DE3222072C2 - Humane T-Zell-Linien und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Humane T-Zell-Linien und Verfahren zu ihrer Herstellung

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine humane parentale T-Zell-Linie, die mit normalen humanen T-Zellen fusionieren kann, und Hybridzell-Linien, die durch Fusion der humanen parentalen T-Zellen und der humanen T-Zellen hergestellt werden und die Lymphokine bilden können. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Herstellung solcher humaner T-Zell-Linien und ein Verfahren zur Herstellung von Lymphokinen aus solchen Hybridzell-Linien.

Description

(1) Morphologische Eigenschaften
Die parentalen Zellen besitzen etwa den 2- bis 3fachen Durchmesser normaler humaner peripherer Blut-T-. Zellen und sind fast kugelförmig. Der Nukleus nimmt einen großen Teil der Zelle ein, und eine geringe Menge an Protoplasma wird beobachtet Das Protoplasma enthält einige Körnchen (granules). Ein pseudopodiumähnliches Verfahren kann gelegentlich festgestellt werden.
(2) Anzahl der Chromosomen
Die parentalen Zellen wenden in Anwesenheit von Colchizin in einer Konzentration von 0,1 μg/mI bei 37° C während 3 Stunden inkubiert, zentrifugiert, mit 0,075 M KCl behandelt und auf einen Objektträger mit einem
Gemisch aus Methanol und Ethanol (3:1) fixiert Die Zahl der nuklearen Chromosomen wird danach mikroskopisch unter Verwendung einer 1 OOOX-Ölimmersionslinse gezählt Die Zellzahl für 100 Zellen in den Metaphasen liegt im Bereich von 69 bis 87 mit einem Durchschnitt von 78 und ist in der folgenden Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Anzahl der 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84
Chromosomen
Anzahl der Zellen 1344444 11 12 10 9495 10 2
> (3) Expression des T-zellen-spezifischen Antigens
Die parentalen Zellen, 5xlO5 an der Zahl, werden mit 100 μΐ eines monoclonalen Antikörpers in einer geeigneten Konzentration (0,lmg/0,5ml anti-Leu-1-, anti-Leu-2A- und anti-Leu-3A-Antikörper, jeweils lOOfach, lOfach bzw. lOfach verdünnt auf 100 μΐ) bei 4°C während 30 Minuten inkubiert Die monoclonalen Antikörper werden von Becton-Dickinson Co, Sunnyvale, Ca. USA (J. Exp. M ed., 153,310—323 [1981]) erhalten. Die Zellen werden danach mit einem MEM-Medium (abgeleitet von dem engl. Ausdruck »minimum essential Eagle media«, welches vom Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, Osaka, Japan erhalten wurde), das 5% FCS (fötales Kalbsserum, vgl. J. Immunol. Bd. 119, No. 4,1977 Seite 1236 linke Spalte) enthält gewaschen, mit FITC (Fluoresceinisothiocyanat)-konjugiertem Kaninchen-Antimaus-Immunoglobulin (Miles Yeda Ltd., Israel) umgesetzt und dann auf die Expression von T-zellenspezifischem Antigen durch indirekte Immunofluoreszenz geprüft Wenn 200 dieser Zellen geprüft werden, sind mindestens 95% positiv für anti-Leu-1- und anti-Leu-3A-Antikörper, und bis zu 1 % sind positiv für anti-Leu-2A-Antikörper.
(4) Rosettenbildung
Zweihundert parentale Zellen werden mikroskopisch bei der 400fachen Vergrößerung für die Rosettenbildung mit EAC (roten Blutzellen (E) von Schafen, die mit Antierythrozytantikörper (a) und humanem Komplement (C) behandelt worden sind) untersucht, mit dem Ergebnis, daß bis zu 1 °/o positiv sind.
(5) Expression von B-Zellen-Marker (Zellenkennzeichen)
Das Oberflächenimmunoglobulin (Ig) wird unter Verwendung von FITC-konjugiertem Maus-Antihumanimmunoglobulin (Behring Werke AG, Marburg) durch direkte Immunofluoreszenz analysiert. Bis zu 1 % der Zellen sind positiv.
