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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von exogenen
Proteinen, umfassend die effiziente Expression eines exogenen Gens, hergestellt durch
rekombinante DNA-Technologie und Isolierung des exprimierten Proteins. Insbesondere bezieht sich
die Erfindung auf ein hervorragendes Verfahren zum Herstellen eines exogenen Proteins,
wobei das gewünschte exogene Protein insbesondere ein rekombinanter Antikörper ist,
hergestellt in einer Serum-freien Kultur unter Verwendung einer fusionierten Zelle als Wirtszelle
für die Expression, erhalten durch Fusionierung eines Maus-Myeloms mit einer
lymphatischen Zelle.
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Der Fortschritt bei der Zellfusionstechnik in den letzten Jahren hat die Herstellung von
monoklonalen Antikörpern vereinfacht. Jedoch wird im Fall von heterogenen Antikörpern, die
keine Maus-Typ-Antikörper sind, das Phänomen beobachtet, daß Chromosomen des
heterogenen Antikörpers schnell in der Hybridzelle (Hybridoma) verschwinden, wenn eine
heterogene Zelle, z. B. eine menschliche Zelle mit einer Myelom-Zellinie eines Nagetieres, wie einer
Maus, Ratte etc., fusioniert wird.
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Aus diesem Grund war es bisher ziemlich schwierig, eine stabile Antikörper-produzierende
Zelle zu erhalten; siehe J. M. Austyn et al., Eur. J. Immunol., Bd. 11 (1981), 805. Obgleich
Zellfusionen durchgeführt worden sind unter Verwendung einer homologen Myelom-Zellinie
oder einer B-Zellinie, die nicht von einem Nagetier abgeleitet worden ist, sind keine
befriedigenden Ergebnisse erhalten worden.
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Andererseits ist das Klonieren von Genen mit dem Fortschritt in der rekombinanten DNA-
Technologie einfacher geworden. Bezogen auf Antikörper sind Expressionstechniken auf
genetischer Ebene entwickelt worden, die die Isolierung und Expression eines Antikörper-
Gens in einer geeigneten Wirtszelle ohne die Deletion von Chromosomen ermöglicht. Jedoch
ist die Menge des exprimierten Antikörpers nach der Transfektion eines Antikörper-Gens im
allgemeinen geringer als durch eine Hybridzelle, hergestellt durch Zellfusionstechnik, da das
Expressionssystem nicht optimiert war, und daher ist diese Expressionsmethode nicht
verwendet worden. Um dieses Problem zu lösen, ist ein Gen-Amplifikationssystem mit z. B. einem
DHFR-Gen verwendet worden (G. Urlaub et al., PNAS USA, Bd. 77 (1980), 4216-4220),
aber im Fall des Maus-abgeleiteten Zellsystems ist gezeigt worden, daß ein exogenes Gen
nicht in ein Wirtschromosom als DM (Double Minutes) eingegliedert wird und daher instabil
ist (siehe G. R. Stark et al., Cell, Bd. 57 (1989), 901-908). Es gibt mehrere Berichte über ein
DHFR-Gen-Amplifikationssystem unter Verwendung von Mauszellen, aber diese beziehen
sich nicht auf die Stabilität von Antikörper-produzierenden Zellen.
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Techniken für die Antikörperherstellung durch rekombinante DNA-Technologie waren bisher
nicht zufriedenstellend hinsichtlich eines Expressionssytems, das im industriellen Maßstab
einsetzbar ist. Daher besteht ein Bedarf, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung eines
rekombinanten Antikörpers hinsichtlich der Expression und Reinheit eines rekombinanten
Antikörpers bereitzustellen.
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Aus technischer Sicht ist die Herstellung eines rekombinanten Antikörpers unter Verwendung
einer Serum-freien Kultur bevorzugt. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist gefunden
worden, daß der gewünschte rekombinante Antikörper sehr effizient hergestellt werden kann unter
Verwendung einer fusionierten Zelle als Wirtszelle, die hergestellt ist aus einer
Maus-Myeloma- und einer lymphatischen Zelle und die kultiviert werden kann in Serum-freien Medium
(obgleich solch eine Zelle ebenfalls als eine Hybridzelle definiert werden kann, wird in der
vorliegenden Erfindung die charakteristische Hybridzelle, die als Wirtszelle zur Expression
eines exogenen Proteins verwendet wird, als fusionierte Zelle bezeichnet), und Expression
eines Antikörper-Gens in der fusionierten Zelle.
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Mehrere verschiedene Verfahren sind beschrieben worden, die die Transfektion von
rekombinanten Zellen in Maus-Myeloma-Zellen durchführen, siehe Beidler et al., J. Immunol., Bd.
141 (1988), 4053-4060 und Neumaier et al., Cancer Res., Bd. 50 (1990), 2128-2134. In den
bisher bekannten Verfahren ist jedoch eine Stamm-Zellinie (Myeloma) selbst als eine
Wirtszelle verwendet worden, anstatt daß sie zur Herstellung eines Hybridomas verwendet wurde,
ein exogenes Gen ist eingegliedert worden in diese Wirtszelle und der Antikörper ist
exprimiert worden. Jedoch wenn eine Maus-Myeloma-Zelle verwendet wird als eine Wirtszelle zur
Expression eines exogenen Gens, ist es schwierig, Zellen herzustellen, die geeignet sind zur
Kultur in Serum-freiem Medium und es wird als schwierig betrachtet, eine Wirtszelle
herzustellen, die sowohl fähig zum Wachstum in Serum-freiem Medium ist wie in einem Medium,
supplementiert mit Serum und die eine stabile Gen-Expression zeigt.
