Ag−1.2.3から誘
導されるハイブリツド骨髄腫セルラインをクロー
ニングして、それによつて免疫グロブリン・チエ
ーンを発現しないY3−Ag1.2.3のラツト骨髄腫セ
ルライン誘導体を単離するラツト骨髄腫セルライ
ンの生産方法を含む。この様なラツト骨髄腫セル
ラインは一般にヒポキサンチン／アミノプテリ
ン／チミジン（HAT）に敏感であり（リトウル
フイールド、サイエンス、1964、145、709）、こ
れはこの性質を一般に有さないハイブリドーマか
ら親細胞からの分離を容易にし、この様な感受性
はしばしば８−アザグアニン抵抗性と共存する。
セルラインYB2／3.0.Ag.20がHAT感受性および
８−アザグアニン抵抗性の性質を有することが、
これらの性質を有したことを確かめるための積極
的な工程を用いることなくわかつた。しかしなが
ら、他の場合ではこれらの性質を有するセルライ
ンを得るための積極的な工程、例えば８−アザグ
アニン含有媒体中でY3−Ag1.2.3の融合からハイ
ブリドーマ・セルを増殖させてこの化合物に抵抗
性である細胞を選択する工程を採用する必要があ
る（上述したごとくHAT感受性はしばしば８−
アザグアニン抵抗性と共存しており、後の性質は
より容易にその選択に用いられる）。 セルラインYB2／3.0.Ag20はその製造に使用さ
れる二種類のラツトの標識、即ち、Lou（Y3−
Ag1.2.3骨髄腫）およびAO（人の補体C3感作脾臓
細胞）を有しているが、後者は弱くしか発現され
ないと思われる。この細胞はY3−Ag1.2.3と同じ
一般的形態を有しているが（このY3−Ag1.2.3も
またその親210.RCY3.Ag1と同じ一般的形態を有
している）この細胞（およびそれから誘導される
ハイブリツド・セルも一般に）Y3−Ag1.2.3セル
よりも大きくかつより丸くなつている。YB2／
3.0.Ag.20の培養容器、特にプラスチツク容器に
対する細胞粘着性はY3−Ag1.2.3で見られるもの
よりずつと小さくNSI／1Ag4−１で見られるも
のに似ている。セルラインYB2／3.0.Ag.20はY3
−Ag1.2.3と似て、８−アザグアニンに対して抵
抗性であり（但し30μｇ／mlのより高いレベルに
おいて）、HAT（リトルフイールド、サイエン
ス、1964、145、709）含有培地中で死ぬ。セルラ
インYB2／3.0.Ag.20は優れた融合能力を保有し、
曲型的にはラツトの脾臓細胞との融合において細
胞106当り１の効果のレベルを与える。さらに軟
質寒天（soft agar）中での細胞のクローン化性
（clonability）は良好であり、確かに、クローン
がより密である限りY3−Ag1.2.3セルのそれより
も良好であり、それによつて一般にYB2／3.0.
Ag.20から誘導されるハイブリドーマをY3−
Ag1.2.3からのものより精製を容易にする。 セルラインYB2／3.0.Ag.20株はケンブリツジ
のメデイカル・リサーチ・カウンスルズ・ラボラ
トリー・オブ・モレキユラー・バイオロジーに保
存されており、そのセルラインは1980年６月25日
にパリのインスチチユート・パスツールのC.N.
C.MにC.N.C.M.No.I.126の番号で寄託された。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は種々の形態の栄
養培地で増殖できる。即ち、本発明はセルライン
YB2／3.0.Ag.20の細胞とそれ用の栄養培地から
構成されたものである細胞培養系にも及ぶ。この
様な細胞培養系は便宜的にはインビトロであり、
培地は本質的には合成培地であるが、もちろん血
清のごとき天然源から得られる成分を含んでいて
もよい。この様な培地の例は、熱で不活性化した
馬の血清または好ましくは仔牛の胎児血清を例え
ば10％（Ｖ／Ｖ）補給した、ダルベツコ
（Dulbeccos）変性イーグル（Eagle）最小必須培
地（例えばジブコ・バイオカルト社；パイスリ
ー、スコツトランドから入手可能）である。この
細胞をこれより低い血清レベルの使用または血清
を含まないアインコブ（Isocove）変性品（アイ
ソコブおよびメルチヤーズ、ジヤーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メデイシン、1978、147、
923）の使用に条件づけしてもよい。抗生物質の
補給は培地中に使用してもよい。この様な培地中
で増殖した細胞は短期間の条件づけで、仔牛の胎
児血清を有するRPMI1640および細胞培養に一般
に用いられ、この技術分野の文献に記載されてい
るごとき他の種々の培地中で増殖させることがで
きる。懸濁培地中では一般に約24時間の細胞倍加
間（doubling time）が得られ、この様な培地を
好適には、細胞および培地の一部を除去し、これ
を新鮮な培地で置き換えることによつて一週間に
３回供給する。一般に、低血清含量の培地、例え
ば約５％（Ｖ／Ｖ）ないしそれ以下、例えば血清
供給量2.5％を含有する培地中で増殖するよう細
胞を条件づけることは融合中に曝される条件を容
易に受け入れる丈夫な細胞を調製する点で価値が
ある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は液体窒素中で良
好な貯蔵安定性および該セルラインの多数の世代
にわたつてインビトロ培養における良好な安定性
を示す。但し、通常のごとくルーチンチエツクを
時々実施するのが望まれる。融合能力のごとき細
胞のある種の性質は連続培養によつて改良される
得ることが理解されるであろう。確かに、例えば
連続した継代（passage）および／またはクロー
ニングを通して、殆んどの点でYB2／3.0.Ag.20
に実質状類似するが、ある種の変わつた性質を有
する種々のセルラインを得ることを可能にし、融
合に使用するための親セルラインとしての最初の
使用に加えて、セルラインの第二の使用はその様
な変異種の製法にある。この様な変異株は自然発
生的に生じ、インビトロでの継代、しばしばこれ
に続くクローニングまたは特に直接クローニング
することによつて、もとのYB2／3.0.Ag.20のバ
ルクから選定される。このクローニングは例えば
軟質寒天上で行なわれる。しかしながらこの様な
工程はむしろ単調であつて、多数のクローンの研
究を含み、変異株の生産は、後述するごとく変異
株の生産にセルラインの細胞を適応（adaption）
させる条件、特に細胞の継代における使用によ
り、しばしばより好適に達成される。 変異種は都合のよいことにはハイブリドーマの
生産におけるその使用に関連するセルライン
YB2／3.0.Ag.20の一ないしそれ以上の性質にお
ける変化を示す。この様な性質は融合特性および
増殖特性を含み、後者はハイブリドーマの増殖特
性に関係をもつている点で特に興味深い。特に興
味のある変異株はこの様な一種ないしそれ以上の
性質の向上を示すものであり、ある種の特に興味
ある特殊なタイプの変異株については後述する
（第24頁）。従つて、本発明はさらにセルライン
YB2／3.0.Ag.20から誘導される親骨髄腫セルラ
イン、特に上述の変異株に関するものである。 セルラインYB2／3.0.Ag.20および本発明に従
う他の親セルライン特有の価値は単クローン性抗
体の調製用に使用し得るハイブリツド・セルライ
ンの製造にある。この目的に使用される方法は
種々の親セルライン、即ちYB2／3.0.Ag.20それ
自体のみでなくY3−Ag1.2.3から誘導されるゼ
ロ・セルラインおよびYB2／3.0.Ag.20の変異株
に対し広い範囲で類似しているが、便宜上特に
YB2／3.0.Ag.20に言及して記載する。親セルラ
インからハイブリツド・セルラインを製造する方
法は脾臓、リンパ線または他のセルラインの細胞
で免疫原に感作した免疫細胞（即ち免疫学的に適
応性を有する細胞）を融合する工程を含む。この
感作した免疫細胞は種々のソースから採取しても
よいが、最良の結果はラツトの細胞を用いて得ら
れ、これが他のホスト、即ちマウスや人から得ら
れたものより好ましいことがわかつた。YB2／
3.0.Ag.20セルラインはLouおよびAOラツトの両
方に対して標識を有しているので、後続のインビ
ボ増殖によるハイブリドーマからの抗体の生産を
意図しているときは免疫細胞を生産するために使
用するラツトはAOまたはLouラツトのいずれか
であるのが好ましい。本発明に従う他の親セルラ
インは後述するごとく広く選択できる。免疫細胞
の感作は正常に発生してよく、自然発生的な免疫
化によつて、しかし好ましくは直接免疫化によつ
て感作させる。必要な免疫原を免疫化工程でホス
ト動物に積極的に投与する。 セルラインの細胞と適当な免疫細胞の融合は融
合を促進する試薬を含む適当な培地での混合を必
要とする。即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.
Ag.20の細胞と免疫細胞、例えばマウスまたは特
に人、就中、ラツトからの脾臓細胞を該細胞の融
合を促進する試薬を含む栄養培地で融合するシス
テムを含む。この様な培地は好適には合成物であ
つてもよいが、もちろん、所望ならば天然源から
得られる成分を含んでいてもよい。しかしなが
ら、この場合以上のごとき可能性は少ない。この
様な培地の例はイーグルの最少必須培地
（Eagles minimum essential medium）、そのダ
ルベツコ変性培地（Dulbecco modification）、
RPMI1640および細胞培養に一般に使用され、当
該技術文献に記載された他の種々の培地であり、
細胞の培養には上述したごとく、抗菌性助剤がし
ばしば用いられる。種々の融合試剤を用いてもよ
く、例えばセンダイ・ウイルス（Sendai uirus）
のごときウイルス、ポリエチレングリコール、例
えばPEG1500が好ましい。これらの試薬での細
胞の融合は文献に記載され、本件実施例に説明さ
れているが、ガイダンスとしてはポリエチレング
リコールの約40から約55％（Ｖ／Ｖ）がしばしば
使用され、その最適濃度は分子量により、例えば
PEG1500では約50％（Ｖ／Ｖ）である。所望な
らばジメチルスルホキシドをポリエチレングリコ
ールに加えてもよい。ハイブリドーマ単離を好適
にはもとの培地を、親セルラインに対しては毒性
であるがハイブリツド・ラインに対しては一般に
毒性のないHAT培地と置き換えることによつて
補助してもよい。これに続いてクローニングとサ
ブ・クローニングを用い、抗体生産用試験に照ら
して適当なハイブリツドを選ぶ。 上に示したごとく、要求される免疫原に感作さ
れた免疫細胞は別の方法によつて得ることもでき
る。即ち、該細胞は要請される型の自然発生免疫
細胞を選択することによつて、あるいは一連の投
与量で免疫原をフロインド・アジユバンドのごと
きアジユバンド（ここでは適当である）と共に動
物（ここでは人を含む）に投与し次いで脾臓また
は他の免疫細胞を採取することを含む当該技術に
おいて記載された方法によつてうまく得られる。 免疫細胞の自然発生法の採用は人の免疫細胞に
関して特に興味深く、ここでは免疫原の投与はあ
まり魅力的ではなく、患者の感染した病気から自
然に生産された免疫細胞がもつと適当である。自
然の免疫細胞に関し特に興味のある領域は自動抗
体（auto antibody）の生産である。 本発明は蛋白質と糖蛋白、オリゴおよびポリサ
ツカライド、リポサツカライド、パプテンおよび
類似物、例えばペプチド、神経伝達物質およびホ
ルモン類のごとき抗原を含む広範囲の免疫原に対
して感作された直接または自然に感作された動物
からの免疫細胞に適用できる。表面標識であつ
て、腫瘍性の物質、特に充実性腫瘍（Solid
tumour）から誘導される免疫原はかなり興味深
いが、本発明は細菌性およびウイルス性抗原に対
しおよび原生類および菌類から誘導される免疫原
に適用してもよい。 即ち、本発明は更にラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20または前述した本発明の他の親
セルラインと動物、例えばマウス、特に人、就中
ラツトからの免疫原に感作した脾臓または免疫細
胞間のハイブリツドである細胞を含む。 ハイブリツド・セルは親YB2／3.0.Ag.20細胞
と、および前述のものと同じ一般的な型の培地で
の培養によつて維持してもよい。 本発明のセルラインによる抗体の製法はそれ用
のインビトロまたはインビボ培地いずれかでセル
ラインを培養することによつて行なつてもよい。
即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.Ag.20また
は本発明に従つた他の親セルラインから誘導され
るハイブリツド・セルをインビトロまたはインビ
ボ培地で培養し、その後該培地から抗体を単離す
る工程を含む抗体の生産方法を提供する。 インビトロとインビボの選定は種々の因子によ
る。即ち、インビトロ培養は、抗体が必要とされ
る用途が化学的な性質よりむしろ免疫学的であ
り、かつラツト中でのインビボ増殖からのラツト
免疫グロブリン汚染物の存在が望ましくないとこ
ろで必要とされる。インビトロ増殖はまた免疫細
胞が得られるラツトの素質（strain）は重要でな
いと云う利点を有する（インビボ増殖では重要で
ある）。さらにハイブリドーマ・セルはインビボ
では増殖しない場合がある。しかしながら、イン
ビボ培養はインビトロ培地と比較してml当り著る
しく高い抗体のレベルが一般に得られる（血清お
よび／または腹水中）。インビボ培養は好ましく
はラツト中で行ない、セルラインYB2／3.0.
