SE460852B - T-cellinje dess framstaellning och anvaendning vid lymfokinframstaellning - Google Patents

Description

460 852 från den normala T-cellen. V Eftersom det år svårt att erhålls stora mängder av homo- gena, lösliga immunoreglerande faktorer är analysen av deras kemiska och biologiska karaktéristika förenat med stora svå- righeter. Den kliniska användningen av dessa faktorer och de- ras kliniska effekter har följaktligen ej utforskats. Eftersom humana T-hybridcellinjer ej har upprättats ännu har man dess- utom gjort föga eller inga framsteg med avseende pà analysen av ytantigener på humana T~celler och T~cellreceptorer för sntigener vid undersökning av den human; T-cellens komponenter < och vid cellulära och immunologiskà studier med avseende pà differentieringen, förökningen och sktiveringen av humana T-celler i sig.

Ett syfte med föreliggande uppfinning är foljaktligen att tillhandahålla en utgàngscellinje som kan sammansmälta med humana T-celler. Ett annat syfte med uppfinningen är tillhan- dahållande av ett förfarande för bildning av en utgàngscellin- je som kan ssmmsnsmälta med humana T-celler.

Ytterligare ett syfte med uppfinningen är tillhandahål- lsnde av nya hybridcellinjer bildade av utgángscellinjer och “humana T-celler.

Ytterligare ett syfte med uppfinningen är tillhandahål- lande av ett förfarande för bildning av hybridoellinjen. _ Dessutom är ett syfte med uppfinningen framställning av en stor mängd av lösliga immunoreglerande faktorer snabbt och enkelt in vitro med användning av hybridcellinjen.

Dessa syften med och andra särdrag hos uppfinningen ' framgår av fnljsnde beskrivning.

C Föreliggande uppfinning svser sålunda en cellinge, som utgöres av sl en human T-leukemicellinje med hypoxantin-gus- nin-fosíoribosyl~transferas fHGFRT>-brist, som har väsentligen samma identifieringskarskteristika som ATCC nr CRL-8081 har och som uppvisar förmåga till ssmmsnsmáltning med normala humana T-celler under bildning av stabila hybridcellinjerf eller av b! dmilymfokinbildande hybridcellinje som är bildad genom sammansmältning sy de humana T-leukemicellerna u§pvisen~ de HGFRT-brist från al med normala humana T-celler. 'humanh hybridceller och att hybridcellerna latt kan utvalgas Mer speciellt tillhandsliàllay uppfinningefiéßurßggn ny utgàngs~T-cellinje a), som aj är känd pà något sätt och som kan sammansmältas med humana T-celler till de nya hybridcell- linjerna b) bildade av utgàngscellinjen a) och humana Troel- ler. I Uppfinningen avser även ett förfarande för framställning av sådana oallinjer innefattande att a) för framställning av en human T-leukemicellinja med HGPRT-brist, som uppvisar väsentligen samma identifieringskarakteristiko som ATCC nr CRL-8081, odlas sådana humana T-leukamicaller, som betecknas CCR?-CEM i ett medium innehållande 8-azaguanin; och att even- tuellt b) de i steg a) erhållna humana leukemi~T~cellerna med HGPRT-brist, som uppvisar väsentligen samma idontifieringska- rakteristika som ATCC nr CRL~BO81, sammansmältes med normala humana T-celler med användning av en sammansmältningsfrämjande substans, varefter hybridceller, som erhållits vid samman- smältningen, förökas selektivt i ett selektivt medium, som innehåller hypoxantin, aminopterin och tymidin, och klonas for erhållande av en hybridcellinje uppvisande förmåga att bilda ett lymfokin. V V Enligt uppfinningen har omfattande forskningsarbete nad- lagts på utvecklande av en human T-cellsammansmältningsteknik.

Det nar därvid visat sig att en specifik cellinja kan samman- smälta med humana T-coller, uppvisar känslighet mot odlinga- mediet for utvdljande av sammansmalta celler, kan upprätthål- ...tï 5.; las permanent i kultur och är låmpàd såsom en utgàngscellinje for framställning av humana T-hybridceller. Det har också i . visat sig att linjen vid anvandning såsom ett utgàngsmaterial samminsmilter med humana T-celler och dirvid ger upphov till med anvàndn ng iv ett selektivt medium. Vidare innefattar klo- nerna erhållna från de humana T~hybridcellerna som framställts sålundi sàdsna som uppvisar formågs att bilda losliga immuno- reglerande faktorer (lymíokinerl som utsondras från humana T-celler och som min vet spelar en betydelsefull roll vid rog- lering av inmmnsvar. Föreliggande uppfinning ar baserad pà 7 'wf i "“"**“"“*'*'“”'^*^^*.~'-fl~f-->':« dessa nya upptàckter. fw: www tmwf -w-al ._ _.. 460 852 10 15 20 25 av m” m _Uppfinningen förklaras närmare med hänvisning till rit- ningarna varpå fig 1-4 visar diagram belysande den mitogena' svarsbenägenheten av utgångscellínjen CEM-AGR och T-hybridcell- linjen (klon nr 24-A) enligt föreliggande uppfinning; och fig 5 och 6 visar diagram som belyser TCGF-aktivitet för T-hybridcell- linjen (klon nr 24-A) enligt föreliggande uppfinning.

Utgångscellinjen och hybridcellinjerna enligt uppfinningen kan odlas kontinuerligt. Med upprättandet av dessa cellinjer, speciellt hybridcellinjerna, möjliggöres _ “framställning in vitro av stora mängder av lösliga immunoreglerande faktorer, som utsöndras av humana T-celler, dvs lösliga faktorer, som för- medlar intercellulär reaktion vid immunsvar och att analysera kemiska och biologiska karakteristika hos dessa lösliga faktorer som ej har klartlagts fullständigt ännu, vilket bidrar i stor utsträckning till forskningen avseende klinisk användning och effekter av dessa faktorer. Dessutom tillhandahåller' upprättan- det av humana T-hybridcellinjer ett mycket användbart medel för analys av ytantigener på humana T-celler och av T-cell- receptorer för antigener, för undersökning av den humana T-ce1-- lens komponenter och för ccllulära och immunologiska studier avseende differentiering, förökning och aktivering av humana T-celler i sig. I Den nya utgángscellinjen enligt föreliggande uppfinning härstammar från en human T-leukemicellinje och kännetecknas därav att den uppvisar HGPRT-brist. Cytologíska och andra karakteristika för utgàngscellinjen är följande. (1) Morfologiska karakteristika.