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Eine repräsentative Maus-Myeloma-Zelle ist die P3X63Ag8.653-Zellinie. Diese Zellinie ist
eine exzellente Wirtszelle, da ein exogenes Gen leicht in die Zellinie transfiziert werden kann,
in das Genom integriert werden kann und sie eine hohe Expression zeigt. Jedoch, wie
vorstehend erwähnt, ist es nicht einfach, die P3X63Ag8.653-Zellinie an Serum-freies Medium
anzupassen, da ihr Wachstum variiert, abhängig von dem Transformant und daher nicht in
Serum-freiem Medium wachsen kann, und nur in einem Kulturmedium supplementiert mit
Serum wächst. Gemäß den Untersuchungen der vorliegenden Erfinder zeigt diese Zellinie eine
Cholesterin-abhängige Autotrophie und das Kulturmedium muß supplementiert werden mit
LDL, YLP (Yoke-Lipoprotein), Liposom etc. für eine längere Subkultur. Jedoch ist selbst in
diesen Kulturmedium, enthaltend eine große Menge von Cholesterin, das Wachstum nicht
vollständig wie in einem Medium, supplementiert mit Serum. Andere, unbekannte Faktoren,
abgeleitet von Serum, werden ebenfalls benötigt. Bisher sind Wachstumsfaktoren in dem
Serum, die von der Zelle benötigt werden, unbekannt.
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Daher haben die vorliegenden Erfinder solche Maus-Myeloma-Zellen mit lymphatischen
Zellen fusioniert, um fusionierte Zellen herzustellen, die angepaßt sind, um in Serum-freiem
Medium kultiviert zu werden und haben die so hergestellten fusionierten Zellen als
Wirtszellen für die Expression eines exogenen Gens verwendet. Als Ergebnis ist gefunden worden,
daß transduzierte Zellen, die ein gewünschtes exogenes Gen effizient und stabil exprimieren
und die fähig sind, selbst in Serum-freiem Medium kultiviert zu werden, hergestellt werden
können. Die lymphatischen Zellen, die in der vorliegenden Erfindung zur Herstellung solcher
fusionierten Zellen verwendet werden, sollten Zellen sein mit einer Fähigkeit der Anpassung
an eine Serum-freie Kultur nach der Fusion. Zum Beispiel können von Hybridzellen,
Hybridomas, die im allgemeinen zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers von einer
Myeloma-Zelle und einer lymphatischen Zelle hergestellt werden, solche Zellen verwendet
werden, die angepaßt sind oder anpassungsfähig sind an eine Serum-freie Kultur. Unter solchen
Hybridzellen schließt eine geeignete Zelle zur Fusion mit einer Maus-Myeloma-Zelle in der
vorliegenden Erfindung die Hybridzelle Sp2/0 (ATCC Nr. CRL1581) ein.
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Die besonders bevorzugten Maus-Myeloma-Zellen, die zur Herstellung einer
erfindungsgemäßen fusionierten Zelle verwendet werden können, schließen die Maus-Myeloma-Zellinie
P3X63Ag8.653 (ATCC Nr. CRL1580) ein. Die vorliegenden Erfinder untersuchten auf
verschiedene Art und Weise eine Zellinie zur Verwendung bei der Herstellung einer fusionierten
Zelle, die fähig ist, ein rekombinantes Antikörper-Gen effizient zu exprimieren und
bestätigten, daß die Maus-Myeloma-Zellinie P3X63Ag8.653 die besonders bevorzugte unter
verschiedenen Maus-Myelomas hinsichtlich der Einführung eines exogenen Gens ist.
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Um die Herstellung einer großen Menge eines exogenen Proteins im industriellen Maßstab zu
erreichen, z. B. eines rekombinanten Antikörpers, sollten die folgenden Bedingungen
eingehalten werden:
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(1) Das Wachstum sollte in einem Serum-freien Medium niedriger Kosten stattfinden, in
dem das gewünschte Produkt leicht gereinigt werden kann.
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(2) Es sollte eine große Menge des gewünschten Proteins hergestellt werden.
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(3) Eine maßstabsgetreue Vergrößerung in einem Suspensionkultursystem sollte leicht
möglich sein.
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Das Verfahren zur Expression eines exogenen Gens der vorliegenden Erfindung unter
Verwendung einer fusionierten Zelle als Wirtszelle zur Expression des exogenen Gens, die fähig
ist, kultiviert zu werden in einem Serum-freien Medium, hergestellt durch Fusionieren eines
Maus-Myelomas mit einer lymphatischen Zelle, ist dadurch charakterisiert, daß fusionierte
Zellen erhalten werden durch Mischen eines Maus-Myelomas (z. B. P3X63Ag8.653-Zellinie)
mit einer lymphatischen Zelle und Durchführen einer Zellfusion durch Hinzufügen eines
Fusionsmittels wie Polyethylenglykol. Die fusionierten Zellen werden einer Selektion in
Serum-freiem Medium unterzogen und einer Serie von Klonierungsschritten unterzogen, um
fusionierte Zellen herzustellen, die in Serum-freien Medium wachsen können und die stabil
ein exogenes Antikörper-Gen exprimieren. Solche fusionierten Zellen werden als Wirtszellen
verwendet. Diese Zellen sind ein ausgezeichnetes Werkzeug zur Herstellung eines exogenen
Proteins, das gewünschte exogene Gen kann in den fusionierten Zellen exprimiert werden und
dadurch kann das gewünschte exogene Protein aus dem Serum-freien Medium gesammelt
werden. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung erfüllt die vorstehend erwähnten
Bedingungen.