Ag.20の場合には（これは前述のごとくラツトの
AOまたはLou種からの免疫細胞とうまく融合し、
そこでは得られた抗体生産用ハイブリドーマのイ
ンビボ培養が意図されている）ラツトは好ましく
はLou×AOハイブリツドである（ラツトのAOま
たはLou純潔種においては増殖の容易さが劣る場
合がある）。加えて、放射線照射および／または
免疫抑制剤の使用によつてラツトの不適合種中で
ハイブリドーマの生育を達成することも可能であ
ろう。 ラツトの単一種、例えばラインY3−Ag1.2.3の
場合における種Louから親骨髄腫セルラインが誘
導されるときは、ハイブリドーマを生産する親セ
ルラインと融合する免疫細胞を供給するためラツ
トのどの純潔種を使用してもよく、また親セルラ
インと免疫細胞の誘導に相当する株のハイブリツ
ド中でハイブリドーマの易インビボ増殖が起るで
あろうと云う利点がある。従つて前に言及したご
とくセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株の典形
はセルラインがラツトの純潔種、特にAOまたは
Lou（後者の場合、AO標識が失なわれているかマ
スクされたもの）中での増殖に適応（adapt）さ
れたものである。この方法でセルラインYB2／
3.0.Ag.20を適用するための好ましい方法はライ
ンがそれに適応されるべき種である多数のラツト
（例えば少なくとも５匹、特に約10匹）を通して
それを継代することである。この方法ではセルラ
インによつて誘発された腫瘍の明らかな退行が生
じている一連の二、三の速いラツトに最初にみら
れる増殖のモードから、退行なしに容易に増殖す
る一連の遅いラツトにみられるモードにセルライ
ンを適用することが可能である。最後のラツトか
ら単離された腫瘍細胞を次いで培養し、所望なら
ばクローンし、変異株と融合するための免疫細胞
を提供するために都合よく使用されるラツトの種
類のある範囲に関して高められた性質を示すべく
適応されたセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株
を提供する。この形の種々の適応されたセルライ
ンを調製してもよく、好ましい例はYB2／3.0.
Ag.20の融合特性の保持または改良に対して選ば
れる。 インビトロの系の場合は用いられる培地は細胞
培養システムに関連して上記したものと同じであ
つてよいが、血清レベルはできるだけ低く、例え
ば５％（Ｖ／Ｖ）ないしそれ以下、好ましくは約
2.5％（Ｖ／Ｖ）より多くなく、好適には0.5％
（Ｖ／Ｖ）程度であるのが好ましい。アイソコブ
血清（Isocove）−微変性を使用してもよい。この
細胞は都合のよいことには対数相を越えてうまく
増殖させることができ、これによつて最終生存度
を犠牲にして最大最終濃度を達成できる。細胞の
定常相（stationary phase）における短期間の生
育は、抗体の最終収量を改良するので好ましい。
抗体生産の適当な組織培養法の例は紡すい状容器
（spinner container）中での塊状増殖（massive
grawth）および当該技術分野においてよく知ら
れた大量培養法である。インビボ法は好ましくは
ラツトに接種して充実または腹水腫瘍を生産する
方法を含む。接種に先立つてラツトを免疫抑制す
るかおよび／または腹水の分泌をうながすプリス
タン（pristane）のごとき薬剤で処理してもよ
い。腫瘍を適当な期間増殖させた後、動物を殺
し、抗体単離のために腹水および／または血清を
集め、腹水腫瘍の場合はその期間後生きた動物か
ら腹水を集めてもよい。即ち腹水腫瘍はより多量
の液を生産する能力を有するが、この技術の価値
は腹水および／または血清中に存在する抗体の濃
度にある。インビトロまたはインビボ法いずれか
からの抗体の単離は、沈澱、透析、免疫−吸着剤
（immuno−absorbent）の使用を含むクロマトグ
ラフイー、および膜過を含む当該技術において
記載された方法によつてうまく達成できる。 即ち、本発明は動物、特にラツトに本発明に従
うYB2／3.0.Ag.20または他の親セルラインから
誘導されるハイブリツド・セルを接種し、充実性
または腹水腫瘍をラツト中に増殖させ、次いでラ
ツトの血清および／または腹水から抗体を単離す
る工程を含む単クローン性抗体の生産法を含む。 本発明は本発明に従うセルラインYB2／3.0.
Ag.20または他の親セルラインから誘導されるハ
イブリツド・セルを用いて調製される抗体にも及
ぶ。この様な抗体は治療および特に診断、および
親和クロマトグラフイー（affinity
chromatography）等の種々の用途を有する。生
産される単クローン性抗体の一例は人の細胞の亜
個体群（sub−population）を認知する種々の人
原発性腫瘍細胞に対する抗体であり、これは血液
学的診断に有用である。他の形の用途として自然
に発生する物質、例えばこの物質の精製用蛋白質
に対する抗体の使用が例示される。 本発明を以下の実施例で説明する。 実施例 １ ハイブリツド・セルラインYB2／3HLからの
セルラインYB2／3.O.Ag.20.の調製 セルラインY3−Ag1.2.3から誘導されるハイブ
リツド・セルラインYB2／3HLの細胞をダルベ
ツコ変性イーグルス培地にもとづく培地（これは
DMMと同じであり、DMMはダルベツコ変性イ
ーグルス培地にある種の添加物を加えた市販調製
品であり、以下の成分を含む： 500mlダルベツコMEM（4500mgグルコース／
を含みピルビン酸Naは含まない）−ジブコ−バイ
オカルト・カタログNo.320−1665、 ５mlピルビン酸Na MEM（100ｍＭ）−ジブ
コ・カタログNo.320−1360 10mlペニシリン／ストレプトマイシン（5000単
位ペニシリン／500ｍｃｇストレプトマイシン／
ml） 培地はNaHCO3含量3700mg／、PH7.2〜7.5で
ある）に牛の胎児血清〔FCS；異なつたバツチか
ら選ぶ（セラ−ラブ・カタログNo.５−000−1a〕
10％（ｖ／ｖ）を補給した培地から得、本質的に
はコツトンらによりヨーロピアン・ジヤーナル・
オブ・イムノロジー、1973、３、136に記載され
たごとき軟質寒天中でクローンした。総計116の
ランダム・クローンを培養し、この培養上澄液
を、塩化クロムと結合した羊の赤血球（SRBC）
の羊中に生じた抗ラツトIgに対する間接凝集によ
り、ラツトIgの生産に対してスクリーンする（ケ
ーラーら、ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー、1976、６、292）。各ケースにおい
て、上澄液をSRBCと混合し、10分間静置後、遊
離抗ラツトIgを加えると上澄液中にラツトIgの存
在するものは凝集する。116クローンからラツト
免疫グロブリン生産に関し陰性であるかごく弱い
陽性を示す３クローンが選択され、これらの３ク
ローンはP1.F11、P2.G11およびP.H12として固
定される。この３個のクローンによる細胞外およ
び細胞内〔 14C〕−リジン取込みを、通常のリジ
ン含量の培地を〔 14C〕−リジンで置き替えた
DMM−５％FCS（使用されるFCSは透析された
もの）中でインキユベートすることにより研究し
た。上澄液をケーラーおよびミルスタインのヨー
ロピアン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー、
1976、６、511に記載されているごとく、総減数
（total reduction）後、ドデシルサルフエート
Na塩／ポリアクリルアミド電気泳動（SDS−
PAGE）を用いて分析した。 得られた結果を表に示す。 【表】 この３個のクローンを更に研究するため、フル
オレツセン・イソチオシアネートラビツト抗ラツ
トIg（ブラツドストツクらジヤーナル・オブ・ナ
シヨナル・カンサー・インスチチユート、65、
No.、81）を用いる内部細胞螢光顕微鏡法によりス
クリーンし、ゼロ・セルラインの単離に対し最も
有望なものとしてクローンP2.G11が現われ、こ
れは40％の強い陽性に対しほぼ60％の陰性の個体
数を示した。 従つてクローンYB2／3HL P2.G11を軟質寒天
でクローンし、得られた43クローンを内部細胞螢
光顕微鏡法でスクリーンし、22の明らかな陰性体
が９の明らかな陽性体および12の明瞭でないクロ
ーンまたは混合クローン共に見出された。内部細
胞螢光顕微鏡法によるスクリーニングにおいて陰
性であるこの22個のクローンをさらにスクリーン
し、継続するSDS‐PAGE分析によつて、クロー
ンYB2／3HL P2.G11.16（Ｏ）が内部細胞〔
14C〕−リジン取込み上にチエーンを有さないもの
として選択された。これらの細胞は30μｇ／mlの
８−アザグアニンに対し抵抗性であることは既に
見出されているので、この細胞を８−アザグアニ
ンに対し適応させる必要はない。これらの細胞、
即ちYB2／3HL.P2.G11.16（Ｏ）Agを８−アザグ
アニン30μｇ／mlの存在下に軟質寒天中でクロー
ンし、このクローンをクローンが密に増殖した基
体上で選定する。さらにクローンYB2／3HL.P2.
G11.16（Ｏ）Ag.20をその増殖速度の速さの観点
で選定し、試料をHAT感受性に対して試験し
た。 即ちYB2／3HL.P2.G11.16（Ｏ）細胞はハイブ
リドーマを生産する単クローン性抗体に導く融合
において親骨髄腫細胞として使用し、セルライン
YB2／3.0.Ag.20.を構成するのに適した性質を示
す。この細胞を寒天から採取し、20％（ｖ／ｖ）
FCS含有DMM培地を加えたリンブロ・プレート
（Linbro plate）の２mlの穴に入れた。この細胞
を増殖し、徐々により大きな容器で増殖し、かつ
培養器に供給する代替培地の血清レベルを減少さ
せる通常の方法によつて低い血清レベルに条件づ
けした（培養は37℃、CO2 10％（ｖ／ｖ）空気
90％（ｖ／ｖ）、雰囲気下）。この方法では、細胞
は〔2.5％（ｖ／ｖ）FCS／2.5％（ｖ／ｖ）熱で
不活性化した馬の血清〕、次いで〔５％（ｖ／ｖ）
FCS〕および最後に〔2.5（ｖ／ｖ）FCS〕中で増
殖するよう条件づけられ、最終的に１紡錘状フ
ラスコ中、37℃、10％（ｖ／ｖ）CO2／90％
（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下および95％湿度で培養
した。 セルラインの凍結試料（カルチユアー・コレク
シヨンに寄託したものを含めて）を５×105／ml
の細胞数を越えない段階で指数的に増殖する細胞
から調製した。１×107より多い細胞を含む培地
を７分間で600ｇの割合で遠心分離した。細胞ペ
レツトを４℃に冷却し、これを90％（ｖ／ｖ）
FCS−10％ジメチルスルホキシドに懸濁して濃度
５×106（細胞）／mlにした。この懸濁液１ml（４
℃）をアンプルに入れ、シールして、４℃から１
℃／時間の割合で冷却して凍結した。細胞が−50
℃に達したとき液体窒素中に浸漬した。この様な
凍結アンプルから細胞を再生するにはアンプルの
内容物を急速に４℃にし、次いで迅速に冷（４
℃）DMM−10％（ｖ／ｖ）FCSで20mlの容積ま
で稀釈した。次いで細胞を７分間で600ｇの割合
で遠心し、２ml培地中に各1/2、1/4、1/8、1/16
および1/32ペレツト化細胞を含むよう再懸濁し
た。その後、培地を37℃、10％（ｖ／ｖ）CO2／
90％（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下で増殖させ、さら
に凍結前の細胞に対して記載したのと同様に増殖
させる。新しい凍結株を調製するためには解凍後
最少１週間、最大３週間の間に得られた培養物を
増殖する必要がある。その間に細胞は24時間の培
化時間で指数的に増加する。 ハイブリツド・セルラインYB2／3HL源 YB2／3HLセルを以下のごとく調製した。イ
ヌリン（ブリテイツシユ・ドラツグ・ハウシズ）
のりん酸塩バツフアー・ザリーン（100mg／ml）
懸濁液を１分間超音波処理し、次いで懸濁液0.5
mlを正常な人の血清（エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，N′−テトラ酢
酸（EGTA）10ｍＭおよびMgCl2でMg7ｍＭに
したもの）10mlで37℃で15分間処理し、イヌリン
に対するC3の固定および補体経路（complement
pathway）のいずれかを活性化させる。懸濁液を
生理食塩水、2MNaClおよび再び生理食塩水で遠
心分離して洗浄し、生理食塩水で原容量１mlとす
る。 ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ペニシ
リン5000単位−ストレプトマイシン500ｍcg／
ml）250μ、正常なラツトの血清50μをフロイ
ンド完全アジユバンド（CFA）約１ml中に加え
た液で抗原補体１mlを乳化して最終容量2.4mlと
した。この調製品0.1mlを２匹のAOラツトそれぞ
れに各４箇所（合計ラツト１匹に0.4ml）筋肉注
射した。３週間後、各ラツトにCFAを含まない
がビー・ペルツシス５×109を含む類似の抗原調
製物0.5mlを骨膜内（intraperistoneal）注射す
る。４週間後、いかなる形態のアジユバンドも有