Humanes HLA-DR-Antigen (welches im folgenden als »DR« bezeichnet wird) wird unter Verwendung von monoclonalem anti-DR-Antikörper (der von Becton Dickinson Co. bezogen wird) durch indirekte Immunofluoreszenz geprüft 3is zu 1% der analysierten Zellen sind positiv.
Die Expression des humanen B-zellenspezifischen Antigens (B-Antigen) wird durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung von monoclonalem antihumanem B-Zellen-Antikörper, der aus einer Hybridzell-Linie erhalten wurde, die aus Myeloma P3Ui (erhalten vom Albert Einstein College of Medicine) und Mäusemilzzellen hergestellt wurde und mit einer humanen B-Zell-Linie (CESS, erhalten von Dr. Peter Ralph vom Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, New York, USA) immunisiert wurde und mit einem Virus (Epstein-Barr-Virus) transformiert wurde (vgl. G. Kohler und C. Milstein, Nature, 256,495,1975), analysiert. Bis zu 1 % der Zellen sind positiv. Der Antikörper reagiert mit den B-Zellen oder den Linien davon, reagiert jedoch nicht mit den T-Zellen oder den Linien davon.
(6) HLA-Phenotyp
Die parentalen Zellen werden mit anti-HLA-Serum (erhalten von Prof. Sasazuki der Tokyo Medical and Dental University, Japan) bei 37° C während 30 Minuten inkubiert. Danach wird während 60 Minuten mit Kaninchenkomplement, adsorbiert an der erfindungsgemäßen parentalen Zelle, inkubiert, und dann wird die Überlebensrate kontrolliert. Der HLA-Phenotyp ist A2, Al 1, B8, B37 und Bw 22.
(7) Wachstum
Die parentalen Zellen wachsen zufriedenstellend in RPMI-1640-Kulturmedium (Flow Laboratories, USA vgl. J. Immunol. Bd. 119, No. 4, 1977 Seite 1236, linke Spalte), welches 8-Azaguanin (8-AG, 100 μΜ), 10% FCS, 5 χ 10~5 M 2-Mercaptoethanol und 1 mM Glutamin enthält.
(8) Wachstumsbedingungen
Die parentalen Zellen wachsen im allgemeinen zufriedenstellend bei einer Temperatur von 36 bis 38° C und einem pH-Wert von 7,2 bis 7,3. Es ist sinnvoll, einen Inkubator, welcher 5% Kohlendioxid und 95% Luft enthält, zu verwenden.
(9) Kontinuierliche Kultur
Die parentalen Zellen können kontinuierlich und unbeschränkt inkubiert werden.
(10) Konservierung in gefrorener Form
Die parentalen Zellen können in flüssigem Stickstoff über sehr lange Zeit konserviert und gelagert werden.
(11) Resistenz gegenüber 8-Azaguanin
Die parentalen Zellen sind gegenüber 8-Azaguanin (100 μΜ) resistent und sterben in einem Medium (HAT-Medium), welches Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält. Dies zeigt, daß die parentalen Zellen defizient an HGPRT sind.
(12) Mitogenansprechbereitschaft
Wenn 10 bis 100 μg/ml Concanavalin A (Con A) und 1 bis 10% Pflanzenlectin, Phytohemagglutinin (PHA) zu dem Medium zugegeben werden, wird das Wachstum der parentalen Zeil-Linie in gewissem Ausmaß inhibiert. Pokeweedmitogen (PWM), wie auch Protein A (Pro A) bewirken keinen Einfluß auf das Wachstum der Linie bei beliebigen Konzentrationen.