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Die Art des exogenen Proteins, das gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung
hergestellt wird, ist nicht beschränkt und schließt verschiedene nützliche Proteine ein, z. B. antigene
Proteine, physiologisch aktive Proteine und Enzyme, und ist insbesondere nützlich für die
Herstellung von Antikörpern durch die rekombinante DNA-Technologie. Diese Zellen sind
besonders geeignet zur Expression von verschiedenen genetisch rekombinierten Antikörpern
wie eines chimeren Antikörpers, eines Antikörpers mit einer umgestalteten V-Region [CDR-
umgestalteter Antikörper] etc. und kann effizient einen gewünschten rekombinanten
Antikörper herstellen.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
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Fig. 1 zeigt die Struktur eines Vektors, der die IgG-L-Kette exprimiert, als ein Beispiel eines
exogenen Gens, verwendet für einen Gen-Transfektionstest.
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Fig. 2 zeigt die Struktur eines Vektors, der die IgG-H-Kette exprimiert, verwendet zur
Transformation in Beispiel 4.
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Fig. 3 zeigt die Struktur eines Vektors, der die IgG-L-Kette exprimiert, verwendet zur
Transformation in Beispiel 4.
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Fig. 4 zeigt das Wachstum in Serum-freiem Medium eines Transformanten, etabliert unter
Verwendung einer fusionierten Zelle und die Expressionsmenge des rekombinanten
Antikörpers.
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Die vorliegende Erfindung wird nachstehend detaillierter erläutert anhand eines Beispiels für
die Herstellung eines rekombinanten Antikörpers.
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Im allgemeinen wird als Grundkomponente für ein Kulturmedium für die Suspensionskultur
von Säugerzellen RPMI-1640-Medium, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum etc.,
verwendet. In einem Serum-freien Medium mit verminderter Menge Gesamtprotein, wie
nachstehend gezeigt, hatte die erfindungsgemäße fusionierte Zelle ein Zellwachstum und eine
Kapazität, um einen rekombinanten Antikörper herzustellen, der äquivalent ist zu solchen in
einem Medium, supplementiert mit Serum.
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Ein Gemisch von Ham F12-Medium: Dulbecco-modifiziertes MEM-Medium: RPMI1640-
Medium in einem Verhältnis von 1 : 1 : 2 oder 2 : 1 : 1 wird als Grundmedium verwendet und die
in der folgenden Tabelle 1 gezeigten Zusätze werden hinzugefügt.
Tabelle 1
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Zusatz Endkonzentration
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Transferrin 1,0 mg/ml
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Ethanolamin 0,020 mM
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2-Mercaptoethanol 0,025 mM
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Selenigsäure 0,013 mg/l
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Antibiotika q. s.
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Gemische von Vitaminen
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Biotin 2,0 mg/l
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Calcium-D-Pantothenat 2,0 mg/l
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Cholinchlorid 2,0 mg/l
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Folsäure 2,0 mg/l
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Inositol 4,0 mg/l
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Nikotinamid 2,0 mg/l
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Pyridoxinhydrochlorid 2,0 mg/l
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Riboflavin 0,2 mg/l
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Thiaminhydrochlorid 2,0 mg/l
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Wenn ein DHFR-Gen-Amplifikationssystem verwendet wird, können etwa 10&supmin;&sup7; M
Methotrexat (MTX) hinzugefügt werden zu dem Medium, und wenn ein G418-Resistenz-Gen
eingegliedert ist, können etwa 0,5 mg/ml 6418 zu dem Medium hinzugefügt werden.
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Als lymphatische Zellen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, kommen
normale lymphatische Zellen, erhältlich von peripheren Lymphozyten, Lymphknoten oder der
Milz, aber ebenfalls eine lymphatische Hybridzelle, typischerweise Sp2/0 in Frage. Zellfusion
wird durchgeführt durch Mischen derartiger lymphatischer Zellen mit Maus-Myeloma-Zellen,
vorzugsweise P3X63Ag8.653, in Gegenwart eines Mittels zur Zellfusion (z. B.