さない抗原調製品0.5mlを静脈注射し次の月の間
にさらに５回類似の静脈注射を行なつた。 最後の静脈注射３日後にラツトを殺した。各ラ
ツトにつき、滅菌条件下で脾臓を除去し、補給血
清を含まない新しく調製したDMM培地５mlを入
れた氷冷した小さなペトリ血に置いた。脾臓を切
つた後、前述の血清を含まないDMM培地４mlを
含む10mlプラスチツク製丸底チユーブに移し、う
まく適合しない（２mmのクリアランス）テフロン
製乳棒で潰した。得られた混合物を１分間氷の上
に放置し、上層3.5mlをプラスチツク製の普通の
チユーブに移した。潰した脾臓の残りをDMM5
mlで洗い、混合物を１分間立てて、大部分の破片
を沈澱させた。上澄液を破片から傾瀉し、チユー
ブ中の細胞に加えた。このチユーブをDMMで満
たし、ベンチ遠心機を用い600rpmで７分間回転
した。次いで上澄液を傾瀉し、細胞をDMM中に
再分散した。細胞108を含むこの懸濁液の１アリ
コートをケンブリツジにあるエム・アール・シー
ス・ラボラトリー・オブ・モレキユラー・バイオ
ロジーに保存されている株から得られる洗浄した
Y3−Ag1.2.3細胞107と50ml円錘遠心管中で混合
した。次いでDMM培地を細胞混合物に加え全体
を遠心分離した。 液を切つた細胞ペレツトを含むチユーブを37℃
の水浴中に置き軽くたたいた。ポリエチレングリ
コール（PEG）1500のDMM50％（ｗ／ｖ）溶液
0.8mlを37℃において、１分間かけて該細胞中に
加え、ピペツトを用いてゆるくかき混ぜた。ゆる
やかな撹拌をさらに１分間続け、DMM培地２ml
を２分間にわたつて加え、次いで３分間かけて
DMM8mlを加え、さらにDMM10mlを滴下した。
この細胞を回転し、次いで別のバツチ（セル−ラ
ボ カタログNo.５−000−1a）からの牛の胎児血
清（FCS）20％（ｖ／ｖ）を補給しておいた予備
加温（37℃）DMM培地に初めはその２、３滴中
に次いでその25mlにゆつくりと再懸濁させた。容
積を予め加温した同じ培地で50mlにした（この段
階および以下のインキユベーシヨン中に使用され
たFCSを56℃で30分間熱不活性化処理した）。 二匹のラツトから得られた細胞含有培地をリン
ブロ・プレートの２mlの穴96個に分配し、同じ培
地１ml中に約１×105個の洗浄脾臓細胞を含む液
を各穴にフイーダー（feeder）として加え、全体
を37℃でインキユベイトした。次の日、培地２ml
のうち１mlを各穴から除き、20％FCSおよび
HAT（リトルフイールド、サイエンス、1964、
145、709）を含むDMM培地１mlで置換する。イ
ンキユベイシヨンを37℃で２週間続け、その培地
の半分を最初の置換後２日目およびその後は２〜
３日間隔を置いてHAT培地で同様に置換した。 ２週間後に80個の穴に活性な増殖が観察され、
この増殖はハイブリツド骨髄腫の存在を示した。
80個の培養基それぞれの使用済みの培地を以下の
ごとき間接的な結合アツセイにより抗体生産用に
試験した。複合体をラツクマンおよびホバート、
1978、コンプリメント・テクノロジー、ザ・ハン
ドブツク・オブ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー、著者デイー・エム・ワイヤー（ブラツクウ
エル・サイエンテイフイツク・パブリケイシヨ
ン）の方法に本質的に従つて、37℃で酵母処理し
た人の血清（R3）でエリスロサイト（EA）を有
する羊の抗体を処理し次いで洗浄することによつ
て製造する。複合体（EACと云う）のこの中間
物はC3b、C3biおよびある種のC3dをその表面に
有するが、C5は有さないか或はその上の後の成
分はR3として、“非反応”（non‐reactor）血清
から得られた。EAとEACの両者は各穴からの使
用済培地の稀釈液で処理し、洗浄し、〔 125I〕ラ
ベル化抗ラツト免疫グロブリン抗体とインキユベ
ートした。さらに洗浄した後細胞の放射能を測定
した。この間接結合アツセイで測定したときこの
80培養基のうちわずか３例が明瞭な抗体生産活性
を示し、２匹のラツトの１匹から誘導されたこれ
らの培養基の一つがハイブリツド骨髄腫YB2／
39を含んでいた。 ハイブリツド骨髄腫YB2／39を上記コツトン
らの文献に記載されたのと本質的に同じ方法を用
いて軟質寒天中でクローンした。クローニングを
数種の細胞濃度において実施し、クローンを最低
クローン濃度から選んだ。この最初のクローニン
グ段階でのクローニング効果は約10％であつたが
最初に単離された活性クローンの率は100％
（21／21）であつた。クローン39−11を選択し、
軟質寒天中でクローンして、４／４陽性クローン
を得、そこからクローン39−11−１−７を選び、
軟質寒天中でクローンしてセルラインYB2／
3HLを構成するクローン39−11−１−７を得た。
この細胞を低いクローン／プレート数（≪100）
を含む寒天プレートから採取した。クローン当り
の細胞の数は約100であつた。FCS20％（ｖ／ｖ）
含有DMM1mlを加えたリンブロ・プレートの２
mlの穴に細胞を移した。次いで細胞を20％（ｖ／
ｖ）FCS含有DMM中で増殖し、培養基を補給す
るために用いる培地の血清濃度を10％（ｖ／ｖ）
に薄めた。より大きい培養基を種々の大きさの平
底組織培養容器に移すことにより作り、空気中に
10％（ｖ／ｖ）CO2を含む雰囲気を封ずるため、
容器を気密にシールし、細胞を37℃、懸濁培養基
として、通常の方法で増殖した。 実施例 ２ セルラインYB2／3.0.Ag.20とイースト・チユ
ーブリン（yeast tubulin）で高度免疫化され
たラツトからの脾臓細胞との融合によるハイブ
リドーマの製造： ラツトのLou株を次のスケジユールに従つて免
疫化した： 第１日目：フロインド全アジユバンド中の20μ
ｇイースト・チユーブリンを腹膜内（i.p.）注射
する、 第22日目：フロインド不完全アジユバンド中の
20μｇイースト・チユーブリンを腹膜内注射す
る、 第53日目：22日目と同じ、 第85日目：イースト・チユーブリン20μｇを静
脈内（i.v.）する。 89日目にラツトを殺し、その脾臓を滅菌条件下
に除き、２％（ｖ／ｖ）FCS血清補剤を含む
DMM培地を用いる以外、第 頁に記載されたご
とき融合を行ない、最終品を満たして600r.p.mで
７分間まわし、血清補剤を含まないDMMで再懸
濁した。108個の細胞を含む再懸濁脾臓細胞の１
アリコートを同じ培地中でセルラインYB2／3.0.
Ag.20の６×107個の細胞と混合した。この混合
物を50mlプラスチツク製円錘チユーブ中で600ｇ
で７分間遠心にかけ、次いで上澄液を除去し、細
胞ペレツトをチユーブの底をゆるくかき混ぜて粉
砕した。さらに操作を約37℃で行なつた。DMM
培地（PH7.6−7.8：フエノール・レツドで指示）
中にポリエチレングリコール（PEG）1500（新た
に調製し暗所に保存）50％を含む液１mlを用い
て、この液を１分間かけて加えながら、細胞をゆ
つくりと懸濁させた。この懸濁液を37℃で１分間
保持し、DMM培地１mlをさらに１分間かけて加
えた。DMM培地を更に20ml、５分間かけて加
え、この細胞を遠心分離しFCS20％（ｖ／ｖ）含
有DMM培地中にゆるやかに再懸濁し、総容積25
mlとした。 この懸濁液を２ml穴48個を有するリンブロ
BCL−5041トレイ中に0.5ml中に以下のごとく分
配した。もとの容積25mlのうち18mlを36個の穴に
分配し、残りの７mlを14mlに稀釈した（この、お
よび後の稀釈を20％（ｖ／ｖ）FCS含有DMM培
地で行なつた）。14mlのうち６mlを12の穴に分配
し、残りの８mlを16mlに稀釈した。16mlのうち６
mlを12の穴に分配し、残りの10mlを20mlに稀釈し
た。20mlのうち18mlを36の穴に分配し残り２mlを
捨てた。96の穴それぞれを、20％（ｖ／ｖ）FCS
含有DMMで容積２mlにした。この細胞を培養
し、24時間後に培地の1/2を20％（ｖ／ｖ）FCS
およびHAT（リトルフイールド、サイエンス、
1964、145、709）含有DMM培地で置き換える。
この操作を２日後およびその後２日毎に繰り返し
た。 15〜20日後に穴中で激しい増殖がみられ、これ
はハイブリツド・クローンの成功を示す。合計52
の穴がハイブリツド増殖を示した（稀釈が増す順
番に36／36、６／12、３／12および９／36）。 ２の段階でもとのおよび非稀釈の培養基の分析
を行ない、高率の36の増殖培養基をSDS−PAGE
によつて分析した（技術上の理由から全ての培養
基の分析はできなかつた）。分析した28培養基の
培養基当りのハイブリツド・クローンの平均数は
１であり、ハイブリツドの90％はIgヘビー・チエ
ーンを分泌（secrete）していた。（詳細な分析
は、ヘビー・チエーンな１；３、μヘビー・チエ
ーンのみ；24、δヘベー・チエーンのみ；１、μ
およびδヘビー・チエーン；０であつた）。 各ハイブリツド培養基の使用済み培地は以下の
方法を用いて結合アツセイにも試験される（イエ
ンセンおよびウイリアムス、ヨーロピアン・ジヤ
ーナル・オブ・イムノロジー、1974、４、91）。
イースト・チユーブリン溶液（50μｇ／ml）25μ
をステリリン平底96穴微量滴定プレートの穴に
入れ４℃で一晩保持した。イースト・チユーブリ
ンを除去し、各穴にPH7.2の0.1Mヘペス
（Hepes）、0.15MNaCl、0.8％（ｖ／ｖ）ボビン
血清アルブミンおよび0.1％（ｗ／ｖ）ナトリウ
ムアジドを含むPH7.5の0.5Mりん酸カリウム塩バ
ツフアー100μを加え、次いでこのプレートを
室温で１時間放置した。穴を同じバツフアー溶液
（２倍）100μで洗浄し、使用済み培地25μを
加えプレートを４℃で１時間維持した。穴をさら
にりん酸塩バツフアー・ザリーン（３倍）、次い
で2NNaOH水溶液100mlで洗浄した。放射能レベ
ルをカウントし、〔 125I〕−活性度が陽性の反応
を示す穴を取りあげた。この試験で52の穴のうち
６個が陽性を示した。 この６個の陽性培養基のうち４個をYOL1／
５、YOL1／19、YOL1／34およびYOL1／38
（YOL1／34はチユーブリンに対し特に高い親和
性を有する）と命名し、これらを上記コツトンら
によつて記載されたのと本質的に同じ方法を用い
て軟質寒天上でクローンした。各ケースにおいて
得られた１またはそれ以上のクローンを再び軟質
寒天上でクローンした。このクローンを第１およ
び第２クローニング後、予め使用されたものに類
似のアツセイによつてイースト・チユーブリン・
バインデイグを測定した。結果は以下の通りであ
る。 【表】 培養基YOL1／34の場合1δ3個の陽性クローン
の一種（YOL1／34、10）を再びクローンし、12
個の陽性のクローン（YOL1／34 10.1から
YOL1／34.10.12）を得た。陽性の抗体生産に関
する培養基の最初の不安定性は、第１のクローニ
ングの結果で示したごとく、第２のクローニング
で克服されたことがわかる。クローンYOL1／
34.10.1からYOL1／34.10.12の全てはもとの培養
基と同様、チユーブリンに対し非常に高い結果親
和性を有する抗体を生産した。 注記： 同じ脾臓細胞を用いた正確な比較試験において
は親ラツト骨髄腫セルラインY3−Ag.1.2.3はハイ
ブリツド増殖に対し陽であるより高いレベルの穴
を与えるのみでなく、直接血球凝集アツセイで陽
性である同じ数の穴を与え、これによつて
YB2／3.0.Ag.20に対しより高い効果を予測させ
る。 実施例 ３ セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの脾臓細胞
との融合によるハイブリドーマの製造 正常なヒトの脾臓細胞を実施例２に記載のよう
にして融合用に調製し、血清補液（supplement）
が存在しないDMM培地内の脾臓細胞108個のア
リクオートを同一の培地内のセルラインYB2／
3.0.Ag.20の細胞６×107個と混合した。次いでこ
の細胞混合物を実施例２に記載の手順によつて処
理してその融合をおこない、実施例２に記載のよ
うに類似の20％ｖ／vFCS含有DMM内細胞懸濁
液25mlを得た。 この懸濁液をLinbro BCL−5041トレイの48個
のくぼみの中へ0.5mlずつ分配し、各くぼみ内の
液は20％ｖ／vFCS含有DMM培地を用いて２ml
に埋合せた。次いでい細胞を培養し、24時間後に
培地の半分を20％ｖ／vFCSおよびHAT｛リトル
フイールド・サイエンス（Littlefield Science）、
第145巻、第709頁（1964年）｝を含有するDMM
培地で置き換えた。この操作をその後２日おきに
おこなつた。 15〜20日後にくぼみ内では活発な増殖がみら
れ、好結果のハイブリツド・クローンが示され48
個のすべてのくぼみにおいてハイブリツド増殖が
示されることが認められた。各ハイブリツド培養
に使用された培地はシープの赤血球凝集反応の抑
制に依存する方法において試験した。使用された
細胞はヒトのガンマグロブリンを用いて被覆し、
単クローン性抗ヒユーマンカツパIgおよび単クロ
ーン性抗ヒユーマンガンマIgを用いる凝集反応に
対して試験した。遊離のヒユーマンIgの存在は抗
体との結合を妨げ、このような妨害は48個のすべ
ての培養について発生し、このことはこれらがヒ