In den Fig. 1 bis 4 sind diese Eigenschaften dargestellt. 2χ 104 Zellen der erfindungsgemäßen parentalen Zeil-Linie werden in Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Mitogenen (F i g. 1 für Con A, F i g. 2 für PHA, Fig.3 für PWM und Fig.4 für Pro A) während 60 Stunden in einem RPMI-1640-Medium, welches 10% FCS enthält gezüchtet. 0,2 μα 3H-Thymidin (3H-TdR) wird zu dem Medium während der letzten 12 Stunden der Züchtung zugegeben. Die Kulturen werden auf Glasfaserstreifen geerntet, und die 3H-TdR-Aufnahme in Deoxyribonucleinsäurefraktion wird durch Flüssigkeitsszintillationszählung bestimmt. Bei jedem Versuch werden die Kulturen dreifach angesetzt, und die mittleren Werte (bis zu 10% in S. D.) werden angegeben. In jeder graphischen Darstellung ist die Konzentration des Mitogens als Abszisse aufgetragen und die 3H-TdR-Zählung (C.P.M. χ 10"5) als Ordinate. Die eine Linie (·——·) stellt das Ergebnis dar, das man mit der erfindungsgemäßen
parentalen Zeil-Linie erhält, und die andere Linie (· ·) stellt das Ergebnis mit Clon 24A (ein Clon der
erfindungsgemäßen humanen T- Hybridzell- Linie), dar, wobei eine Erläuterung folgt.
Die erfindungsgemäße HGPRT-defiziente humane T-leukämische Zeil-Linie, die die zuvor erwähnten Eigenschaften aufweist leitet sich beispielsweise von humanen T-Ieukämischen Zellen (CCRF-CEM) ab (J. Kaplan, T. C. Shope und W. D. Peterson, jun., J. Exp. Med. 139,1070—1076,1974) und kann erhalten werden, indem man solche Zellen in RPMI-1640-Medium, welches 10% FCS und 8-Azaguanin (8-AG) enthält, züchtet, und dann diese Zelle auf solche Medien transferiert, die erhöhte Konzentrationen an 8-AG aufweisen. Genauer gesagt, werden die Zellen in Medien dieser Art gezüchtet, welche beispielsweise 2 μΜ 8-AG für eine Woche zuerst enthalten, dann wird das gleiche Medium, welches 16 μΜ 8-AG enthält während einer Woche verwendet, und anschließend werden ähnliche Medien verwendet, wobei die Konzentration an 8-AG 2fach aufeinanderfolgend erhöht wird. Schließlich wird eine 8-AG-resistente Zeil-Linie lebend in einem Medium erhalten, welches 100 μΜ 8-AG enthält Die entstehende Zeil-Linie wächst stark in einem Medium mit 100 μΜ 8-AG und kann kontinuierlich in dem gleichen Medium gezüchtet werden.
Die so erhaltene Linie, die die zuvor erwähnten Eigenschaften aufweist, ist eine neue T-Zell-Linie, die zuvor nicht beschrieben wurde und die permanent gezüchtet werden kann und nach dem Gefrieren fast unbegrenzt gelagert und konserviert werden kann.
Die HGPRT-defiziente erfindungsgemäße Zeil-Linie kann in verschiedenen Nährmedien, die im wesentlichen synthetisch sind, die aber natürliche Bestandteile, wie Serum, enthalten können, gezüchtet werden. Beispiele nützlicher Nährmedien sind RPMI-1640-Medium, modifiziert mit FCS, Pferdeserum oder ein serumähnliches Supplement (Ergänzung) und Dulbecco-Medien, welches mit Iscovemodifiziertem Medium, das frei von Serum ist modifiziert wurde. Die erfindungsgemäßen Zellen können auf solchen Medien gezüchtet werden, und sie können leicht so angepaßt werden, daß sie auf verschiedenen Medien, die im allgemeinen auf diesem Gebiet verwendet werden, wie FCS enthaltendem Minimum-im-wesentlichen-Eagle-Medium (MEM), gezüchtet werden können. Zur Erhaltung der erfindungsgemäßen parentalen Zellen müssen solche Medien nicht immer 8-AG enthalten, sie enthalten jedoch bevorzugt 8-AG. Die Zelle kann in diesen Medien und bei solchen Bedingungen gezüchtet werden, die im allgemeinen für die Züchtung normaler Zellen verwendet werden. Im allgemeinen können die parentalen Zellen zufriedenstellend bei 36 bis 38° C gezüchtet werden, wobei die flüssige Komponente alle 3 bis 5 Tage ersetzt wird.