Polyethylenglykol, etc.) bei Raumtemperatur. Die Zellfusion wird durchgeführt in üblicher Art und
Weise. Zum Beispiel werden 1 bis 10 · 10&sup7; Zellen von P3X63Ag8.653 mit 1 bis 5 · 10&sup8;
Zellen einer normalen lymphatischen Zelle oder mit 1 bis 10 · 10&sup7; von Sp2/0 gemischt und das
Gemisch wird bei 1500 rpm für 5 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu präzipitieren. Nach
Hinzufügen von Serum-freiem RPMI1640-Medium (40 ml), wird die Zentrifugation bei 1500
rpm für 10 Minuten durchgeführt, um die Zellen zu waschen. Nach dem Auflösen des Zell-
Pellets werden 45% Polyethylenglykol (mit einem Polymerisationsgrad von 1500 bis 4000
tropfenweise mit einer Rate von 1 ml pro Minute hinzugefügt und das Gemisch wird für 1
Minute gerührt. Nach weiterem Hinzufügen tröpchenweise von 1 ml RPMI1640-Medium über
1 Minute und wiederum tropfenweise hinzufügen eines zusätzlichen 1 ml des Mediums über 1
Minute wird PEG (Polyethylenglykol) mit 8 ml RPMI1640-Medium verdünnt. Die
Zellsuspension wird für 10 Minuten bei 1200 rpm zentrifugiert, um die Zellen zu sammeln. Nach der
Zellfusion wird die Kultur in Serum-freiem Medium, enthaltend 1% fötales Kälberserum, für
1 Woche gehalten und danach in dem vorstehend erwähnten vollständig Serum-freien
Medium, so daß die P3X63Ag8.653-Zellen, die nicht fusioniert sind, sterben, wohingegen
fusionierte Zellen weiter wachsen. Auf diese Art und Weise kann eine fusionierte Zelle, fähig
zum Wachstum in einem Serum-freien Medium, leicht erhalten werden und Antikörper in
dem Kulturüberstand können gescreent werden durch einen geeigneten Assay wie einem
Antikörper, markiert mit einem Radioisotop oder einem EIA unter Verwendung eines
Enzymmarkierten Antikörpers etc.
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Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Expression eines exogenen Gens, insbesondere
eines rekombinanten Antikörper-Gens und daher einer fusionierten Zelle, die einen von dem
Wirt abgeleiteten Antikörper nicht exprimiert, und unter den fusionierten Zellen, die fähig
sind, in Serum-freien Medium zu wachsen, durch das vorstehende Screening-Verfahren
aussortiert werden kann. Ob die fusionierten Zellen als Wirt für ein rekombinantes Protein
geeignet sind, kann jedoch bestätigt werden durch den folgenden Gen-Transfektionstest.
Gen-Transfektionstest
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Nach Durchführen der Zellfusion in gewöhnlicher Art und Weise und Inokulieren der
Suspension der fusionierten Zellen in einem Serum-freien Medium auf einer
24-Well-Kulturplatte, wird die Kultur für etwa 2 Monate fortgesetzt, während das Kulturmedium mit
frischem Serum-freien Medium alle 3 Tage ausgetauscht wird. Während dieser Kulturperiode
wird ein Teil des Kulturüberstandes herausgenommen und die Produktion von Antikörpern
durch EIA etc. am 3., 14. und 21. Tag nach der Zellfusion untersucht. Nach etwa 10 Tagen
werden Pools von fusionierten Zellen, fähig zum Wachstum in Serum-freiem Medium,
erhalten, und Wells, die gutes Wachstum zeigen, werden ausgewählt und zur Klonierung einem
limitierenden Verdünnungsverfahren in RPMI1640-Medium, enthaltend 10% fötales
Kälberserum, unterzogen. Wells von einem einzelnen Klon werden selektiert und ausgebreitet von
einer 96-Well-Platte auf eine 24-Well-Platte. Wenn die Klone Wachstum zeigen, wird zuerst
das Kulturmedium ausgetauscht durch Serum-freies Medium, enthaltend 5% fötales
Kälberserum, und danach wird die Konzentration von fötalem Kälberserum graduell abgesenkt und
schließlich wird auf Serum-freies Medium umgestellt. Die Zelldichte wird gezählt und die
Zellen werden auf einer anderen 24-Well-Platte bei einer Dichte von 2 · 10&sup5; Zellen pro ml
inokuliert und einem Gen-Transfektionstest unterzogen. Bezogen auf die zurückbleibenden
Zellen wird die Kultur fortgesetzt in Serum-freiem Medium, bis die Testergebnisse erhalten
werden. Der Gen-Transfektionstest wird wie folgt durchgeführt: Die 24-Well-Platte wird
stehengelassen, bis die inokulierten Zellen auf der Platte zum Boden der Well präzipitierten und
0,3 ml des Überstandes werden entfernt, um das Volumen auf 0,3 ml/Well einzustellen. Ein
geeignetes Expressionsplasmid (z. B. ein Plasmidvektor zur Expression einer Antikörper-L-
Kette etc., Fig. 1) wird in sterilem destillierten Wasser aufgelöst und mit einem geeigneten
Mittel für die Gen-Transfektion (DEAE-Dextran, Calciumphosphat, Lipofectin, etc.)
gemischt, um ein Gesamtvolumen von 0,3 einzustellen. Nach Stehenlassen für 15 Minuten bei
Raumtemperatur wird 0,01 ml des Gemisches tröpfchenweise zu den Zellen auf der 24-Well-
Platte hinzugegeben und die Zellen werden für 5 bis 24 Stunden bei 37ºC kultiviert. Nach
Abschluß der Kultur werden 0,3 ml eines Serum-freien Mediums, supplementiert mit 20%
fötalem Kälberserum, hinzugefügt und die Kultur wird für 2 bis 3 Tage fortgesetzt. Danach
wird der Kulturüberstand mit Hilfe eines geeigneten Testverfahrens auf die Expression des
Gens untersucht.