ユーマンIgに対して陽性であることを示すもので
ある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの脾臓細胞
を用いる融合方法は成功したが、この特別な方法
によつて得られたハイブリドーマは約２週間後に
はその能力を失なつて抗体をつくる。 実施例 ４ セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの末梢血液
リンパ細胞との融合によるハイブリドーマの生
産 (A) Rh因子陽性（rhesus positive）細胞投与に
よつてさらに感作された生まれつきRh因子陰
性（抗−Ｄ陽性）患者からのヒトの末梢血液リ
ンパ細胞によつて正常なヒトの脾臓細胞を置き
かえる以外は実施例３の手順に従つた。
Linbro BCL−5041トレイを用いて全体で96個
の培養をおこなつたところ、このうちの34個は
ハイブリツド・クローンの存在を示す活発な増
殖を呈した。34個のハイブリツドのいずれも抗
−Ｄ陽性ではなかつたが、実施例３に記載の試
験におけるヒユーマンカツパIgに対して陽性の
ものが１つ認められた。 ハイブリドーマを生産する抗−ヒユーマンカ
ツパIgを、初期濃度20％ｖ／ｖから最終濃度
2.5％ｖ／ｖまで減少するレベルでFCSを含有
するDMM培地内で２カ月間培養し、次いで実
施例１に記載の手順により軟アガール内でクロ
ーンした。得られた20個のクローンのうち、18
個がヒユーマンカツパIgに対して陽性で、これ
らのクローンは８−アザグアニンに適応させる
と（生産されたクローンはHATにも感作性が
ある）18個のうちの12個は陽性を保持した。こ
れらの12個のうちの１つを、初期濃度20％ｖ／
ｖから最終濃度2.5％ｖ／ｖまで減少するレベ
ルでFCSを含有するDMM培地内でのスピナー
培養において６カ月間保持しても陽性が保たれ
た。 (B) 上記手順の変形法においては融合に先だち、
イムノグロブリン生産を高める物質であるアメ
リカやまごぼうミトゲン（poke weed
mitogen）を用いて末梢血液リンパ細胞を刺激
した。(A)において用いられたリンパ細胞の同一
試料のフラクシヨンに適用されたこの手順によ
つて全体で37個のハイブリツドを生産したとこ
ろ、このうちの23個が蛋白質Ａで被覆されたシ
ープ赤血球の使用に基づくブロードスペクトル
試験におけるヒユーマンIgに対して陽性であつ
た。これらの細胞はラビツト抗−ヒユーマン
Ig、次いで培養培地上澄みを用いて培養し、続
いてヒユーマンIgが該上澄みによつて系内へ導
入されたなら赤血球を溶解させるモルモツト補
体を用いて処理した。しかしながら37個のうち
23個が陽性となつたが、これらのハイブリドー
マのいずれも１カ月以上にわたつてその抗体生
産能を維持しなかつた。 実施例 ５ 酵母チユーブリンに対する単クローン性抗体の
生体内生産 実施例２に記載のようにして生産された
YOL1／34.10.1セルをF1ハイブリツド（Lou×
AO）ラツト内で腫瘍として増殖させた。この手
順は最初は一匹のラツトを用いるが、次いでこの
ラツトから得られた腫瘍を他のラツトに移植さ
せ、そこから得られた腫瘍をさらに２回移植させ
て、全体で４世代のラツトを使用した。 全体で４世代を結びつけたラツトをそれぞれ17
匹、19匹および９匹使用する３つの別々の実験に
おいては、細胞（５×107）を皮下注射によつて
投与した。各ラツトにおいては約10日後に注射し
た部分に充実性の腫瘍がみられ、ラツトが苦痛の
徴候を示しはじめたら全身麻酔した後、動脈から
全身出血させることによつて殺した（上述のよう
にある場合には腫瘍細胞の一部は次の世代のラツ
トへの移植用に使用した）。補集された血液は37
℃で30分間凝固させ、血清は遠心分離によつて澄
ませた。３つの実験において補集された血液量は
17匹のラツトからは135ml、19匹のラツトからは
169ml、９匹のラツトからは100mlであつた（血清
の収量はこれらの量の約2/3であつた）。 第４の実験においては全体で４世代を結びつけ
た11匹のラツトを用いて腫瘍は腹水腫瘍として増
殖させた。細胞（５×107）は腹腔内注射によつ
て投与し、次いで約２週間以前にプリスタン0.5
mlを腹腔内注射し、殺して腹腔内を切り開いて抗
体源として血液と腹水液を補集した。補集された
血液と腹水液の全収量は271mlであつた。 ラツト１匹あたりの抗体含有液体の収量は腹腔
内に注射された腹水腫瘍ラツトに対しては高い
が、抗体力価はこれらの動物からの液体において
は一般に低く、典型的な力価は皮下注射された充
実性腫瘍ラツトに対して５×105〜106であるが、
腹水腫瘍ラツトによる力価のほんのわずかのもの
のみがこれと同じぐらいの高い値を示すにすぎな
かつた。充実性腫瘍ラツトに対するIgG含量は典
型的には10〜15mg／mlであるが、腹水腫瘍ラツト
に対してはしばしば８mg／ml以下となつた。 得られた血清または血清腹水液は当該技術分野
で既知の手段例えば実施例６に記載の方法を用い
ることによつてそれらの使用目的に適した程度に
までさらに精製してもよい。 実施例 ６ 単クローン性抗体の生体外生産 ハイブリドーマセル、例えば実施例２で生産さ
れたものを最小量の血清（0.5％ｖ／ｖ）の存在
下で増殖させた。これらの細胞は、胎児性子牛血
清0.5％ｖ／ｖで補充されたDMM培地を含む５
スピナーフラスコ内においてCO210％、空気90
％の雰囲気下で増殖させた。細胞は、懸濁液が典
型的には１mlあたり抗体10〜50μｇ含有する定常
相(1)に達するまで増殖する。 抗体調製品を精製するには硫酸アンモニウムを
懸濁に添加して50％飽和溶液とし、得られた沈殿
を補集する。沈殿を最小容量の燐酸塩バツフアー
サーリンに溶解させ、この溶液を同一媒体に対す
る透析に付して精製された抗体調製品を得る。 (1) 第２の変形法では細胞を最小の血清濃度を用
いて対数相（logarithmic phase）で増殖さ
せ、次いで血清を含まないがイスコブ
（Iscove）によつて推奨されているような増殖
添加剤を含有する媒体で直接稀釈する。 (2) 第３の変形法では精製手順をDEAEクロマト
グラフイーまたは免疫吸着剤、例えば抗−ラツ
トイムノグロブリンを用いて続けるか、膜フイ
ルターの使用でこの手順を置きかえる。 実施例 ７ セルラインYB2／3.0.Ag.20の適応生産 標準的なサーリン中のYB2／3.0.Ag.20セル108
〜109個を皮下注射によつてラウラツト（Lou
rat）に投与したところ注射した場所に充実性腫
瘍が徐々に発現した。腫瘍退化の第１の徴候がみ
られた時点でラツトを殺して腫瘍を〓出した。腫
瘍を粉砕し、標準サーリン中の腫瘍細胞108〜109
個を皮下注射によつて第２のラウラツトに投与し
た。全体で10匹のラウラツト内において細胞が増
殖するまでこの手順をくり返した。腫瘍退化の徴
候が最初の数匹において検出されたが、このよう
な徴候はセルラインがラウラツト内での増殖によ
りよく適応するようになるとその後のラツトでは
みられなかつた。これらのその後のラツトは苦痛
の徴候を示しはじめたら殺した。腫瘍の増殖が
徐々に容易になることは、最初の数匹の後の各ラ
ツト内における増殖期間が短くなることによつて
示される。10匹のラツトに注射をおこなつた日付
は次の通りである：９月９日、10月16日、10月28
日、11月12日、11月20日、11月28日、12月６日、
12月15日、12月22日および12月31日。 10匹のラツトからの腫瘍細胞は10％ｖ／vFCS
含有DMM内へ入れ、プランジヤーを用いて微細
なナイロン網を押し通すことによつて粉砕して細
胞懸濁液を得た。この懸濁液を種々の希釈度で20
％ｖ／vFCS含有DMM中に分配させ、培地内の
FCS濃度が徐々に減少するLinbroプレート内で
くり返して二次培養した。 ３週間後、2.5％ｖ／vFCS含有DMM内での二
次培養増殖物（YBO）を得た。このセルライン
をYB2／3.0.Ag.20自体に関する実施例１に記載
の手順と同様にしてDMM／2.5％ｖ／vFCS内で
のスピナー培養に付した。セルラインYBOの特
性は実質上はYB2／3.0.Ag.20の特性と同様であ
るが、ハイブリツドLou×AOラツトにおけると
同様に純粋なLouにおける増殖にも容易に適応
し、AOマーカーはこのセルラインにおいては明
らかに失なわれているか、完全に抑制されてい
る。
使用に関する。 適当な親セルラインから細胞融合技術によつて
誘導されるセルラインから単クローン性の抗体の
生産が最近かなりの注目を集めてきた。まず、免
疫を有するマウスまたはラツトからの細胞と融合
させる親セルラインとして一種または数種のマウ
ス骨髄腫セルラインを用いてハイブリツド骨髄腫
を得、これを増殖させて免疫化に使用された免疫
原に対する抗原を生産する方法がある。この方法
の利点は非精製免疫原を用いて、極めて特異的な
抗体の生産に使用し得る点である。 この方法は免疫法に使用するための重要な新し
い手段を提供するが、入手し得る親セルラインの
性質から生ずる或る種の限界を有している。しか
しながら、1979年、ガルフレ、ミルスタインおよ
びライトらによつてラツト骨髄腫セルラインY3
−Ag1.2.3が報告され（ネイチヤー1979、277、
131）、このセルラインは英国特許出願第8000595
（第2039948号として公告された）の主題であり、
この出願と関連して、1979年１月９日にインスチ
チユート・パスツール（Institut Pasteur）にお
けるC.N.C.M.に寄託された（C.N.C.M.No.１−
078）。セルラインY3−Ag1.2.3自体は現存するマ
ウス骨髄腫セルラインと比較してハイブリツド骨
髄腫（またはハイブリドーマ（hybridoma））を
生成する単クローン性抗体の生産における親セル
ラインとして使用するためのかなりの利点を有し
ている。本発明者らはY3−Ag1.2.3の誘導体であ
つて、この目的にとつてより適当な新しいラツト
骨髄腫セルラインを調製した。 即ち、本発明はラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20を提供する。 ラツト骨髄腫セルラインはマウス骨髄腫セルラ
インより多くの利点を有する。抗体の生産用ハイ
ブリツド・セルラインのインビボ培養はインビト
ロ組織培養法と比較して或る種の利益−例えば培
養基と比較して動物血清中ではml当り著るしく高
いレベルの抗体が得られるがある。インビボ培養
のためのラツトの使用はいくつかの点でマウスの
使用より優れている。例えば血清および腹水流体
の収率が高く、同腹子（litter）が一般に大きく、
ラツトは抗原刺戟に対しマウスよりよく応答す
る。さらにラツトは単クローン性異種発生性抗マ
ウスおよび同種異系抗ラツト抗原の生産に必要で
ある。しかし親マウス骨髄腫セルラインと免疫化
されたラツトからの細胞の組合せによつて生産さ
れるハイブリツド・セルはマウスまたはラツトい
ずれにおいても容易に培養されないことがわかつ
た。加えてラツト骨髄腫セルラインは或る種の異
種融合（heterogeneous fusions）、例えばうさぎ
（rabbit）または人（human）の細胞との融合に
利点があることがわかつた。 セルラインYB2／3.0.Ag.20はもとのラツト・
セルラインY3−Ag1.2.3に由来する上述の利点を
有するのみならず、かなり有用な別の性質を有し
ている。Y3−Ag1.2.3は特有のカツパー型のライ
ト・チエーン（light chain）、コード名S210、を
生成および分泌し、Y3−Ag1.2.3を用いて生産し
たハイブリドーマもまた、ほぼ一定不変にこのラ
イト・チエーンを含んでいることがわかつた。し
かしながらその調製中に使用される免疫原に関す
る抗体活性は免疫化動物から誘導され、通常Ｈお
よびＬとして指示される免疫グロブリン・チエー
ンが存在するときしか一般により完全には発現せ
ず、かつ骨髄腫からの免疫グロブリンは抗体の結
合特性と干渉しかねないのでハイブリドーマ中に
それが存在することは不利である。 ある種のマウス骨髄腫親セルラインの場合にお
いて免疫グロブリンチエーンを発現しない突然変
異体をそこから直接単離することは可能であつた
が、その後の研究にもかかわらず、同様の手がか
りはY3−Ag1.2.3セルラインの場合にも可能であ
ることは知られていなかつた。セルライン
YB2／3.0.Ag.20がやゝ常套でない方法によつて
Y3−Ag1.2.3から得られた。セルラインY3−
Ag1.2.3を用いた融合試験の一つは、Y3−
Ag1.2.3と、人の補体C3に感作されたAOラツト
からの脾臓セルと融合して数種の抗−C3抗体産
生セルラインを得ることにある。その一つである
YB2／3HLは、Y3−Ag1.2.3から誘導されるハイ
ブリドーマ間では一般的ではなく、カツパー・ラ
イトチエーンを発現する能力を欠いている。一連
のクローニング試験によつて、後に詳述するごと
く、YB2／3HLからセルラインYB2／3.0.Ag.20
を選択することが可能なことがわかつた。そこで
はＨおよびＬチエーンを発現する能力を欠き、そ
れによつて免疫グロブリン・チエーンを発現しな
いゼロ・セルラインを与える。 また本発明はセルラインY3−Ag−1.2.3から誘
導されるハイブリツド骨髄腫セルラインをクロー
ニングして、それによつて免疫グロブリン・チエ