Utgångscellerna uppvisar cirka 2-3 gånger diametern av normala humana perifera blod-T-celler och är nästan sfäriska. 10 _ v-n-f i., ffmfv-»gïaw._,,,ï,qí _Kärnan upptar en stor andel av cellen och en liten mängd proto- plasma iakttages. Protoplasma innefattar en del granÅ-IÉÛ. pseudopodiumliknande förlopp kan ibland finnas. (2) Antal kromosomer. ä Utgàngscellerna inkuberas i närvaro av colchicin i en koncentration av 0,1 pg/ml vid 37°C under tre timmar, Centrifu- geras, behandlas med 0,075-N ÜCl och fixeras på ett objektglas genom blandning av metanol och etanol (3:1). Antalet kärnkromo- somer räknas därefter med mikroskop med användning av en 1000 X oljeimmersionslins. Värdet för 100 celler i metafaser varierar ifrån 69 till S7 med ett medelvärde av 78 och finns angivet i tabell 1 nedan.

Tabell 1 I 1 1' 'âfišååsomer 69 711 ?1 72 73 74 75 i 76 77 Antal _ celler 1 s 4 4 V4 1 4 11 12 Antal kromosomer 78 79 80 81 S2 S3 S4 SS 86 8? Antal 1 ° Cfillèr 10 9 4 9 S TÜ 2 1 2 1 (3) Uttryckande av T-cellspecifik antigen.

Utgàngscellerna, 5 x 105 till antal, inkuberades med 100 ,ul av en monoklonal antikropp i en lämplig koncentration (0,1 mg/0,5 ml anti-Leu 1, anti-Leu ZA och anti-Leu 3A~antikroppar utspädda 100 gånger, 10 gånger respektive 10 gånger till 100 nl) vid~4°C under 30 minuter. De monoklonala antikropparna tillhandaè hölls från Becton-Dickinson Co., Sunnyvale, Ca, USA ( J. Exp.

Ned., 153, 310-325 (19S1)}. Cellerna tvättades därefter med ett MEN-medium (erhållet från Research Institute for Microbíal Diseases; Osaka University, Osaka, Japan) innehållande 5 3 PCS (fetalt kalvserum), bringades att reagera med FITC Cfluorescein- isotiocyanat)~konjugerat knnin~anti-mus-immunoglobulin (Miles- Yeda Ltd., Israel) och undersöktes därefter med avseende pa uttryckande av ett T-cellspecifikt-antigen genom indirekt 4L60 852 immunofluorescens. Här 200 av dessa celler kontrollerades var 10 to (n bn Un JU åtminstone 95 % positiva för anti-Leu P-och anti-Leu SA-anti- kroppar och upp till 1 % var positiva för anti-Leu ZA-antikropp. (4) Rosettbildning. V ' 200 utgångsceller kontrollerades mikroskopiskt vid 400 X med avseende på rosettbildning med EAC (röda fârblodsceller (E) behandlade med antierytrocyt-antikropp (A) och humant komple- ment (C)), med resultatet att upp till 1 % var positiva.

(S) Uttryckande av B-cellmarkering.

Ytimmunoglobulin (lg) analyserades med användning av FITC- konjugerad mus-antihumant immunoglobulin (Behring Werke AG, Marburg) genom direkt immunofluorescens. Upp till I % av cellerna var positiva. V Human HLA-DR-antigen (betecknas hädanefter "DR”) analyse- rades med användning av en monoklonal anti-DR-antikropp (till- handahållen genom Becton-Dickinson Co.) genom indirekt immuno- fluorescens. Upp till l'% av cellerna som analyserades var posi- tiva. ~ Uttryckšnde av humant B-cellspecífikt antigen (B-antigen) analyserades genom indirekt immunofluorescens med användning av en monoklonal anti-human B-cellantikropp erhàllen från en hybrídcellinje framställd från myelom PSUI (tillhandahàllen från -Elbert Einstein College of Medicine) och musmjältceller immuni- serade med en'human B-cellinje (CESS, tillhandahàllen från Dr..

Peter Ralph, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research,_ l New York, ETA) transformerad med ett virus (Epstein-Barr-virus) (se C. Kohler och C. Milstein, Nature, 356, 495, 1975 _ Upp till l % av cellerna var positiva. Antikroppen regarerar med B-celler eller linjerna därav men reagerar ej med T-celler eller linjerna därav. I .(6) HLA~fenotyp.

Utgángscellerna inkuberades med anti-HLA-serum (tillhanda- hållet från Prof. Sasazuku, Tokyo Medical and Dental University, Japan) vid 370C under 30 minuter, inkuberades därefter under oO minuter med kaninkomplement absorberat av utgángscellen enligt föreliggande uppfinning och kontrollerades därefter med avseende »pa överlevnad. HLA-fenotypen utgöres av A3, All, BS, B37 och BW I 2 . (7) Förökning.

Utgñngscellerna förökar si godtagbart i RPHlAloåÜ od- (1 b lingsmedium (Flow Laboratories, USA) innehållande S-azaguanin 10 IS h) U1 30 b! 'J1 4D fi7¿ 8552 ts-AG, ioo PM), 10 % Pcs, s X 1o'5n_z-merkaptoetanoi och 1 mn glutamin. (8) Förökningsbetingelser.

Generellt förökar sig utgângscellerna godtagbart vid en temperatur av 56-SSOC och ett pH av 7,2-7,3. Det är lämpligt att använda en inkuberingsanordning innefattande 5 % koldioxid och '95 % luft. (9) Kontinuerlig odling.

Utgångscellerna kan inkuberas kontinuerligt och under obe- gränsad tid. (10) Bevarande i frusen form.

Utgângscellerna kan bevaras i flytande kväve under en förlängd tidsperiod. \ (11) Beständighet moed 8-azaguanin.

Utgángscellerna är beständiga mot S+a:aguanín (100 pM) och dör i ett medium (HAT-medium) innehållande hypoxantin,_amino- opterin och tymidin. Detta indikerar att utgàngscellerna uppvisar HGPRT-brist. (12) Mitogensvarsbenägenhet. _ När l0-100 ng/ml av concanavalin A (Con Al och 1-10 i av växtlektin, fytohemagglutinin (PHA) sattes till mediet ínhiberas förökningen av utgånscellinjen i viss utsträckning. "Pokeweed"- ' mitogen (PWM) samt protein A (Pro A) ger ingen inverkan pá för- ökningen av linjen vid någon som helst koncentration.