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Ein Pool von fusionierten Zellen, der eine hohe Expressionseffizienz des gewünschten
Produkts zeigt, wird ausgewählt und einer weiteren Klonierung durch das limitierende
Verdünnungsverfahren unterzogen unter Verwendung einer 96-Well-Mikroplatte. Der gleiche Gen-
Transfektionstest wird wiederholt, um einen fusionierten Zellklon zu erhalten, der geeignet ist
als ein Wirt für rekombinante DNA-Vektoren.
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Zusätzlich zu dem Verfahren des Einführens eines exogenen Gens in die zuvor erwähnte
erhaltene fusionierte Zellinie ist es ebenfalls möglich, zuerst ein exogenes Gen in ein Maus-
Myelom einzuführen. Danach wird der erhaltene Transfektant mit einer normalen
lymphatischen Zelle oder einer anderen Hybridzelle fusioniert, um eine genetisch rekombinante
erfindungsgemäße Zelle herzustellen, die fähig ist, in Serum-freiem Medium zu wachsen. Daher
kann das Einführen eines exogenen Gens entweder vor oder nach dem Schritt des Erhaltens
einer fusionierten Zelle durchgeführt werden. Wenn das Einführen des exogenen Gens vor der
Zellfusion durchgeführt wird, wird die Selektion in einem Serum-freien Medium zuerst
durchgeführt, um Zellen, abgeleitet von einem Maus-Myelom, zu zerstören (z. B.
P3X63Ag8..653). Danach wird die Kultur in ein Selektionsmedium (enthaltend MTX, G418),
supplementiert mit 1% fötalem Kälberserum, überführt, um Antikörper-produzierende Zellen
zu erzeugen. Die so erhaltenen Zellen können graduell an ein Serum-freies Medium angepaßt
werden. Wenn eine große Anzahl von Transformanten gewünscht wird, ist das Verfahren des
Einführens eines exogenen Gens nach der Zellfusion vorteilhafter, um Arbeit beim
Zellfusionsschritt einzusparen.
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Wenn die Sp2/0-Zellinie als ein Partner zur Zellfusion eingesetzt wird, kann die
G418-Resistenzgen-Expressionseinheit im voraus in das Maus-Myelom P3X63Ag8.653 als ein
Selektionsmarker für die Fusion eingeführt werden, so daß fusionierte Zellen leicht durch
Kultivierung in einem geeigneten Selektionsmedium nach der Fusion selektiert werden können. Mit
Hilfe dieser Mittel für die Gen-Einführung wurde bestätigt, daß das Maus-Myelom
P3X63Ag8.653 effektiv ein exogenes Gen integriert, wohingegen Sp2/0-Zellen selbst kaum
ein exogenes Gen integrieren.
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Zur Verwendung als eine Wirtszelle für die Gen-Transfektion ist die Fähigkeit, große Mengen
eines gewünschten Gen-Produkts zu produzieren, ein anderer wichtiger Faktor, der
berücksichtigt wird zusätzlich zu einer guten Transformationseffizienz und der Fähigkeit, in
Serum
freiem Medium kultiviert werden zu können. Entsprechend ist es wichtig, die
Expressionskaparität der Wirtszelle im voraus zu untersuchen. Die Zellen, die die höchste
Expressionskapazität haben, sollten als Wirtszellen ausgewählt werden. Die Expressionskapazität einer Zelle
kann untersucht werden durch Einführen eines geeigneten Gens in die Zelle durch Herstellen
von Transformanten und Messen der Menge eines exprimierten Produkts des Gens in dem
Kulturüberstand, auf der Zelloberfläche oder innerhalb der Zelle des Transformanten. Zum
Beispiel zeigt Tabelle 2 die Ergebnisse, erhalten durch einen Enzym-Immungssay, der die
Menge eines rekombinanten Proteins mißt. Das rekombinante Protein wird exprimiert in dem
Kulturüberstand von Transformanten, hergestellt durch Transformieren von 26 Klonen der
fusionierten Zellen und ihrer parenteralen Zellen (P3X63Ag8.653 und Sp2/0) mit Plasmiden,
wie in Fig. 2 und 3 gezeigt, gefolgt von einer Selektion mit G418. Die meisten der 26 Klone
der fusionierten Zellen zeigten höhere Expressionskapazitätenls ihre parenteralen Zellen und
insbesondere der Klon Nr. 34 zeigte höchste Expressionsmengen. Daher wurde Klon Nr. 34
betrachtet als am meisten geeigneter Klon für eine Wirtszelle für die Expression eines
exogenen Gens. Unter Verwendung dieses Klons als eine Wirtszelle wurde das in Fig. 4 gezeigte
Expressions-Gen exprimiert, um 20 pg Antikörper pro Zelle/pro Tag/pro ml herzustellen.
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Bisher waren für die Expression einer großen Menge von Antikörpermolekülen in einem
Maus-Myelom-Zellsystem andere Zellkulturtechniken, wie Gen-Amplifikation, etc.
erforderlich. Zum Beispiel führte Gillies et al., BioTechnology 7 (1989), 799, das Gen eines anti-
Tetanus-Toxin-Antikörpers in Sp2/0-Zellen ein und führte eine Gen-Amplifikation mit MTX
durch, um die Herstellungsmenge mehrfach zu erhöhen. Die Menge des Antikörpers,
exprimiert durch diese Zelle, betrug etwa 20 pg/Zelle/Tag/ml. Bebbington et al., BioTechnology 10
(1992), 169, führte ebenfalls eine Expression eines Antikörper-Gens in einer Myelom-Zelle
durch und erhielt Transformanten mit 9,5 bis 15 pg/Zelle/Tag/ml Produktionskapazität, was
ebenfalls erreicht wurde durch Verwendung der Glutaminsynthetase-Gen-Amplifikation.