ーンを発現しないY3−Ag1.2.3のラツト骨髄腫セ
ルライン誘導体を単離するラツト骨髄腫セルライ
ンの生産方法を含む。この様なラツト骨髄腫セル
ラインは一般にヒポキサンチン／アミノプテリ
ン／チミジン（HAT）に敏感であり（リトウル
フイールド、サイエンス、1964、145、709）、こ
れはこの性質を一般に有さないハイブリドーマか
ら親細胞からの分離を容易にし、この様な感受性
はしばしば８−アザグアニン抵抗性と共存する。
セルラインYB2／3.0.Ag.20がHAT感受性および
８−アザグアニン抵抗性の性質を有することが、
これらの性質を有したことを確かめるための積極
的な工程を用いることなくわかつた。しかしなが
ら、他の場合ではこれらの性質を有するセルライ
ンを得るための積極的な工程、例えば８−アザグ
アニン含有媒体中でY3−Ag1.2.3の融合からハイ
ブリドーマ・セルを増殖させてこの化合物に抵抗
性である細胞を選択する工程を採用する必要があ
る（上述したごとくHAT感受性はしばしば８−
アザグアニン抵抗性と共存しており、後の性質は
より容易にその選択に用いられる）。 セルラインYB2／3.0.Ag20はその製造に使用さ
れる二種類のラツトの標識、即ち、Lou（Y3−
Ag1.2.3骨髄腫）およびAO（人の補体C3感作脾臓
細胞）を有しているが、後者は弱くしか発現され
ないと思われる。この細胞はY3−Ag1.2.3と同じ
一般的形態を有しているが（このY3−Ag1.2.3も
またその親210.RCY3.Ag1と同じ一般的形態を有
している）この細胞（およびそれから誘導される
ハイブリツド・セルも一般に）Y3−Ag1.2.3セル
よりも大きくかつより丸くなつている。YB2／
3.0.Ag.20の培養容器、特にプラスチツク容器に
対する細胞粘着性はY3−Ag1.2.3で見られるもの
よりずつと小さくNSI／1Ag4−１で見られるも
のに似ている。セルラインYB2／3.0.Ag.20はY3
−Ag1.2.3と似て、８−アザグアニンに対して抵
抗性であり（但し30μｇ／mlのより高いレベルに
おいて）、HAT（リトルフイールド、サイエン
ス、1964、145、709）含有培地中で死ぬ。セルラ
インYB2／3.0.Ag.20は優れた融合能力を保有し、
曲型的にはラツトの脾臓細胞との融合において細
胞106当り１の効果のレベルを与える。さらに軟
質寒天（soft agar）中での細胞のクローン化性
（clonability）は良好であり、確かに、クローン
がより密である限りY3−Ag1.2.3セルのそれより
も良好であり、それによつて一般にYB2／3.0.
Ag.20から誘導されるハイブリドーマをY3−
Ag1.2.3からのものより精製を容易にする。 セルラインYB2／3.0.Ag.20株はケンブリツジ
のメデイカル・リサーチ・カウンスルズ・ラボラ
トリー・オブ・モレキユラー・バイオロジーに保
存されており、そのセルラインは1980年６月25日
にパリのインスチチユート・パスツールのC.N.
C.MにC.N.C.M.No.I.126の番号で寄託された。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は種々の形態の栄
養培地で増殖できる。即ち、本発明はセルライン
YB2／3.0.Ag.20の細胞とそれ用の栄養培地から
構成されたものである細胞培養系にも及ぶ。この
様な細胞培養系は便宜的にはインビトロであり、
培地は本質的には合成培地であるが、もちろん血
清のごとき天然源から得られる成分を含んでいて
もよい。この様な培地の例は、熱で不活性化した
馬の血清または好ましくは仔牛の胎児血清を例え
ば10％（Ｖ／Ｖ）補給した、ダルベツコ
（Dulbeccos）変性イーグル（Eagle）最小必須培
地（例えばジブコ・バイオカルト社；パイスリ
ー、スコツトランドから入手可能）である。この
細胞をこれより低い血清レベルの使用または血清
を含まないアインコブ（Isocove）変性品（アイ
ソコブおよびメルチヤーズ、ジヤーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メデイシン、1978、147、
923）の使用に条件づけしてもよい。抗生物質の
補給は培地中に使用してもよい。この様な培地中
で増殖した細胞は短期間の条件づけで、仔牛の胎
児血清を有するRPMI1640および細胞培養に一般
に用いられ、この技術分野の文献に記載されてい
るごとき他の種々の培地中で増殖させることがで
きる。懸濁培地中では一般に約24時間の細胞倍加
間（doubling time）が得られ、この様な培地を
好適には、細胞および培地の一部を除去し、これ
を新鮮な培地で置き換えることによつて一週間に
３回供給する。一般に、低血清含量の培地、例え
ば約５％（Ｖ／Ｖ）ないしそれ以下、例えば血清
供給量2.5％を含有する培地中で増殖するよう細
胞を条件づけることは融合中に曝される条件を容
易に受け入れる丈夫な細胞を調製する点で価値が
ある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20は液体窒素中で良
好な貯蔵安定性および該セルラインの多数の世代
にわたつてインビトロ培養における良好な安定性
を示す。但し、通常のごとくルーチンチエツクを
時々実施するのが望まれる。融合能力のごとき細
胞のある種の性質は連続培養によつて改良される
得ることが理解されるであろう。確かに、例えば
連続した継代（passage）および／またはクロー
ニングを通して、殆んどの点でYB2／3.0.Ag.20
に実質状類似するが、ある種の変わつた性質を有
する種々のセルラインを得ることを可能にし、融
合に使用するための親セルラインとしての最初の
使用に加えて、セルラインの第二の使用はその様
な変異種の製法にある。この様な変異株は自然発
生的に生じ、インビトロでの継代、しばしばこれ
に続くクローニングまたは特に直接クローニング
することによつて、もとのYB2／3.0.Ag.20のバ
ルクから選定される。このクローニングは例えば
軟質寒天上で行なわれる。しかしながらこの様な
工程はむしろ単調であつて、多数のクローンの研
究を含み、変異株の生産は、後述するごとく変異
株の生産にセルラインの細胞を適応（adaption）
させる条件、特に細胞の継代における使用によ
り、しばしばより好適に達成される。 変異種は都合のよいことにはハイブリドーマの
生産におけるその使用に関連するセルライン
YB2／3.0.Ag.20の一ないしそれ以上の性質にお
ける変化を示す。この様な性質は融合特性および
増殖特性を含み、後者はハイブリドーマの増殖特
性に関係をもつている点で特に興味深い。特に興
味のある変異株はこの様な一種ないしそれ以上の
性質の向上を示すものであり、ある種の特に興味
ある特殊なタイプの変異株については後述する
（第24頁）。従つて、本発明はさらにセルライン
YB2／3.0.Ag.20から誘導される親骨髄腫セルラ
イン、特に上述の変異株に関するものである。 セルラインYB2／3.0.Ag.20および本発明に従
う他の親セルライン特有の価値は単クローン性抗
体の調製用に使用し得るハイブリツド・セルライ
ンの製造にある。この目的に使用される方法は
種々の親セルライン、即ちYB2／3.0.Ag.20それ
自体のみでなくY3−Ag1.2.3から誘導されるゼ
ロ・セルラインおよびYB2／3.0.Ag.20の変異株
に対し広い範囲で類似しているが、便宜上特に
YB2／3.0.Ag.20に言及して記載する。親セルラ
インからハイブリツド・セルラインを製造する方
法は脾臓、リンパ線または他のセルラインの細胞
で免疫原に感作した免疫細胞（即ち免疫学的に適
応性を有する細胞）を融合する工程を含む。この
感作した免疫細胞は種々のソースから採取しても
よいが、最良の結果はラツトの細胞を用いて得ら
れ、これが他のホスト、即ちマウスや人から得ら
れたものより好ましいことがわかつた。YB2／
3.0.Ag.20セルラインはLouおよびAOラツトの両
方に対して標識を有しているので、後続のインビ
ボ増殖によるハイブリドーマからの抗体の生産を
意図しているときは免疫細胞を生産するために使
用するラツトはAOまたはLouラツトのいずれか
であるのが好ましい。本発明に従う他の親セルラ
インは後述するごとく広く選択できる。免疫細胞
の感作は正常に発生してよく、自然発生的な免疫
化によつて、しかし好ましくは直接免疫化によつ
て感作させる。必要な免疫原を免疫化工程でホス
ト動物に積極的に投与する。 セルラインの細胞と適当な免疫細胞の融合は融
合を促進する試薬を含む適当な培地での混合を必
要とする。即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.
Ag.20の細胞と免疫細胞、例えばマウスまたは特
に人、就中、ラツトからの脾臓細胞を該細胞の融
合を促進する試薬を含む栄養培地で融合するシス
テムを含む。この様な培地は好適には合成物であ
つてもよいが、もちろん、所望ならば天然源から
得られる成分を含んでいてもよい。しかしなが
ら、この場合以上のごとき可能性は少ない。この
様な培地の例はイーグルの最少必須培地
（Eagles minimum essential medium）、そのダ
ルベツコ変性培地（Dulbecco modification）、
RPMI1640および細胞培養に一般に使用され、当
該技術文献に記載された他の種々の培地であり、
細胞の培養には上述したごとく、抗菌性助剤がし
ばしば用いられる。種々の融合試剤を用いてもよ
く、例えばセンダイ・ウイルス（Sendai uirus）
のごときウイルス、ポリエチレングリコール、例
えばPEG1500が好ましい。これらの試薬での細
胞の融合は文献に記載され、本件実施例に説明さ
れているが、ガイダンスとしてはポリエチレング
リコールの約40から約55％（Ｖ／Ｖ）がしばしば
使用され、その最適濃度は分子量により、例えば
PEG1500では約50％（Ｖ／Ｖ）である。所望な
らばジメチルスルホキシドをポリエチレングリコ
ールに加えてもよい。ハイブリドーマ単離を好適
にはもとの培地を、親セルラインに対しては毒性
であるがハイブリツド・ラインに対しては一般に
毒性のないHAT培地と置き換えることによつて
補助してもよい。これに続いてクローニングとサ
ブ・クローニングを用い、抗体生産用試験に照ら
して適当なハイブリツドを選ぶ。 上に示したごとく、要求される免疫原に感作さ
れた免疫細胞は別の方法によつて得ることもでき
る。即ち、該細胞は要請される型の自然発生免疫
細胞を選択することによつて、あるいは一連の投
与量で免疫原をフロインド・アジユバンドのごと
きアジユバンド（ここでは適当である）と共に動
物（ここでは人を含む）に投与し次いで脾臓また
は他の免疫細胞を採取することを含む当該技術に
おいて記載された方法によつてうまく得られる。 免疫細胞の自然発生法の採用は人の免疫細胞に
関して特に興味深く、ここでは免疫原の投与はあ
まり魅力的ではなく、患者の感染した病気から自
然に生産された免疫細胞がもつと適当である。自
然の免疫細胞に関し特に興味のある領域は自動抗
体（auto antibody）の生産である。 本発明は蛋白質と糖蛋白、オリゴおよびポリサ
ツカライド、リポサツカライド、パプテンおよび
類似物、例えばペプチド、神経伝達物質およびホ
ルモン類のごとき抗原を含む広範囲の免疫原に対
して感作された直接または自然に感作された動物
からの免疫細胞に適用できる。表面標識であつ
て、腫瘍性の物質、特に充実性腫瘍（Solid
tumour）から誘導される免疫原はかなり興味深
いが、本発明は細菌性およびウイルス性抗原に対
しおよび原生類および菌類から誘導される免疫原
に適用してもよい。 即ち、本発明は更にラツト骨髄腫セルライン
YB2／3.0.Ag.20または前述した本発明の他の親
セルラインと動物、例えばマウス、特に人、就中
ラツトからの免疫原に感作した脾臓または免疫細
胞間のハイブリツドである細胞を含む。 ハイブリツド・セルは親YB2／3.0.Ag.20細胞
と、および前述のものと同じ一般的な型の培地で
の培養によつて維持してもよい。 本発明のセルラインによる抗体の製法はそれ用
のインビトロまたはインビボ培地いずれかでセル
ラインを培養することによつて行なつてもよい。
即ち、本発明はセルラインYB2／3.0.Ag.20また
は本発明に従つた他の親セルラインから誘導され
るハイブリツド・セルをインビトロまたはインビ
ボ培地で培養し、その後該培地から抗体を単離す
る工程を含む抗体の生産方法を提供する。 インビトロとインビボの選定は種々の因子によ
る。即ち、インビトロ培養は、抗体が必要とされ
る用途が化学的な性質よりむしろ免疫学的であ
り、かつラツト中でのインビボ増殖からのラツト
免疫グロブリン汚染物の存在が望ましくないとこ
ろで必要とされる。インビトロ増殖はまた免疫細
胞が得られるラツトの素質（strain）は重要でな
いと云う利点を有する（インビボ増殖では重要で
ある）。さらにハイブリドーマ・セルはインビボ
では増殖しない場合がある。しかしながら、イン
ビボ培養はインビトロ培地と比較してml当り著る
しく高い抗体のレベルが一般に得られる（血清お
よび／または腹水中）。インビボ培養は好ましく
はラツト中で行ない、セルラインYB2／3.0.