Obgleich die zuvor erwähnte parentale Zeil-Linie vom Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan nicht akzeptiert wurde, wurde sie von den Anmeldern die ganze Zeit über in solchem Zustand konserviert und gehalten, daß-lie für die Öffentlichkeit zugänglich ist Weiterhin wurde eine Probe der Zeil-Linie bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA am 30. Juli 1981 hinterlegt und hat die Hinterlegungsnummer ATCC CRL 8081 erhalten.
Die HGPRT-defiziente T-Zell-Linie gemäß der Erfindung kann als parentale Zeil-Linie für die Fusion mit humanen T-Zellen verwendet werden.
Beispiel
Herstellung von HGPRT-defizienten humanen T-leukämischen Zellen
Humane T-leukämische Zeil-Linie CCRF-CEM, erhalten von Dr. Minowada, RPMI, Buffalo wird in RPMI-1640-Medium (Flow Laboratories), welches 10% FCS (Centaurus, Biological Co., Lot Nr. 527) enthält, gezüchtet.
Die CCRF-CEM-Zellen werden in RPMI-1640-Medium, welches 2 μΜ 8-AG enthält und mit 10% FCS in einer Konzentration von 1 χ 106 Zellen/ml modifiziert ist, suspendiert. Ein 10-ml-Teil der Suspension wird in eine Kulturflasche gegeben und für die Inkubation in einen Inkubator bei 37°C während einer Woche gestellt. Die Flasche wird horizontal hingelegt, während ein Gemisch aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft durch den Inkubator geleitet wird. Die überlebenden Zellen werden gesammelt, in einer Konzentration von 1 χ ΙΟ6 Zellen/ml in der gleichen Art von Medium, welches 8.-AG in der zweifachen obigen Konzentration, d. h. 4 μΜ, enthält, suspendiert und auf ähnliche Weise während einer Woche gezüchtet. Die Zellen, die das vorerwähnte Kulturverfahren überleben, werden jede Woche unter Verwendung von frischem Medium gezüchtet, wobei die Konzentration von 8-AG ungefähr zweifach jede Woche
(d.h.2 —4 — 8— 16 — 32->50 — 75—ΙΟΟμΜ)
erhöht wird und wobei man schließlich überlebende Zellen in dem Medium, welches 100 μΜ 8-AG enthält, erhält. Die gewünschte 8-AG-resistente Zeil-Linie wird in acht Wochen erhalten. Die Linie wird als »CEM-AG®« bezeichnet. Die Linie wächst danach auf einem RPMI-1640-Medium, das 8-AG in der gleichen Konzentration (100 μΜ) enthält und mit 10% FCS modifiziert ist, lebhaft und wurde seitdem im gleichen Medium durch kontinuierliche Kultur gehalten. Die Linie besitzt die gleichen zytologischen und andere Eigenschaften, wie sie bereits beschrieben wurden.
25
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

Patentansprüche:
1. Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase-(HGPRT)-arme humane T-leukämische Zeil-Linie.
2. Verfahren zur Herstellung der Zeil-Linie gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man humane T-leukämische Zellen in einem 8-Azaguanin enthaltenden Medium züchtet.
ίο Die Erfindung betrifft eine hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase-(HGPRT)-arme humane T-leukämische Zeil-Linie. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung dieser Zeil-Linie, gemäß dem humane T-leukämische Zellen in einem 8-Azaguanin enthaltenden Medium gezüchtet werden.
Lymphozyten, die im humanen Immunsystem auftreten, werden im allgemeinen in T-Zellen, nämlich sich von Thymus ableitenden Zellen, und in B-Zellen, nämlich sich vom Knochenmark ableitenden Zellen, klassifiziert. Es ist bekannt, daß die B-Zellen Antikörper absondern. Es wurde eine Technik entwickelt, um monoclonale Antikörper aus B-Zellenhybridomen herzustellen, wobei diese durch Zell-Hybridisierung von Antikörper erzeugenden B-Zellen und Myeloma-Zellen, die als psrentale Zellen dienen, hergestellt wurden (vgl. »Rinsho Kagaku [Clinical Science]«, Bd. 16,Nr.9,1103-1114[198O]).