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Die Gen-Amplifikation ist nachteilig, da zunächst Zeit für die Amplifikation benötigt wird,
gewöhnlich mehrere Monate, um eine Zellinie mit hoher Expression zu erhalten. Ein weiterer
Nachteil ist das Fehlen von Stabilität der Gen-Expression, d. h. eine Deletion eines Gens findet
statt, wenn Zellen kultiviert werden ohne ein Selektionsmittel wie MTX oder MSX,
resultierend in einer Abnahme der Produktionsmenge bis zu einer Menge vor der Amplifikation.
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Daher ist es notwendig, entweder diese Selektionsmittel während der Kulturperiode
hinzuzufügen oder eine stabile Zellinie zu klonieren.
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Im Gegensatz dazu hatten die transformierten Zellen, abgeleitet von den fusionierten Zellen,
etabliert gemäß der vorliegenden Erfindung, eine Expressionskapazität äquivalent zu der der
vorstehend erwähnten etablierten Zellinien, ohne daß eine Gen-Amplifikation benötigt wird.
Bisher haben die vorliegenden Erfinder die Expression durchgeführt eines Antikörper-Gens in
P3X63Ag8.653 oder Sp2/0-Zellen und haben gefunden, daß diese Zellen einen Antikörper
exprimieren können mit mehreren pg/Zelle/Tag/ml oder niedriger. Die Erfinder fanden
überraschenderweise, daß die fusionierte Zelle, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung,
eine hohe Produktionskapazität ohne Gen-Amplifikation aufweist und daß diese fusionierte
Zelle zum ersten Mal eine derartig hohe Produktionskapazität erlaubt. Entsprechend können
bei Verwendung dieser fusionierten Zelle zur Transformation Zellen mit einer hohen
Produktionskapazität erhalten werden ohne die Notwendigkeit einer Gen-Amplifikation.
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Es ist ebenfalls möglich, die Expressionsmenge des Produkts dieser Zellen durch
Gen-Amplifikation unter Verwendung von Reagenzien wie MTX oder MSX weiter zu erhöhen. Zum
Beispiel, wie in Beispiel 6 gezeigt, wurde die Gen-Amplifikation durchgeführt durch Erhöhen
der MTX-Konzentration während der Kultur der Transformanten und als Ergebnis wurde ein
Anstieg der Expression des rekombinanten Proteins um das 10fach erhalten.
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Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch die nicht einschränkenden Beispiele näher
beschrieben.
Beispiel 1
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Die Milz stammte von einer Maus, die nicht immunisiert war. Milzzellen wurden steril in 10
ml Serum-freiem RPMI1640-Medium suspendiert. Sie wurden in ein Zentrifugenröhrchen
transferiert, um Bindegewebe etc. zu präzipitieren und die Zellsuspension zu sammeln. Zum
Milzzell-Präzipitat wurden 0,5 ml eines Wachstumsmediums, enthaltend fötales Kälberserum,
hinzugefügt und weitere 10 ml eines 10fachen Verdünnungsmediums wurden schnell
hinzugefügt und Erythrozyten durch Hypotensionsbehandlung bei Raumtemperatur für 15 bis 20
Sekunden entfernt. Nach der Hypotensionsbehandlung wurden schnell 10 ml eines zweifach
konzentrierten Mediums hinzugefügt, die Zellen wurden mit einer Pipette suspendiert,
zusätzliche 10 oder 20 ml Wachstumsmedium wurden hinzugefügt und das Gemisch wurde
zentrifugiert (1500 rpm, 5 Minuten), um eine Präzipitierung der Milzzellen zu erreichen. Hierzu
wurden 20 bis 30 ml eines Wachstumsmediums hinzugefügt und das Gemisch wurde mit
einer Pipette gemischt und danach bei 1500 rpm für 5 Minuten bei Raumtemperatur
zentrifugiert, um normale lymphatische Zellen zu erhalten. Die Maus-abgeleiteten Milzzellen (1 bis 5
· 10&sup8; Zellen) und 1 bis 10 · 10&sup7; Zellen der Zellinie P3X63Ag8.653 wurden in einem
Verhältnis von 5 bis 10 : 1 gemischt. Hierzu wurden 40 ml Serum-freies RPMI1640-Medium
hinzugefügt und das Gemisch wurde bei 1500 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu
waschen. Das Zellpräzipitat wurde mit einer Pipette suspendiert und danach wurden 45%
Polyethylenglykol (Grad der Polymerisation von 1500 bis 4000) tropfenweise hinzugefügt bei
einer Rate von 1 ml pro Minute und das Gemisch wurde für 1 Minute leicht gerührt. Danach
wurde 1 ml des RPMI1640-Mediums tropfenweise über 1 Minute hinzugefügt und zusätzlich
wurde 1 ml des Mediums über 1 Minute hinzugefügt und danach wurde PEG
(Polyethylenglykol) verdünnt mit 8 ml des RPMI1640-Mediums und eine Zentrifugation bei
1200 rpm für 10 Minuten durchgeführt, um die Zellen zu sammeln. Nach der Zellfusion
wurde die Kultivierung durchgeführt in HAT-Medium (enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin
und Thymidin), suppelementiert mit 10% fötalem Kälberserum für mehrere Wochen und
danach in dem zuvor erwähnten vollständigen Serum-freien Medium. Als Ergebnis starben
P3.653-Zellen, die nicht fusioniert waren, allmählich, wohingegen die fusionierten Zellen
kontinuierlich ohne Zerstörung wuchsen. Als Ergebnis wurden fusionierte Zellen, fähig zum
Wachstum in Serum-freiem Medium erhalten.