Dessa karakteristika framgår av fig 1-4. 2 x 104 celler av föreliggande utgångscellinje odlades i närvaro:n'olika koncent- rationer av mitogener (fig I för Con A, fiš 2 för PHA, fig 3 för PWM och fig 4 för Pro A) under 60 timmar i_RPMI 1640-melíum inne- hållande 10 % PCS. 0,2¿uCï av SH-tvmidin (JH-TdRl sattes till mediet under de sista 12 timmarna av odlingen. Odlingarna skörda- des på glasfíberremsorv(Labo-Science Cell Harvester, Tokyo) ooh SH-TdR upptagningen i deoxiribonuklinsyrafraktion bestämdes genom vätskescintíllationsräkning_ I varje experiment användes kulturerna i trippelprover och medelrärdena (upp till 19 2 standardevíation) anges. I varâe diagram avsattes koncentrationen av mitogenen på abskissan och JH-TdR-värdet (C.P.M. X IOQQ) på ordinatan; Den ena linjen (---~«) betecknar resultatet som er- hölls med föreliggande utgångscellinje och den andra linjen (G---0) betecknar resultat med klen 24A (en klen av den humana T-hybridcellinjen enligt uppfinningen) som beskrives senare. 10 15 bl.

'J1 JO Ilöåüemêdiumï innehållande 10 % 8 humana T-leukexnvicellinjen enligt uppfinningn med llGPRT-j brist och uppvisande ovan angivna karakteristika härstammar exempelvis från humana T-leukemiceller (CCRF-CEM) (J. KAPLAN, T.C. SHOH3och W.D. PETERSON, Jr., J. Exp. Med. 139; 1070-1076, 1974) och kan erhållas genom odling av sådana celler i RPMI A FCS och S-azaguanin (S-AG] och därefter successiv överföring av dessa celler till sådana 'medier med ökade koncentrationer av 8-AG. Ner speciellt odlades cellerna i denna typ av medium innehållande exempelvis 2 NM S-AG under en första vecka och därefter i samma medium innehål- lande lo pM 8-AG under en vecka och därefter likartat i medier i följd med en tváfaldigt ökande koncentration av 8-AG. Slut- ligen erhålles en levande S-AG-resynent cellínje i ett medium innehållande 100 NM 8-AG. Erhållen cellinje förökar sig snabbt ' i mediet med l0O,uM 8-AG och kan odlas kontinuerligt i samma medium. Å _ Sålunda erhàllen cellínje uppvisar ovan angivna karakteris- tika, utgör en ny T-celïinje som ej har rapporterats tidigare, kan odlas permanent och kan bevaras genom frysning under nästan obegränsad tid.

Cellinjen med HG?RT-brist enligt föreliggande uppfinning kan odlas i olika näringsmedier som ar vàsentligen syntetiska men som kan innehålla en naturlig beståndsdel, såsom serum.

Exempel på användbara näringsmedier är RPM! lëlfl-medium (Flow .

Laboratories, USA) modifierat med PCS, hästserum eller ett serumliknande supplement och Dulbecco-medium modifierat med lscove-modifierat medium fritt från serum. Cellerna enligt upp- finningen som skall odlas på sådana medier kan lätt anpassas sä'att de förökar sig på olika medier som konventionellt an- vändes inom denna teknik, sàsom FCS-haltiga minimala essentiella Eagle-medier (MEN). För upprätthållande av utgàngscellerna enligt föreliggande uppfinning behöver sådana medier ej alltid inne- halla 8-AG men innehåller dock företrädesvis S-AG. Cellerna kan odlas i dessa medier under betingelser som vanligen användes för odling av konventionella celler. l allmänhet kan utgångs- cellerna föröka sig godtagbart vid cirka_3o-SSÛC varvid rärske- komponenten ersattes var tredje till var femte dag.

Fastän den ovannämnda utgangscellinjen ej acce för deponering av Fermentation Research lnstitute, Age.cy of w W ïfr š. í I I ííéa-f_íï_____ 10 15 20 pzs .S0 35 40 8552 aiizia 1 ett sidan: tillstànd att den är aiimänz aiiigängiig. '\øDessutom har ett prov av cellinjen deponerats hos American Type o* Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA den 30 juli 1981 och har givits ATCC-numret CRL sos1. ' D , - T-eellinjen enligt uppfidningen uppvisande HGPRT-brist-t kan användas såsom en utgångscellinje för sammansmältning med humana Tsceller. Förtarandet enligt uppfinningen innefattar såsom ' ett eventuellt steg sammansmältning av humana T-celler med denna utgångscellinje, varvid T=hybridcellinjen enligt uppfinningen erhålles.

De humana T-cellerna som kan användas för T-cellsamman- smältning är ej speciellt begränsade. Exempel pà användbara T- celler är sådana erhållna -frámperifert blod, benmärg, lymfonoder, mjälte, tonsiller, tymus, etc. Sådana T-celler kan isoleras och renas genom olika separationsmetoder, som är kända, exempel- vis konventionella fysikaliska metoder, kemiska metoder och vid- häftníngsmetoden till ytmembran och kan användas för cellsamman- smältning enligt uppfinningen. För uppnående av en förbättrad sammansmältningsverkningsgrad kan dessa T-celler stimuleras med_ olika mitogener före sammansmältning. Exempel på användbara mítogener är sådana uppvisande känslighet för T-celler, såsom concanavalin A (Con A, Sigma Chemical Co., St. LLouis, Missouri, USA), renat tuberkulín (PPD, tillhandahàllen av Dr. Takatsu, ,Institute"for Cancer Research, Osaka University Medical School, Osaka, Japan), Protein A (Pro A, Pharmacia Co., Sverige), fyto- hemagglutinin (PHA, Difco, Detroit, Mich., USA), "pokew80k"f mitogen (PWM, GIBCO Laboratories, USA), etc. T-cellerna som skall användas kan också aktiveras medelst blandad lymfocyt- kultur. I efterföljande exempel beskrives bildningen av humana T-celler och mitogenstimulerade T-celler närmare.

Sammansmältningsreaktionen mellan humana T-leukemiceller uppvisande HGPRT~brist och humana T-celler gcnomföres väsentë ligen pá samma sätt som det kända förfarandet för cellsamman- smältning i'närvaro av en sammansmältningsfrämjande substans i ett lämpligt medium. Virus, såsom Sendai-virus (HVJ) är lämpliga såsom sammansmültningsfrämjande substans men företrädesvis an- vändes nyligen utvecklad polyetylcnglykol UWGJ såsom främjande substans. Företrädesvis användes PEG med en medelmolekylvikt av cirka 1000 till cirka 6000. Det är lämpligt att mediet inne; häller sådan PEG i en koncentration av cirka 30 till cirka 60 % ' ä: ewwmsy-gøfrwawf--ç-smwfiwm-fsfefyåffsfgfie, 10 ttêdåkéåäáåym). Användbara odlingsmedier är MEN-medium såsom sådant 10 40 eller modifierat med Dulbecco-medium, RPNI 1640-medium och andra medier som vanligen användes för odling av celler. Om önskvärt kan mediet uppvisa dimetylsulfoxid eller ett liknande hjälpmedel' inneslutet däri för förbättrande av sammansmältningsverknings- graden. Proportionerna av utgångsceller enligt uppfinningen och humana T-celler som skall användas för sammansmältning är ej speciellt begränsade. I allmänhet kan antalet humana T-celler vara cirka 1 - cirka 10 gånger antalet utgångsceller. Företrädes- vis sammansmältes cellerna på exempelvis följande sätt. Specifi- serade mängder av utgângsceller och humana T-celler blandas .noggrant samman i mediet, blandningen centrifugeras och erhàllen övervätska förkastas. En lämplig mängd av en PEG-lösning upphet-A tad till 57°C blandas därefter med den återstående massan, varigenom cellsammansmältningsreaktion initieras. Med tillsatsen av ett lämpligt medium centrifugeras blandningen och övervätskan förkastas. Detta förfarande upprepas och de önskvärda sammansmälta cellerna bildas.