Ag.20の場合には（これは前述のごとくラツトの
AOまたはLou種からの免疫細胞とうまく融合し、
そこでは得られた抗体生産用ハイブリドーマのイ
ンビボ培養が意図されている）ラツトは好ましく
はLou×AOハイブリツドである（ラツトのAOま
たはLou純潔種においては増殖の容易さが劣る場
合がある）。加えて、放射線照射および／または
免疫抑制剤の使用によつてラツトの不適合種中で
ハイブリドーマの生育を達成することも可能であ
ろう。 ラツトの単一種、例えばラインY3−Ag1.2.3の
場合における種Louから親骨髄腫セルラインが誘
導されるときは、ハイブリドーマを生産する親セ
ルラインと融合する免疫細胞を供給するためラツ
トのどの純潔種を使用してもよく、また親セルラ
インと免疫細胞の誘導に相当する株のハイブリツ
ド中でハイブリドーマの易インビボ増殖が起るで
あろうと云う利点がある。従つて前に言及したご
とくセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株の典形
はセルラインがラツトの純潔種、特にAOまたは
Lou（後者の場合、AO標識が失なわれているかマ
スクされたもの）中での増殖に適応（adapt）さ
れたものである。この方法でセルラインYB2／
3.0.Ag.20を適用するための好ましい方法はライ
ンがそれに適応されるべき種である多数のラツト
（例えば少なくとも５匹、特に約10匹）を通して
それを継代することである。この方法ではセルラ
インによつて誘発された腫瘍の明らかな退行が生
じている一連の二、三の速いラツトに最初にみら
れる増殖のモードから、退行なしに容易に増殖す
る一連の遅いラツトにみられるモードにセルライ
ンを適用することが可能である。最後のラツトか
ら単離された腫瘍細胞を次いで培養し、所望なら
ばクローンし、変異株と融合するための免疫細胞
を提供するために都合よく使用されるラツトの種
類のある範囲に関して高められた性質を示すべく
適応されたセルラインYB2／3.0.Ag.20の変異株
を提供する。この形の種々の適応されたセルライ
ンを調製してもよく、好ましい例はYB2／3.0.
Ag.20の融合特性の保持または改良に対して選ば
れる。 インビトロの系の場合は用いられる培地は細胞
培養システムに関連して上記したものと同じであ
つてよいが、血清レベルはできるだけ低く、例え
ば５％（Ｖ／Ｖ）ないしそれ以下、好ましくは約
2.5％（Ｖ／Ｖ）より多くなく、好適には0.5％
（Ｖ／Ｖ）程度であるのが好ましい。アイソコブ
血清（Isocove）−微変性を使用してもよい。この
細胞は都合のよいことには対数相を越えてうまく
増殖させることができ、これによつて最終生存度
を犠牲にして最大最終濃度を達成できる。細胞の
定常相（stationary phase）における短期間の生
育は、抗体の最終収量を改良するので好ましい。
抗体生産の適当な組織培養法の例は紡すい状容器
（spinner container）中での塊状増殖（massive
grawth）および当該技術分野においてよく知ら
れた大量培養法である。インビボ法は好ましくは
ラツトに接種して充実または腹水腫瘍を生産する
方法を含む。接種に先立つてラツトを免疫抑制す
るかおよび／または腹水の分泌をうながすプリス
タン（pristane）のごとき薬剤で処理してもよ
い。腫瘍を適当な期間増殖させた後、動物を殺
し、抗体単離のために腹水および／または血清を
集め、腹水腫瘍の場合はその期間後生きた動物か
ら腹水を集めてもよい。即ち腹水腫瘍はより多量
の液を生産する能力を有するが、この技術の価値
は腹水および／または血清中に存在する抗体の濃
度にある。インビトロまたはインビボ法いずれか
からの抗体の単離は、沈澱、透析、免疫−吸着剤
（immuno−absorbent）の使用を含むクロマトグ
ラフイー、および膜過を含む当該技術において
記載された方法によつてうまく達成できる。 即ち、本発明は動物、特にラツトに本発明に従
うYB2／3.0.Ag.20または他の親セルラインから
誘導されるハイブリツド・セルを接種し、充実性
または腹水腫瘍をラツト中に増殖させ、次いでラ
ツトの血清および／または腹水から抗体を単離す
る工程を含む単クローン性抗体の生産法を含む。 本発明は本発明に従うセルラインYB2／3.0.
Ag.20または他の親セルラインから誘導されるハ
イブリツド・セルを用いて調製される抗体にも及
ぶ。この様な抗体は治療および特に診断、および
親和クロマトグラフイー（affinity
chromatography）等の種々の用途を有する。生
産される単クローン性抗体の一例は人の細胞の亜
個体群（sub−population）を認知する種々の人
原発性腫瘍細胞に対する抗体であり、これは血液
学的診断に有用である。他の形の用途として自然
に発生する物質、例えばこの物質の精製用蛋白質
に対する抗体の使用が例示される。 本発明を以下の実施例で説明する。 実施例 １ ハイブリツド・セルラインYB2／3HLからの
セルラインYB2／3.O.Ag.20.の調製 セルラインY3−Ag1.2.3から誘導されるハイブ
リツド・セルラインYB2／3HLの細胞をダルベ
ツコ変性イーグルス培地にもとづく培地（これは
DMMと同じであり、DMMはダルベツコ変性イ
ーグルス培地にある種の添加物を加えた市販調製
品であり、以下の成分を含む： 500mlダルベツコMEM（4500mgグルコース／
を含みピルビン酸Naは含まない）−ジブコ−バイ
オカルト・カタログNo.320−1665、 ５mlピルビン酸Na MEM（100ｍＭ）−ジブ
コ・カタログNo.320−1360 10mlペニシリン／ストレプトマイシン（5000単
位ペニシリン／500ｍｃｇストレプトマイシン／
ml） 培地はNaHCO3含量3700mg／、PH7.2〜7.5で
ある）に牛の胎児血清〔FCS；異なつたバツチか
ら選ぶ（セラ−ラブ・カタログNo.５−000−1a〕
10％（ｖ／ｖ）を補給した培地から得、本質的に
はコツトンらによりヨーロピアン・ジヤーナル・
オブ・イムノロジー、1973、３、136に記載され
たごとき軟質寒天中でクローンした。総計116の
ランダム・クローンを培養し、この培養上澄液
を、塩化クロムと結合した羊の赤血球（SRBC）
の羊中に生じた抗ラツトIgに対する間接凝集によ
り、ラツトIgの生産に対してスクリーンする（ケ
ーラーら、ヨーロピアン・ジヤーナル・オブ・イ
ムノロジー、1976、６、292）。各ケースにおい
て、上澄液をSRBCと混合し、10分間静置後、遊
離抗ラツトIgを加えると上澄液中にラツトIgの存
在するものは凝集する。116クローンからラツト
免疫グロブリン生産に関し陰性であるかごく弱い
陽性を示す３クローンが選択され、これらの３ク
ローンはP1.F11、P2.G11およびP.H12として固
定される。この３個のクローンによる細胞外およ
び細胞内〔 14C〕−リジン取込みを、通常のリジ
ン含量の培地を〔 14C〕−リジンで置き替えた
DMM−５％FCS（使用されるFCSは透析された
もの）中でインキユベートすることにより研究し
た。上澄液をケーラーおよびミルスタインのヨー
ロピアン・ジヤーナル・オブ・イムノロジー、
1976、６、511に記載されているごとく、総減数
（total reduction）後、ドデシルサルフエート
Na塩／ポリアクリルアミド電気泳動（SDS−
PAGE）を用いて分析した。 得られた結果を表に示す。 【表】 この３個のクローンを更に研究するため、フル
オレツセン・イソチオシアネートラビツト抗ラツ
トIg（ブラツドストツクらジヤーナル・オブ・ナ
シヨナル・カンサー・インスチチユート、65、
No.、81）を用いる内部細胞螢光顕微鏡法によりス
クリーンし、ゼロ・セルラインの単離に対し最も
有望なものとしてクローンP2.G11が現われ、こ
れは40％の強い陽性に対しほぼ60％の陰性の個体
数を示した。 従つてクローンYB2／3HL P2.G11を軟質寒天
でクローンし、得られた43クローンを内部細胞螢
光顕微鏡法でスクリーンし、22の明らかな陰性体
が９の明らかな陽性体および12の明瞭でないクロ
ーンまたは混合クローン共に見出された。内部細
胞螢光顕微鏡法によるスクリーニングにおいて陰
性であるこの22個のクローンをさらにスクリーン
し、継続するSDS‐PAGE分析によつて、クロー
ンYB2／3HL P2.G11.16（Ｏ）が内部細胞〔
14C〕−リジン取込み上にチエーンを有さないもの
として選択された。これらの細胞は30μｇ／mlの
８−アザグアニンに対し抵抗性であることは既に
見出されているので、この細胞を８−アザグアニ
ンに対し適応させる必要はない。これらの細胞、
即ちYB2／3HL.P2.G11.16（Ｏ）Agを８−アザグ
アニン30μｇ／mlの存在下に軟質寒天中でクロー
ンし、このクローンをクローンが密に増殖した基
体上で選定する。さらにクローンYB2／3HL.P2.