Beispiel 2
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Ein Transfektant, der zuvor hergestellt worden war durch Einführen eines Antikörper-
Expressionsvektors, enthaltend eine DHFR-Gen-Expressionseinheit und eine
G418-Resistenzgen-Expressionseinheit, in die Zellinie P3X63Ag8.653 wurde fusioniert mit der Sp2/0-
Zellinie (ATCC Nr. 1581) und eine Selektion in Serum-freiem Medium wurde durchgeführt.
Die selektierten fusionierten Zellen wurden weiter in dem zuvor erwähnten Serum-freien
Medium, enthaltend MTX (Methotrexat) kultiviert und nach 2 Wochen wurde das
Vorhandensein von Antikörper in dem Kulturüberstand durch EIA unter Verwendung eines
Peroxidase-markierten-anti-IgG-Antikörpers bestimmt. Die Transfektanten, die nicht fusioniert
waren, konnten in dem Serum-freien Medium nicht wachsen und starben. Auf der anderen
Seite konnten die Sp2/0-Zellen, die nicht fusioniert waren, ebenfalls in dem Serum-freien
Medium, enthaltend MTX und G418 nicht wachsen und starben ebenfalls. Die fusionierten
Zellen konnten in dem Serum-freien Medium, enthaltend MTX, überleben und als Ergebnis
konnten in einer hohen Ausbeute Klone erhalten werden, die große Mengen des gewünschten
Antikörpers exprimieren. Darüber hinaus war die Klonierung gemäß Beispiel 1 sehr
zeitintensiv, da die fusionierten Zellen kultiviert werden mußten in einem Selektionsmedium wie
das HAT-Medium etc., wohingegen in Beispiel 2 die gewünschten Klone in einer kurzen Zeit
erhalten werden konnten.
Beispiel 3
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Die Maus-Hybridoma Sp2/0-Zellinie kann leicht an Serum-freies Medium angepaßt werden
und erlaubt daher die Serum-freie Kultur in industriellem Maßstab. Darüber hinaus, da die
Sp2/0-Zellinie keinen Antikörper sekretiert, kann eine Fusion von Sp2/0 mit P3X63Ag8.653
einen Wert für die Einführung eines exogenen Gens bereitstellen, der die Charakteristika von
beiden Zellinien hat, d. h. die Wachstumskapazität von Sp2/0 und die hohe
Gen-Einführungsrate und die hohe Expressionseffizienz von P3X63Ag8.653.
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Nach der Zellfusion beider Zellinien gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wurde
die Kultur in Serum-freiem Medium auf einer 24-Well-Platte für etwa 2 Monate mit Wechsel
des Kulturmediums durchgeführt. Pools mit gutem Wachstum wurden ausgewählt und die
Klonierung wurde in RPMI1640-Medium, enthaltend 10% fötales Kälberserum, durchgeführt.
Wells mit einem einzelnen Klon der fusionierten Zellen wurden ausgewählt und von einer 96-
Well-Platte auf eine 24-Well-Platte ausgedehnt. Wenn Wachstum in Serum-freiem Medium,
enthaltend 5% fötales Kälberserum, zu beobachten war, wurde das Kulturmedium gegen
vollständig Serum-freies Medium ausgetauscht. Die Zellanzahl wurde gezählt für die erhaltenen
fusionierten Zellklone und der Gen-Einführungstest wurde unter Verwendung von Lipofectin
durchgeführt. Als Ergebnis zeigten solche fusionierten Zellen, die in Serum-freiem Medium
wachsen konnten, eine Expressionseffizienz äquivalent zu der der P3X63Ag8.653-Zellinie
(Tabelle 2). Die Kontrolle P3X63Ag8.653 selbst konnte in dem Serum-freien Medium nicht
wachsen und Sp2/0 konnte wachsen, zeigte aber extrem niedrige Kapazität der
Antikörperproduktion.
Tabelle 2
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Unter Verwendung der vorstehend erhaltenen fusionierten Zellen wurde ein rekombinantes
Antikörpergen mit einem hierin eingegliederten DHFR-Gen hergestellt und die Stabilität der
Antikörperproduktion wurde untersucht. Die Stabilität der Antikörperproduktion variierten
zwischen den Klonen, aber vergleichbar stabile Klone unter den vorstehend erwähnten Klonen
zeigten keine Abnahme der Kapazität der Antikörperproduktion selbst nach einer Kultur in
großem Maßstab bis zu 6001 in Gegenwart von MTX.