T-Zellen spielen eine wesentliche Rolle bei der Regulierung der Immunantwort. Obgleich viele ihrer Eigenschäften noch untersucht werden müssen, ist es bekannt, daß T-Zellen viele lösliche immunoregulatorische Faktoren (Lymphokine) abscheiden, wie einen Faktor, der die Antikörperbildung unterdrückt, lösliche Faktoren, die das Wachstum anderer T-Zellen (Interleukine) induzieren, etc. Jedoch werden diese Faktoren selbst in vivo in sehr geringen Mengen abgeschieden, und weiterhin ist es extrem schwierig, sie in großen Mengen in vitro herzustellen, zu isolieren oder zu sammeln. Man hat daher Versuche unternommen, T-Hybridzellen durch Zellfusion herzustellen, damit man solche Faktoren in vitro herstallen kann. Die verschiedenen erfolgreichen Fälle einer T-Zellfusion, über die bis jetzt berichtet wurde, sind jedoch nur auf Mäuse-T-Zellen beschränkt Hinsichtlich der erfolgreichen Hybridisierung von humanen T-Zellen wurde bis jetzt noch nichts berichtet. Humane T-parentale Zellen, die mit humanen T-Zellen fusioniert werden können, wurden bis jetzt noch nicht entwickelt. Genauer gesagt, wird die parentale Zelle, selbst wenn e;ne solche parentale Zelle für die Hybridisierung mit der normalen humanen T-ZeIIe erhalten wird, in ihren ursprünglichen Zustand vor und/oder während des Hybridisierungsverfahrens zurückkehren, wodurch die Selektion von Hybridomen fast unmöglich wird. Selbst wenn Hybridome ausgewählt und isoliert werden, ist es höchst unvorhersehbar, daß die Hybridome funktionell stabil sind oder während langer Zeit wachsen werden, während sie die Gene, die aus der normalen T-Zelle in sie übertragen wurden, zurückhalten.
Da es schwierig ist, große Mengen an homogenen löslichen immunoregulatorischen Faktoren herzustellen, treten bei der Analyse ihrer chemischen und biologischen Eigenschaften extreme Schwierigkeiten auf. So wurden bis jetzt noch keine Forschungen unternommen, die sich mit der klinischen Anwendung dieser Faktoren und ihrer klinischen Wirkungen befassen. Da humane T-Hybridzell-Linien bis jetzt noch nicht etabliert wurden, erfolgte bisher nur ein geringer oder kein Fortschritt bei der Analyse der Oberflächenantigene auf humanen T-Zellen und T-Zellen-Rezeptoren für Anägene und in der Erfrischung von humanen T-Zellen-Untergruppen und bei cellularen und immunologischen Untersuchungen hinsichtlich der Differenzierung, dem Wachstum und der Aktivierung humaner T-Zellen per se.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine HGPRT-arme humane T-leukämische Zeil-Linie und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung betrifft somit eine hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-transferase-(HGPRT)-arme humane T-leukämische Zeil-Linie und ein bestimmtes Verfahren zu ihrer Herstellung (vgl. die Patentansprüche).
Die erfindungsgemäße parentale Zeil-Linie kann kontinuierlich kultiviert bzw. gezüchtet werden. Mit der Etablierung dieser Zeil-Linie wird es möglich, in vitro große Mengen löslicher immunoregulatorischer Faktoren zu erzeugen, die aus humanen T-Zellen abgesondert werden, d. h. lösliche Faktoren, die die interzellulare Reaktion bei der Immunantwort vermitteln, und es wird möglich, die chemischen und biologischen Eigenschaften dieser löslichen Faktoren, die bis jetzt nicht vollständig geklärt wurden, zu analysieren, wodurch die Forschung hinsichtlich der klinischen Anwendung und der Wirkung dieser Faktoren wesentlich beeinflußt wird.
Die erfindungsgemäße neue parentale Zeil-Linie leitet sich von einer humanen T-leukämischen Zeil-Linie ab und ist dadurch gekennzeichnet, daß sie an HGPRT (verarmt ist) defizient ist. Die zytologischen und anderen Eigenschaften der parentalen Zeil-Linie sind wie folgt. (Anstelle des in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Ausdrucks »parentale Zeil-Linie« kann man selbstverständlich auch »Ursprungszeil-Linie« schreiben).
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