G11.16（Ｏ）Ag.20をその増殖速度の速さの観点
で選定し、試料をHAT感受性に対して試験し
た。 即ちYB2／3HL.P2.G11.16（Ｏ）細胞はハイブ
リドーマを生産する単クローン性抗体に導く融合
において親骨髄腫細胞として使用し、セルライン
YB2／3.0.Ag.20.を構成するのに適した性質を示
す。この細胞を寒天から採取し、20％（ｖ／ｖ）
FCS含有DMM培地を加えたリンブロ・プレート
（Linbro plate）の２mlの穴に入れた。この細胞
を増殖し、徐々により大きな容器で増殖し、かつ
培養器に供給する代替培地の血清レベルを減少さ
せる通常の方法によつて低い血清レベルに条件づ
けした（培養は37℃、CO2 10％（ｖ／ｖ）空気
90％（ｖ／ｖ）、雰囲気下）。この方法では、細胞
は〔2.5％（ｖ／ｖ）FCS／2.5％（ｖ／ｖ）熱で
不活性化した馬の血清〕、次いで〔５％（ｖ／ｖ）
FCS〕および最後に〔2.5（ｖ／ｖ）FCS〕中で増
殖するよう条件づけられ、最終的に１紡錘状フ
ラスコ中、37℃、10％（ｖ／ｖ）CO2／90％
（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下および95％湿度で培養
した。 セルラインの凍結試料（カルチユアー・コレク
シヨンに寄託したものを含めて）を５×105／ml
の細胞数を越えない段階で指数的に増殖する細胞
から調製した。１×107より多い細胞を含む培地
を７分間で600ｇの割合で遠心分離した。細胞ペ
レツトを４℃に冷却し、これを90％（ｖ／ｖ）
FCS−10％ジメチルスルホキシドに懸濁して濃度
５×106（細胞）／mlにした。この懸濁液１ml（４
℃）をアンプルに入れ、シールして、４℃から１
℃／時間の割合で冷却して凍結した。細胞が−50
℃に達したとき液体窒素中に浸漬した。この様な
凍結アンプルから細胞を再生するにはアンプルの
内容物を急速に４℃にし、次いで迅速に冷（４
℃）DMM−10％（ｖ／ｖ）FCSで20mlの容積ま
で稀釈した。次いで細胞を７分間で600ｇの割合
で遠心し、２ml培地中に各1/2、1/4、1/8、1/16
および1/32ペレツト化細胞を含むよう再懸濁し
た。その後、培地を37℃、10％（ｖ／ｖ）CO2／
90％（ｖ／ｖ）空気の雰囲気下で増殖させ、さら
に凍結前の細胞に対して記載したのと同様に増殖
させる。新しい凍結株を調製するためには解凍後
最少１週間、最大３週間の間に得られた培養物を
増殖する必要がある。その間に細胞は24時間の培
化時間で指数的に増加する。 ハイブリツド・セルラインYB2／3HL源 YB2／3HLセルを以下のごとく調製した。イ
ヌリン（ブリテイツシユ・ドラツグ・ハウシズ）
のりん酸塩バツフアー・ザリーン（100mg／ml）
懸濁液を１分間超音波処理し、次いで懸濁液0.5
mlを正常な人の血清（エチレングリコールビス
（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，N′−テトラ酢
酸（EGTA）10ｍＭおよびMgCl2でMg7ｍＭに
したもの）10mlで37℃で15分間処理し、イヌリン
に対するC3の固定および補体経路（complement
pathway）のいずれかを活性化させる。懸濁液を
生理食塩水、2MNaClおよび再び生理食塩水で遠
心分離して洗浄し、生理食塩水で原容量１mlとす
る。 ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（ペニシ
リン5000単位−ストレプトマイシン500ｍcg／
ml）250μ、正常なラツトの血清50μをフロイ
ンド完全アジユバンド（CFA）約１ml中に加え
た液で抗原補体１mlを乳化して最終容量2.4mlと
した。この調製品0.1mlを２匹のAOラツトそれぞ
れに各４箇所（合計ラツト１匹に0.4ml）筋肉注
射した。３週間後、各ラツトにCFAを含まない
がビー・ペルツシス５×109を含む類似の抗原調
製物0.5mlを骨膜内（intraperistoneal）注射す
る。４週間後、いかなる形態のアジユバンドも有
さない抗原調製品0.5mlを静脈注射し次の月の間
にさらに５回類似の静脈注射を行なつた。 最後の静脈注射３日後にラツトを殺した。各ラ
ツトにつき、滅菌条件下で脾臓を除去し、補給血
清を含まない新しく調製したDMM培地５mlを入
れた氷冷した小さなペトリ血に置いた。脾臓を切
つた後、前述の血清を含まないDMM培地４mlを
含む10mlプラスチツク製丸底チユーブに移し、う
まく適合しない（２mmのクリアランス）テフロン
製乳棒で潰した。得られた混合物を１分間氷の上
に放置し、上層3.5mlをプラスチツク製の普通の
チユーブに移した。潰した脾臓の残りをDMM5
mlで洗い、混合物を１分間立てて、大部分の破片
を沈澱させた。上澄液を破片から傾瀉し、チユー
ブ中の細胞に加えた。このチユーブをDMMで満
たし、ベンチ遠心機を用い600rpmで７分間回転
した。次いで上澄液を傾瀉し、細胞をDMM中に
再分散した。細胞108を含むこの懸濁液の１アリ
コートをケンブリツジにあるエム・アール・シー
ス・ラボラトリー・オブ・モレキユラー・バイオ
ロジーに保存されている株から得られる洗浄した
Y3−Ag1.2.3細胞107と50ml円錘遠心管中で混合
した。次いでDMM培地を細胞混合物に加え全体
を遠心分離した。 液を切つた細胞ペレツトを含むチユーブを37℃
の水浴中に置き軽くたたいた。ポリエチレングリ
コール（PEG）1500のDMM50％（ｗ／ｖ）溶液
0.8mlを37℃において、１分間かけて該細胞中に
加え、ピペツトを用いてゆるくかき混ぜた。ゆる
やかな撹拌をさらに１分間続け、DMM培地２ml
を２分間にわたつて加え、次いで３分間かけて
DMM8mlを加え、さらにDMM10mlを滴下した。
この細胞を回転し、次いで別のバツチ（セル−ラ
ボ カタログNo.５−000−1a）からの牛の胎児血
清（FCS）20％（ｖ／ｖ）を補給しておいた予備
加温（37℃）DMM培地に初めはその２、３滴中
に次いでその25mlにゆつくりと再懸濁させた。容
積を予め加温した同じ培地で50mlにした（この段
階および以下のインキユベーシヨン中に使用され
たFCSを56℃で30分間熱不活性化処理した）。 二匹のラツトから得られた細胞含有培地をリン
ブロ・プレートの２mlの穴96個に分配し、同じ培
地１ml中に約１×105個の洗浄脾臓細胞を含む液
を各穴にフイーダー（feeder）として加え、全体
を37℃でインキユベイトした。次の日、培地２ml
のうち１mlを各穴から除き、20％FCSおよび
HAT（リトルフイールド、サイエンス、1964、
145、709）を含むDMM培地１mlで置換する。イ
ンキユベイシヨンを37℃で２週間続け、その培地
の半分を最初の置換後２日目およびその後は２〜
３日間隔を置いてHAT培地で同様に置換した。 ２週間後に80個の穴に活性な増殖が観察され、
この増殖はハイブリツド骨髄腫の存在を示した。
80個の培養基それぞれの使用済みの培地を以下の
ごとき間接的な結合アツセイにより抗体生産用に
試験した。複合体をラツクマンおよびホバート、
1978、コンプリメント・テクノロジー、ザ・ハン
ドブツク・オブ・エクスペリメンタル・イムノロ
ジー、著者デイー・エム・ワイヤー（ブラツクウ
エル・サイエンテイフイツク・パブリケイシヨ
ン）の方法に本質的に従つて、37℃で酵母処理し
た人の血清（R3）でエリスロサイト（EA）を有
する羊の抗体を処理し次いで洗浄することによつ
て製造する。複合体（EACと云う）のこの中間
物はC3b、C3biおよびある種のC3dをその表面に
有するが、C5は有さないか或はその上の後の成
分はR3として、“非反応”（non‐reactor）血清
から得られた。EAとEACの両者は各穴からの使
用済培地の稀釈液で処理し、洗浄し、〔 125I〕ラ
ベル化抗ラツト免疫グロブリン抗体とインキユベ
ートした。さらに洗浄した後細胞の放射能を測定
した。この間接結合アツセイで測定したときこの
80培養基のうちわずか３例が明瞭な抗体生産活性
を示し、２匹のラツトの１匹から誘導されたこれ
らの培養基の一つがハイブリツド骨髄腫YB2／
39を含んでいた。 ハイブリツド骨髄腫YB2／39を上記コツトン
らの文献に記載されたのと本質的に同じ方法を用
いて軟質寒天中でクローンした。クローニングを
数種の細胞濃度において実施し、クローンを最低
クローン濃度から選んだ。この最初のクローニン
グ段階でのクローニング効果は約10％であつたが
最初に単離された活性クローンの率は100％
（21／21）であつた。クローン39−11を選択し、
軟質寒天中でクローンして、４／４陽性クローン
を得、そこからクローン39−11−１−７を選び、
軟質寒天中でクローンしてセルラインYB2／
3HLを構成するクローン39−11−１−７を得た。
この細胞を低いクローン／プレート数（≪100）
を含む寒天プレートから採取した。クローン当り
の細胞の数は約100であつた。FCS20％（ｖ／ｖ）
含有DMM1mlを加えたリンブロ・プレートの２
mlの穴に細胞を移した。次いで細胞を20％（ｖ／
ｖ）FCS含有DMM中で増殖し、培養基を補給す
るために用いる培地の血清濃度を10％（ｖ／ｖ）
に薄めた。より大きい培養基を種々の大きさの平
底組織培養容器に移すことにより作り、空気中に
10％（ｖ／ｖ）CO2を含む雰囲気を封ずるため、
容器を気密にシールし、細胞を37℃、懸濁培養基
として、通常の方法で増殖した。 実施例 ２ セルラインYB2／3.0.Ag.20とイースト・チユ
ーブリン（yeast tubulin）で高度免疫化され
たラツトからの脾臓細胞との融合によるハイブ
リドーマの製造： ラツトのLou株を次のスケジユールに従つて免
疫化した： 第１日目：フロインド全アジユバンド中の20μ
ｇイースト・チユーブリンを腹膜内（i.p.）注射
する、 第22日目：フロインド不完全アジユバンド中の
20μｇイースト・チユーブリンを腹膜内注射す
る、 第53日目：22日目と同じ、 第85日目：イースト・チユーブリン20μｇを静
脈内（i.v.）する。 89日目にラツトを殺し、その脾臓を滅菌条件下
に除き、２％（ｖ／ｖ）FCS血清補剤を含む
DMM培地を用いる以外、第 頁に記載されたご
とき融合を行ない、最終品を満たして600r.p.mで
７分間まわし、血清補剤を含まないDMMで再懸
濁した。108個の細胞を含む再懸濁脾臓細胞の１
アリコートを同じ培地中でセルラインYB2／3.0.
Ag.20の６×107個の細胞と混合した。この混合
物を50mlプラスチツク製円錘チユーブ中で600ｇ
で７分間遠心にかけ、次いで上澄液を除去し、細
胞ペレツトをチユーブの底をゆるくかき混ぜて粉
砕した。さらに操作を約37℃で行なつた。DMM
培地（PH7.6−7.8：フエノール・レツドで指示）
中にポリエチレングリコール（PEG）1500（新た
に調製し暗所に保存）50％を含む液１mlを用い
て、この液を１分間かけて加えながら、細胞をゆ
つくりと懸濁させた。この懸濁液を37℃で１分間
保持し、DMM培地１mlをさらに１分間かけて加
えた。DMM培地を更に20ml、５分間かけて加
え、この細胞を遠心分離しFCS20％（ｖ／ｖ）含
有DMM培地中にゆるやかに再懸濁し、総容積25
mlとした。 この懸濁液を２ml穴48個を有するリンブロ
BCL−5041トレイ中に0.5ml中に以下のごとく分
配した。もとの容積25mlのうち18mlを36個の穴に
分配し、残りの７mlを14mlに稀釈した（この、お
よび後の稀釈を20％（ｖ／ｖ）FCS含有DMM培
地で行なつた）。14mlのうち６mlを12の穴に分配
し、残りの８mlを16mlに稀釈した。16mlのうち６
mlを12の穴に分配し、残りの10mlを20mlに稀釈し
た。20mlのうち18mlを36の穴に分配し残り２mlを
捨てた。96の穴それぞれを、20％（ｖ／ｖ）FCS
含有DMMで容積２mlにした。この細胞を培養
し、24時間後に培地の1/2を20％（ｖ／ｖ）FCS
およびHAT（リトルフイールド、サイエンス、
1964、145、709）含有DMM培地で置き換える。
この操作を２日後およびその後２日毎に繰り返し
た。 15〜20日後に穴中で激しい増殖がみられ、これ
はハイブリツド・クローンの成功を示す。合計52
の穴がハイブリツド増殖を示した（稀釈が増す順
番に36／36、６／12、３／12および９／36）。 ２の段階でもとのおよび非稀釈の培養基の分析
を行ない、高率の36の増殖培養基をSDS−PAGE
によつて分析した（技術上の理由から全ての培養
基の分析はできなかつた）。分析した28培養基の
培養基当りのハイブリツド・クローンの平均数は
１であり、ハイブリツドの90％はIgヘビー・チエ
ーンを分泌（secrete）していた。（詳細な分析
は、ヘビー・チエーンな１；３、μヘビー・チエ
ーンのみ；24、δヘベー・チエーンのみ；１、μ
およびδヘビー・チエーン；０であつた）。 各ハイブリツド培養基の使用済み培地は以下の
方法を用いて結合アツセイにも試験される（イエ
ンセンおよびウイリアムス、ヨーロピアン・ジヤ
ーナル・オブ・イムノロジー、1974、４、91）。
イースト・チユーブリン溶液（50μｇ／ml）25μ
をステリリン平底96穴微量滴定プレートの穴に
入れ４℃で一晩保持した。イースト・チユーブリ
ンを除去し、各穴にPH7.2の0.1Mヘペス
（Hepes）、0.15MNaCl、0.8％（ｖ／ｖ）ボビン
血清アルブミンおよび0.1％（ｗ／ｖ）ナトリウ
ムアジドを含むPH7.5の0.5Mりん酸カリウム塩バ
ツフアー100μを加え、次いでこのプレートを
室温で１時間放置した。穴を同じバツフアー溶液
（２倍）100μで洗浄し、使用済み培地25μを
加えプレートを４℃で１時間維持した。穴をさら
にりん酸塩バツフアー・ザリーン（３倍）、次い
で2NNaOH水溶液100mlで洗浄した。放射能レベ