Beispiel 4
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Die in Beispiel 3 erhaltenen fusionierten Zellen wurden auf die Expressionskapazität für ein
rekombinantes Protein getestet. Fig. 2 und Fig. 3 zeigen die Struktur der
Expressionsvektoren, kodierend für eine rekombinante Antikörper-H-Kette und -L-Kette. Unter den
fusionierten Zellen, erhalten in Beispiel 3, wurde Klon Nr. 34 mit zwei Arten von Expressionvektoren
transfiziert. 10 ug von Antikörper-H- und -L-Ketten-Expressionsplasmiden wurden mit 50 ul
Lipofectin (BRL) gemischt. 10&sup6; Zellen wurden mit diesem Gemisch transfiziert. Am dritten
Tag wurden die Transfektanten in RPMI1640-Medium, enthaltend 1 mg pro ml G418, 0,25 ·
10&supmin;&sup7; M MTX und 5% fötales Kälberserum, selektiert. Nach der Selektion wurden transfizierte
Zellen durch ein limitierendes Verdünnungsverfahren kloniert, um eine
Antikörper-produzierende Zellinie (genannt "8-3-2-10") zu erhalten.
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Diese Zellinie wurde in Serum-freiem Medium kultiviert und wuchs sehr gut. Während der
Kultur im kleinen Maßstab betrug die maximale Zelldichte 1,5 · 10&sup6; /ml (Überlebensrate 92%)
und die erforderliche Zeit für die zweifache Multiplizierung betrug etwa 16 Stunden.
Beispiel 5
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Eine Kultur in großer Dimension von 600 l wurde in Serum-freiem Medium für die 8-3-2-10
Zellen, erhalten in Beispiel 4, durchgeführt. Fig. 4 zeigt die Wachstumskurve der Zellen und
den Anstieg der Antikörpermengen, exprimiert in dem Kulturüberstand. Diese Zellinie konnte
gut wachsen, selbst in Serum-freiem Medium, und die maximale Zelldichte erreichte 1,45 ·
10&sup6; Zellen/ml. Die Menge des hergestellten Antikörpers pro Zelle pro Tag betrug 20 pg/ml.
Beispiel 6
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Unter Verwendung der fusionierten Zellen, erhalten in Beispiel 3, wurde die
Gen-Amplifikationskapazität der transfizierten Zellen untersucht. Die Expressionsvektoren, kodierend für die
rekombinante Antikörper-H-Kette und -L-Kette wurden in den Klon Nr. 34 eingeführt. 10 ug
jedes Expressionsplasmids, pSV2-neo, enthaltend das Gen kodierend für die Antikörper H-
Kette und pSV2-dhfr, enthaltend das Gen kodierend für die Antikörper-L-Kette, wurden mit
50 ul Lipofectin (BRL) gemischt und 10&sup6; Zellen der fusionierten Zellen wurden mit dem
Gemisch transfiziert. Nach 3 Tagen wurden die Transfektanten in RPMI1640-Medium,
enthaltend 1 ug/ml G418, 0,25 · 10&supmin;&sup7; M MTX und 5% fötales Kälberserum, selektiert. Nach der
Selektion wurden die transfizierten Zellen durch ein limitierendes Verdünnungsverfahren
kloniert, um die Antikörper-produzierenden Zellen SP119-2, 3, 7, 10, 15 und 16 zu erhalten.
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Danach wurde diese sechs Klone in RPMI1640-Medium, enthaltend 1 mg/ml G418, 1 · 10&supmin;&sup7;
M MTX und 5% fötales Kälberserum, kultiviert. Nach 1 Monat wurde die
Antikörperkonzentration, exprimiert in dem Kulturüberstand der resistenten Zellen, durch einen
Enzym-Immunoassay bestimmt und verglichen mit der Antikörperkonzentration, erhalten durch Gen-
Amplifikation. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 dargestellt.
Tabelle 3
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Name der Zelle Rate des Anstiegs der Antikörperproduktion a)
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SP 119-2 1,42
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3 2, 81
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7 7,42
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10 2,50
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15 10,47
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16 1,05
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a) Verhältnis der Expressionsmenge von 1 · 10&supmin;&sup7; M MTX-resistenten Zellen zu 0,25 · 10&supmin;&sup7; M
MTX-resistenten Zellen.
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Wie den vorstehenden Ergebnissen zu entnehmen ist, wurde durch Ansteigen des MTX-
Levels in dem Medium um das 4fache und Durchführen der Gen-Amplifikation ein Anstieg
der Antikörper-Expressionsmenge um das 10fache in den höchsten Fällen beobachtet.
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Diese Experimente bestätigten, daß Klon Nr. 34 für die Gen-Amplifikation verwendet werden
kann.
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Entsprechend können hohe Expressionslevel erwartet werden bei Gen-Amplifikation der 8-2-
3-10 Zelle, wie in Beispielen 4 und 5 gezeigt ist.
Industrielle Anwendbarkeit der Erfindung
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Für die Expression eines exogenen Gens, insbesondere eines rekombinanten Antikörpergens,
erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren der Serum-freien Kultur die stabile Produktion von
großen Mengen eines gewünschten rekombinanten Antikörpers etc. in Serum-freiem Medium
und ermöglicht die einfache Reinigung eines gewünschten exogenen Proteins und stellt daher
ein hervorragendes neues Verfahren zur Herstellung eines exogenen Proteins bereit.