De önskvärda sammansmälta cellerna kan erhallas selektivt genom odling av erhállen blandning med ett konventionellt selektivt medium som medger förökning av endast de önskvärda hybridcellerna men som minimerar förökning av utgàngscellerna. (De humana T-cellerna är ovillkorligen inkapabla att förökas i det selektiva mediet.) Typiska sådana medier är exempelvis medium innehållande hypo- xantin, aminopterin och tymidin (HAT-medium). Mer speciellt framställes ett användbart exempel_palïU>mednn1genom tillsats av 4 x l0_7M aminopterin, 1 x 10°%M hypoxantin, 1,6 X 1O_5M tymidin och eventuellt 3 x 10'6M glycin till ett MEN- eller RPMI-1640-medium innehållande 10-20 l FCS. Cellerna odlas i HAT-mediet med användning av den konventionella begränsnings- spädníngsmetoden under en tidsperiod, vanligen från flera dagar till flera veckor, som är tillräcklig för att sådana .celler skall tillåtas dö (exempelvis icke sammansmälta celler, etc) som ej utgöres av de önskvärda hybridcellerna varigenom endast de önskvärda humana T-sammansmälta cellerna förökas selektivt. ' V De sammansmälta cellerna som erhålles sålunda uppvisar nya karakteristika distinkta från sådana hos utgångscellinjen ech humana T-celler med avseende pa karyotyp (antal nukleära kromosomer), fenotyp av cellytan, mitogensvarsbenägenhet, 10 “rn 4 m.“'~*f"'r'flï~flw--.»fl-=-fv-.f-.q e-w- f»- 1,1. lymfokinbíldningsförmåga, etc. Fastän de sammzansmältgrßcglcs-saz, kan förökas ytterligare kontinuerligt i ett lämpligt medium så- som det redan angivna föredrages det att de selektivt framställda cellerna odlas i HT-medium innehållande hypoxantín och tymídín dunder 1-2 veckor och därefter överföres till ett konventionellt nxedium. I belysande syfteanges karakteristika» för sammansmälta celler erhållna i efterföljande exempel i tabell 2 nedan och jänxföres med egenskaperna hos utgångscellínjen (dxfs humana T- leukemiceller uppvisande HGPRT-brist. som hädanefter betecknas "cEM-AGM) _ V' ' T¿be11|2 Hflnid- Human T-cell Frekvens Klon Knmmmosmmntàl cell ' ' nr' (genomsnitt) nr ' 1 Ostímulerad 1/12 Bil-A 79-97 PBL-T (S9) 2 Con A-stimulerad 1/24 ~ 36-B 79-100 Tonsíll-T “ V~ ' (S9) 3 Con A-stímulerad 1/8 SS-B 79-96 _ PBL-T (88) 4 PPD-stímulerad 1/8 41-Ill 75-93 PE-T A (86) 5 Osthnulerad 1/24 43-A 88-99 A V PBL-T _ (93) . 6 Pro Afstimulerad 1/24 1 V '47-A 81-98 , PBLJT (S9) 7 Pro A-stímulerad 4/12 40-VI 82-91 _ PBL-T ' (87) 8 Pro A-stimulerad S/24 44-C .S9-100 PBL-T ' (94) 9 Pro A-stímulerad 3/34 4?-B 87-100 PBL-r (95) 'Utgângs- ~ cent can-AGP* ' - - 69-8? G8) _10 15 460 852 Ibbrnb Uttryckande av T-cell- Rofint- Uttryckande av cell specifik antigen .hílàüng B-markering nr Lou 1 Lou ZA Leu SA E EAC lg UR 3-antigen 1 I ++. I - ++.> ._ ._ _ ' _ _ 2 ++ - ++ - - _ _ _ S ++ - ++ - - - - - 4 ++ - ++ - - - - - 5 ~Q++ - ++ - - - - - 6 -\|~+ - ++ - - - - - 7 No - nn. Nm .tf :en __ r :tm s nn - :en Ä xn :fn xml xn 9 ' ND - ND - ND ND ND ND Frekvensen angiven i tabell 2 erhålles från A/E, vari A är antalet brunnar innehållande etablerade hybridceller och B är an- talet brunnar som ympats med 2 x 103 sammansmälta celler omedel- bart efter sammansnältníny.

Antalet kromosomer,_uttryckande av T-cvllfipecífíkt antigen, ' rosettbíldníng och uttryckande av B-cellmarkcríng bestämmeš en- ligt samma metoder som redan uppgivíts för utgangscellinjen. - Symbolerna i ovanstående tabell har följande betydelse. ++ ..._ Åtminstone 95 l celler är posítíva.' ' - ..._ Upp till 1 % celler är positiva.

ND ..._ Ej genomfört. _ E .... Röda blodceller från fär. _ Nedan sammansfiülegmed hänvisning till tabell 3 olika karakterlstíka hos den humana T-hybrídcellinjen som innefattar samma punkter (1) till (13) som angivits för utgångscellernn samt punkt (13). (1) Morfologiska karakteristika.

Karakterístíka för linjen, vilka visserligen kan variera något från klon till klon, är väsentligen samma för utgångs- cellínjen. Linjen är något större än utgàngslínjen (1,2-!¿5 gånger så stor). Många av cellerna uppvisar flera morrhnrslik- nande utskott pà ytan. (2) Rnryotyp (antal nuklärn kromosomerš.

U: 10 15 u: '_11 40 13 l 4eo 852 Fastän kromosemtalet varierar fran klen till klen är ncde14 kromosomtalet i intervallet S6-Qi och är uppenbarligen större än för utgàngscellerna vilket är 78. (3) till (5) ldentiska med ntgângscellernn för större delen nr klonernn. (Ö) HLA-fenotyp.