ルをカウントし、〔 125I〕−活性度が陽性の反応
を示す穴を取りあげた。この試験で52の穴のうち
６個が陽性を示した。 この６個の陽性培養基のうち４個をYOL1／
５、YOL1／19、YOL1／34およびYOL1／38
（YOL1／34はチユーブリンに対し特に高い親和
性を有する）と命名し、これらを上記コツトンら
によつて記載されたのと本質的に同じ方法を用い
て軟質寒天上でクローンした。各ケースにおいて
得られた１またはそれ以上のクローンを再び軟質
寒天上でクローンした。このクローンを第１およ
び第２クローニング後、予め使用されたものに類
似のアツセイによつてイースト・チユーブリン・
バインデイグを測定した。結果は以下の通りであ
る。 【表】 培養基YOL1／34の場合1δ3個の陽性クローン
の一種（YOL1／34、10）を再びクローンし、12
個の陽性のクローン（YOL1／34 10.1から
YOL1／34.10.12）を得た。陽性の抗体生産に関
する培養基の最初の不安定性は、第１のクローニ
ングの結果で示したごとく、第２のクローニング
で克服されたことがわかる。クローンYOL1／
34.10.1からYOL1／34.10.12の全てはもとの培養
基と同様、チユーブリンに対し非常に高い結果親
和性を有する抗体を生産した。 注記： 同じ脾臓細胞を用いた正確な比較試験において
は親ラツト骨髄腫セルラインY3−Ag.1.2.3はハイ
ブリツド増殖に対し陽であるより高いレベルの穴
を与えるのみでなく、直接血球凝集アツセイで陽
性である同じ数の穴を与え、これによつて
YB2／3.0.Ag.20に対しより高い効果を予測させ
る。 実施例 ３ セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの脾臓細胞
との融合によるハイブリドーマの製造 正常なヒトの脾臓細胞を実施例２に記載のよう
にして融合用に調製し、血清補液（supplement）
が存在しないDMM培地内の脾臓細胞108個のア
リクオートを同一の培地内のセルラインYB2／
3.0.Ag.20の細胞６×107個と混合した。次いでこ
の細胞混合物を実施例２に記載の手順によつて処
理してその融合をおこない、実施例２に記載のよ
うに類似の20％ｖ／vFCS含有DMM内細胞懸濁
液25mlを得た。 この懸濁液をLinbro BCL−5041トレイの48個
のくぼみの中へ0.5mlずつ分配し、各くぼみ内の
液は20％ｖ／vFCS含有DMM培地を用いて２ml
に埋合せた。次いでい細胞を培養し、24時間後に
培地の半分を20％ｖ／vFCSおよびHAT｛リトル
フイールド・サイエンス（Littlefield Science）、
第145巻、第709頁（1964年）｝を含有するDMM
培地で置き換えた。この操作をその後２日おきに
おこなつた。 15〜20日後にくぼみ内では活発な増殖がみら
れ、好結果のハイブリツド・クローンが示され48
個のすべてのくぼみにおいてハイブリツド増殖が
示されることが認められた。各ハイブリツド培養
に使用された培地はシープの赤血球凝集反応の抑
制に依存する方法において試験した。使用された
細胞はヒトのガンマグロブリンを用いて被覆し、
単クローン性抗ヒユーマンカツパIgおよび単クロ
ーン性抗ヒユーマンガンマIgを用いる凝集反応に
対して試験した。遊離のヒユーマンIgの存在は抗
体との結合を妨げ、このような妨害は48個のすべ
ての培養について発生し、このことはこれらがヒ
ユーマンIgに対して陽性であることを示すもので
ある。 セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの脾臓細胞
を用いる融合方法は成功したが、この特別な方法
によつて得られたハイブリドーマは約２週間後に
はその能力を失なつて抗体をつくる。 実施例 ４ セルラインYB2／3.0.Ag.20とヒトの末梢血液
リンパ細胞との融合によるハイブリドーマの生
産 (A) Rh因子陽性（rhesus positive）細胞投与に
よつてさらに感作された生まれつきRh因子陰
性（抗−Ｄ陽性）患者からのヒトの末梢血液リ
ンパ細胞によつて正常なヒトの脾臓細胞を置き
かえる以外は実施例３の手順に従つた。
Linbro BCL−5041トレイを用いて全体で96個
の培養をおこなつたところ、このうちの34個は
ハイブリツド・クローンの存在を示す活発な増
殖を呈した。34個のハイブリツドのいずれも抗
−Ｄ陽性ではなかつたが、実施例３に記載の試
験におけるヒユーマンカツパIgに対して陽性の
ものが１つ認められた。 ハイブリドーマを生産する抗−ヒユーマンカ
ツパIgを、初期濃度20％ｖ／ｖから最終濃度
2.5％ｖ／ｖまで減少するレベルでFCSを含有
するDMM培地内で２カ月間培養し、次いで実
施例１に記載の手順により軟アガール内でクロ
ーンした。得られた20個のクローンのうち、18
個がヒユーマンカツパIgに対して陽性で、これ
らのクローンは８−アザグアニンに適応させる
と（生産されたクローンはHATにも感作性が
ある）18個のうちの12個は陽性を保持した。こ
れらの12個のうちの１つを、初期濃度20％ｖ／
ｖから最終濃度2.5％ｖ／ｖまで減少するレベ
ルでFCSを含有するDMM培地内でのスピナー
培養において６カ月間保持しても陽性が保たれ
た。 (B) 上記手順の変形法においては融合に先だち、
イムノグロブリン生産を高める物質であるアメ
リカやまごぼうミトゲン（poke weed
mitogen）を用いて末梢血液リンパ細胞を刺激
した。(A)において用いられたリンパ細胞の同一
試料のフラクシヨンに適用されたこの手順によ
つて全体で37個のハイブリツドを生産したとこ
ろ、このうちの23個が蛋白質Ａで被覆されたシ
ープ赤血球の使用に基づくブロードスペクトル
試験におけるヒユーマンIgに対して陽性であつ
た。これらの細胞はラビツト抗−ヒユーマン
Ig、次いで培養培地上澄みを用いて培養し、続
いてヒユーマンIgが該上澄みによつて系内へ導
入されたなら赤血球を溶解させるモルモツト補
体を用いて処理した。しかしながら37個のうち
23個が陽性となつたが、これらのハイブリドー
マのいずれも１カ月以上にわたつてその抗体生
産能を維持しなかつた。 実施例 ５ 酵母チユーブリンに対する単クローン性抗体の
生体内生産 実施例２に記載のようにして生産された
YOL1／34.10.1セルをF1ハイブリツド（Lou×
AO）ラツト内で腫瘍として増殖させた。この手
順は最初は一匹のラツトを用いるが、次いでこの
ラツトから得られた腫瘍を他のラツトに移植さ
せ、そこから得られた腫瘍をさらに２回移植させ
て、全体で４世代のラツトを使用した。 全体で４世代を結びつけたラツトをそれぞれ17
匹、19匹および９匹使用する３つの別々の実験に
おいては、細胞（５×107）を皮下注射によつて
投与した。各ラツトにおいては約10日後に注射し
た部分に充実性の腫瘍がみられ、ラツトが苦痛の
徴候を示しはじめたら全身麻酔した後、動脈から
全身出血させることによつて殺した（上述のよう
にある場合には腫瘍細胞の一部は次の世代のラツ
トへの移植用に使用した）。補集された血液は37
℃で30分間凝固させ、血清は遠心分離によつて澄
ませた。３つの実験において補集された血液量は
17匹のラツトからは135ml、19匹のラツトからは
169ml、９匹のラツトからは100mlであつた（血清
の収量はこれらの量の約2/3であつた）。 第４の実験においては全体で４世代を結びつけ
た11匹のラツトを用いて腫瘍は腹水腫瘍として増
殖させた。細胞（５×107）は腹腔内注射によつ
て投与し、次いで約２週間以前にプリスタン0.5
mlを腹腔内注射し、殺して腹腔内を切り開いて抗
体源として血液と腹水液を補集した。補集された
血液と腹水液の全収量は271mlであつた。 ラツト１匹あたりの抗体含有液体の収量は腹腔
内に注射された腹水腫瘍ラツトに対しては高い
が、抗体力価はこれらの動物からの液体において
は一般に低く、典型的な力価は皮下注射された充
実性腫瘍ラツトに対して５×105〜106であるが、
腹水腫瘍ラツトによる力価のほんのわずかのもの
のみがこれと同じぐらいの高い値を示すにすぎな
かつた。充実性腫瘍ラツトに対するIgG含量は典
型的には10〜15mg／mlであるが、腹水腫瘍ラツト
に対してはしばしば８mg／ml以下となつた。 得られた血清または血清腹水液は当該技術分野
で既知の手段例えば実施例６に記載の方法を用い
ることによつてそれらの使用目的に適した程度に
までさらに精製してもよい。 実施例 ６ 単クローン性抗体の生体外生産 ハイブリドーマセル、例えば実施例２で生産さ
れたものを最小量の血清（0.5％ｖ／ｖ）の存在
下で増殖させた。これらの細胞は、胎児性子牛血
清0.5％ｖ／ｖで補充されたDMM培地を含む５
スピナーフラスコ内においてCO210％、空気90
％の雰囲気下で増殖させた。細胞は、懸濁液が典
型的には１mlあたり抗体10〜50μｇ含有する定常
相(1)に達するまで増殖する。 抗体調製品を精製するには硫酸アンモニウムを
懸濁に添加して50％飽和溶液とし、得られた沈殿
を補集する。沈殿を最小容量の燐酸塩バツフアー
サーリンに溶解させ、この溶液を同一媒体に対す
る透析に付して精製された抗体調製品を得る。 (1) 第２の変形法では細胞を最小の血清濃度を用
いて対数相（logarithmic phase）で増殖さ
せ、次いで血清を含まないがイスコブ
（Iscove）によつて推奨されているような増殖
添加剤を含有する媒体で直接稀釈する。 (2) 第３の変形法では精製手順をDEAEクロマト
グラフイーまたは免疫吸着剤、例えば抗−ラツ
トイムノグロブリンを用いて続けるか、膜フイ
ルターの使用でこの手順を置きかえる。 実施例 ７ セルラインYB2／3.0.Ag.20の適応生産 標準的なサーリン中のYB2／3.0.Ag.20セル108
〜109個を皮下注射によつてラウラツト（Lou
rat）に投与したところ注射した場所に充実性腫
瘍が徐々に発現した。腫瘍退化の第１の徴候がみ
られた時点でラツトを殺して腫瘍を〓出した。腫
瘍を粉砕し、標準サーリン中の腫瘍細胞108〜109
個を皮下注射によつて第２のラウラツトに投与し
た。全体で10匹のラウラツト内において細胞が増
殖するまでこの手順をくり返した。腫瘍退化の徴
候が最初の数匹において検出されたが、このよう
な徴候はセルラインがラウラツト内での増殖によ
りよく適応するようになるとその後のラツトでは
みられなかつた。これらのその後のラツトは苦痛
の徴候を示しはじめたら殺した。腫瘍の増殖が
徐々に容易になることは、最初の数匹の後の各ラ
ツト内における増殖期間が短くなることによつて
示される。10匹のラツトに注射をおこなつた日付
は次の通りである：９月９日、10月16日、10月28
日、11月12日、11月20日、11月28日、12月６日、
12月15日、12月22日および12月31日。 10匹のラツトからの腫瘍細胞は10％ｖ／vFCS
含有DMM内へ入れ、プランジヤーを用いて微細
なナイロン網を押し通すことによつて粉砕して細
胞懸濁液を得た。この懸濁液を種々の希釈度で20
％ｖ／vFCS含有DMM中に分配させ、培地内の
FCS濃度が徐々に減少するLinbroプレート内で
くり返して二次培養した。 ３週間後、2.5％ｖ／vFCS含有DMM内での二
次培養増殖物（YBO）を得た。このセルライン
をYB2／3.0.Ag.20自体に関する実施例１に記載
の手順と同様にしてDMM／2.5％ｖ／vFCS内で
のスピナー培養に付した。セルラインYBOの特
性は実質上はYB2／3.0.Ag.20の特性と同様であ
るが、ハイブリツドLou×AOラツトにおけると
同様に純粋なLouにおける増殖にも容易に適応
し、AOマーカーはこのセルラインにおいては明
らかに失なわれているか、完全に抑制されてい
る。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ ８−アザグアニンに対して抵抗性であり、ヒ
ポキサンチン／アミノプテリン／チミジン含有培
地中で死に、免疫グロブリンチエーンを発現しな
いラツト骨髄腫セルラインYB2／3.0.Ag.20また
はそれを継代することにより誘導される上記特性
を有するその変異株。 ２ ラツト骨髄腫セルラインYB2／3.0.Ag.20を
インビボで継代することによつて得られる変異株
である第１項記載の変異株。 ３ セルラインYB2／3.0.Ag.20を多数のラツト
を通して継代することにより得られる第２項記載
の変異株。 ４ ラツトがLouストレインであり、変異株が純
粋Louストレイン・ラツトおよびAO×Louハイ
ブリツド・ラツト中で容易に増殖する能力を有し
ている第３項記載の変異株。 ５ 変異株が、継代細胞をクローニングすること
によつて得られるものである第２項記載の変異
株。 ６ ８−アザグアニンに対して抵抗性であり、ヒ
ポキサンチン／アミノプテリン／チミジン含有培
地中で死に、免疫グロブリンチエーンを発現しな
いラツト骨髄腫セルラインYB2／3.0.Ag.20また
はそれを継代することにより誘導される上記特性
を有するその変異株と免疫原に感作された免疫細
胞との細胞融合により得られる、ヒポキサンチ
ン／アミノプテリン／チミジン培地で死滅しない
ハイブリツド骨髄腫セルライン。 ７ セルラインYB2／3.0.Ag.20を免疫原に感作
されたラツトの免疫細胞と融合することによつて
誘導される第６項記載のハイブリツド骨髄腫セル
ライン。 ８ ラツト骨髄腫セルラインYB2／3.0.Ag.20と
免疫原に感作した動物の免疫細胞とを該細胞の融
合を促進する試剤を用いて融合することによつて
誘導される第６項記載のハイブリツド骨髄腫セル
ライン。 ９ 動物が免疫原の投与によつて免疫原に感作さ
れたものである第８項記載のハイブリツド骨髄腫
セルライン。
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