Fenotyperna för utgângscellerna inkrtnges i varje klen. Åtminstone en NLA-fenotyp av de humana T-cellerna andra än dem för utgàngscellerna, ínkttnges i varje klen. (7) till (10) Ungefär samma sem för utgângscellerna i varje klen, (ll) Bestfindíghet mot 8-nzngunnin. l _ Ingen klon var beständíg mot S-nzngnnnín. \ (12) Mítogensvarsbenägenhet.

Hrbrídcellínjernn är jämförbara med eller starkare än ut- gångscellínjen med avseende på svursbenägenheten på Con A och PHA.

Fastän utgángscellínjen ej uppvisar någon srarshenägennet på FHM visade sig ett antal kloner vara srarsbenägnn på PWM. (15) Lymfekànhildningsbenägennet.

Vissa hybridkloner kan bilda lymíokíner, speciellt hjälp- faktorer. Exempelvis har klaner nr Zl-A, nr SS-E, etc förmåga att bilda T-cellríllräxtfaktor (TCGFä enligt mereden som be- -skrivas i efterföljande exempel. Klenernn är dessutom funktio- nellt stabila, års kan bilda TCGF genem kontinuerlig odlingn _ under en läng tid. _ A > Ovan angivna karnkteristíka indikerar att nya humana T- hybridçellínjer upyrättne enligt föreliggande uppfinning. Upp- rättandet av hybrídcellinjer bekräftas genom att erhållna klaner ej är resistenta mot 8-AG i motsats :ill urgàngscellinjen, upp- visar ett ökat antal nukleära kromesemer och uppvisar andra HLA- fenotyper än dem för utgångscellinjen. A De humana T-hybrídcelllinjerna enligt uppfinningen sen er- hållits sålunda kan om de förökas i ett konrenrienellr medium på konventionell sätt klonas varigenom linjerna kan sepnrerns till individuella lnmnoklmufln hybridcellínjer som var och en uppvisar lätmínstone en nnkleär kromoscm från àen humana T-cellen. Linjen kan färökas gmnm: kontinuerlig odling genom bibehållande nr karakreristika baserade pà generna örerfördn från den humana T-cellen øch kan förvaras í fruset tíllsrand rílket möjliggör undersökning ar humana T~eeller mer i detalj. klønernu inne» Vi? ï-frirfiv-rww *V-.f~-f~f'~-~-»,--V~vsv,§-¿,;-_;y- ~1-M~>-..-._w_-_,V_.fi~.-T_~,-,TW_,_,..~._,__1.W_,_ .?....~,.T,,....,-,. ' ' 460 ssz w fattar sådana som kan bildn_o]ikil>mfoknuny speciellt hjälpfnktorcr, såsom TCCF, som utsöndras från humana T-celler och som man vet spelar en betydelsefull roll vid reglering av ímmunsvnret, så att det genom upprättandet av sådana klaner är möjligt att fram- ställa storn mängder av lymfokíner in vitro lätt och snabbt och därigenom tillhandahålla nyà medel för diagnosen och behand- U? lingen av sjukdomar i ímmunsystemet.

En av de humana T-nybridcellinjernn upnfinïnde och isoleå rade enligt föreliggande uppfinning, nämligen klon nr 24-A be- 10 skrives närmare. Av följande exempel är det uypenbart att denna klon är en av hybridomernn erhållna genom sammansmältningen av utgàngscellinjen och humana T-celler erhållna från perifera blodlymiocyter och uppvisar oliká egenskaper som är gemensamma A , med ovan nämnda hybridcellinjer. Speciellt är det nukleära A la kromosomnntalet för klonen 79-9? (S3 i genomsnitt). Kloncn upp- visar HL.-fenotyper av A2, AW24, All, BS, BS, 33? och BW23 inklusive nen :w nrgnngseeninjen. <.-\§:. nu, ss, ss? och m-:zz och uppvisar ocksa sådana av den huáunn T-cellen (A2, AWIJ, BS och Blu) förutom B40. Den klonnde cellinjen uppvisar en svars- 20 benägenhet mot mitogener som framgår av íig I-4. Förökningen därav inhiberns sålunda nästan fullständigt vid I i PHA och inhiberas ocksa vid en ?KM-koncentration av 0,5-1 l.

~ Klonen kännetecknas dessutom av hög TCGF-aktivitet som framgår av följande exempel och fig 5 och o. - 25 När klanen enligt uppfinningen som beskrivits ovan odlas i lämpligt medium angivet ovan kan human T~celltillväxtfaktor (TCGP3 tillvnratngas från erhållcn örerrñtska. Följaktligen tillhandahåller föreliggande uppfinning också ett nytt förfa- rande för framställning av TCGF. Förfarandet beskrivas närmare 30 i efterföljande_exempel. g Eftersom den nya snmmnnsmälta cellinjen uppvisande förmåga att bilda TCGF ej accepterats för åeposítion hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology.

Japan, förvaras ett prov av linjen hos oss i ett tillstånd sådant at det är tillgängligt för allmänheten. Ett prov deponerndes l§Sl-0?-SH hos ATCC, 12391 Parklawn Drive, Rockrille, M3-.ZUS5l, Lu w USA och har tilldelats ATCC-numret HESHSI.

'Föreliggande uppfinning beskríres närmare med hänvisning ti l följande exempel avseende framställning nr utgàngscellinjen, 30 isolfríng av humana T-celler, sanmnïsnlltníng nr sådana :eller ,l . e. :W 'JT 10 40 *”. . 46o ss2 och testning av erhållna sammnnsmälta linjer.

Exemgel 1 , g Framställning av humana T-leukemícellcr med HGPRT-brist. i En human T-leukemicellinje CCRF-CEM erhàllen av Dr. Minowada, RPMI, Buffalo odlades i RPMI 1640~medium (Flow Laboratories) inne- hållande 10 % PCS (Centaurus, Biological Co., sats nr 527). 7 CCRF-CEN-cellerna uppsamlades i RPNl-1640+medium innehal- lande 2 mm S-AG och modifierades med 10 % PCS i en koncentration av 1 k 106 celler/ml. En 10-ml portion av uppshmmingni placerades i en odlingsbehàllare (Corning Glass Works, Corning, New York, USA) och hölls för inkubering i en inkuberingsanordníng vid 37°Ci under en vecka, varvid behàllarmivar placerad horisontellt under det att en blandning av 5 % koldioxid och 95 % luft passerade därigenom. överlevande celler tillvaratogs, uppslammades till en koncentration av 1 x 106 celler/ml i samma typ av medium innehål- lande S-AG i dubbla ovanstående koncentration, dvs 4 NM, och odlades på likartat sätt under en vecka. Cellerna som överlevde föregående odlingsförfarande odlades varje vecka med användning av färskt medium, varvid koncentrationen av S-AG ökades cirka tváfaldigt varje vecka (dvs 2->4-«:S >16 M»32 >S0»^>75 >100 pm) tills man slutligen erhöll överlevande celler i mediet inne- hållande 100 mm 8-AG. Den önskvärda S-AG-resistenta cellinjen _ erhölls sålunda efter cirka 8 veckor. Linjen betecknas "CEM-AGR"._Därefter växer linjen snabbt på RPMI-1640-medium inne- hållande S-AG i samma koncentration (100 pm) och modifierat med 10 i PCS och har sedan dess bibehàllits i samma medium genom kontinuerlig odling. Linjen uppvisar samma cytologiska och andra karakteristika som redan beskrivits.

Exempel 2 ' ~ Framställning och isolering av humana T-celler. (l) Perifera blod-T~celler. . _ En mängd av 50 ml hepariniserat blod tillvarataget från en vuxen frisk människa centrifugerades med användning av en lympocytseparationsvätska i densitetsgradient ("Ficoll-Paque", en produkt från Pharmacia Japan Co.,Ltd§, Japan) för isolering av 5 x 107 perífera blodlymfocyter. T-celler isoleras från lymfocyterna genom rosettbildning med neuraminidas-behandlade får erytrocyter (SRBC) (T.HIRANÖ, T.KURITANI, T.XlSHlMOTO och ixaxnamaunlx, Jammunoi.. 119, 1255-1241 (uran. ne perifer-a blod-T-cellerna som framställts sålunda betecknas "icke stimu- lerad PBL-T". 83%: stimulerad PBLUI” (1 x 100 celler/ml) stimulerades med ïO,ug/ml Con A, 25 mg/ml PPD eller TO ug/ml Pro A under 48 timmar för erhållande av stimulerade«T-celler som betecknas "Con A-sti- mulerad PBL-T", “PBD-stimulerad PBL-T" eller "Pro A-stimulerad 10 15 k) UI b! m 40 76 PBL-T". (2) T-celler från tonsilla palatína Tonsillen som avlägsnats från tonsilla palatina hos en patient med kroniskt tonsillit uppdelades i små fragment med an- vändning av MEN-medium innehållande 10 enheter/ml heparin och 4 Mg/ml Amphotericin¥B (Sankyo Co., Ltd., Japan) för erhållande av tonsillarceller. Cellerna centrífugerades medelst Ficoll-Paque- densitetsgradientmetoden för isolering av S x 108 tonsillarlymfo- cyter. Tonsillar-T-celler*(2 X 108) ísolerades därifrån pâ samma sätt som i (1) ovan genom rosettbildníng med ncuraminidasbehand- lade fàrerytrocyter. Cellerna (1 x 106 celler/ml HEM) stimulera- des med 10.ug/ml Con A under 48 timmar för erhållande av stimu- lerade tonsillarÅT-Celler som betecknas såsom "Con-A-stimulerad Tonsil-T". b (3) T-celler från pleural utgfutning Lymfocytceller separerades från en pleural utgjutning från en patient med tuberkulos. Mer speciellt tillvaratogs 100 ml pleural utgjutning från patienten genom toracentesmetoden, därefter centrifugerades detta vid ï500 rpm under 5 minuter, tvättades två gånger med MEN innehållande 10 enheter/ml heparin- och centrífugerades melest Fícol1-Paque-densitetsgradientmetoden för isolering av 3 x l08 lymfocyter från pleural utgjutníngt T-celler från pleural utgjutníng erhålls på samma sätt som i (1) ovan. Cellerna (1 x 106/ml) stimulerades med 25,ug/ml PPD under 48 timmar. Cellerna som erhölls sålunda betecknas "PPD-sti- mulerad PE-T".

Exemnel 3 Sammansmältning av utgàngsceller och humana T-celler, utväljande och kloning av de sammansnälta cellerna.

Utgångsceller CEM-AGR som hölls i ett tillstånd av livlig tillväxt genom ersättning av mediet IRPMI 1640 + 10 $ FCS + 100 _uM 8-AG) dagligen under tre dagar före sammansmältning.

CEM-AGR (1 x 107-celler) och varje typ av humana T-celler (2 x 107) som erhölls i exempel 2 användes för sammansmältníng.

Cellerna tvättades tre gånger med PCS-fritt MEN-medium som hölls vid STCC, blandades därefter noggrant samman i ett SQ-ml konískt \1o . 15 460 852 rör och centrifugerades vid 1000 rpm under 20 'nuter. Pelletterna av celler som separerats från övervätskan skakades lätt och 0,3 ml 45 %vPEG~6000 (Koch-Light Co.; England) upphettat till 37°C'till¥ fördes pelletterna. Pelletterna skakades därefter noggrant under 30 sekunder och fick därefter sta vid 37°C under 6 minuter i en inkuberingsnaordning innehâlhnfle S % koldioxid och 95 % luft.

FCS-fritt MEN (upphettat till 379C) placerades i inkuberingsan- fordningefl i en kombinerad mängd av 12 ml med en hastighet av blandningen. erhållen blandning centrifugerades vid 800 rpm under 10 minuter och övervätskan avlägsnades, RPMI 1640-medium innehållande 20 % PCS och upphettat till 37°C tillsattes försik- tigt .för reglering av koncentrationen av CEN~AGR till 2 X 105 celler/ml. En mängd av 1 ml av blandningen placerades i var och en av 50 brunnar, med en diameter av 2 cm, pà en mikrokultur-u platta (Linbro scientific, usa). efter 24 timmar förkastades hälften av övervätskan och 1 ml HAT-medium (RPNI 1040 + 20 b _ FCS-medium innehållande 1 x 10_4M hypoxantin (Sigma Chemical Co., ° ml/min. En mängd av 25 ml MEN tillsattes dessutomfsnabbt till USA) 4 x 10"M aminopterin (Sigma Chemical Co., USA) och 1,6 x _ L V 10 SM tymidin (Sigma Chemical Cou, USA)} placerades i brunnen.

Samma förfarande upprepades varannan dag för odling av cellerna i en inkubationsanordning i närvaro av 5 % koldioxídgas vid - 37°C under 2-4 veckor. De odlade cellinjerna överfördes därefter till HT-medium ej innehållande aminonterin (A) (motsvarande - HAT-medium fritt från A), ínkuberades under ytterligare en vecka, och överfördes därefter till ett HAT-fritt medium av RPMI 1640 + 10 ° PCS (konventionellt medium) och klonades på konventionellt 0 -sätt. Mer speciellt späddes odlingen till en hybrídmfld/ml i ett 'konventionellt medium och placerades i brunnar på en míkroplatta' A(Falcon, USA) i en mängd av 0,2 ml/brunn. Hälften av övervätskan förkastades från varje brunn varannan till var tredje dag och “ett färskt konventionellt odlingsmedium upphettat till 3?°C hälldes ned i brunnen för ytterligare inkubering, vilket gav upphov till monokloner av hybridcellinjerna. Den typiska av sådana erhållna kloner, dvs humana T-hybridcellinjer, uppvisar karakteristika angivna i föregående tabell 2. išxempel 4 'Framställning av odlingsövervätska från humana T~hybrid- m. celler M(l) Üvervätska erhållen utan stimulering\ ffiïïzmvflYWY-ywg-rvrzrsww-w-pw-vf-fmflvy-ww-P-f-'w,_t.,. ., .,.-.- _ -. _ _ . 10 40 Celler av hybridklonen som erhållits i exempel 3, nämligen nr 24-A, justerades till en koncentration av 1 x 105 celler/ml inneslutet i RPMI ¥64O + 10 % FCS-medium, placerades därefter i brunnar, 2 cm i diameter, på en odlíngsplatta (Línbro Scientific, USA) och odlades i en inkuberíngsanordning i närvaro av 5 %_ koldioxid vid 5700 under 2 dagar. Kulturen centrifugerades vid SOOQ rpm under 10 minuter och överrätskan tillvaratogs, filtre- rades med ett O,45quM míllíporfilter för sterilisering och kontrollerades med avseende på lymfokinaktivitet. (2) Kon A-stímulerad övervätska ~ En-övervätska framställdes pà samma sätt som ovanstående metod (1) förutom att l M8/ml av Con A sattes till samma medium som använts i (3) ovan. Cvervätskan undersöktes med avseende pà lymfokinaktivitet. _ (5) PHA-stimulerad övervätska Koncentrationen av hybridklonen nr 38-B-celler erhållna i exerpel 3 justerades tilll] X 103 celler/ml vid användning av RM?I 1640 + 10 2 FSC + 0,1 l PHA. En odlingsörervätska erhölls pa samma sätt som i (1) ovan. (4) Makroíagstimulcrad över'ätska Perífera blodlymfocyter erhållna på samma sätt som i exempel 2-(1) infordes i en Petri-skal och cellerna som ej häl- tade vid skålen-trättades bort. Aterstàende celler som häftar vid skålen lösgjordes genom pipettering med BBSS (Hank's balan- ;“ serade saltlösning)/0,2 %'EDTA (en produkt från Sigma, USA) och ' användes såsom humana makrofager.

En makrofagstimulerad odlingsörervätska eflfiüls på samma sätt som i (SJ ovan förutom att de humana makrofagerna sattes ¿= 5 celler/m1. A till mediet i en koncentration av 0,5 x 10 Exemgel 5 Analys av lymfokümktivitet av odlingsövervätskan från humana T-hybridcellinjer. ' i .Odlingsövervätskorna framställda i exempel 4 testades med avseende pà lymfokinaktivítet med följande metoder. (Ä) Test 1 med avseende på TCGF-aktivitet av odlingsörer~ vätskan från klon nr 24-A.* Tymocyter erhölls frán 5- till o-veckor gamla (šhizuoka Agrucultural Cooperatire Association for Laboratory Animals, Japan), skars till små fragment, trättades två gánge_ BALB/C~möss 1 . med MEN och uppslammades i RPMI 1043-medium innehållande rd å 10 15 Lu '1 40 4650 19. 8552 PCS för erhållande av en cellsuspension uppvisande en koncentra- tion av 1 X lüoiceller/ml. Övervätskan från klen nr 24-A erhallen i exempel 4-(1) eller (2) sattes till en 0,1-ml portion av upp-' slamningen (1 x 105 celler) och blandningen placerades i en 0,2-ml flatbottnad mikroplatta (Falcon). BH-tymidin (°H-Tdk), 0,S3uCi/ brunn, sattes till blandningen under de sista 0 timmarna och Vtymocyterna inkuberades i närvaro av 2 pg/ml Con A för stimule- ring. På dag 3 kontrollerades kulturen med avseende på 3H-TdR-upp- tagning. Kulturövervätskan från CEM-AGR, dvs utšångscellinjen, testades likartat. Resultaten anges i lig 5, vari 3H-TdR-upptag- níngsvärdet (C.P.N. x lO_°) är avsatt såsom ordinatan. Vid A in- dikeras resultatet som uppnåtts utan användning av någon kultur~- övervätska, vid B resultatet för övervätskan från exempel 4-(1) och resultatet för en övervätska från CEM~AGR som erhållits på likartat sätt (den blanka stapeln representerar den förra, den streckade stapeln den senare, på samma sätt som i det följande), och resultatet från cen-AGR av endast 1_ug/ vid C resultat för överrätskan från exempel 4-(2) frán en örervätska som erhållits pá likartat sätt och vid D resultatet som erhållits med användning ml Con A i stället för kulturöverrätskan. Resultaten (A) till (D) indikeras alla uttryckta såsom medelvärden 3 standarddeviationen erhàllen genom upprepning av samma test 5 gånger. Fig 5 visar. att kulturövervätskor från klon nr 24-A (icke streckad B och C) inducerar signifikant förökning av mustymocyter stimulerade med- Con A och att denna aktivitet är speciellt hög för fallet C_som uppnåtts med övervätskan framställd genom stimulering av klen nr 24-A med Con A. Det framgår att för fallet CEM-AGR ger varken övervätskan framställd utan stimulering eller övervätskan fram- ställd med stimulering med Con A någon T-celltillväxtfaktor. (23 Test 3 med avseende på TCGF-aktivitet av kulturörer- vätskan från klon nr 34-A.

En S0~ml portion av övervätskan erhâllen i exempel 4-(lä koncentrerades och fick därefter passera genom en Sqnmdek G-l00- kolonn [Pharmacia, Sverige) för erhållande av en fraktion med en molekylvikt av cirka 13006 till cirka ZGGÛO; som koncentrerades till 5 ml på Amicon YM-S-membran (Amicon Corporation, Lexington, Mass) för framställning av halvrenad ëvervätska. likartat fran- ställdes en halvrenad övervätska från utgàngscellinjen CEM-AC En TCGF-beroende human cytotoxisk T-cellinje íramstäšïàes medelst MLC (blandad lymíocytkulturl-reaktion_mellan normala uawu..«.-.,ult.am.....~l mastur- ... .se §'4eo ss2i[; humana perifera,blod-T-celler och mitomycin-behandlad CESS (humana B-celler transformercde med EB-virus och erhållna från Dr. Peter Ralph, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New Yor, USA) och erhållen kultur inkuberades under 16 veckor 5 ii TCGF (ratt TCGF erhållet genom odling av 1 X 106 humana ton- sillarlymfocyter i närvaro av 0,1 2 PHA under 2 dagar och sepa- ration av övervätskan för användning).

Den cytotoxiska cellinjen (5 x 103) odlades i närvaro av den halvrenade övervätskan under 24 timmar (i en C0,-inkuberings- 10 \ anordning med_användning av RPMI lo40 + 10 % FCS medium vid 37°C) och 0,5;u Ci JH-TdR pulserades under 5-8 timmar. Den halvrenade r övervätskan spädes i serie för räkning av JH-TdR-upptagningen J för bestämning av TCGF-aktiviteten. Resultaten är visade i fig 6, vari spädningen av övervätskan är avsatt pa abskissan, var- vid 1 är den ursprungliga koncentrationen av övervätskan som _..

'Jl skall spädas och O är en kontroll vari ingen övervätska användes; Det streckade värdet representerar den halvrenade övervätskan som först framställts och det icke streckade värdet den halvre- R " . .

. °H-TcR-upptagningstalet (C.P.M. nade övervätskan från CEM-AG 20 x 10-J) är avsatt pa ordinatan. Alla de visade resultaten utgör medelvärdet É standarddeviation erhallen för trippelodlingar.

Fig 6 visar att den halvrenade fraktionen framställd från _ kulturövervätskan från klon nr 24-A enligt uppfinningen och upp- visande en molekylvikt av 13000 till 20000 bibehåller förökning ¿ 2: av den TCGF-beroende humana cytotoxiska T-cellinjen och att V I aktiviteten är beroende av koncentrationen av den lösliga faktorn.

Det framgår också att fraktionen erhàllen från utgàngscellinjen CEM-AGR och ungefär lika med ovanstående fraktioner med avseende på molekylvikt ej uppvisar någon tillväxtaktivitet vid någon 50 koncentration.

V (3) Test med avseende på TCGF-aktivitet hos kulturöver- vätskan från klen nr 38-B.

Odlingsövervätskorna erhållna i exempel 4-(5) och (4) testades med avseende på TCGF-aktivitet på samma sätt som i (2) ovan med användning av ett testsvstem med utnyttjande av den TCGF-beroende cytotoxiska T-cellínjen. Resultaten finns sammanställda nedan i tabell 3, vari grupperna A-H har följande L/l Un betydelse.

A: Kontrollgrupp utan supplement. ¿Ü ' B: Grupp med tillsats av övervätskan erhällen från -exempel 4-(4).

LO 15 20 21 _ 46Û 352 Grupp med tillsats av kulturövervätsknn från utgångs- C: cellen CEM-AGR erhållen på samma sätt som i exempel 4-(4).

D: Grupp med tillsats av övervätskan erhållen i exempel 1-(5). A E: Grupp med tillsats av kulturövervätskan från utgångs- cellen CEN~AGR erhållen pá samma sätt som i exempel E 4-(5). A ^ f F: Grupp med tillsats av humana makroflager uppvisande en densitet av 0,5 x 105 celler/ml och PHA (0,1 %); G: Grupp med tillsats av PHA (0,1 %). “ H: Grupp med tillsats av rått TCGF (0,5 enhet) erhàllen genom cdling av humana tonsillymfocyter (1 x 106 celler/ ml) i närvaro av 0,1A$ PHÅ under två dagar. (TCGF-aktí~ viteten från 1 x 106 PHA-stimulerade celler definieras» sàsom 1 enhet av TCGF).

I3b@11_§ Grupp JH-TdR-upptagning (cpm) IIICÜWHITJÜÛW? 1956 ï sss 5151 ï 1os4 2291 f ses 2170 i oas L _ 1844 i 698 1995 ï 1098 711 I 14 " - 4214 1 3": .t Tabell S visar TCGF-aktiviteten för kulturövervätskan er- hållen från den humana makrofagstimulerade klonen nr 38-B enligt föreliggande uppfinning. Overvätskan från utgângscellinjen CEN-AGR uppvisar ej någon TCGF-aktivet. ,. _-,..,-._r_~_....u._-f_w......».w.»f-

Claims (7)

460 852 Eatentkrav

1. Cellinje, k ä n n e t e c k n~a d_ därav, att den »utgöres av a) en human T-leukemicellinje med hypoxantin-gua- nin-fosforibosyl-transferae samma identifieringskarakteristika som ATCC nr CRL-8081 har och som uppvisar förmåga till sammansmältning med normala humana T-celler under bildning av stabila hybridcellinjer; eller av bïdgn lvmfokinbildande hybridcellinje som är bildad genom sammansmältning av de humana T-laukemice1lerna_uppvisan- de HGPRT-brist fran a) med normala humana T-cellerÄ

2. Cellinje enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d därav, att den utgöres av hybridcellinjen b) som kan bilda en lymfokin.

3. Cellinje enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att hybridcellinjen kan bilda en hjalpfaktor.

4. Cellinje enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d därav, att hybridcellinjen kan bilda T-celltillväxtfaktor,

5. S. Cellinje enligt krav 2, h ä n n e t e c k n a d därav, att hybridcellinjen uppvisar identifieringskarakteris- tika för ATCC nr HB8082.

6. Pörfarande för framställning av en cellinje enligt krav 1, k ä n nte t e c k n a t därav, att a) för framställ- ning av en human T-leukemicellinje med HGPRT-brist, som uppvi- sar väsentligen samma identifieringskarakteristika som ATCC nr CRL-8081, odlas sadana humana T-leukemiceller, som betecknas CCR?-CEM i ett medium innehållande B~azaguanin; och att even-, tuellt b) de i steg a) erhållna humana leukemi-T-cellerna med HGPRT~brist, som uppvisar väsentligen samma identifieringska- rakteristika som ATCC nr CRL-8081, sammansmältes med normala humana T~celler med användning av en sammansmältningsfrämjande substans, varefter hybriceller, som erhållits vid samman- smältningen, förökas selektivt i ett selektivt medium, som innehåller hypoxantin, aminopterin och tymidin, och klonas för erhållande av en hybridcellinje uppvisande förmåga att bilda ett lymfokin. M

7. Användning av en lymfokinbildande human T-hybrid- cellinje enligt krav 1, som är bildad genom sammansmältning av /'*._ normala human-ua T-cellezf och luumana laukeznil-T-celler med 8HêiÅT» -brist och uppvisande väsentligen samma identifieringskarakte- ristika som ATCC nr CRL-8081, för framställning av ett lymío- kin genom odling av hybridcellinjen under sådana betingelser som medger lymfokinbildning.